Identifiering av Metal Oxide Nanopartiklar i histologiska prov av Enhanced Darkfield mikroskopi och Hyperspektrala Mapping

Introduction

Eftersom nanomaterial används alltmer i en mängd olika branscher och applikationer, det finns ett behov av nanoskala imaging och karakteriseringsmetoder som är snabbare, billigare, och bekvämare än traditionella metoder, såsom elektronmikroskopi. Att visualisera nanopartiklar (NP) interaktioner med celler, vävnader och levande system, många optiska tekniker har använts, inklusive differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi ¹ och försvinnande fältbaserade metoder, såsom total inre reflektion (TIR) ​​eller nära- fält scanning optisk mikroskopi (NSOM) ^2,3. Men dessa är high-end analytiska metoder, utom räckhåll för de flesta icke-specialiserade laboratorier ^4. Elektronmikroskopi, inklusive transmissionselektronmikroskop (TEM), har också använts för att studera NP interaktion med celler ^5,6,7,8. Hög vinkel ringformig mörkfält (HAADF) svep transmissionselektronmikroskopi har använts för att studera interaktionen av NPSmed virus ^9. Konfokalmikroskopi är en annan populär teknik som används för att studera NP-cell-interaktioner ^10.

Under de senaste åren, har mörkfältsbaserade hyperspektral avbildning (HSI) tekniker använts som ett lovande analytiskt verktyg för att studera NP i biologiska matriser ^11. HSI system genererar en tredimensionell representation av rumsliga och spektraldata, känd som en hyperkub eller datacube ^12. Den rumsliga karta över spektral variation används för materialidentifiering. Kan genereras spektrala profiler för kända material och används som referensbibliotek för jämförelse med okända prover. En av de stora fördelarna med HSI-system är dess förmåga att kombinera avbildning med spektroskopi, varigenom läget och distribution av okända NP in vivo eller ex vivo samt koppla dem till en annan referens partikel av kända, liknande sammansättning.

Det finns flera fördelar medanvänder HSI-system jämfört med konventionella avbildningstekniker: minimal provberedning krävs, provberedning är typiskt icke-förstörande i naturen; bild förvärv och analys är snabbare, tekniken är kostnadseffektiv ^13; och den geografiska fördelningen och analys av föreningar med blandad sammansättning och / eller i komplexa matriser lättare uppnås ^14.

För nanomaterial forskning som innefattar värdefulla prover, en av de viktigaste faktorerna är att det finns en icke-förstörande avbildningsmetod, som gör det möjligt för den potentiella upprepade gånger undersöka prover från en eller flera metoder. Upprepad eller flera analyser kan vara önskvärt att utveckla omfattande datamängder som inte skulle vara tillgängliga från en enda metod. I detta avseende, studera dess optiska egenskaper är det säkraste sättet att analysera provet. Genom att använda en förbättrad mörkfält mikroskop (EDFM) och HSI system för att studera det optiska svaret hos provet - nämligen Reflectance, men också Absorbans och transmittans - funktion identifiering och karakterisering kan utföras ^15. Potentiella karakterisering endpoints innehålla en bedömning av relativ storlek och form av nanopartiklar eller agglomerat och distribution av nanopartiklar inom ett prov.

I detta dokument beskriver vi kartläggningsmetoder speciellt för metalloxid nanopartiklar i obduktionsvävnad med hjälp av en HSI system baserat på en pixel-spektral match algoritm kallas en spektral vinkel mapper (SAM). Vi valde detta särskilt ansökan eftersom den har potential att komplettera nuvarande och framtida in vivo nanotoxikologi forskning, där djurmodeller används för att utvärdera konsekvenserna för hälsan av exponering för konstruerade nanomaterial. Tillämpning av denna metod kan också informera nanoskala läkemedelsavgivning forskning som utnyttjar vävnads- eller djurmodeller. I synnerhet nanopartikel absorption, distribution, metabolism och utsöndring under hela organs och vävnader kunde undersökas med detta system. Ett stort antal olika tillämpningar undersöks för användning inom biomedicinsk forskning ^11.

Denna metod skulle kunna användas för bedömning av olika biologiska prover (såsom olika vävnader typer, bronkoalveolär sköljprover och blodutstryk) som har exponerats för nanopartiklar av en mängd olika elementära kompositioner ^16-19. Dessutom är denna metod användbar för att studera nanopartikel biofördelning in vivo och in vitro, vilket är relevant för nanoskala läkemedelsadministreringsstudier ^11. Bortom biologiska prover, kan EDFM och HSI användas för att utvärdera nanopartiklar i miljöprover, till exempel avloppsvatten ^20. Yrkes- exponeringsbedömning kan underlättas genom användning av denna teknik också, eftersom det kan användas för att utvärdera effekten av personlig skyddsutrustning för att förhindra nanopartiklar penetration. Vidare forskning team utvecklar för närvarande ett liknande EDFM och HSI protokoll för utvärdering av filtermedia prover av nanopartiklar som samlats in från bedömningar hygieniska. Även om framställningen av dessa olika provtyper för EDFM och HSI kan variera, är det viktigt att de är beredda på ett sådant sätt att de lätt kan visualiseras genom det optiska systemet. Normalt bör provet framställas som om det skulle visualiseras via traditionell bright mikroskopi. Det finns flera hyperspektral bildsystem kommersiellt tillgängliga ^11.

Protocol

Djur protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid utredarnas samarbeta institution, Stony Brook University. En lista över särskilda material och utrustning som används för detta dokument återfinns i tabell 1.

1. Provframställning av vävnader

1. Förbered djurvävnader utsätts för metalloxidnanopartiklar för histologisk eller immunhistokemisk färgning enligt tidigare beskrivna metoder ^21-23.

2. Imaging

1. Initiera mikroskop
   OBS: För denna studie var en forskningskvalitet mikroskop används, utrustad med en högpresterande mörkfält ljuskälla, motoriserade XY skede controller, 14-bitars djup hyperspektral kamera, och flera objektiv (10X luft, 40X luft, 100X oljeimmersion) . Systemet som används här har en 64 nm spatial upplösning på 100X (oljeimmersions) förstoring. Kondensorn används för denna tappy har både Koehler och kritiska belysningsfunktioner och fokuserar en mycket kollimerat ljus vid sneda vinklar på provet.
   1. Koppla in och slå på ljuskällan, XY skede controller, optisk kamera (för mörkfält imaging), hyperspektral kamera och dator. Ställ ljuskällan till 75% effekt; höja scenen till maximal höjd; ansluta ljusledaren till kondensorn för ökad mörkfält avbildning eller till kollimatorn på baksidan av mikroskopet för reflekterande bright avbildning.
      OBS: Genom att ställa in ljuskällan till 75% effekt, det finns tillräckligt, jämn belysning av alla bildpunkter inom hela synfältet som förstärker duller pixlar samtidigt tillåta för kontrasten mellan tråkig och ljusa pixlar.
   2. Höj kondensorn till driftläge. Applicera 3-5 droppar av typ-A immersionsolja på kondensorlinsen försiktigt, undvika bildandet av eventuella bubblor. Torka bort oljan och återanvända det, om bubblor skulle bildas.
   3. Placera glid on scenen. Sakta höja kondensorn tills immersionsoljan kommer i kontakt med sliden. Detta kommer att märkas genom den snabbt ljusare ringen belysnings där oljan kommer i kontakt med sliden.
2. Placera 10X objektivet på plats. Fokus och justera kondensorn genom att undersöka genom okularen.
   1. Flytta scenen upp och ner via grova målet fokusratten tills ljusstyrka maximeras.
   2. Flytta kondensorn fokus upp och ner via kondensorn justeringsratten tills maximal ljusstyrka hittas. Försök att skapa den ljusaste centralt läge möjlig i synfältet.
   3. Rikta in rattarna behov kondensor för att centrera ljuspunkt, om det behövs.
   4. Använd den fina mål fokus ratten för att föra ljuspunkt i fokus. Vid byte mål att få en annan förstoring, justera fokus planet. Vid användning av 100X målet, tillämpa en droppe immersionsolja över täck att förbättra the bild och undvika skador på objektivet.
3. Fånga bilder
   1. Använd stadium kontrollen för att hitta ett område av intresse. Denna region kommer att avgöras av behoven av experimentet. En typisk indikator kommer att vara hög kontrast med omgivande regioner, som områden fylls av metalloxid nanopartiklar verkar ofta ljusare än områden utan dem.
   2. Ta regionen i fokus med den fina objektiv fokuseringsvredet, justera kondensorn fokus som krävs för att jämvikt belysning. Uppnå en hög kontrast, väldefinierad region inom synfältet.
   3. Bestäm vilka bilder (för optisk kamera) eller datacubes (för hyperspektrala kameran) kommer att fångas, och i vilken ordning. Normalt är optiska bilder erhålls med en 10X luft mål 40X luft mål och 100X oljeimmersionsobjektiv och en motsvarande HSI datacube med en 100X olja immersionsobjektiv.
      1. Öppna den optiska bildprogram. Klicka på "Inställningar &# 8221; i menyraden. Välj "Bildinsamling Knapp för capture händelse". Välj den lagrade bildformatet (TIFF användes för detta experiment); tilldela ett filnamn; bläddra och välja en sparad mapp bild; hålla standard Timelapse; klicka på "OK".
      2. Välj exponeringsinställningar som skapar den högsta kontrastbilden i menyn "Exposure" (för denna studie, en nivå på 0,0%, vinst på 3,0 dB, och slutare 35 ms användes).
      3. Ta bilden genom att klicka på "Bild" i menyraden. Fånga flera lågförstorande mörkfältsbilder i tillägg till de som löper hög förstoring genom att ändra mikroskop mål, i syfte att ge sammanhang.
         OBS: Fånga optiska bilder på samma förstoring som alla datacubes som ska fångas med hyperspektrala kameran, eftersom dessa optiska bilder tenderar att ha en större synfält och bättre estetiskt utseende för senare visuell inspektion. Det är viktigt att alla DATACubes som senare kommer att spektralt analyserade användning konsekvent förstoring, eftersom det är möjligt att ändra målet kommer att ändra transmissionsspektra av mikroskopoptik, ändra den infångade spektra, och därmed minska noggrannheten hos den spektrala vinkeln avbildaren (SAM). Om en datacube jämförs med en annan datacube erhålls med ett annat mål, kan SAM funktionen inte fungerar.
   4. Välj hyperspektral kamerabilddetektor genom att styra ljuskällan ratten på mikroskopet till hyperspektrala kameran. Om ljuset riktas mot hyperspektrala kameran, kommer ingen bild att visas i den optiska kameraprogrammet. Minimera men stäng inte optiska bildprogram fönster, som man kan behöva det som anges i steg 2.4.4.
4. Fånga Datacubes
   1. Öppna hyper bildprogram för förvärv av HSI datacubes. Se till ljusledaren riktas mot hyperspektrala kameran.
   2. Öppna "Hyperspectral Mikroskop "i menyraden och välj" HSI Mikroskop Controls ".
   3. Ställ in objektivförstoring och spara banan. Se till att namnge alla bilder och filer tydligt så att ingen överskrivning sker. Ändra område fånga i inställningarna genom att justera synfältet eller antal linjer (använd 720 linjer för denna studie), med en betydande mängd extra tid som krävs för att fånga större områden. Slutligen ställer du in exponeringstiden (0,25 sek för denna studie). Lämna allt annat till standard, och klicka på "Preview HSI" för att visa bilden.
      Obs: Intensiteten graf som visas visar HSI datacube som kommer att spelas på den horisontella axeln. Den vertikala axeln representerar våglängderna spektra som kommer att fångas i HSI datacube. Placera markören på valfri position på intensiteten grafen motsvarar en spektral våglängd orsakar intensitet för alla punkter över bilden, vid denna våglängd, som ska visas.
   4. Justera intensiteten från förhandsvisningen genom att justera käll ljusstyrka, kondensor fokus, eller genom att avbryta förhandsgranskningen för att justera exponeringstiden. Den senare ger de bästa resultaten, men ökade exponeringstiden kan ta längre tid att bilden. Målet är att de mer signifikanta toppar vara tillräckligt stor, men inte överstiger den högsta tillåtna stödnivån för detektorn; här är den ideala intervallet mellan 1.000 och 16.000 enheter.
   5. Klicka på "fånga". Mikroskopet kommer att be att ta en mörk aktuell bild. Omdirigera övre glidstång eller öppning (försiktigt, för att inte störa uppriktningenoch fokus för någon av de andra optik), och klicka på "OK". Återställ reglaget eller öppning i rätt läge och klicka på "OK" igen när uppmaning att bilden visas. Imaging kan ta upp till 30 minuter, även om tider av ca 5 minuter är mer typiska. Längre exponeringstider leder till längre avbildningstider. En förloppsindikator är närvarande. Var noga med att inte fysiskt störa omfattning innan förloppsindikatorn är klar.
   6. Observera fyra nya fönster med namnen: "Tillgängliga band listan", "# 1zoom", "# 1scroll" och "# 1 RGB band". Maximera "# 1RGB band" fönster eftersom detta är den datacube för alla framtida referenser.
   7. Högerklicka på datacube och spara den som en TIFF och klicka på "OK". Om färdig bildbehandling; lägga undan alla prover; rengöra alla olje exponerade ytor med 70% isopropanol i vatten; höja scenen till maximal höjd; lägre kondensorn minimihöjd och tryck till icke-operativ position, stänganer eller koppla ljuskällan, scen controller och kameror.

3. Upprättande av referens Spectral bibliotek

1. Val av referensspektra
   1. Välj en positiv kontroll som är känd för att innehålla materialet av intresse som finns i samma matris som de experimentella proverna, eftersom HSI spektrala profiler är matrisberoende.
      1. För denna studie använda grishud injiceras med höga doser av metalloxid nanopartiklar som positiva kontroller för jämförelse med experimentella grishud vävnad från en aktuell exponering studie. De spektrala profilerna för metalloxidnanopartiklar i suspension genererades och undersöktes och befanns vara en olämplig positiv kontroll för de histologiska experimentprover på grund av de olika matriserna.
   2. Skaffa en datacube från den positiva kontrollen som beskrivs i steg 2.4., Med hjälp av hyperspektrala kameran.
      1. Var särskilt försiktig när setting intensiteten, eftersom detta är den primära variabeln genom vilken den inre partikelfiltret kommer att identifiera de material. Eventuella intensiteter över mättnadspunkten för detektorn (här, 16.000 enheter) kommer att resultera i ogiltiga data (se steg 2.4.5.).
   3. Högerklicka i bildfönstret, och vänsterklicka "Z-profil spektrum". Ett pop-up Spectral Profile fönster visas. Vänsterklicka på bildpunkter av intresse på datacube, särskilt de ljusaste och kära eller de som kan tryggt identifieras som representerar material av intresse. Observera Spectral Profile fönster som visar den tillhörande spektrumet. Notera särskilt deras lägsta och högsta värde och som våglängd motsvarar den.
      1. Vid undersökning av positiva kontrollprov, undersökning genom att klicka på områden av intresse som är mycket ljus i förhållande till den omgivande vävnaden, särskilt de med lätt identifierbara partiklar. Dessa partiklar är mest sannolikt att vara den materIALS av intresse, särskilt i fråga om metaller.
   4. Använd "Partikelfilter" verktyg under menyn "Particle Analysis" för att identifiera partiklar i datacube. I den nya pop-up fönster, observera "Spectral Max måste överstiga". Detta kommer att bestämmas av iakttagelser i steg 3.1.3. Ställ in detta värde så det är högre än bakgrundspixlar, men lägre än de material av intresse. Den "Valid Data Max" är den högsta nivån (här, 16.000 enheter).
      1. Lämna andra parametrar till standard, men exkluderar objekt baserat på storlek genom att justera "Size Threshold" rutan. Spara dessa uppgifter antingen vid denna tidpunkt, eller efter att ha kört analysen. För detta experiment, använda följande parametrar: Spectral Max överstiga: 5000; Gäller Data Max: 16000; Storlek Threshold (pixlar): 400. När alla parametrar har ställts in, klicka på "OK".
   5. Notera vilken grafen med uppgifter ompartiklar upptäckts inom den angivna intensitetströskel; dessa data kan exporteras. Om den karakteristiska maximala reflektionsvåglängd av materialet av intresse känd, välja ut de partiklar som har en liknande "Max WL" värde; annars klickar du på "markera alla". Klicka sedan på "Export"; "Att Spectral Library". Välj ett filnamn och klicka sedan på "OK".
2. Ta Falskt positiva Spectra
   1. Välj ett prov som kommer att fungera som en negativ kontroll. Ett sådant prov skulle ha upprättats och behandlas på samma sätt som alla experimentella prover sparar att frånvaron av nanopartiklar som liknar eller är identiska med materialet av intresse garanteras.
      OBS: Det är viktigt att matrisen av den negativa kontrollen är densamma som matrisen av de experimentella proverna, som HSI spektrala profiler är matrisberoende. För denna studie använde vi grishud som inte utsattes för metalloxidnanomaterial som negativakontroller.
   2. Skaffa flera datacubes från den negativa kontrollen som beskrivs i steg 2.4.7, med hjälp av hyperspektrala kameran. Åtminstone en krävs, men mer kan fångas för att öka selektiviteten (detta är särskilt viktigt i den händelse att någon kontaminant kan vara i referensspektra).
   3. Använd hyper bildbehandlingsprogram för att filtrera den spektrala bibliotek samlas i steg 3,1 (positiv kontroll) mot varandra datacube fångas i steg 3.2.2 (negativa kontroller) seriellt, enligt anvisningarna i följande steg:
      OBS: Spara den resulterande, filtreras spektral biblioteket till en separat fil, och använda som referens spektrala bibliotek för materialet av intresse.
      1. Klicka på "Filter Spectral Library" under Analys menyn, som ligger på huvudprogrammet verktygsfältet. Klicka på "Öppna"; "Ny fil" och välj den spektrala bibliotek skapade i steg 3.1. för den positiva kontrollen som inmatningsfilen. Klicka på "OK".
      2. FrämreXterna källa, välj "Bild" under Spectral rutan Data. Håll standardinställningar under behandlingsparametrar rutan. Välj en utgång namn för filtrerad Library (detta skulle vara annorlunda än originalet, eller den råa spektrala bibliotek samlas in kommer att förloras). Klicka på "OK".
      3. Klicka på "Öppna"; "Ny fil" och välj den första datacube fångas i steg 3.2.2 för den negativa kontrollen, när du uppmanas att välja en källbild.
         OBS: Programmet kommer att analysera den spektrala biblioteket och ta bort varje spektrum som matchar alla spektrum av den negativa kontrollen datacube. Ta bort bakgrunden från urvalskriterierna minskar därmed risken för falskt positiva. En sammanfattning kommer att finnas tillgängliga när detta görs (observera att denna sammanfattning inte sparas automatiskt).
      4. Om ytterligare filtrering önskas, upprepa från steg 3.2.3.1, utom steg 3.2.3.2, välja den senaste filtrerade spektrala bibliotek som skapats (vilket resulterar efter steg 3.2.3.3 co.mpletes); i steg 3.2.3.3, välja nästa datacube från steg 3.2.2.
         OBS: Korrigera och normalisera för lampan spektrum kan behövas om prover sprider en avsevärd mängd ljus (t.ex. kolnanorör) och / eller om noll spektra kvar när filtrering av en positiv kontroll spektral bibliotek mot en negativ kontroll. Dessa omständigheter inte uppstå för vår studie och så denna korrigering inte utfördes.

4. Bildanalys

1. Spectral Vinkel Kartläggning
   1. Öppna "Spectral Angle Mapper" (SAM) från Spectral menyn Mapping Methods menyn, med hjälp av hyper bildprogram när alla experimentella datacubes har uppnåtts efter steg 2.4. Den spektrala vinkel mapper jämför spektra med geometriskt analysera förändringarna i intensitet som en funktion av våglängd (dvs jämför det två spektra genom att normalisera sin intensitet och jämföra vinklarna rekrävas för att spåra grafen för varje spektra) ^24.
   2. Med datacube öppet, väljer du namnet på den experimentella datacube i pop-up-fönster och klicka på "OK". Om inga filnamn listas, klicka på "öppna"; "Ny fil", välj den experimentella datacube, klicka sedan på "OK".
      1. Iaktta en ny pop-up fönster som heter ändenhet Samling: SAM. Klicka på "Importera" i menyraden, välj sedan "från Spectral Library filen". Ett pop-up-fönster som heter Spectral Bibliotek Input File visas. Öppna Spectral Library of referens som skapades i steg 3.2.3. och klicka på "OK". Iaktta en ny pop-up fönster som heter "Input Spectral Library".
      2. Klicka på "Välj alla artiklar"; klicka på "OK" högerklicka på "Färg" och välj "Använd standardfärger för alla." Klicka på "Markera alla", följt av "Verkställ" och välj sedan utfilnamet end klicka på "OK". Spectral Angle Mapper tar några sekunder att analysera och spara data.
   3. Öppna datacube i hyper bildprogram. Välj "Klassificering" i Overlay-menyn i bildfönstret, sedan navigera till filnamnet och klicka på "OK". Användaren kan nu överlagra alla spektrum från biblioteket för att se var de kartlägga i bilden.
   4. Välj "Slå ihop klasser" alternativ från Alternativ-menyn i "Interactive klassen funktionen" öppnas via Overlay-menyn i bildfönstret, om en enhetlig färgsättning önskas, såsom för enklare analys av andra program (som beskrivs i steg 4,2 .).
   5. Markera alla klassificeringar att kombinera (typiskt, allt utom "icke" i "klasser för att slås samman till bas" lista), och välj en enda spektrum från "basklass" listan, klicka sedan på "OK". Den färgen kommer nu Represent alla valda spektra.
   6. Klicka på den färg som valts och alla matchande spektra kommer att visas i den färgen.
   7. För att få en dikromatiska bild som visar matchande spektra över en svart bakgrund, cIick på "oklassificerade" färger box, som är svart som standard. Iaktta en dikromatiska bild. Detta steg kan vändas genom att klicka igen på "oklassificerade" färger box.
   8. Högerklicka för att spara bilden som en TIFF, inklusive eventuella över aktiva.
      OBS: För framtida bildbehandling, kommer en dikromatiska bilden användas.
   9. Välj "Klass Distribution" från Alternativ-menyn i "Interactive Class Tool" fönstret för att förvärva kartläggning statistiken. Dessa data visar hur många pixlar var unmapped (icke) och hur många identifierades som material av intresse. Observera att antalet pixlar inte motsvarar antalet partiklar mappade. Denna information är inte automatiskt recorded.
2. Partikelanalys i Hyperspektrala mappade bilder
   1. Öppna bilderna i NIH ImageJ programvara.
   2. Använd menyn Bild, Justera menyn "Threshold" -funktion. Välj parametrar som skiljer partiklar av intresse från alla andra material. Använd följande tröskelparametrarna för denna studie: standardtröskelmetoden, färg röd, färgrymd HSB, kontrollerat mörk bakgrund kryssrutan kontrolleras pass kryssrutorna för nyans, mättnad och ljusstyrka.
      OBS: Detta kan variera kraftigt från fall till fall. Vid analys av en mappad datacube, kan detta förenklas genom att förena alla relevanta klasser till en enda färg och överlagring färgen med alla oklassificerade färger innan du skapar bilden (steg 4.1.4 till 4.1.8).
   3. Använd Analysera menyn "Analysera partiklar" -funktion, som kommer att hämta information om området, menar, min- och maxvärden. För denna studie använda parametrarna här: storlek 0-oändlighet, cirkularitet0-1, show ingenting, kontrolleras visa resultat kryssrutan.
   4. För statistisk analys, exportera dessa data till ett annat program som möjliggör statistisk jämförelse med antalet och storleken av partiklar som finns i liknande kontrollprover. Vi föreslår att du använder ett kalkylblad för analys av ImageJ uppgifter. Data som visas i resultattabellen efter steg 4.2.4 ska kopieras till ett kalkylblad. MAX-funktionen kan användas på den första kolonnen (utan titel) för att bestämma antalet partiklar, medan den genomsnittliga funktionen kan användas om området kolonn för att bestämma medelstorlek av en partikel. I framtiden kommer experimentell validering göras för att undersöka denna funktion för att bestämma medelstorlek mot en etablerad standard för dimensionering (t ex TEM).

Representative Results

Hyperspektral mikroskopi är användbar för dess förmåga att identifiera material på ett sätt som liknar spektrofotometri. Såsom indikeras i fig 1, har varje material flera karakteristiska spektra och en total form av dess reflektans, vilket är unikt. Vidare Figur 1 illustrerar matrisberoende karaktären hos de spektrala profilerna: de spektrala profiler för vart och ett av de tre metalloxider i histologiska vävnadsprover (övre panelen) skiljer sig från de spektrala profilerna för var och en av de tre metalloxider i vattenhaltig suspension ( bottenpanel). Genom att kartlägga de karakteristiska spektrala profilerna för okända prov i samma matris, är tekniken användbar för att bestämma närvaro eller frånvaro av ett material, och kan även halvkvantitativt jämföra relativa mängder av material i prover.

Referensspektrala bibliotek som skapats från positiv kontroll hudprover är lämpliga för kartläggning experimentellhudprover. Som framgår av Figur 2, referensspektrala biblioteken map väl till motsvarande positiva kontroller och inte mappas till motsvarande negativa kontroller.

Den mest betydande fördelen med tekniken är dess förmåga att detektera låga nivåer av material av intresse i prover, såväl som för att skilja dem från föroreningar. . Till exempel kan observeras enskilda nanorör i lungorna under inhalation av doser så låga som 40 mikrogram i en 20-30 g råtta ²⁵ Figur 3 visar detta i histologiska hudprover: medan vissa partiklar är lätt uppenbart i mörkfälts- optiska bilden (kolumn 2), andra detekteras med hjälp av hyperspektral imaging (kolumn 3) som kan ha missat med hjälp av bright mikroskopi (kolumn 1) eller andra metoder. Användningen av mörkfält HSI tjänar också till att förbättra specificiteten över enkla bright mikroskopi. Dessa bilder kan sedan bli föremål för ytterligare kvantitativa former av analys, notably analys partikel via ImageJ.

Förbättrad mörkfält mikroskopi har flera olika tillämpningar, även i frånvaro av hyperspektral avbildning. Den första är dess förmåga att generera hög kvalitet, bilder med hög kontrast. Detta är bäst framgår av figur 3, i vilken partiklar av intresse är lätt identifierbara i jämförelse med sina ljusfält motsvarigheter. Dessa bilder kan också bli föremål för kvantitativ partikelanalys, men i avsaknad av hyperspektrala kartläggning är nödvändig försiktighet för att undvika förvirrande en förorening partikel från en partikel av intresse.

Figur 1. Referensspektrala bibliotek (vävnadsmatris) jämfört med spektrala bibliotek (nanopartiklar i suspension). Denna figur visar hur viktigt det är att generera en referens spektral bibliotek från nanomaterials av intresse i samma matris som experimentprover. Den första raden visar referensspektrala biblioteket (RSL) för varje material i denna studie (aluminiumoxid, kiseldioxid och ceriumoxid). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Denna RSL skapades av den metod som beskrivs i detta protokoll, om det är positivt kontrollvävnadsprover filtrerades mot negativa kontrollvävnadsprover. Den andra raden visar spektrala bibliotek (SL) har skapats från nanopartiklar av intresse i flytande suspension på en glasskiva. För aluminiumoxid framställdes en bimodal topp vid våglängder av 500 och 650 finns i RSL, medan en mer krökt och mindre distinkt topp sågs i aluminiumoxiden NP suspensionen SL på runt 600. För kiseldioxid, en topp vid en våglängd av omkring 650 var närvarande i RSL, medan en mer krökt och mindre distinkt topp sågs i kiseldioxiden NP suspensionen SL vid around 600. För ceriumoxid, var en bimodal topp hittades vid våglängderna 520 och 620 i RSL, medan en mindre distinkt topp sågs i ceriumoxid NP fjädring SL på runt 560. Detta föreslår att matrisen i vilken de nationella parlamenten är inbäddade skapar en förändring i spektra som kan vara betydande vid val av kontroller för att skapa SL så specifika experiment.

Figur 2. Referensspektrala bibliotek (vävnads matris) avbildas på positiv kontroll och negativ kontroll grishud vävnad. Denna siffra tjänar som en bekräftelse av RSLS som är lämpligt för att kartlägga experimentella prover, att varje RSL (vänstra kolumnen) kartor väl till dess motsvarande positiv kontroll (mittkolumnen) och inte mappa till dess motsvarande negativ kontroll (högra kolumnen). Vänligen klicka here för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Hyperspektrala kartläggning av experimentell grishud vävnad utsätts för metalloxidnanopartiklar. Rader från topp till botten motsvarar olika hudlagren, från ytliga till djupaste skikt: epidermis, dermis och subkutan vävnad, respektive. Den första raden visar hornlagret i överhuden från ett hudprov som utsattes för aluminium NP i suspension; den andra raden utsattes för kiseldioxid NP i suspension; och den tredje raden att Ceria NP i suspension. Varje kolumn visar samma område av huden avbildas med olika tekniker. Den första kolumnen motsvarar bright mikroskopi (40X mag .; skala bar = 50 nm), där det område som avgränsas i en röd fyrkant förstorades (100X mag, skala bar = 10 nm) med förbättrad mörkfält mikroskopi (EDFM) i den andra kolumnen, där vita pilarna pekar på den höga kontrasten nationella parlamenten. Den tredje kolumnen erhölls med ett hyperspektral kamera (HSI), visar samma höga kontrast NP (vita pilar). EDFM och HSI bilder togs vid 100 gångers förstoring; skala bar = 10 mikrometer. Den fjärde kolumnen visar HSI bilden mappas mot respektive RSL för varje exponeringsgrupp, där aluminium NP visas i grönt, kiseldioxid NP i rött, och ceriumoxid NP i gult, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

För vävnadsprover som har genomgått konventionell histologisk färgning, identifiering och analys av metalloxid nanopartiklar kan uppnås genom en kombination av EDFM, HSI kartläggning och bildanalysteknik. Medan det finns flexibilitet i provberedning för histologi eller immunohistokemi (t.ex., med användning av fasta eller frysta vävnader; typ av fläck), är det viktigt att proven sektione till en tjocklek av 5-10 | im för optimal visualisering. Prov som användes här var formalinfixerade och paraffininbäddade före snitt med en roterande mikrotom till 6 ^ m tjocklek, monterade på glasmikroskopobjektglas, färgades med hematoxylin och eosin och med täckglas. Grishud vävnader från en ex vivo kutana penetrationen toxikologi samarbete användes för denna studie. Vävnaderna exponerades för metalloxidnanopartiklar (aluminiumoxid, kiseldioxid, ceriumdioxid) i vattenhaltiga suspensioner. Detektering av regionen (er) av intresse (hög kontrast elemenätter) med EDFM är ett kritiskt första steg som underlättar efterföljande HSI kartläggning och analys. Positiva och negativa kontrollprover måste avbildas och analyseras först för att skapa en spektral bibliotek för referens. Den uppsamlade spektra från den positiva kontrollen exporteras till en positiv kontroll spektral bibliotek. Därefter är alla spektra från de negativa kontroll bilder subtraheras från den positiva kontrollen spektrala bibliotek i syfte att förbättra specificiteten (minska falska positiva). Den resulterande filtrerade spektral bibliotek anses RSL som tjänar för analys av material av intresse. Alla vävnadsprover genomgå samma avbildningsprocessen och mappas mot RSL. Den resulterande bilden kommer att innehålla endast områden med inslag av intresse över en svart bakgrund. Den här bilden kan sedan analyseras med ImageJ med hjälp av dess tröskel- och partikelanalysfunktioner för att få området mappade partiklar per synfält. Numeriska data som erhållits från ImageJ kan vara exported till ett kalkylblad för vidare analys.

Det är viktigt att tänka på att så biologiska prover är till sin natur skiljer sig från varandra, och färgningsmetoder kan påverka visualisering genom EDFM och HSI bör exponeringsinställningarna fastställas i enlighet med vad som ger den bästa bild med hög kontrast för en viss typ av prov. Även om minskning av falska positiva kan uppnås genom filtrering av spektrala bibliotek, är det viktigt att få fram tillförlitliga negativa kontroller som har undvikit kontaminering med inslag av intresse, eftersom spektra som motsvarar denna förorening skulle kunna filtreras från den positiva kontrollen spektrala bibliotek ökar falskt negativa resultat. Även spektrumet intensitetsområde som kan detekteras med den hyper bildprogram kan inte överträffa gränsen för det särskilda program (för denna studie är att 16.000 enheter): områden med ett stort antal av ackumulerade partiklar som producerar spectral intensiteter över intensitetsgränsen lämnas ut från den spektrala bibliotek, på grund av risken för att öka antalet falskt negativa.

Medan HSI-systemet ger många fördelar jämfört med traditionella metoder, finns det vissa nackdelar och begränsningar att överväga. En är att den stora mängden av optiska data som samlas in kan kräva betydande datorkraft. En annan är att HSI kan vara tidskrävande, särskilt i början stadier när referensspektrala bibliotek skapas. Dessutom kan imaging tid kräva flera minuter per bildfångst, vilket gör det långsammare än enkel mörkfält bildbehandling; emellertid är det fortfarande snabbare än att utföra framställning och visualisering sampling genom elektronmikroskopi. Dessutom kan komplexa system resultera i flera karakteristiska spektra, som kräver utveckling av högt specialiserade kontroller och göra inrättandet av standardiserade, universella referensbibliotek svåra ^26. Slutligen, technique resulterar i lägre upplösning än probe- eller elektronmikroskopiska tekniker, såsom atomkraftsmikroskopi eller transmissionselektronmikroskopi, vilket kan lösa enskilda atomer. Denna teknik resolution är begränsad på grund av sin fotoniska natur, som hindrar den från att vara en hög precision verktyg för att mäta partikelstorlekar på nanometernivå eller exakt lokalisera material i en sub-micron nivå. Medan tekniken kan ha möjlighet att peka ut partiklar inom vissa teoretiska vävnader eller cellulära organeller som är större än 1 | im (såsom cellkärnor), är mindre organeller eller funktioner utmanande att visualisera exakt med denna metod. Lägg också märke till, med tanke på dess rymdupplösning, kan denna metod inte särskilja mellan enskilda nanopartiklar och agglomerat ^11.

Andra överväganden inkluderar: vissa material (t.ex. ädelmetaller) har mycket högre reflektans och tydliga spektrala profiler, vilket kan göra dem lättare att Analyze och karta spektralt med detta verktyg. Andra, såsom halvmetalloxider som undersökts i denna studie och kolbaserade nanomaterial ^{24, 27,} kan vara svårare på grund av deras elementära sammansättning, form, och beroende på matrisen. I två murina inhalationsstudier av Mercer et al., Har ett liknande system till ett som användes i denna studie används för att lokalisera kolnanorör i lungan och i sekundära organ kring deras anmärkningsvärt hög kontrast med omgivande vävnader. Emellertid var hyperspektral kartläggning inte visat i någon av studierna, sannolikt eftersom den unika formen av kolfibrer var en tillräcklig drag för identifiering. En annan faktor gäller specifikt till vävnader: sedan deponera nanopartiklar av intresse för specifika organ genom normala biofysiska processer är oförutsägbar (och ofta själv föremål för studien), kan fastställandet av en tillämplig positiv kontroll vara svårt och kräver en undersökning av hur generering av styr might påverka tillståndet hos ett material av intresse. Till exempel, om en spektral bibliotek skapas från orörda nanopartiklar av intresse, kan det vara svårt att kartlägga bibliotek till samma nanopartiklar i vävnader eller celler på grund av förändringar i de spektra som framställs förändring av partikeln (t.ex., på grund av förändringar i pH, upplösning, agglomerering, proteinbindning) och den totala mikro eller matris. Slutligen är tekniken begränsad i sin semi-kvantitativ natur: det kan bara vara så kvantitativ som andra tvådimensionell mikroskopitekniker av liknande resolution, vilket betyder att det kan inte vara lätt att användas för att utföra uppgifter som kännetecknar den totala organbördan av ett material.

Sammantaget EDFM och HSI ger flera fördelar jämfört med konventionella nanomaterial avbildnings och karakteriseringstekniker, såsom TEM, HAADF och DIC. EDFM / HSI möjliggör snabbare bildtagning och analys, vilket sparar tid och kostnader i jämförelse med mer intensiv konventionnella tekniker. Dessutom är provberedning för EDFM / HSI typiskt både minimal och icke-förstörande, vilket sparar tid och även möjliggör en mer flexibel analys av ett givet prov eftersom det då kan användas för andra tekniker. Vidare är HSI mångsidig, vilket möjliggör analys av nanoskala material av många kompositioner och i en mängd olika matriser. Forskargruppen arbetar med att förfina den här beskrivna metoden för andra material och provtyper, inklusive en fördjupad utvärdering av specificiteten av tekniken. En kritisk nästa steg under utredning av forskargruppen är validering av dessa tekniker mot traditionella guld standarder (t ex, Raman, TEM, SEM) för material och vävnadstyper av intresse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoViva 150 Unit (condenser)	CytoViva (Auburn, AL)		mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)	Schott NEXTERION	1025087	reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	custom	reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil	Fisher Scientific	12368B	multiple suppliers
70% isopropanol in water			multiple suppliers
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH)		free open-source software online download
metal oxide nanoparticles	supplied to the research team by industrial partners		alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.