Introduction
나노 물질이 점점 산업 및 다양한 용도에 사용되는 바와 같이, 더 신속한 저렴 및 전자 현미경과 같은 기존의 양상,보다 편리 나노 이미징 및 특성화 방법이 필요하다. 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경 (1) 및 내부 전반사 (TIR) 또는 근 등 산장 기반 접근 방식을 포함하여 많은 광학 기술이 채용 된 세포, 조직 및 생활 시스템과 나노 입자 (NP)의 상호 작용을 시각화 필드 주사 광학 현미경 (NSOM) 2,3. 그러나 이러한 대부분의 비 전문 연구소 4의 손이 닿지 않는 곳에 하이 엔드 분석 접근 방식이다. 투과 전자 현미경 (TEM)을 포함하여 전자 현미경은 또한 세포와 5,6,7,8- NP 상호 작용을 연구하는데 사용되었다. 높은 각도 환형 암시 야 (HAADF) 주사 투과형 전자 현미경 된 NP의 상호 작용을 연구하기 위해 사용되어왔다바이러스 9. 공 초점 현미경 NP-세포 상호 작용 (10)을 연구하는 데 또 다른 인기있는 기술이다.
최근, 암시 야 계 초 분광 영상 (HSI) 기술은 생물학적 매트릭스 11 NPS를 연구하기위한 유망한 분석 도구로서 사용되어왔다. HSI 시스템 또는 하이퍼 큐브 datacube 12라고도 공간 및 스펙트럼 데이터의 3 차원 표현을 생성한다. 스펙트럼 변동 공간지도 소재 식별을 위해 사용된다. 공지 된 재료의 스펙트럼 프로파일이 생성 미지 시료에 비교 참조 라이브러리로서 사용될 수있다. HSI 시스템과 주요 이점 중 하나는 이에 의해 공지 된 유사한 조성물의 다른 기준 입자에 이들과 결합뿐만 아니라 또는 생체 생체 내 위치 알려지지 된 NP의 분포를 확립 분광법으로 촬상을 결합 할 수있는 능력이다.
여러 장점이 있습니다종래의 이미징 기술 위에 HSI 시스템을 사용 : 최소 샘플 준비가 요구된다; 시료 준비는 자연에서 일반적으로 비파괴; 이미지 수집 및 분석은 빠르다; 기술은 비용 효율적인 13이고; 혼합 된 조성물 및 / 또는 복잡한 매트릭스의 화합물의 공간 분포 분석은보다 쉽게 14 달성된다.
귀금속 나노 물질을 포함하는 샘플의 연구를위한 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 잠재적 반복 하나 이상의 방법에 의해 시료를 검사 할 수있는 비파괴 이미징 법의 유용성이다. 반복 또는 복수의 분석은 하나의 방법에서 사용하지 못할 것입니다 포괄적 인 데이터 세트를 개발하는 것이 바람직 할 수있다. 이러한 측면에, 그 광학 특성을 연구하는 샘플을 분석하는 안전한 방법이다. 향상된 암시 야 현미경 (EDFM)와 HSI 시스템을 사용하여 샘플의 광학 응답을 연구 - 즉 reflectance뿐만 아니라, 흡광도 및 투과율 - 기능 식별 및 특성은 15을 행할 수있다. 잠재적 인 특성 엔드 포인트는 상대적인 크기와 샘플 내에서 나노 입자 또는 덩어리와 나노 입자의 분포의 모양에 대한 평가를 포함한다.
본 논문에서는 스펙트럼 각도 맵퍼 (SAM)로 지칭 화소 스펙트럼 매치 알고리즘을 기반 HSI 시스템을 이용하여 사후 조직에서 금속 산화물 나노 입자에 대한 구체적 매핑 방법을 설명한다. 이 동물 모델은 나노 물질에 대한 노출의 건강 영향을 평가하는 데 사용되는 것을 특징으로하는 생체 나노 독성학 연구에서 현재와 미래를 보완 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 우리는이 특정 응용 프로그램을 선택했다. 이 방법의 응용 프로그램은 또한 조직 또는 동물 모델을 이용하여 나노 약물 전달 연구를 알릴 수있다. O에 걸쳐 특히, 나노 입자의 흡수, 분포, 대사, 배설에rgans와 조직이 시스템을 조사 할 수있다. 애플리케이션의 다양한 생물 의학 연구 (11)에서 사용하기 위해 연구되고있다.
이 방법은 원소 조성물 16-19의 다양한 나노 입자에 노출되어 (예컨대 다양한 조직 유형, 기관지 폐포 세척액 시료 및 혈액 도말 같은) 상이한 생물학적 시료의 평가에 이용 될 수있다. 또한,이 방법은 생체 내에서와 나노 약물 전달 연구 (11)에 대한 관련입니다 체외에서 나노 입자의 생체 분포를 연구하는 데 유용합니다. 생물학적 시료 넘어 EDFM 및 HSI는 폐수 20 환경 시료에서 나노 입자를 평가할 수있다. 이 나노 입자의 침입을 방지 개인 보호 장비의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있기 때문에, 작업장 노출 평가는 물론이 기술의 사용에 의해 촉진 될 수있다. 또한, 연구 테오전 현재 직업적 노출 평가에서 수집 된 나노 입자의 필터 미디어 샘플의 평가 및 유사 EDFM HSI 프로토콜을 개발하고있다. EDFM HSI 및 이러한 다른 종류의 시료 준비는 다를 수 있지만, 그들이 쉽게 광학계에 의해 가시화 될 수있는 방식으로 제조하는 것이 중요하다. 그것은 전통적인 시야 현미경을 통해 가시화 될 것처럼 일반적 시료로한다. (11) 시판의 하이퍼 스펙트 럴 여러 이미징 시스템이있다.
Protocol
동물 프로토콜은 연구자 '협력 기관, 스토니 브룩 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 특정 물질이 종이에 사용되는 장비의 목록은 표 1에서 찾을 수 있습니다.
조직의 1. 샘플 준비
- 전술 한 방법에 따라 21-23 조직학 또는 면역 조직 화학 염색을 위해, 금속 산화물 나노 입자에 노출 된 동물의 조직을 준비한다.
2. 영상
- 현미경을 초기화
참고 : 본 연구를 위해 연구 등급 현미경, 고성능 암시 야 광원이 장착, 사용 된 전동 XY 스테이지 컨트롤러, 14 비트 깊이 하이퍼 스펙트 럴 카메라, 복수의 대물 렌즈 (10 배 공기, 40X 공기, 100X 오일 침지) . 여기에 사용 된 시스템은 100X (기름 침지) 배율에서 64 nm의 공간 해상도를 가지고있다. 이 스터드 사용 응축기Y는 쾰러와 조명 모두 중요한 기능을 가지고 샘플에 비스듬한 각도로 고도로 평행 광을 초점을 맞춘다.- 에 연결하고 광원 (암시 야 이미징) XY 스테이지 컨트롤러, 광학 카메라, 초 분광 카메라, 컴퓨터 시스템을 켭니다. 75 % 전력으로 광원을 설정; 최대 높이에 무대를 마련, 강화 된 암시 야 이미징 또는 반사 시야 이미징에 대한 현미경의 뒷면에있는 콜리메이터에 콘덴서에 라이트 가이드를 연결합니다.
참고 : 75 %의 전력으로 광원을 설정함으로써, 정지 둔하고 밝은 픽셀 간의 대비를 허용하면서 흐릿한 화소 향상도의 전체 필드 내의 모든 픽셀 충분하고 균일 한 조명이있다. - 작동 위치에 콘덴서를 올립니다. 기포의 형성을 피하는, 신중 집광 렌즈 형 침지 오일 3-5 방울을 적용한다. 거품 형성하는 경우는, 기름을 닦아하고 다시 적용합니다.
- 슬라이드 O를 배치무대를 명. 침지 오일이 슬라이드에 닿을 때까지 천천히 콘덴서를 올립니다. 이 오일이 슬라이드와 접촉하는 조명의 빠른 속도로 밝게 링을 통해 눈에 띄는 것입니다.
- 에 연결하고 광원 (암시 야 이미징) XY 스테이지 컨트롤러, 광학 카메라, 초 분광 카메라, 컴퓨터 시스템을 켭니다. 75 % 전력으로 광원을 설정; 최대 높이에 무대를 마련, 강화 된 암시 야 이미징 또는 반사 시야 이미징에 대한 현미경의 뒷면에있는 콜리메이터에 콘덴서에 라이트 가이드를 연결합니다.
- 장소에 10 배 목표를 넣습니다. 초점과 접안을 검사하여 콘덴서를 맞 춥니 다.
- 밝기가 최대화 될 때까지 거친 목적 초점 노브를 통해 위아래 단계로 이동합니다.
- 최대 밝기가 발견 될 때까지 응축기가 초점을 상하 응축기 조정 노브를 통해 움직인다. 시야에서 가능한 가장 밝은 중앙 지점의 생성을 시도합니다.
- 필요한 경우, 밝은 점을 중앙에 필요한 콘덴서 정렬 노브를 조정합니다.
- 초점 밝은 반점을 가지고 미세 목적 초점 노브를 사용합니다. 다른 배율을 얻는 것이 목표를 변경할 때, 초점 평면을 재조정. 100X 대물 렌즈를 이용하면, 제 향상을 커버 슬립 위에 침지 기름 방울을 적용전자 화상과, 대물 렌즈의 손상을 방지.
- 캡처 이미지
- 관심있는 영역을 찾아 스테이지 제어기를 사용한다. 이 영역은, 실험의 요구에 의해 결정된다. 금속 산화물 나노 입자로 뒤덮인 지역이 자주없는 지역보다 밝게 나타나는 일반적인 표시, 주변 지역과 콘트라스트가 높은 것입니다.
- 조명 평형화 필요한 콘덴서 초점 조정, 미세 대물 포커스 노브를 사용하여 초점 영역을 가지고. 시야 내에서 높은 콘트라스트, 잘 정의 된 영역을 획득.
- (초 분광 카메라) 결정 (광학 카메라) 어떤 이미지 나 datacubes 캡처, 어떤 순서로한다. 일반적으로 광학 이미지는 10X 공기 목적, 40X 공기 목적 및 100X 기름 침지 객관적이고 100X 오일 침지 목적으로 해당 HSI의 datacube를 얻을 수 있습니다.
- 광학 이미징 소프트웨어를 엽니 다. 설정 및 "을 클릭합니다# 8221; 메뉴 바에서. "캡처 이벤트에 대한 이미지 캡처 버튼"을 선택합니다. (TIFF는이 실험에 사용 된) 저장된 이미지 형식을 선택합니다; 파일 이름을 지정; 검색 및 저장된 이미지 폴더를 선택; 기본 timelapse에 계속; "확인"을 클릭합니다.
- "노출"메뉴에서 가장 높은 콘트라스트 이미지를 만들 노출 설정을 선택합니다 (이 연구, 0.0 %의 수준, 3.0 dB의 게인, 35 MS의 셔터를 사용 하였다).
- 메뉴 바에서 '이미지'버튼을 클릭하여 이미지를 캡처합니다. 컨텍스트를 제공하기 위해, 현미경 목적을 변경하여 높은 배율에서 그 외에도 여러 가지 저 배율 암시 야 이미지를 캡처.
참고 :이 광 이미지보기 나중에 육안 검사에 더 미적 외관의 큰 필드가 경향, 초 분광 카메라로 촬영됩니다 어떤 datacubes 같은 배율의 광학 이미지를 캡처합니다. 그것은 어떤 datac하는 것이 필수적이다이 목적을 변경해 현미경 광학계의 투과 스펙트럼 캡처 스펙트럼을 변경하고, 따라서 스펙트럼 각도 맵퍼 (SAM)의 정확성을 감소 변경할 것을 가능 후술 스펙트럼 사용 일관된 배율을 분석한다 ubes. 하나 datacube가 다른 목적으로 얻은 또 다른 datacube 비교하면, SAM 기능이 작동하지 않을 수 있습니다.
- 초 분광 카메라에 현미경의 광원 노브를 리디렉션하여 초 분광 카메라 영상 검출기를 선택합니다. 광 하이퍼 스펙트 럴 향하는 카메라의 경우, 이미지는 광학 카메라 소프트웨어에 도시되지 않는다. 단계 2.4.4에서 규정 한 필요할 수 있으므로 최소화하지만, 광학 이미징 소프트웨어 창을 닫지 마십시오.
- Datacubes 캡처
- HSI의 datacubes의 수집을위한 초 분광 이미징 소프트웨어를 엽니 다. 라이트 가이드는 초 분광 카메라에 관한 것이다 확인합니다.
- 열기 "Hyp이erspectral 현미경 HSI 현미경 컨트롤 "을"메뉴 표시 줄 및 선택 ".
- 목표 배율을 설정하고 경로를 저장합니다. 특유은 그래서 덮어 쓰기가 발생하지 모든 이미지와 파일 이름을 지정해야합니다. 큰 영역을 캡처 필요한 추가 상당한 시간과 함께, 볼 또는 라인 (720 본 연구 선을 사용)의 수의 필드를 조정함으로써 설정에서 캡처 영역을 변경한다. 마지막으로, 노광 시간 (본 연구 0.25 초)을 설정한다. 기본적으로 다른 모든 것을 그대로두고 이미지를 볼 수 있습니다 "미리보기 HSI"을 클릭합니다.
참고 : 나타나는 강도 그래프는 가로축에 기록 될 HSI의 datacube을 보여줍니다. 세로축은 HSI의 datacube에서 캡처 될 스펙트럼의 파장을 나타낸다. 스펙트럼 파장에 상응하는 강도 그래프상의 임의의 위치에 커서를 위치 시키면 이미지 전체의 모든 점들의 세기를 일으키는, 그 파장에서 도시된다. - 또는 노광 시간을 조정하기 위해 미리 제거하여 소스 밝기, 집광하여 초점 조절이 미리부터 강도를 조정한다. 후자는 최상의 결과를 얻을 수 있지만, 증가 된 노출 시간은 이미지에 더 오래 걸릴 수 있습니다. 목표는 더 상당한 피크가 충분히 큰하지만 검출기의 최대 강도를 초과하지 않는 것으로하기위한 것이다; 여기에, 이상적인 범위는 1,000 내지 16,000 단위입니다.
- "캡처"를 클릭합니다. 현미경은 어두운 현재의 이미지를 촬영하기 위해 요청합니다. 배향을 방해하지 않도록, 상기 상부 슬라이드 바 또는 신중 개구 (리디렉션다른 광학의 초점), "확인"을 클릭합니다. 올바른 위치로 슬라이드 막대 또는 조리개를 복원 이미지 표시에 때 프롬프트 다시 "확인"을 클릭합니다. 약 5 분의 시간이 더 일반적인 비록 영상은 30 분까지 걸릴 수 있습니다. 긴 노출 시간이 긴 촬영 시간에 이어집니다. 진행 표시기가 존재한다. 진행 표시기가 완료되기 전에 물리적 범위를 방해하지 않도록주의하십시오.
- 이름으로 네 개의 새 창을 준수하십시오 "사용 가능한 밴드리스트", "# 1 1zoom", "# 1 1scroll"와 "# 1 RGB 밴드". 이 모든 미래의 참조에 대한 datacube 그대로 "# 1RGB 밴드"창을 최대화합니다.
- 오른쪽 datacube를 클릭하고 TIFF로 저장하고 "확인"을 클릭합니다. 완료 이미징 경우는 모든 샘플을 버리고; 물에 70 % 이소프로판올 모든 기름에 노출 된 표면을 청소; 최대 높이에 무대를 마련, 비 작동 위치로 최소 높이와 언론에 낮은 콘덴서; 닫은또는 아래로하면 광원, 스테이지 컨트롤러 및 카메라를 뽑습니다.
참조 스펙트럼 라이브러리 3. 창조
- 참조 스펙트럼의 선택
- HSI 스펙트럼 프로파일 매트릭스 의존적이기 때문에, 실험 샘플과 같은 행렬에 포함되는 관심있는 물질을 포함하는 공지 된 양성 대조군을 선택.
- 이 연구를 위해 국소 노출 연구에서 실험 돼지 피부 조직에 비교를 위해 금속 산화물 나노 입자 양성 대조군의 고용량을 주사 돼지 피부를 사용합니다. 현탁액 중의 금속 산화물 나노 입자의 분광 프로파일 인해 다른 행렬로 생성하고 조직 학적 검사와 실험 샘플에 대한 양성 대조군 부적절한 것으로 판명되었다.
- 단계 2.4에 설명 된대로 긍정적 인 컨트롤에서 datacube를 얻습니다., 초 분광 카메라를 사용.
- 특히주의해야 할 때 그 자체이 내부 입자 필터 재료를 식별하는 중요한 통계이기 때문에, 강도 tting. 검출기 (여기에, 16,000 대)의 포화 점 이상 모든 강도는 (2.4.5 단계를 참조하십시오.) 유효하지 않은 데이터가 발생합니다.
- 오른쪽 이미지 창에서 클릭하고 "Z-프로필 스펙트럼"을 클릭 떠났다. 팝업 스펙트럼 프로파일 창이 나타납니다. datacube에 대한이자의 픽셀, 특히 밝은 사람 또는 자신의 관심의 재료를 대표로 식별 할 수있는 사람들에 클릭을 떠났다. 관련 스펙트럼을 보여주는 스펙트럼 프로파일 창을 준수하십시오. 특히 자신의 최저 및 최고 값과 어떤 파장 그것에 대응의주의하세요.
- 주변 조직에 매우 밝은 상대, 쉽게 식별 입자 특히 있습니다 관심있는 지역을 클릭하여 양성 대조 샘플 조사를 조사합니다. 이 입자들은 교인이 될 가능성이 가장 높은특히 금속의 경우에 관심 IALS.
- datacube에 존재하는 입자를 식별하기 위해 "입자 분석"메뉴에서 "입자 필터"도구를 사용합니다. 새로운 팝업 창에서 "스펙트럼 맥스 초과해야"관찰한다. 이 단계 3.1.3에서 관찰에 의해 결정됩니다. 그것은 관심의 재료보다 배경 픽셀보다 더 높은, 그러나 낮은 있도록이 값을 설정합니다. "유효한 데이터 최대"최대 강도 (여기에, 16,000 단위)입니다.
- 기본값으로 다른 매개 변수를두고 있지만, "크기 임계 값"상자를 조절하여 크기에 따라 개체를 제외 할 수 있습니다. 어느 시점에서, 또는 분석을 실행 한 후,이 데이터를 저장한다. 이 실험을 위해, 다음과 같은 매개 변수를 사용합니다 스펙트럼 최대 초과해야합니다 : 5,000; 유효한 데이터 최대 : 16,000; 크기 임계 값 (픽셀) : 일단 모든 매개 변수가 설정 한 (400)는, "확인"을 클릭합니다.
- 의 세부 결과 그래프를 관찰표시된 강도 임계치 내에서 검출 된 입자; 이 데이터를 내보낼 수 있습니다. 관심 물질의 특성 최대 반사 파장이 알려져있는 경우, 유사한 "최대 WL"값을 갖는 이들 입자를 선택; 그렇지 않으면, "모두 선택"을 클릭합니다. 그런 다음 "내보내기"를 클릭; "받는 스펙트럼 라이브러리". 파일 이름이 다음 "확인"을 클릭 선택합니다.
- HSI 스펙트럼 프로파일 매트릭스 의존적이기 때문에, 실험 샘플과 같은 행렬에 포함되는 관심있는 물질을 포함하는 공지 된 양성 대조군을 선택.
- 거짓 양성 스펙트럼 제거
- 음성 대조군이 될 것입니다 샘플을 선택합니다. 이러한 샘플을 준비하고, 모든 실험 샘플 관심 물질과 유사하거나 동일한 나노 입자의 부재가 보증되는 저장과 같은 방법으로 처리 된 것이다.
주 : HSI 스펙트럼 프로파일 매트릭스 종속적으로 네거티브 컨트롤의 매트릭스는, 실험 샘플들의 행렬과 동일한 것이 중요하다. 이 연구를 위해, 우리는 음수로서 금속 산화물 나노 물질에 노출되지 않은 돼지의 피부를 이용통제 수단. - 초 분광 카메라를 사용하여, 단계 2.4.7에 설명 된대로 음성 대조군에서 여러 datacubes를 얻습니다. (이 일부 오염물은 기준 스펙트럼에있을 수 있다는 경우에 특히 중요하다) 적어도 하나가 필요하지만, 더 선택성을 증가시키기 위해 포착 될 수있다.
- 다음 단계의 지침에 따라 순차적으로 단계에서 캡처 3.2.2 (음성 대조군)을 각각 datacube에 대한 단계 3.1 (양성 대조군)에 수집 된 스펙트럼 라이브러리를 필터링 할 초 분광 이미징 소프트웨어를 사용하여
참고 : 별도의 파일로 생성, 필터링 된 스펙트럼 라이브러리를 저장하고 관심의 재료에 대한 기준 스펙트럼 라이브러리로 사용합니다.- 메인 프로그램의 도구 모음에있는 분석 메뉴에서 "필터 스펙트럼 라이브러리"를 클릭합니다. "열기"를 클릭; "새 파일"과 단계 3.1에서 만든 스펙트럼 라이브러리를 선택합니다. 입력 파일로 양성 대조군 용. "확인"을 클릭합니다.
- 전부xternal 소스, 스펙트럼 데이터 상자에서 "이미지"를 선택합니다. 가공 매개 변수 상자에서 기본 설정을 유지합니다. 필터링 라이브러리에 대한 출력 이름 (이 원본보다 달라야합니다, 또는 수집 된 원시 스펙트럼 라이브러리가 손실됩니다)을 선택합니다. "확인"을 클릭합니다.
- "열기"를 클릭; "새 파일"과는 소스 이미지를 선택하라는 메시지가 음성 대조군에 대한 단계 3.2.2에서 캡처 첫 번째 datacube을 선택합니다.
참고 :이 소프트웨어는 스펙트럼 라이브러리를 분석하고 음성 대조군 datacube의 스펙트럼을 일치하는 각 스펙트럼을 제거합니다. 선택 기준에서 배경을 제거하여 가양 가능성을 줄일 수 있습니다. 이 (이 요약은 자동으로 저장되지 않았 음을) 완료되면 요약 사용할 수 있습니다. - 단계 3.2.3.3 후 결과 (마지막으로 만든 필터링 된 스펙트럼 라이브러리를 선택, 단계 3.2.3.2 공동 : 추가 필터링이 필요한 경우를 제외하고, 단계 3.2.3.1에서 반복합니다.mpletes); 단계 3.2.3.3에서, 단계 3.2.2에서 다음 datacube을 선택합니다.
주의 : 샘플 광의 상당한 양 (예를 들면, 탄소 나노 튜브) 및 산란 경우 램프 스펙트럼 보정 및 정규화가 필요할 수 / 또는 음성 대조군에 대해 양성 대조군 스펙트럼 라이브러리를 필터링 할 때 제로 스펙트럼 남아 있으면. 이러한 상황은 우리의 연구에 대한 발생하지 않았고, 그래서이 보정이 수행되지 않았습니다.
- 음성 대조군이 될 것입니다 샘플을 선택합니다. 이러한 샘플을 준비하고, 모든 실험 샘플 관심 물질과 유사하거나 동일한 나노 입자의 부재가 보증되는 저장과 같은 방법으로 처리 된 것이다.
4. 이미지 분석
- 스펙트럼 각도 매핑
- 모든 실험 datacubes 단계 2.4 다음 인수 된 이후에 초 분광 이미징 소프트웨어를 사용하여 스펙트럼 메뉴, 매핑 방법 하위 메뉴에서 "스펙트럼 각도 매퍼"(SAM)를 엽니 다. 스펙트럼 각도 매퍼 기하학적 파장의 함수로서 세기의 변화를 분석하여 스펙트럼을 비교한다 (즉, 그 자신의 강도를 정규화하고 각이 다시 비교하여 두 스펙트럼을 비교각각의 스펙트럼의 그래프) (24)를 추적 quired.
- 열린 datacube으로, 팝업 창에서 실험 datacube의 이름을 선택하고 "확인"을 클릭합니다. 어떤 파일 이름이 나열되지 않으면, "열기"클릭 "새 파일", 실험 datacube을 선택한 다음 "확인"을 클릭합니다.
- Endmember 컬렉션라는 새로운 팝업 창을 준수 : SAM을. 다음 "스펙트럼 라이브러리 파일"을 선택, 메뉴 바에서 "가져 오기"를 클릭합니다. 이름 스펙트럼 라이브러리 입력 파일이 나타납니다 팝업 창. 단계 3.2.3에서 만든 기준의 스펙트럼 라이브러리를 엽니 다. "확인"을 클릭합니다. "입력 스펙트럼 라이브러리"라는 새로운 팝업 창을 준수하십시오.
- "모든 항목을 선택합니다"를 클릭; "확인"오른쪽 "색상"을 클릭하고 선택을 클릭합니다 "모든 기본 색상을 적용합니다."를 클릭 "적용"다음에 "모두 선택"후 출력 파일 이름을 선택"확인"을 클릭합니다 거라고. 스펙트럼 각도 매퍼는 데이터를 분석하고 저장하는 데 몇 초 정도 걸립니다.
- 초 분광 이미징 소프트웨어의 datacube를 엽니 다. 이미지 창의 오버레이 메뉴에서 "분류"를 선택하고 파일 이름을 탐색하고 "확인"을 클릭합니다. 사용자는 이제 이미지에 매핑 위치를 확인하기 위해 라이브러리에서 모든 스펙트럼을 중첩 할 수 있습니다.
- 단계 4.2에 설명 된대로 통일 된 색상이 (예 : 다른 소프트웨어에 의해 쉽게 분석으로, 필요한 경우, 이미지 창에서 오버레이 메뉴를 통해 열 "대화 형 클래스 도구"의 옵션 메뉴에서 "클래스를 병합"옵션을 선택합니다 .).
- (일반적으로 "분류"를 제외한 모든 목록 "클래스가베이스에 병합") 결합하고, "기본 클래스"목록에서 하나의 스펙트럼을 선택한 후 "확인"을 클릭하여 모든 분류를 선택합니다. 뜻이 지금 repres 그 색선택한 모든 스펙트럼을 ENT.
- 선택한 색상을 클릭하고 일치하는 모든 스펙트럼은 그 색상으로 표시됩니다.
- 기본적으로 검은 색입니다 "분류되지 않은"색상 상자, 검은 배경, cIick 이상 일치하는 스펙트럼을 보여줄 것이다 이색 이미지를 구하십시오. 이색 이미지를 관찰한다. 이 단계는 "분류되지 않은"색상 상자를 다시 클릭하여 반전 될 수있다.
- 마우스 오른쪽 버튼으로 모든 오버레이가 현재 활성화 포함, TIFF로 이미지를 저장합니다.
주 : 미래 촬상 처리의 경우, 이색 화상이 사용된다. - 매핑 통계를 얻기 위해 "대화 형 클래스 도구"창에서 옵션 메뉴에서 "클래스 배포"를 선택합니다. 이 데이터는 많은 픽셀 매핑되지 않은 (분류) 얼마나 많은 것은 관심있는 물질로 확인되었다 얼마나 나타냅니다. 화소 수가 매핑 입자의 개수와 일치하지 않는다. 이러한 정보는 자동 r에 아니다ecorded.
- 초 분광에서 입자 분석 이미지를 매핑
- NIH ImageJ에 소프트웨어의 이미지를 엽니 다.
- 하위 메뉴, "임계 값"기능을 조절, 이미지 메뉴를 사용합니다. 다른 모든 물질로부터 관심의 입자를 구별 매개 변수를 선택합니다. 이 연구를 위해 다음과 같은 임계 값 매개 변수를 사용하여 기본 임계 방법, 붉은 색, 색 공간 HSB, 어두운 배경 체크 박스, 색조, 채도 및 밝기에 대한 확인 통과 체크 박스를 확인했습니다.
참고 :이 사건의 경우에 상당히 다를 수 있습니다. 매핑 datacube를 분석 할 때, 이것은 하나의 색에 관련된 모든 클래스들을 통합 및 이미지 (4.1.8 4.1.4 단계)를 생성하기 전에 모든 색 분류 그 색을 중첩하여 단순화 될 수있다. - , 지역에 대한 정보를 검색 할 의미합니다 기능, 최소 및 최대 값을 "입자를 분석", Analyze (분석) 메뉴를 사용합니다. 크기 0 - 무한대, 원형이 연구를 위해, 여기에 매개 변수를 사용하여0-1, 쇼 아무것도, 결과를 표시 확인란을 선택.
- 통계적인 분석을 위해, 유사한 대조 시료에있는 입자의 개수와 크기를 갖는 통계적인 비교를 가능 다른 소프트웨어 프로그램이 데이터를 내보낼. 우리는 ImageJ에 데이터의 분석을 위해 스프레드 시트를 사용하는 것이 좋습니다. 단계 4.2.4 후 결과 테이블에 표시 데이터를 스프레드 시트에 복사해야합니다. AVERAGE 함수 입자의 평균 크기를 결정하는 영역 칼럼에서 사용될 수있는 반면 MAX 함수는, 입자의 개수를 결정하기 위해 제 (추천) 컬럼에 이용 될 수있다. 미래에, 실험적 검증이 (예를 들어, TEM)을 사이징 설정된 표준에 대하여 평균 크기를 결정하는데,이 기능을 조사하기 위해 추구한다.
Representative Results
하이퍼 스펙트 럴 현미경 측정법에 유사한 방식으로 물질을 식별하는 능력에 유용하다. 그림 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 재료는 여러 가지 특성 스펙트럼과 고유의 반사율의 전체 모양을 가지고 있습니다. 또한,도 1은 스펙트럼 정보의 매트릭스 - 의존 특성을 도시한다 : 조직 학적 조직 샘플에서 세 금속 산화물의 각각의 (상부 패널)에 대한 스펙트 럴 프로파일은 수성 현탁액의 3 금속 산화물 각각에 대한 스펙트 럴 프로파일 (상이한 하단 패널). 동일한 매트릭스 미지 시료에 분광 특성 정보를 매핑함으로써, 기술은 재료의 유무를 확인하는 데 유용하고, 또한 반 정량적으로 샘플 물질의 상대적인 양을 비교할 수있다.
양성 대조군 피부 샘플에서 생성 된 기준 스펙트럼 라이브러리는 실험에 매핑에 적합한피부 샘플. 도 2에 도시 된 바와 같이, 기준 스펙트럼 라이브러리 대응 양성 대조군 웰에 매핑하고 대응하는 음성 대조군에 매핑되지 않는다.
기술의 가장 중요한 장점은 샘플에서 관심 물질의 낮은 수준을 검출 할뿐만 아니라, 오염물들을 구별 할 수있는 능력이다. . 예를 들어, 개별 나노 튜브는 20~30g 쥐 25에서 40 μg의 낮은 용량의 흡입시 폐에서 관찰 할 수있다 그림 3이 조직 학적 피부 샘플을 보여줍니다 일부 입자가 암시 야 광학 이미지에서 쉽게 명백한 반면 (열을 2) 나머지는 명 시야 현미경 (컬럼 1), 또는 다른 방법을 사용하여 누락되었을 수있는 하이퍼 스펙트 럴 영상 (컬럼 3)를 사용하여 검출된다. 암시 야 HSI의 사용은 단순 시야 현미경 위에 특이성을 향상시키는 역할을한다. 이러한 이미지는 다음, 분석의 더 정량적 형태의 대상이 될 수 없음ImageJ에 통해 otably 입자 분석.
향상된 암시 야 현미경 심지어 하이퍼 스펙트 럴 이미징 부재에서 여러 가지 응용을 갖는다. 첫번째 품질 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 능력이다. 이 가장 잘되는 관심의 입자는 그들의 시야 대응에 비해 쉽게 식별하고, 그림 3에 의해 입증된다. 하이퍼 스펙트 럴 매핑의 부재 하에서,주의가 관심 입자로부터 오염물 입자 혼란을 방지 할 필요가 있지만 이들 이미지는 또한, 입자 정량 분석의 대상이 될 수있다.
스펙트럼 라이브러리 (서스펜션의 나노 입자)에 비해 그림 1 참조 스펙트럼 라이브러리 (조직 매트릭스). 이 도면은 유모으로부터의 기준 스펙트럼 라이브러리를 생성하는 것의 중요성을 보여준다실험 샘플과 같은 행렬에 대한 관심이 omaterials. 첫 번째 행이 연구 (알루미나, 실리카, 세리아)의 각 물질에 대한 기준 스펙트럼 라이브러리 (RSL)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 RSL은 양성 대조군 조직 샘플을 음성 대조군 조직 샘플에 대해 여과하고이 프로토콜에 기재된 방법에 의해 만들어졌다. 두 번째 행은 유리 슬라이드에 액체 현탁액에 대한 관심의 나노 입자에서 생성 된 스펙트럼 라이브러리 (SL)를 보여줍니다. 더 곡선 덜 특유의 피크가 약 650의 파장에서 약 600 실리카, 피크에서 알루미나 순이익 서스펜션 SL에서 관찰되었다 반면, 알루미나를 들어, 500과 650의 파장에서 바이 모달 피크, RSL에서 발견했다 더 곡선 덜 특유의 피크가 arou에 실리카 순이익 서스펜션 SL에 보였다 반면, RSL에 존재덜 특유의 피크가이 국민 연금이 포함 된 행렬이 만들어 제안하는 것이 주변 (560)에 세리아 순이익 서스펜션 SL에서 관찰되었다 반면 차 세리아를 들어 600은 바이 모달 피크, RSL 520과 620의 파장에서 발견되었다 특정 실험에 대한 SL을 만들 컨트롤을 선택할 때 상당한 될 수 있습니다 스펙트럼의 변화.
그림 2. 참조 스펙트럼 라이브러리 (조직 매트릭스) 양성 대조군과 음성 대조군 돼지 피부 조직에 매핑. 각 RSL (왼쪽 열)의 대응 양성 대조군 (가운데 열)에 잘 매핑과는 음성 대조군 (오른쪽 열)에 대응에 매핑되지 않는다는 점에서이 그림은., 실험 샘플 매핑에 맞게 RSL에 확인 역할을 하십시오 시간을 클릭감수는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
금속 산화물 나노 입자에 노출 실험 돼지의 피부 조직의도 3 초 분광 매핑. 각각 표피, 진피, 피하 조직 : 위에서 아래로 행은 다른 표면에서 깊은 층에 피부의 층에 해당합니다. 첫째 행은 현탁액 중의 알루미나 NP에 노출 된 피부 샘플로부터 표피의 각질층을 나타낸다 두 번째 행은 서스펜션에 NPS를 대 실리카에 노출되었다 세 번째 행은 서스펜션에 NPS를 산화 세륨합니다. 각 열은 다른 이미징 기술과 피부의 동일한 영역을 나타낸다. 첫 번째 열은 빨간색 사각형으로 둘러싸인 영역이 확대 된 시야 현미경 (40X 잡지; 스케일 바 = 50 μm의)에 해당 (100X 잡지, 스케일 바 = 10 μm의) 강화 암시 야 현미경과 (EDF흰색 화살표가 높은 콘트라스트 된 NP를 가리키는 두 번째 열에서 M). 세 번째 열은 같은 고 대비 NP에 (흰색 화살표)를 보여, 하이퍼 스펙트 럴 카메라 (HSI)를 얻었다. EDFM 및 HSI 이미지는 100 배의 배율로 찍은; 스케일 바는 10 μm의 =. 네 번째 열은 알루미나 된 NP는 녹색, 빨간색 실리카 NP에, 그리고 세리아 NP에 표시됩니다 각 노출 그룹에 대한 각각의 RSL에 대해 매핑 HSI 이미지를 보여줍니다 노란색, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
종래의 조직 학적 염색법, 금속 산화물 나노 입자의 식별 및 분석을받은 조직 샘플은 EDFM, HSI 매핑, 및 영상 분석 기술들의 조합을 통해 달성 될 수있다 들어. 그것은 샘플 최적 시각화 50-10 ㎛의 두께로 절단하는 것이 중요하다; 조직학 또는 면역 조직 샘플 준비 유연성 (얼룩의 타입 등, 고정 또는 고정 된 조직을 사용하여)이 존재한다. 여기에 사용 된 시료를 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색하고 coverslipped, 유리 현미경 슬라이드에 장착, 포르말린 고정 파라핀 이전 6 ㎛의 두께로 회전하는 마이크로톰으로 절편을했다. 생체 외 피부 침투 독성 협력에서 돼지 피부 조직은 본 연구에 사용 하였다. 조직은 수성 현탁액에서 금속 산화물 나노 입자 (알루미나, 실리카, 세리아)에 노출시켰다. 관심 영역 (들)의 검출 (고 대비 eleme국세청) EDFM 후속 HSI 매핑 및 분석을 용이하게하는 중요한 첫 번째 단계입니다. 양성 및 음성 대조군 샘플 이미징 및 참조 용 스펙트럼 라이브러리를 만들기 위해 먼저 분석해야한다. 양성 대조군에서 수집 된 스펙트럼은 양성 대조군 스펙트럼 라이브러리에 수출하고 있습니다. 그리고, 음의 제어 화상의 모든 스펙트럼 특이성을 개선하기 위하여 양성 대조군의 스펙트럼 라이브러리로부터 감산된다 (위양성을 감소). 결과 필터링 스펙트럼 라이브러리는 관심 물질의 분석을 위해 제공하는 RSL 간주됩니다. 모든 조직 샘플은 동일 화상 형성 공정을 거치며 RSL 대해 매핑된다. 결과 이미지는 검은 배경 위에 관심의 요소와 영역 만 포함됩니다. 이 이미지는 다음 ImageJ에 시야 당 매핑 입자의 영역을 획득하기 위해 임계 값과 입자 분석 기능을 사용하여 분석 될 수있다. ImageJ에 얻은 수치 데이터를 수출 할 수있다추가 분석을 위해 스프레드 시트로 에드.
이는 생물학적 시료가 서로 본질적으로 다르며, 염색 방법 EDFM과 HSI 통해 시각화에 영향을 미칠 수 있으므로, 노출 설정은 시료의 특정 유형에 대한 가장 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 것에 따라 결정되어야 함을 고려하는 것이 중요하다. 오탐 (false positive)의 감소가 스펙트럼 라이브러리를 여과를 통해 달성 될 수 있지만,이 오염에 대응하는 스펙트럼 잠재적 양성 대조군의 스펙트럼 라이브러리에서 필터링 될 수 있으므로, 그것은, 관심있는 요소의 오염을 회피 한 신뢰성있는 음성 대조군을 얻기 위해 매우 중요 , 위음성 율을 증가시킨다. SP를 생성 축적 된 입자의 수가 높은 영역 : 또한, 하이퍼 스펙트 럴 이미징 소프트웨어와 검출 가능한 스펙트럼 강도 범위가 특정 소프트웨어의 한계 능가 없다 (본 연구를위한, 즉 16000 단위이다)강도 한도 이상의 ectral 강도 인해 위음성의 수를 증가의 위험, 스펙트럼 라이브러리에서 제외된다.
HSI 시스템은 기존의 방법에 비해 많은 장점을 부여하지만, 고려해야 할 몇 가지 단점과 한계가 있습니다. 하나는 상당한 컴퓨팅 성능을 요구할 수의 수집 된 광 데이터 다량있다. 또 다른 기준 스펙트럼 라이브러리가 생성 될 때 HSI는 특히 초기 단계에서 시간이 많이 될 수 있다는 것이다. 또한, 촬영 시간은 간단한 암시 야 영상보다가 느리게 만들고, 이미지 캡처 당 몇 분을 필요로 할 수있다 그러나, 여전히 전자 현미경에 의해 샘플 준비 및 시각화를 수행하는 것보다 더 빠르다. 또한, 복잡한 시스템은 매우 전문화 제어의 개발을 필요로하고 26 어려운 표준화 보편적 기준 라이브러리의 구축을 여러 특성 스펙트럼을 초래할 수있다. 최종적으로, 첨단개별 원자를 해결할 수있는 등의 원자력 현미경 또는 투과 전자 현미경과 같은 프로브 - 또는 전자 현미경 기법보다 낮은 해상도에서 nique 결과. 이 기술의 해상도로 인해 나노 미터 수준에서 정확하게 또는 서브 미크론 수준에서 물질을 찾기위한 입자 크기를 측정하기위한 고정밀 공구 할 수없는 성질의 광자, 제한된다. 기술은 특정 조직 구획 또는 세포 소기관 내에서 입자를 정확하게 지적 할 수 있지만 (예 : 세포 핵 등)보다 1 ㎛, 작은 세포 기관 또는 기능은이 방법으로 정확하게 시각화하기 위해 도전하고 있습니다. 또한 공간 해상도 주어진 참고,의,이 방법은 단일 나노 입자 덩어리 (11)를 구별 할 수 없습니다.
기타 고려 사항은 다음과 같습니다 (예 : 귀금속 등) 특정 재료들을 쉽게 analy 할 수 있도록 할 수있는, 훨씬 더 높은 반사율과 별개의 스펙트럼 프로파일이ZE이 도구를 사용하여 스펙트럼지도. 같은 반 금속이 연구에서 조사 산화물과 탄소 기반 나노 물질 24, 27와 같은 다른 사람들은 그들의 원소 조성, 형상에 더 도전, 그리고 매트릭스에 따라 수 있습니다. 머서 의해 외. 두 뮤린 흡입 연구에서, 본 연구에 사용 된 것과 유사한 시스템이 폐와 주위 조직과의 현저하게 높은 콘트라스트 차에 기초하여 장기에 탄소 나노 튜브를 찾기 위해 사용 하였다. 탄소 섬유의 형상은 고유 식별을위한 충분한 특성이었다 때문에, 하이퍼 스펙트 럴 매핑은, 어느 연구 것으로 입증되지 않았다. 정상적인 생물 물리학 적 과정을 통하여 특정 장기에 관심 나노 입자를 증착하는 단계 (그리고 종종 그 자체 연구 주제) 예측할 수 있기 때문에, 적용 양성 대조군의 결정이 어려울 수 있으며, 상기 제어 m의 방법 생성을 고려를 요구한다 : 또 다른 고려 사항은 조직 특이 관한관심 물질의 상태에 영향을 ight. 스펙트럼 라이브러리는 관심 깨끗한 나노 입자에서 생성되는 경우, 예를 들어, 인한 변화에 따른 예를 들어 입자 (의 변화로 인한 스펙트럼 변화에 조직 또는 세포에서와 같은 나노 입자 라이브러리를 매핑하기 어려울 수있다 산도, 용해, 응집, 단백질 결합) 및 전체 미세 또는 매트릭스. 마지막으로,이 기술은 그 반 정량적 자연 제한된다 : 그것은 단지 쉽게 그러한 재료의 전체 장기 부담을 특징으로 작업을 수행 할 수 없음을 의미 유사한 해상도, 다른 이차원 현미경 기술로 정량 할 수있다.
전반적 EDFM 및 HSI는 TEM, HAADF 및 DIC 같은 종래 나노 이미징 특성화 기술에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. EDFM / HSI 더 집중적 편의에 비해 시간과 비용을 절약 빠른 이미지 획득 및 분석을 허용적인 기술. 또한 EDFM / HSI 용 샘플 준비 시간을 절약하고이어서 다른 기술에 사용될 수 있기 때문에, 또한 주어진 샘플의보다 유연한 분석을 허용하는 일반적으로 최소 및 비파괴 모두이다. 또한, HSI 많은 조성물의 나노 물질의 분석 및 행렬의 다양한 있도록 다재다능하다. 연구팀은이 기술의 특이성에 대한 심층적 인 평가를 포함한 기타 자료 및 샘플 유형, 여기에 기술 된 방법을 구체화하기 위해 노력하고 있습니다. 연구팀의 조사에서 중요한 다음 단계는 기존의 골드 표준에 대한 이러한 기술 검증 (예, 라만, TEM, SEM) 재료와 관심의 조직 유형.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x 1.45 mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
References
- Sun, W., et al. Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy. Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).
- Anselme, K., et al. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).
- Anshup, A., et al. Growth of gold nanoparticles in human cells. Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).
- Weinkauf, H., et al. Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae. Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).
- Sondi, I., et al. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria. J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).
- Berry, C. C. Possible exploitation of magnetic nanoparticle cell interaction for biomedical applications. J Mater Chem. 15 (5), 543-547 (2005).
- Chithrani, B. D., et al. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein coated gold nanoparticles of different sizes and shapes. Nano Lett. 7 (6), 1542-1550 (2007).
- Chithrani, B. D., et al. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6 (4), 662-668 (2006).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV 1. J Nanobiotechnol. 3 (6), 1-10 (2005).
- Carlson, C., et al. Unique cellular interaction of silver nanoparticles size dependent generation of reactive oxygen species. J Phys Chem. 112 (43), 13608-13619 (2008).
- Roth, G. A., et al. Hyperspectral microscopy as an analytical tool for nanomaterials. WIREs Nanomed Nanobiotechnol In Press. , (2015).
- Williams, P., et al. Maize kernel hardness classification by near infrared (NIR) hyperspectral imaging and multivariate data analysis. Anal Chim Act. 653 (2), 121-130 (2009).
- Ziph Schatzberg, L. Hyperspectral imaging enables industrial applications. Industrial Photonic. , (2014).
- Sun, D. W. Hyperspectral imaging for food quality analysis and contro. , Elsevier. (2010).
- ElMasry, G., et al. Hyperspectral imaging for nondestructive determination of some quality attributes for strawberry. J Food En. 81 (1), 98-107 (2007).
- Mortimer, M., et al. Potential of hyperspectral imaging microscopy for semi quantitative analysis of nanoparticle uptake by protozoa. Environ Sci Techno. 48, 8760-8767 (2014).
- Sarlo, K., et al. Tissue distribution of 20 nm 100 nm and 1000 nm fluorescent polystyrene latex nanospheres following acute systemic or acute and repeat airway exposure in the rat. Toxico. 263, 117-126 (2009).
- Husain, M., et al. Pulmonary instillation of low doses of titanium dioxide nanoparticles in mice leads to particle retention and gene expression changes in the absence of inflammation. Toxicol Appl Pharmacol. 269, 250-262 (2013).
- Meyer, J. N., et al. Intracellular uptake and associated toxicity of silver nanoparticles in Caenorhabditis elegan. Aquatic Toxicol. 100, 140-150 (2010).
- Badireddy, A. R., et al. characterization and abundance of engineered nanoparticles in complex waters by hyperspectral imagery with enhanced darkfield microscopy. Environ Sci Technol. 46 (18), 10081-10088 (2012).
- Dettmeyer, R. F. Staining techniques and microscopy Forensic histopathology fundamentals and perspectives. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. vol 26 issue 453 370 (2011).
- Titford, M. Progress in the development of microscopical techniques for diagnostic pathology. J Histotechnol. 32 (1), 9-19 (2009).
- Kumar, G. L. Special stains and H&E. , Dako North America. Carpinteria, California. (2014).
- Manolakis, D., et al. Hyperspectral image processing for automatic target detection applications. Lincoln Laboratory Journal. 14 (1), 79-116 (2003).
- Mercer, R. R., et al. Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi walled carbon nanotubes. Part Fibre Toxicol. 8 (1), 21 (2011).
- Kim, M. S., et al. Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety. T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Part Fibre Toxico. 10 (1), 38 (2013).
