Introduction
В наноматериалы все шире используются в различных отраслях промышленности, существует потребность в наноразмерных изображений и характеристика методов, которые более быстрым, доступным и удобным, чем традиционные методов, таких как электронная микроскопия. Для визуализации наночастиц (NP) взаимодействия с клетками, тканями и живых систем, многие оптические методы были использованы, в том числе дифференциальной помехи контраста (DIC) микроскопии 1 и неоднородные поля на основе таких подходов, как полного внутреннего отражения (TIR) или ближней сканирования оптической микроскопии (NSOM) 2,3. Тем не менее, эти высококачественные аналитические подходы, в недоступном для большинства неспециалистов лабораториях 4. Электронная микроскопия, в том числе электронной микроскопии (ПЭМ), также был использован для изучения NP взаимодействие с клетками 5,6,7,8. Высокий угол кольцевой темного поля (HAADF) сканирование электронной микроскопии был использован для изучения взаимодействия наночастицвирусами 9. Конфокальной микроскопии является еще одним популярным методом, используемым для изучения NP-клеточные взаимодействия 10.
В последние годы, гиперспектрального томография (HSI) методы темнопольные основе были использованы в качестве перспективного аналитического инструмента для изучения NPS в биологических матриц 11. Системы HSI генерировать трехмерное представление пространственных и спектральным данным, известным как гиперкуба или Datacube 12. Пространственная карта спектрального хода используется для идентификации материала. Спектральные профили известных материалов могут быть получены и использованы в качестве справочных библиотек для сравнения неизвестных образцов. Одним из главных преимуществ системы с HSI является его способность сочетать с изображений спектроскопии, таким образом устанавливая расположение и распределение неизвестных наночастиц в живом организме или исключая виво, а также связывая их на другое исходное частицы, известной, аналогичного состава.
Есть несколько преимуществс помощью системы HSI по сравнению с обычными методами обработки изображений: минимальный подготовки образца не требуется; пробоподготовка, как правило, неразрушающий характер; приобретение и анализа изображений быстрее; техника является экономически эффективным 13; и пространственное распределение и анализ соединений смешанного состава и / или в комплексных матриц становится более легким, 14.
Для наноматериалов исследований с участием драгоценные образцы, один из самых важных вопросов является наличие неразрушающим методом визуализации, который позволяет потенциал многократно исследовать образцы от одного или более методов. Неоднократный или несколько анализов может быть желательно разработать комплексные наборы данных, которые не будут доступны из одного метода. Для этой связи, изучение ее оптические свойства является самым безопасным способом анализа образца. При использовании усиливается темнопольном микроскопе (EDFM) и систему HSI изучать оптический отклик образца, а именно - Reflectance, но также абсорбцию и пропускания - идентификация функция и характеристика может быть выполнена 15. Потенциальные конечные характеристика включает оценку относительного размера и формы наночастиц или агломератов и распределение наночастиц в образце.
В этой статье мы опишем методы отображения специально для оксидов металлов наночастиц в посмертном ткани с использованием системы HSI на основе пикселей спектральных алгоритма матч называют спектральной угол преобразователя (SAM). Мы выбрали именно эту заявку, потому что у него есть потенциал, чтобы дополнить текущий и будущее в естественных условиях исследования нанотоксикологии, в котором животные модели, используемой для оценки последствий для здоровья воздействия наноматериалов на. Применение этого метода может также сообщить наноразмерных исследований доставки лекарств, который использует ткани или животного модели. В частности, наночастиц поглощения, распределения, метаболизма и выведения, по всей Organs и ткани могут быть исследованы с помощью этой системы. Широкое разнообразие приложений изучаются для использования в медико-биологических исследований 11.
Этот метод может быть использован для оценки различных биологических образцах (например, типов различных тканей, бронхоальвеолярного лаважа образцы и мазках крови), которые были подвержены наночастиц различных элементным составом 16-19. Кроме того, этот метод полезен для изучения наночастиц биораспределение в виво и ин витро, который уместен для исследований доставки наноразмерных препарат 11. Кроме биологических образцов, EDFM и HSI может быть использован для оценки наночастиц в пробах окружающей среды, таких как сточные воды 20. Профессиональные оценки воздействия можно облегчить путем использования этой техники, а также, так как он может быть использован для оценки эффективности средств индивидуальной защиты для предотвращения проникновения наночастиц. Кроме того, исследования теутра в настоящее время разрабатывает аналогичную EDFM и протокол HSI для оценки образцов фильтрующий материал наночастиц, собранных из оценок профессиональных воздействия. В то время как подготовка этих различных типов образцов для EDFM и HSI может варьироваться, важно, что они получают таким образом, что они могут быть легко визуализированы с помощью оптической системы. Как правило, образец должен быть получен, как если бы он быть визуализированы с помощью традиционного светлого микроскопии. Есть несколько систем гиперспектрального изображений коммерчески доступные 11.
Protocol
Протоколы животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в сотрудничающей учреждения следователей, Университета Стоуни Брук. Перечень конкретных материалов и оборудования, используемого для этой работы можно найти в таблице 1.
1. Подготовка образцов тканей
- Подготовка тканей животных, подверженных наночастиц оксидов металлов для гистологического или иммуногистохимического окрашивания как за ранее описанных методов 21-23.
2. изображений
- Инициализация микроскоп
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования, научный класс микроскоп используется, оснащен высокопроизводительным источником темного поля света, моторизованные XY этап контроллер, 14-битная глубина гиперспектрального камеры и несколько объективов (10X воздух, 40X воздух, 100X нефти погружения) , Система используется здесь имеет 64 нм пространственное разрешение на 100X (масло погружения) увеличении. Конденсатор для этого шпилькиу есть и Келер и критические функции освещения и фокусируется высоко коллимированный свет в острых углов на образце.- Подключите и включите источник света, XY этап контроллера, оптическая камера (для визуализации темнопольным), гиперспектральной камеры, и компьютерной системы. Установите источник света до 75% мощности; поднять этап к максимальной высоте; подключить световод в конденсатор для повышения визуализации темнопольном или к коллиматора на задней микроскопом отраженного изображения светлого.
ПРИМЕЧАНИЕ: При установке источника света до 75% мощности, имеется достаточно, равномерное освещение всех пикселей в пределах всего поля зрения, что повышает скучнее пикселей в то же время позволяя отличие между тупыми и ярких пикселей. - Поднимите конденсатор в рабочее положение. Применение 3-5 капель типа A иммерсионного масла на линзы конденсатора осторожно, чтобы исключить образование каких-либо пузырьков. Вытрите масло и повторно его, если пузырьки должны сформировать.
- Расположите слайд Oп сцену. Медленно поднять конденсатор, пока масло не погружение вступает в контакт с горкой. Это будет заметно через быстро увеличивая яркость освещения кольца, где масло контактирует с горкой.
- Подключите и включите источник света, XY этап контроллера, оптическая камера (для визуализации темнопольным), гиперспектральной камеры, и компьютерной системы. Установите источник света до 75% мощности; поднять этап к максимальной высоте; подключить световод в конденсатор для повышения визуализации темнопольном или к коллиматора на задней микроскопом отраженного изображения светлого.
- Поставьте цель 10X на месте. Фокус и выровнять конденсатор, исследуя через окуляры.
- Перемещение этап вверх и вниз с помощью грубой объективной ручки фокусировки, пока яркость не является максимальным.
- Перемещение конденсатор сосредоточиться вверх и вниз с помощью ручки регулировки конденсатора до максимальной яркости не найдено. Попытка создать яркую центральную возможное место в поле зрения.
- Отрегулируйте выравнивание ручки конденсатора, необходимую для центрирования яркое пятно, если это необходимо.
- Используйте ручку мелкий цель фокусировки, чтобы принести яркое пятно в центре внимания. При изменении цели, чтобы получить другую увеличение, отрегулируйте фокус самолет. При использовании цели 100X, нанесите каплю иммерсионного масла на покровное повышения йе изображение и избежать повреждения объектива.
- Захват изображений
- Используйте контроллер этап найти область интереса. Этот регион будет определяться потребностями эксперимента. Типичный индикатор будет высокий контраст с окружающими регионами, в районах, проникнутые наночастиц оксидов металлов часто появляются ярче, чем областях без них.
- Принесите регион в фокусе, используя тонкую объективную ручку фокусировки, корректируя фокус конденсатора, необходимую для уравновешивания освещения. Достичь высокой контрастности, а определенный регион в поле зрения.
- Определите, какие изображения (для оптического камеры) или datacubes (для гиперспектральной камеры) будут захвачены, и в какой последовательности. Как правило, оптические изображения получены с воздуха цели 10X 40X, воздуха целью, и 100X иммерсионным цели и соответствующего HSI DataCube с 100X иммерсионным цели.
- Откройте программу оптического изображения. Нажмите на кнопку "Настройки &# 8221; в строке меню. Выберите кнопку "Capture Image для захвата события". Выберите сохраненный формат изображения (TIFF используется для этого эксперимента); назначить имя; просмотреть и выбрать сохраненный папку; держать умолчанию интервальная съемка; нажмите "ОК".
- Выберите настройки экспозиции, которые создают высокий контраст изображения в меню "экспозиции" (для этого исследования, уровень 0,0%, прирост 3,0 дБ, и затвор 35 мс были использованы).
- Захват изображения, нажав на кнопку "изображение" в панели меню. Захват несколько низкого увеличения для темного поля изображения в дополнение к тем, при большом увеличении, изменив цели микроскопа, для того, чтобы обеспечить контекст.
ПРИМЕЧАНИЕ: Захват оптических изображений с тем же увеличением, как и любые datacubes, которые будут захвачены с гиперспектральной камеры, так как эти оптические изображения, как правило, чтобы иметь более широкое поле зрения и более эстетичный внешний вид для последующего визуального осмотра. Очень важно, чтобы любой DATACмассовые рассылки, которые впоследствии будут проанализированы спектрально использование последовательного увеличения, как это возможно, что изменение цели будет изменять спектры пропускания оптики микроскопа, изменяя захваченное спектры, и, таким образом, уменьшая точность спектрального угла преобразователя (SAM). Если Datacube сравнивается с другой DataCube полученной с другим цели, функция САМ может не работать.
- Выберите гиперспектральной детектор изображения камеры путем перенаправления источника света ручку на микроскопом, чтобы гиперспектрального камеры. Если свет направлен на гиперспектральной камеры, изображение не будет показано в программе оптического камеры. Минимизировать но не закрыть окно программы оптического изображения, как можно это нужно, как указано в шаге 2.4.4.
- Захват Datacubes
- Откройте гиперспектральной обработки изображений для приобретения HSI datacubes. Убедитесь, что световод направляется в гиперспектральной камеры.
- Открыть "Hyperspectral микроскоп "в строке меню и выберите" HSI микроскоп управления ".
- Установите объективную увеличение и путь для сохранения. Убедитесь, что имя все изображения и файлы отчетливо, так нет перезапись не происходит. Изменение захват области в настройках, регулируя угол обзора или количества строк (720 строк использовать для этого исследования), со значительным количеством дополнительного времени, необходимого для захвата больших площадей. Наконец, установите время экспозиции (0,25 сек в данном исследовании). Оставьте все остальное по умолчанию, и нажмите кнопку "Предварительный просмотр" HSI для просмотра изображения.
Примечание: На графике интенсивности, что появляется показывает Datacube HSI, который будет записан в горизонтальной оси. Вертикальная ось представляет длины волн спектра, которые будут захваченного в DataCube HSI. Поместив курсор в любом положении на графике интенсивности, соответствующей спектральной волны вызывает интенсивности всех точек по всей изображения, на этой длине волны, чтобы показать. - Регулировка интенсивности от этого просмотра, регулируя яркость источника, конденсатор направленность, или отмены предварительного просмотра, чтобы настроить время экспозиции. Последнее дает лучшие результаты, но увеличение времени экспозиции может занять больше времени, к изображению. Цель заключается в более значительные пики быть достаточно большой, но не более максимальной интенсивности для детектора; здесь, идеальный диапазон между 1000 и 16000 единиц.
- Нажмите кнопку "захват". Микроскоп будет просить взять темный текущее изображение. Перенаправление верхний ползунок или диафрагмы (осторожно, чтобы не нарушить выравниваниеи фокус любой из других оптики), и нажмите кнопку "ОК". Восстановление ползунок или диафрагмы в положение и нажмите "ОК" еще раз, когда появится запрос на изображение. Изображений может занять до 30 мин, хотя времена около 5 мин, более типично. Более длительное время воздействия привести к увеличению времени визуализации. Индикатор прогресса присутствует. Будьте осторожны, чтобы не нарушить физическое сферы до завершения индикатор прогресса.
- Соблюдайте четыре новые окна с именами: "список Доступные полос", "# 1zoom", "# 1scroll" и "# 1 RGB группа". Разверните окно "# 1RGB группа", как это Datacube для всех будущих ссылок.
- Щелкните правой кнопкой мыши Datacube и сохранить его в качестве TIFF и нажмите "ОК". Если готового изображения; убрать все образцы; очистить все масляные поверхностей, подвергшихся воздействию с 70% изопропанола в воде; поднять этап к максимальной высоте; ниже конденсатора минимальной высоты и нажмите в нерабочем положении; закрытьвниз или отключите источник света, контроллер этапе, а камер.
3. Создание опорной спектральной библиотек
- Выбор эталонных спектров
- Выберите положительного контроля, что, как известно, содержат материал, содержащийся в интересах той же матрицы, что и опытных образцов, так как HSI спектральные профили матрицы зависит.
- Для этого исследования, используют свиной кожи вводят с высокими дозами металлических наночастиц оксида в качестве положительных контролей для сравнения с экспериментальными свиной кожи ткани из тематического изучения экспозиции. Спектральные профили наночастиц оксидов металлов в суспензии были получены и исследованы и нашли, чтобы быть неуместным положительный контроль для гистологических экспериментальных образцов в связи с различными матрицами.
- Получить Datacube от положительного контроля, как описано в шаге 2.4., При помощи гиперспектральной камеру.
- Будьте особенно осторожны, когда себек раб интенсивность, так как это основным показателем, по которому фильтр внутренний частиц будет идентифицировать материалы. Любые интенсивности выше точки насыщения детектора (здесь, 16000 единиц) приведет недействительных данных (обратитесь к шагу 2.4.5.).
- Щелкните правой кнопкой мыши в окне изображения, и нажмите левую кнопку "Z-профиль спектр". Появится всплывающее окно Спектральный профиля. Щелкните левой кнопкой мыши на пикселов интерес на DataCube, особенно самых ярких и те, которые могут быть с уверенностью определены как представляющие материал интереса. Соблюдайте спектральное окно профиля, показывающий, связанный спектр. Обратите внимание, в частности, их низкой и самой высокой стоимости, и которые длина волны соответствует ему.
- Когда съемки положительный контрольный образец, опрос, нажав на регионы, представляющие интерес, которые очень ярко по сравнению с окружающей тканью, особенно с готовностью идентифицируемых частиц. Эти частицы, скорее всего, будет матерМОГВ интересов, особенно в случае металлов.
- Используйте «Фильтр частиц" инструмент в меню "Анализ частиц" для идентификации частиц, присутствующих в DataCube. В новом всплывающем окне, соблюдайте "Спектральный Макс должен превышать". Это будет зависеть от наблюдений на шаге 3.1.3. Это значение, так что выше, чем фон пикселей, но ниже, чем материалы, представляющие интерес. К "Действительно данных Макс" является максимальная интенсивность (здесь 16000 единиц).
- Оставьте другие параметры по умолчанию, но исключать объекты, основанные на размере, регулируя окно "Размер Threshold". Сохранить данные либо в этой точке, либо после запуска анализа. Для этого эксперимента, используйте следующие параметры: Спектральный Макс должен превышать: 5000; Действительно данных Макс: 16000; Размер Порог (пикселей): 400. После того, как все параметры были установлены, нажмите "ОК".
- Соблюдайте Полученный граф с деталямичастицы, обнаруженные в пределах порога, указанного в интенсивности; Эти данные могут быть экспортированы. Если характеристика максимальная длина волны отражения материала интереса известно, выбрать те частицы, которые имеют аналогичную "Макс" WL значение; в противном случае, нажмите "выбрать все". Затем нажмите кнопку "Экспорт"; "Для Спектральный Библиотека". Выберите имя файла и нажмите "ОК".
- Выберите положительного контроля, что, как известно, содержат материал, содержащийся в интересах той же матрицы, что и опытных образцов, так как HSI спектральные профили матрицы зависит.
- Удалить ложноположительных Spectra
- Выберите образец, который будет служить в качестве отрицательного контроля. Такой образец должен были подготовлены и обработаны таким же образом, как и все опытные образцы исключением того, что отсутствие наночастиц подобные или идентичные материала интерес гарантируется.
Примечание: Важно, что матрица с отрицательным контролем такой же, как матрицы экспериментальных образцов, а HSI спектральные профили матрица-зависимого. Для этого исследования мы использовали свиной кожи, что не подвергалась оксида металла наноматериалов как негативныйуправления. - Получить несколько datacubes от негативного контроля, как описано в шаге 2.4.7, используя гиперспектральной камеру. По крайней мере один требуется, но более могут быть захвачены, чтобы увеличить селективность (это особенно важно в том случае, некоторые загрязнений может быть в эталонных спектров).
- Используйте гиперспектральной обработки изображений для фильтрации спектральную библиотеку, собранную на шаге 3.1 (положительный контроль) в отношении каждого DataCube захватили в шаге 3.2.2 (отрицательный контроль) последовательно, как указано в следующих шагов:
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните полученный, фильтруют спектральной библиотеки в отдельном файле, и использовать в качестве опорной спектральной библиотеки для интересующего материала.- Нажмите кнопку "Filter Spectral Library" в меню Analysis, расположенной на главной панели инструментов программы. Нажмите кнопку "Открыть"; "Новый файл" и выберите спектральный библиотеки, созданный на шаге 3.1. для положительного контроля в качестве входного файла. Нажмите "ОК".
- При еxternal источник, выберите "Image" под окном спектральных данных. Держите настройки по умолчанию под окном параметров обработки. Выберите имя для вывода фильтром библиотеки (это должно быть иным, чем в оригинале, или сырые спектральные библиотеки собраны будут потеряны). Нажмите "ОК".
- Нажмите кнопку "Открыть"; "Новый файл" и выберите первый Datacube снятое на шаге 3.2.2 для отрицательного контроля, когда будет предложено выбрать исходный файл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение будет анализировать спектральный библиотеки и удалить каждый спектр, который соответствует любому спектр отрицательного DataCube управления. Удаление фона от критериев отбора, таким образом, уменьшает потенциал для ложных срабатываний. Резюме будут доступны, когда это будет сделано (внимание, что это резюме не сохраняются автоматически). - Если дополнительная фильтрация желательно, повторите процедуру с шага 3.2.3.1, за исключением: шаг 3.2.3.2, выберите последний отфильтрованный спектральную библиотеку, созданную (в результате после этапа 3.2.3.3 CO.mpletes); в шаге 3.2.3.3, выбрать следующий Datacube из стадии 3.2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коррекция и нормализующее для спектра лампы могут быть необходимы, если образцы рассеивают значительное количество света (например, углеродные нанотрубки) и / или, если нуль-спектры остаются при фильтрации положительного контроля спектрального библиотеки против отрицательного контроля. Эти обстоятельства не возникают для нашего исследования, так и эта поправка не была выполнена.
- Выберите образец, который будет служить в качестве отрицательного контроля. Такой образец должен были подготовлены и обработаны таким же образом, как и все опытные образцы исключением того, что отсутствие наночастиц подобные или идентичные материала интерес гарантируется.
Анализ 4. Изображение
- Спектральный Угол Отображение
- Откройте "Spectral Angle Mapper" (SAM) из меню Spectral, методы отображения подменю, с помощью программного обеспечения визуализации гиперспектральной когда все экспериментальные datacubes были приобретены следующим шагом 2.4. Спектральный Угол преобразователь сравнивает спектры геометрически анализа изменений в интенсивности в зависимости от длины волны (то есть, он сравнивает два спектра путем нормализации их интенсивность и сравнение углы повторнопотребовавшие, чтобы проследить график каждого спектров) 24.
- С DataCube открытой, выберите имя экспериментальной DataCube в всплывающем окне и нажмите "ОК". Если имена файлов не указаны, нажмите "Открыть"; "Новый файл", выбрать экспериментальный Datacube, затем нажмите кнопку "ОК".
- Соблюдайте новый всплывающее окно с названием Endmember Коллекция: SAM. Нажмите кнопку "Импорт" в строке меню, затем выберите "от спектрального файл библиотеки". Всплывающее окно с именем Спектральный Библиотека Входной файл появится. Откройте Spectral Library ссылки, который был создан в шаге 3.2.3. и нажмите "ОК". Соблюдайте новый всплывающее окно с именем "Ввод Спектральный Библиотека".
- Нажмите "Выбрать все товары"; нажмите "ОК" щелкните правой кнопкой мыши на "Color" и выберите "Применить цвета по умолчанию для всех". Нажмите "Выбрать все", затем "Применить", а затем выберите выходной файл назватьD нажмите "ОК". Спектральный Угол Mapper займет несколько секунд, чтобы проанализировать и сохранить данные.
- Откройте Datacube в гиперспектральной обработки изображений. Выберите "Классификация" в меню Наложение окна изображения, затем перейдите к имени файла и нажмите "ОК". Теперь пользователь может накладывать любую спектр из библиотеки, чтобы увидеть, где они карту в изображении.
- Выберите опцию "Объединить классы" из меню Option в "интерактивный инструмент класса« открыл через меню Наложение в окне изображения, если единая цветовая схема желательно, например, для облегчения анализа другими программами (как описано в шаге 4.2 .).
- Выделите все классификации, чтобы объединить (как правило, все, кроме "несекретные" в "классы, чтобы объединить в базу" список), и выбрать один спектр от "базового класса" списка, а затем нажмите "ОК". Этот цвет сейчас represЛОР всех выбранных спектров.
- Нажмите на цвет, выбранный и все соответствующие спектры будут показаны в этом цвете.
- Чтобы получить двухцветный изображение, которое будет показывать соответствующий спектры на черном фоне, cIick на поле "несекретные" цвета, что является черный по умолчанию. Соблюдайте двухцветный изображение. Этот шаг может быть отменено, нажав снова на «несекретные» цвета коробки.
- Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы сохранить изображение в формате TIFF, как, в том числе любые накладки данный момент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейшей обработки изображений, будет использоваться двухцветный изображения. - Выберите "Класс Distribution" в меню Option в окне "интерактивный инструмент класса", чтобы приобрести статистику картирования. Эти данные представляют, сколько пикселей были несопоставленные (несекретные) и сколько было выявлено в качестве материала интерес. Обратите внимание, что количество пикселей не соответствует числу частиц, отображенных. Эта информация не является автоматически гecorded.
- Анализ частиц в Гиперспектрального Подключенные изображений
- Откройте изображения в программном обеспечении НИЗ ImageJ.
- Используйте меню изображения, Отрегулируйте подменю, функции "порог". Выберите параметры, которые отличают частицы интересов от всех других материалов. Используйте следующие пороговые параметры для данного исследования: метод пороговой умолчанию, цвет красный, цвет пространства HSB, проверил темный фон флажок, проверяются флажки пройти для оттенка, насыщенности и яркости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может значительно отличаться от случая к случаю. При анализе отображенный Datacube, это может быть упрощена путем объединения всех соответствующих классов в одном цвете и наложения, что цвет со всеми несекретных цветов перед формированием изображения (шаги 4.1.4 4.1.8). - Используйте меню Analyze, "Анализ частиц" функцию, которая будет извлекать информацию для области, значит, минимальные и максимальные значения. Для этого исследования, использовать параметры: размер здесь 0-бесконечность, округлость0-1, ничего не показывают, проверил Результаты флажок.
- Для статистического анализа, экспортировать эти данные в другую программу, позволяющим статистическое сравнение с количеством и размером частиц, расположенных в аналогичных контрольных образцов. Мы рекомендуем использовать электронную таблицу для анализа данных ImageJ. Отображаемые в таблице результатов после шага 4.2.4 Данные должны быть скопированы в таблицу. Функция MAX может быть использован на первой колонке (безымянного), чтобы определить количество частиц, в то время как средняя функция может быть использована на колонке области, чтобы определить средний размер частицы. В будущем, экспериментальное подтверждение будет осуществляться, чтобы исследовать эту функцию в определении среднего размера против установленной нормы для размеров (например, TEM).
Representative Results
Гиперспектрального микроскопии является полезным для его способности идентифицировать материалы аналогично спектрофотометрии. Как показано на рисунке 1, каждый материал имеет несколько характерных спектров и общую форму его отражения, который является уникальным. Кроме того, Рисунок 1 иллюстрирует матрицу-зависимый характер спектральных профилей: спектральные профили для каждого из трех оксидов металлов в образцах гистологических тканей (верхняя панель) отличаются от спектральных профилей для каждой из трех оксидов металлов в водной суспензии ( Нижняя панель). Путем отображения характерные спектральные профили для неизвестных образцов в той же матрицы, метод используется для определения наличия или отсутствия материала, а также может полуколичественно сравнивать относительные количества материала в образцах.
Опорная спектральная библиотеки, созданные из образцов кожи позитивный контроль подходят для отображения на экспериментальнойОбразцы кожи. Как показано на фиг.2, опорная спектральная библиотеки хорошо согласуются с соответствующими положительным контролем и не отображаются на соответствующих отрицательных контролей.
Наиболее значительным преимуществом метода является его способность обнаруживать низкие уровни материалы, представляющие интерес в пробах, а также чтобы отличать их от загрязнений. . Например, отдельные нанотрубки можно наблюдать в легких во время ингаляции дозах в 40 мкг в 20-30 г крысы 25 Рисунок 3 демонстрирует это в гистологических образцов кожи: в то время как некоторые частицы легко очевидным в темнопольном оптического изображения (колонка 2), другие определяются с использованием гиперспектральных изображений (колонка 3), что, возможно, было пропущено с помощью светлого микроскопии (столбец 1) или другие методы. Использование темнопольным HSI также служит для улучшения специфичности над простым светлого микроскопии. Эти изображения могут затем подвергаться более количественных форм анализа, пotably анализ частиц с помощью ImageJ.
Улучшенная темного поля микроскопии имеет несколько различных приложений, даже в отсутствие гиперспектральных изображений. Первый является его способность генерировать высокое качество, высокая контрастность изображения. Это лучше всего продемонстрировано на фиг.3, в котором частицы интерес легко идентифицируются по сравнению с их аналогами светлого. Эти изображения могут быть также подвергнуты анализу количественной частиц, хотя в отсутствии гиперспектральной отображения, необходимо проявлять осторожность, чтобы избежать путаницы загрязнителя частицу от частицы интереса.
Рисунок 1. Ориентир спектральные библиотеки (матричные ткани) по сравнению с спектральных библиотек (наночастиц в суспензии). Эта цифра демонстрирует важность формирования опорного спектра библиотеку из нанomaterials интересов в той же матрицы, как опытных образцов. Первая строка показывает опорной спектральной библиотеки (РГБ) для каждого материала в этом исследовании (оксид алюминия, диоксид кремния и оксида церия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Это РГБ была создана по методу, описанному в данном протоколе, где образцы положительный контроль тканей фильтровали против образцов отрицательного контроля тканей. Вторая строка показывает спектральные библиотеки (SL), созданные из наночастиц, представляющих интерес в жидкой суспензии на стекле. Для глинозема, бимодальное пик при длинах волн 500 и 650 был найден в RSL, тогда как более изогнутыми и менее отличительной пик был замечен в глинозема НП подвески SL на уровне около 600. Для кремния, пиковой длиной волны около 650 было присутствует в РГБ, в то время как более изогнутые и менее отличительной пик был замечен в диоксид кремния НП подвески SL на Arouй 600. церия, бимодальное пик был обнаружен на длинах волн 520 и 620 в RSL, в то время как менее отличительной пик был замечен в церия НП подвески SL на уровне около 560. Это говорит о том, что создает матрицу, в которой НПС встроены сдвиг в спектрах, что может быть значительным при выборе управления для создания SL для специфических эксперимента.
Рисунок 2. Ссылка спектральные библиотеки (ткань матричные) отображается на положительный и отрицательный контроль свиной кожи ткани. Эта цифра служит подтверждением из ЗАСЖ, которые необходимы для отображения на опытных образцах, что каждый РГБ (левый столбец) отображает также в соответствующий положительный контроль (средней колонке) и не отображает в соответствующий негативный контроль (правая колонка). Пожалуйста, нажмите часпрежде чем, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Гиперспектрального отображение экспериментальной ткани свиней кожи подвергаются наночастиц оксидов металлов. Строки сверху вниз соответствуют различным слоям кожи, от поверхностных до глубоких слоев эпидермиса,: дермы, и подкожной ткани, соответственно. Первая строка показывает роговой слой эпидермиса от образца кожи, что подвергался алюминия НП в суспензии; второй ряд был выставлен на силикагеле NPS в суспензии; и третий ряд, чтобы оксид церия NPS в суспензии. Каждый столбец изображает тот же участок кожи, полученную с использованием различных методов. Первый столбец соответствует светлого микроскопии (40X MAG .; масштаб бар = 50 мкм), где площадь, заключенная в красном квадрате, был увеличен (100X MAG; масштаб бар = 10 мкм) с повышенной темнопольным микроскопии (EDFМ) во второй колонке, где белые стрелки, указывающие на высокую контрастность NPS. В третьей колонке была получена с гиперспектральной камеры (HSI), показывающий те же высокую контрастность NPS (белые стрелки). EDFM и HSI изображения были взяты в 100-кратном увеличении; Шкала бар = 10 мкм. В четвертой колонке показано изображение HSI отображенный против соответствующего РГБ для каждой группы экспозиции, где алюминия НЧ показаны зеленым, кремния наночастиц в красный и церия НП в желтый, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Для образцов тканей, которые подверглись обычный гистологический окрашивание, выявление и анализ наночастиц оксидов металлов может быть достигнуто путем сочетания EDFM, отображение HSI, и методов анализа изображений. В то время как есть гибкость в подготовке проб для гистологии или иммуногистохимии (например, с использованием фиксированных или замороженные ткани; тип пятно), важно, что образцы подразделяются на толщину 5-10 мкм для оптимальной визуализации. Образцы, используемые здесь, были фиксированные формалином и парафин до секционирования с помощью роторного микротома до 6 мкм толщины, установленный на предметные стекла микроскопа, окрашивали гематоксилином и эозином и coverslipped. Свиные тканей кожи от экс естественных кожного сотрудничестве проникновения токсикологии были использованы в данном исследовании. Ткани были подвергнуты наночастиц оксида металла (алюминия, диоксид кремния, оксида церия) в водных суспензиях. Обнаружение области (ы) интересов (высокая контрастность ElemeНТС) с EDFM является важным первым шагом, что облегчает последующее отображение и анализ HSI. Положительные и отрицательные контрольные образцы должны быть отображены и проанализированы сначала, чтобы создать библиотеку спектрального для справки. Собранные спектры от положительного контроля экспортируются в положительный контроль спектральной библиотеке. Затем, все спектры от негативных образов контроля вычитают из спектральной библиотеки положительного контроля для того, чтобы улучшить специфичность (снижение ложных срабатываний). В результате фильтрации спектральная библиотека считается RSL, который служит для анализа материалов, представляющих интерес. Все образцы ткани проходят такую же обработку изображения и отображаются против RSL. Полученное изображение будет содержать только участки с элементами интерес на черном фоне. Это изображение может затем быть проанализированы с помощью ImageJ его порог и анализ частиц функции, чтобы получить площадь отображенных частиц в поле зрения. Числовые данные, полученные от ImageJ может быть экспортред в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
Важно учесть, что, как биологические образцы по своей природе отличаются друг от друга, и методы окраски может повлиять визуализации через EDFM и HSI, установки экспозиции должна быть определена в соответствии с тем, что обеспечивает наилучшее высокой контрастности изображения для конкретного типа образца. Хотя снижение ложных срабатываний может быть достигнуто путем фильтрации спектральных библиотек, важно, чтобы получить достоверные отрицательные элементы управления, которые бы избежать загрязнения с элементом интерес, так как спектры, соответствующие этой загрязнения потенциально может быть отфильтрован от спектральной библиотеки положительного контроля в , увеличивая ложные отрицательные темпы. Кроме того, диапазон спектра интенсивности, что можно обнаружить с гиперспектральной обработки изображений не может превзойти предел конкретного программного обеспечения (для данного исследования, то есть 16000 единиц): районы с большим количеством накопленных частиц, которые производят зрectral интенсивности выше предела интенсивности исключены из спектрального библиотеки, из-за риска увеличения числа ложных отрицательных.
В то время как система HSI дает много преимуществ по сравнению с традиционными методами, есть некоторые недостатки и ограничения, которые следует учитывать. Во-первых, большим количеством оптических данных, собранных может потребовать значительных вычислительных мощностей. Другой является то, что HSI может быть время интенсивного, особенно на начальных этапах, когда создаются ссылки спектральные библиотеки. Кроме того, время визуализации может потребоваться несколько минут в захвате изображения, что делает его медленнее, чем простой визуализации темнопольным; Однако, это еще быстрее, чем выполнение подготовки выборки и визуализации с помощью электронной микроскопии. Кроме того, сложные системы могут привести к нескольким характерным спектрам, которые требуют развития узкоспециализированных управления и сделать создание стандартизированных универсальных справочных библиотек сложных 26. Наконец, технологияNique приводит низким разрешением, чем через зонд или электронной микроскопии методами, такими как атомно-силовой микроскопии или электронной микроскопии, которые могут разрешить отдельные атомы. Разрешение этой техники является ограниченным из-за его фотонной природы, которая предотвращает его от высокоточный инструмент для измерения размеров частиц в нанометровом уровне или для точной локализации материалов на уровне субмикронных. В то время как этот метод может быть в состоянии определить частицы в определенных средах ткани или клеточных органелл больше 1 мкм (например, клеточные ядра), меньшие органеллы или функции являются сложными для визуализации точно с помощью этого метода. Также следует отметить, учитывая его пространственное разрешение, этот метод не может различать отдельных наночастиц и агломератов 11.
Другие соображения включают в себя: некоторые материалы (например, благородных металлов) имеют гораздо более высокий коэффициент отражения и различные спектральные профили, которые могут сделать их легче анаZE и спектрально карту с помощью этого инструмента. Другие, такие как оксиды полуметаллических исследованных в этом исследовании и углеродных наноматериалов 24, 27, может быть более сложной, из-за их элементного состава, формы, и в зависимости от матрицы. В двух мышиных ингаляционных исследований по Mercer и др., Подобная система с одной используемой в данном исследовании была использована для того, чтобы найти углеродных нанотрубок в легких и в средних органов в зависимости от их чрезвычайно высокой контрастностью с окружающими тканями. Тем не менее, гиперспектрального отображение не была продемонстрирована в обоих исследованиях, вероятно, потому, что уникальная форма углеродных волокон была достаточно черта для идентификации. Еще одно соображение относится конкретно к тканям: с нанесения наночастиц интерес к определенным органам по обычным биофизических процессов непредсказуемо (и часто сам предмет исследования), определение применимого положительного контроля может быть трудным и требует рассмотрения того, как поколение управления мIGHT влияет на состояние интересующего материала. Например, если спектральная библиотека создана из нетронутых наночастиц интерес, может быть трудно отобразить библиотеку на тех же наночастиц в ткани или клетки за счет изменений в спектре в результате изменения частицы (например, в связи с изменением рН, растворение, агломерация, связывание белка) и в целом микросреда или матрица. Наконец, метод ограничен в своей полуколичественного характера: он может быть только в количественной других методов двумерной микроскопии аналогичное решение, что означает, что не может быть легко использована для выполнения задач, таких как, характеризующий общее органа нагрузку материала.
В целом, EDFM и HSI обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с обычными наноматериал изображений и характеристика методов, таких как ТЕМ, HAADF и DIC. EDFM / HSI позволяет быстрее получения изображения и анализа, что позволяет экономить время и затраты по сравнению с более интенсивной Конвенные методы. Кроме того, подготовка проб для EDFM / HSI, как правило, как минимальная и неразрушающего, что экономит время, а также позволяет более гибко анализа данного образца, так как это может быть использовано для других методов. Кроме того, HSI является универсальным, что позволяет анализа наноматериалов многих композиций и в различных матриц. Исследовательская группа работает для уточнения способа, описанного здесь для других материалов и типов образцов, в том числе в углубленной оценки специфики технологии. Критический следующий шаг под следствием исследовательской команды проверка этих методов против традиционных золотых стандартов (например, комбинационного рассеяния, ПЭМ, РЭМ) для материалов и типов тканей, представляющих интерес.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x 1.45 mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
References
- Sun, W., et al. Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy. Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).
- Anselme, K., et al. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).
- Anshup, A., et al. Growth of gold nanoparticles in human cells. Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).
- Weinkauf, H., et al. Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae. Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).
- Sondi, I., et al. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria. J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).
- Berry, C. C. Possible exploitation of magnetic nanoparticle cell interaction for biomedical applications. J Mater Chem. 15 (5), 543-547 (2005).
- Chithrani, B. D., et al. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein coated gold nanoparticles of different sizes and shapes. Nano Lett. 7 (6), 1542-1550 (2007).
- Chithrani, B. D., et al. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6 (4), 662-668 (2006).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV 1. J Nanobiotechnol. 3 (6), 1-10 (2005).
- Carlson, C., et al. Unique cellular interaction of silver nanoparticles size dependent generation of reactive oxygen species. J Phys Chem. 112 (43), 13608-13619 (2008).
- Roth, G. A., et al. Hyperspectral microscopy as an analytical tool for nanomaterials. WIREs Nanomed Nanobiotechnol In Press. , (2015).
- Williams, P., et al. Maize kernel hardness classification by near infrared (NIR) hyperspectral imaging and multivariate data analysis. Anal Chim Act. 653 (2), 121-130 (2009).
- Ziph Schatzberg, L. Hyperspectral imaging enables industrial applications. Industrial Photonic. , (2014).
- Sun, D. W. Hyperspectral imaging for food quality analysis and contro. , Elsevier. (2010).
- ElMasry, G., et al. Hyperspectral imaging for nondestructive determination of some quality attributes for strawberry. J Food En. 81 (1), 98-107 (2007).
- Mortimer, M., et al. Potential of hyperspectral imaging microscopy for semi quantitative analysis of nanoparticle uptake by protozoa. Environ Sci Techno. 48, 8760-8767 (2014).
- Sarlo, K., et al. Tissue distribution of 20 nm 100 nm and 1000 nm fluorescent polystyrene latex nanospheres following acute systemic or acute and repeat airway exposure in the rat. Toxico. 263, 117-126 (2009).
- Husain, M., et al. Pulmonary instillation of low doses of titanium dioxide nanoparticles in mice leads to particle retention and gene expression changes in the absence of inflammation. Toxicol Appl Pharmacol. 269, 250-262 (2013).
- Meyer, J. N., et al. Intracellular uptake and associated toxicity of silver nanoparticles in Caenorhabditis elegan. Aquatic Toxicol. 100, 140-150 (2010).
- Badireddy, A. R., et al. characterization and abundance of engineered nanoparticles in complex waters by hyperspectral imagery with enhanced darkfield microscopy. Environ Sci Technol. 46 (18), 10081-10088 (2012).
- Dettmeyer, R. F. Staining techniques and microscopy Forensic histopathology fundamentals and perspectives. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. vol 26 issue 453 370 (2011).
- Titford, M. Progress in the development of microscopical techniques for diagnostic pathology. J Histotechnol. 32 (1), 9-19 (2009).
- Kumar, G. L. Special stains and H&E. , Dako North America. Carpinteria, California. (2014).
- Manolakis, D., et al. Hyperspectral image processing for automatic target detection applications. Lincoln Laboratory Journal. 14 (1), 79-116 (2003).
- Mercer, R. R., et al. Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi walled carbon nanotubes. Part Fibre Toxicol. 8 (1), 21 (2011).
- Kim, M. S., et al. Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety. T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Part Fibre Toxico. 10 (1), 38 (2013).
