Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Den bm12 Induserbare Modell av systemisk lupus erythematosus (SLE) i C57BL / 6 Mus

Published: November 1, 2015 doi: 10.3791/53319
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center and University of Cincinnati College of Medicine

Introduction

Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en kompleks autoimmun sykdom karakterisert prototypically av anti-nuclear antistoff (ANA) produksjon og glomerulonefritt. En rekke andre følgesykdommer, inkludert dermal, hjerte-lunge, og lever lesjoner er assosiert med sykdom hos noen individer. Prevalensestimater i USA varierer mye, fra 150,000-1,500,000 1,2, med spesielt høy forekomst hos kvinner og minoriteter 3. Selv om etiologien av SLE har vært vanskelig å skjelne, er det tenkt å oppstå fra samspillet mellom ulike genetiske og miljømessige faktorer, som kulminerer i systemisk autoimmunitet.

Mange dyremodeller har blitt ansatt for å studere faktorer som fører til sykdomsutbruddet og progresjon. Klassiske musemodeller av SLE inkludere genetisk predisponerte musestammer inkludert NZB x NZW F1-modellen og dens derivater, NZM MLR / lpr-stamme, og den BXSB / Yaa belastning, og induserbare systemer, slik som p-ristane og kronisk graft-versus-host-sykdom (cGVHD) modeller 4. Tidlige rapporter om autoantistoff produksjon i GVHD modeller brukt ulike musestammer eller hamster stammer for foreldre til F1 overføringer 5 - 8; vanligste metodene som brukes for å studere lupus-lignende sykdom for tiden omfatter DBA / to foreldre → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, og bm12 overføring modellen beskrevet her. Hver modell har sine egne begrensninger, men de vanligvis har et felles sett med funksjoner som korrelerer med kliniske sykdom hos mennesker. De oftest rapporterte parametre i musemodeller inkluderer splenomegali, lymfadenopati, nefritt, ANA produksjon, og på cellenivå, utvidelse av T follikulære hjelpeceller (TFH), germinale sentrum (GC) B-celler og plasmaceller.

Den induserbare bm12 modellen oppnås ved adoptiv overføring av lymfocytter fra IA bm12 B6 (C) - H2 - Ab1 bm12 / KhEgJ (bm12) mus, en stamme identical til C57BL / 6 med unntak av 3 aminosyresubstitusjoner på MHC klasse II, i IA b C57BL / 6 (B6) mus. Alloactivation av donor CD4 T-celler hos mottakeren APC fører til cGVHD med symptomer som likner SLE. Nærmere bestemt, disse inkluderer ekspansjon av donor-avledede TFH, utvidelse av mottaker GC-avledede B-celler og plasmaceller, og produksjon av ANAS inkludert anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-kromatin, og anti-RBC-antistoffer 9. Over tid resipientmus utvikle glomerulonefritt assosiert med IgG innskudd i glomerulær, interstitiell og vaskulære regioner i nyrene 10. Vi har nylig vist at, i likhet med human sykdom, er det også en avgjørende rolle for type I-IFN i denne modellen 11. Spesielt, de definerende kriterier for human SLE ​​inkluderer utvikling av nefritt forenlig med SLE i nærvær av anti-dsDNA-antistoffer 12, som begge er fremtredende trekk ved denne musemodell.

Det er i seg selvVeral fordeler ved bm12 modellen i løpet av de spontane modeller. Classic-modellene som utvikler SLE-lignende tegn spontant stole på enten hybridmusestammer, innavlede musestammer ikke på B6 bakgrunn, eller store genetiske loci på B6 bakgrunn, som gjør krysset til knockout eller på annen måte genmodifiserte mus vanskelig og tidkrevende. Med bm12 induserbare modellen, kan genetisk modifiserte mus tjener som enten donor eller mottaker, slik at mer rask identifisering av den cellulære rommet i hvilket bestemte gener kan være viktig for sykdom. Videre er sykdomsutvikling i bm12 modellen mye raskere, krever bare to uker til utseendet ANAS, sammenlignet med flere måneder for de spontane modeller. Videre, i motsetning til de spontane modeller som utvikler sykdom ved forskjellige tidspunkter, sykdomsutbruddet og progresjon i bm12 → B6 modellen er meget synkronisert. Dette åpner for generering av riktig størrelse årskull som kan be brukt for intervensjons eller terapeutiske strategier på ethvert stadium i sykdomsutviklingen.

Det følgende er en detaljert protokoll for å initiere SLE-lignende autoimmunitet ved adoptiv overføring av bm12 lymfocytter inn i C57BL / 6-mus, eller genetiske varianter på B6 bakgrunn. I tillegg, beskriver vi en strømningscytometrisk fargeprotokoll for opplisting TFH, GC-B-celler og plasmaceller-celletyper assosiert med human sykdom. Viktigere, kan disse protokollene også brukes til å karakterisere sykdom i de fleste musemodeller av SLE og identifisere TFH, GC-B-celler og plasmaceller i andre sykdomsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal arbeidet ble utført under patogenfrie forhold i henhold til retningslinjer fastsatt av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International og vår Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

MERK: Innarbeide mus som uttrykker en congenic markør som CD45.1 på hver giver eller mottaker dyr hvis mulig, fordi dette åpner for overvåking av donor pode effektivitet og spesifikk utvidelse av donor CD4 T-cellepopulasjon. Hvis de vurderer bruk av ellers genmodifiserte mus som giver eller mottaker, sikre belastningen er riktig backcrossed til B6 bakgrunn, eller overførte cellene kan avvises-dette vil bli behandlet i større detalj i de representative resultater og diskusjonsdelene.

MERK: Følgende prosedyrer detalj volumer for høsting fire donor bm12 mus, noe som bør gi nok celler til å injisere 12-16 mus. Sekstil tolv uker gamle bm12 mus gi om lag 100-140 millioner lymfocytter med ca 25% CD4 T-celler. Ved å starte med forskjellige antall mus eller forskjellige musestammer, skala volumer opp eller ned tilsvarende. C57BL / 6-mus generelt gir tilsvarende utbytter med tettere til bare 20% CD4-T-celler.

MERK: Utfør alle trinn ved RT og bruke RT media for å unngå varme og kuldesjokk, noe som kan svekke langsiktig lymfocytt levedyktighet. Utfør vev innhøsting og vev-behandlingstrinn i en vev kultur hette ved hjelp av aseptisk teknikk. Alle medier i denne protokollen er IMDM med 10% varme-inaktivert FBS, med mindre annet er angitt, og vil bli bare referert til som "fullstendig medium".

1. Novel Metode for Genotyping bm12 Mus

MERK: En kort restriksjonskutting-basert protokoll for genotyping er gitt her, som en enkel og rimelig alternativ til sekvensering, som er i dag den eneste publiserte genotyping metodefor disse mus.

  1. Isolere genomisk DNA fra mus haler. Vennligst referer til en tidligere Jove artikkelen for detaljerte protokoller på musehaleklipping og generering av cDNA fra halen fordøyer 13.
  2. Utføre en revers-transkriptase polymerisert kjedereaksjon (PCR) for å amplifisere en 14 felles 474 bp DNA-fragment fra MHC-II IA IA bm12 b og ved anvendelse av primere og termo betingelser som er oppført i tabell 1.
  3. Utføre restriksjonskutting på ~ 7 pl av PCR-produktet ved bruk av enzymet PsuI, eller en av dens isoschizomers (BstX2I, BstYI, MflI eller XhoII) som spalter villtype IA b, men ikke IA bm12 mutant. Følg fordøye protokollen gitt av produsenten, som vil angi en blanding av vann, buffer og enzym, og en inkubasjon av 5 min. til flere timer ved 37 ° C 15.
  4. Last fordøye produkt og kjørt på en polyakrylamidgel% med etidiumbromid 14 i 30-45 min. på en50V-skjønt optimale spenning og tid vil variere avhengig av PCR gelapparatur brukt. Visual DNA-band med et UV-lys. Representative resultater er vist i figur 1.

Figur 1
Figur 1. Representant bm12 genotyping resultater.
Å identifisere mus homozygot for IA bm12 / bm12, ble hale DNA screenet for bm12 av PCR / begrensning fordøye genotyping (trinn 1). Homozygot villtype (IA b / b) DNA gir to band på 227 og 247 bp (visualisert som en tykk band på ~ 250 bp); homozygot bm12 (IA bm12 / bm12) DNA gir ett band på 474 bp; og heterozygot (IA bm12 / b) DNA gir to band på ~ 250 og 474 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Høsting DonorCeller

  1. Sacrifice giver mus bruker Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) -godkjent primære og sekundære eutanasi metoder. For eksempel, avlive mus ved kvelning med CO 2 etterfulgt av halsdislokasjon.
  2. Bruk aseptisk teknikk, slakte spleens og lymfeknuter (overfladisk cervical, kjeve, brachialis, armhulen, mesenterisk, og lyske) inn i 15 ml rør inneholdende 10 ml komplett media som i 11-13.
    MERK: Se tidligere rapporter for detaljert lymfeknutedisseksjon protokoller 16 - 18. Denne modellen er også vellykket å bruke bare musesplenocyter for overføring, men i tillegg til lymfeknutene reduserer det nødvendige antall donor mus betraktelig.
  3. Generere en enkeltcellesuspensjon av mose lymfevev i trinn 2,2 ved 70 um celle siler ved hjelp av stempelet fra en sprøyte. For bedre avlinger, ikke overbelaste siler-bruk ~ 6 siler for hver 4mus behandlet, og skyll siler ofte mens behandlingen. Kombiner vev fra 4 mus i to 50 ml koniske rør, og cellene sentrifugeres i 5 minutter ved 400 xg, og dekanter supernatanten.
  4. Resuspender celler fra både koniske rør i 50 ml komplett medie og overføre til ny konisk rør. Hold dette røret ved RT.
    MERK: Fett fester seg til sidene av røret, og hvis røret ikke blir erstattet, kan slutt cellulære utbytter lide.

3. Donor Cell Counting

MERK: For å bevare den høyeste levedyktigheten, røde blodceller (RBC) lyse av hele prøven er ikke anbefalt.

  1. Bland enkelt celle suspensjon fra trinn 2,4 godt, fjern 1 ml og overføre den til et eget 50 ml konisk. Spar litt, urørte celler (49 ml) ved RT mens telling.
  2. Tilsett 3 ml av en ammoniumklorid-basert røde blodcellelysebuffer i 1 ml donorcelleprøve. Bland forsiktig i 1 min. av rocking, så fyll opp til 50 ml med komplett media, ennd Sentrifuger i 5 min. ved 400 xg og decant supernatant.
  3. Resuspender RBC-lysert celler i 10 ml komplett medie og telle (f.eks, med trypanblått bruke en hemocytometer). Multiplisere resultatet med 49 dette er det totale antall celler som er igjen i ikke-lyserte prøve som ble satt til side. Forkast RBC-lysert celler.

4. Donor Cell Merking og / eller CD4 T Cell Rensing

  1. Hvis ønskelig, rense CD4 T-celler på dette stadium, men dette er ikke nødvendig. I tillegg, hvis ønskelig, etikett celler med CFSE, som ved 19, eller andre cellesporingsstoffer, et eksempel på dette er vist i figur 4 av de representative resultater delen.
    MERK: For CD4 T-celle-rensing, er negative magnetiske utvalg anbefales, da det kan oppnå høy renhet og etterlater celler urørt med høy levedyktighet som beskrevet i 20. Det er viktig at endotoksin-frie buffere blir benyttet; Derfor, i stedet for BSA, gjør separasjon buffer with 2% FBS og den anbefalte konsentrasjonen av EDTA.

5. Injeksjon av Donor bm12 Cells

  1. Når telleren donorlymfocytter i trinn 3 (og renset eller merket som i trinn 4, som ønsket), sentrifuger cellene i 5 minutter ved 400 x g. Dekanter supernatanten og resuspender cellene i PBS med 120 millioner lymfocytter pr ml (eller 30 millioner rensede CD4 T-celler per ml). Overfør cellene til en steril 5 ml rundbunnet tube, eller annet sterilt rør som lett rommer en 1 ml sprøyte utstyrt med en 27,5 G x 13 mm nål.
  2. Før injeksjon sette en liten prøve av donorceller fra trinn 5,1 ved 4 ° C for å strømme farging for å bestemme prosentandelen av CD4 T celler i donorprøver. Beis disse prøver som beskrevet i trinn 8 ved hjelp av minimal antistoff-panelet (tabell 2).
    MERK: Hvis celler fra forskjellige musestammer blir brukt som separate donorer, er dette en viktig faktor, og hvis CD4 T-celle-prosenter variere betydelig, purreduser fuktighet kan være nødvendig.
  3. Bland cellene forsiktig, men grundig. Dette kan gjøres ved å pipettere opp og ned celler ved anvendelse av en 1 ml sprøyte uten en tilknyttet nål. Etter blanding trekke celler i 1 ml sprøyte. Fest nålen etter fjerning av luftbobler. Mens nålen holdes av mens grunning sprøyten hjelper opprettholde celle levedyktighet.
  4. Injisere 250 ul pr mus (som er lik 30 millioner lymfocytter, eller 7,5 millioner rensede CD4 T-celler per mus) intraperitonealt, som beskrevet i 21.
    MERK: I eksperimentene er vist her og i vårt tidligere arbeid 11, er hver mus injisert med 30 millioner totalt lymfocytter fra donorer bm12, snarere enn 100 millioner totale splenocytter som tradisjonelt anvendes. I upubliserte data fra vår lab, ble ikke observert noen forskjell i serum anti-dsDNA på dag 14 etter injeksjoner med 30 eller 100 millioner lymfocytter per mus. Selv om dette reduserer antallet mus som trengs for eksperimenter, utvikling av nefritt wit betydeligh dette antall celler ikke er blitt vurdert.

6. Bestem Pode Effektivitet

NOTE 1: Denne delen vil beskrive hvordan å fastslå graden av donorcelle pode i mottakeren på dag 3 for å identifisere eventuelle mus som har mottatt suboptimale injeksjoner (for eksempel er den pode i ett muse <10% av det man ser i alle andre mus fra samme gruppe). Disse dataene kan også bidra til å bestemme hvorvidt celler fra en genmodifisert mus belastningen blir avvist på senere tidspunkter (for detaljer, se representative resultater delen, figur 6).

MERK 2: Denne delen er bare mulig hvis givere og mottakere er fra mus på ulike congenic bakgrunner, for eksempel, når du bruker CD45.1 bm12 givere og CD45.2 C57BL / 6 mottakere, eller når donorceller er merket med en celle sporing fargestoff. Viktigere, 3 dager etter injeksjon, har CD4 T-celler gått minimal utvidelse (seavsnitt e representative resultater, figur 4), slik at forskjellene observert i podningsgrad skyldes variasjon i injeksjoner, ikke ekspansjon.

  1. Anesthetize mus med 4% isofluran eller andre IACUC-godkjent metode. Test bakre foten reflekser for å sikre mus er skikkelig bedøvet før du fortsetter til blodprøvetaking.
  2. Høste 100-200 mL blod ved hjelp av en IACUC-godkjent metode, for eksempel retro-orbital punktering som i 22. Samle opp blod inn i individuelle 0,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende en anti-koagulant, slik som plasma prøverør det refereres til i tabell materialer, som inneholder frysetørket dikalium EDTA. Etter blodprøvetaking, trykk forsiktig til musen øye med en steril håndkle eller gasbind for å sikre at blødningen stopper, og deretter plassere musen tilbake i sitt hjem buret der det vil gjelde til den endelige vev innhøsting (trinn 7).
    MERK: Ikke la mus uten tilsyn til mus har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet tilopprettholde ventral recumbency, og ikke tilbake mus til selskapet av andre før fullt restituert.
  3. Bringe blodvolumet til 500 ul med 21 ° C PBS og overfør til konisk bunn mikrosentrifugerør, deretter sakte underlag 200 ul av 21 ° C med høy tetthet celleseparasjons løsning med en 200 ul pipette, er forsiktig for å minimere blanding mellom de to fasene ( se Materialer tabell for anbefalte løsninger). Sentrifuger cellene ved 700 xg i 20 min ved 20-25 ° C med sentrifuge bremsen settes til lav.
  4. Fjern topplag som inneholder lymfocytter med en 1 ml pipette og overføre til en ny mikro rør som inneholder 800 mL kald komplett media. Forsiktig vortex å blande celler. Sentrifuger cellene ved 700 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og dekanter supernatanten.
  5. Resuspender celler i 200 pl komplett medium, overføring til en 96-brønn U-bunnplaten, og beis for flowcytometri som beskrevet i trinn 8 ved hjelp av en minimal antistoff panel (tabell 2) for å bestemme tHan relative overflod av CD4-T-celle-graft som en prosentandel av PBMC.

7. Endelig Tissue Harvests

MERK: Forsøkene som er beskrevet i resultatene delen ble høstet 14 dager etter injeksjon av donorceller (eller i noen tilfeller mindre tid), som de fokuserer på den første utviklingen av TFH celler og plasmaceller; men siden denne modellen er en kronisk GVHD modell for SLE, sykdom kan overvåkes ved mye senere tidspunkter. Den optimale tidsrommet vil avhenge av den forskning spørsmålet som stilles i hvert enkelt eksperiment.

  1. På et forutbestemt tidspunkt etter injeksjon av bm12 donorceller (trinn 5.4), ofre mus ved hjelp av en IACUC-godkjent metode for eutanasi. Kvelning med CO 2 etterfulgt av exsanguination anbefales. Cervikal dislokasjon kan fungere som en sekundær metode for eutanasi, men dette kan redusere blodprøvetaking utbytte.
  2. Fukt magen av musen lett med en sprayflaske som inneholder 70%etanol. Lag en liten, overfladisk snitt med kirurgiske saks ca 1 cm over genitalia. Trekke tilbake huden på magen mot sternum, er forsiktig med å holde peritoneal fascia intakt.
    MERK: Syke mus vanligvis stede med 0,5-3 ml ascites på dag 14, som, selv om det ennå ikke er godt karakterisert, kan måles og analyseres som en ekstra sykdom parameter.
  3. Monter en 5 ml sprøyte med en 18 G nål. Sett nålen inn i den nedre høyre kvadrant av abdomen med nålen rettet opp mot dyrets hode og ved 15 ° vinkel i forhold til planet til fascia. Plasser nålespissen nær cecum for å hindre at nålen tettes med tarmen mens aspirere ascites.
  4. Rotere forsiktig musen på sin side, deretter sakte trekke ascites inn i sprøyten. Når ascites har blitt gjenopprettet, fjern sprøyten og registrere aspirer volum, basert på de volumetriske markeringene på siden av Syringe.
  5. Utslipps ascites i en 5 ml rundbunnet rør og butikken på is for senere behandling.
  6. Høste blod via trekning fra inferior vena cava (IVC) i hovedsak som i 22. Bruke kjedelig pinsett, forsiktig flytte tarmene til venstre side av musen, avdekke IVC. Sett en 27,5 G nål montert på en 1 ml sprøyte inn i IVC og langsomt trekke 400-500 ul blod.
  7. For å minimere hemolyse, sakte injisere blod inn i en 0,5 ml mikro serum eller plasma samling rør. For senere serum analyse av Anas av ELISA, holde blodet på is.
  8. Dissekere og innhente ytterligere relevante vev (milt og, hvis ønskelig, lymfeknuter og nyrer, spesielt hvis samle på senere tidspunkter og glomerulonefritt scores). Fjerne milten ved forsiktig å plassere tarmen tilbake mot høyre side av dyret, og å trekke i bukspyttkjertelen, som er milten primære bindevev.
  9. Fjern eventuelle bukspyttkjertelen igjen, deretter veiespleens på en høy presisjon balanse umiddelbart etter disseksjon, som brutto splenomegali er et vanlig rapportert parameter i musemodeller av SLE. Plasser lymfevev i individuelle 1,5 ml rør fylt med 1 ml komplett medie på is. Fix nyrer i 10% nøytral bufret formalin eller knipse fryse nyrer for senere histologi som i 23.
  10. Sentrifuger blod innen 2 timer av samlingen i 3 min. ved 10.000 xg (4 ° C). Fjern serum og oppbevares ved -80 ° C for senere analyser av ANA ved ELISA. Referere til tidligere rapporter for detaljert ANA ELISA protokoller 24,25. Lagres serum i multiple 10-20 ul aliquoter å minimal fryse / tine-sykluser, og tillater et større antall fremtidige analyser.
  11. Sentrifuger ascites 400 xg i 5 min. Fjern supernatanten med en 1 ml-pipette, og i flere alikvoter 0,5 ml rør. Fryse supernatanten ved -80 ° C for senere analyser av anti-nukleære antistoffer (ANAS) eller andre oppløselige inflammatoriske mediatorer.
  12. Resuspender cellular desimalplasser du skal bruke ion i løpet av ca. 1 ml komplett medium og overføre 200 ul i en 96-brønners U-bunnplate for strømningen farging (som i trinn 8).
  13. Mos hver milt gjennom 70 mikrometer celle siler inn i separate rør og skyll med komplett media. Resuspender splenocytter med 1 ml kald lyseringsbuffer RBC i 1 min. og bland forsiktig med rocking. Bringe volumet til 10 ml med kaldt komplett medium og sentrifuger i 5 minutter ved 400 xg, og dekanter supernatanten.
  14. Resuspender cellepelleten i 5 ml komplett media og telle ved hjelp av en hemocytometer. Juster volumet slik at 200 ul av komplett medie inneholder 1-3 millioner celler. Begynn farging for flowcytometri (trinn 8) ved hjelp av en utvidet panel (tabell 2) for å kvantifisere donor CD4 T-celle og B-celledifferensiering mottaker og ekspansjon.
    MERK: Avhengig av hva laser, fotomultiplikatorrør (PMT), og filter set kombinasjoner er tilgjengelige, separering av T- og B-celle analyse panelet inn flere paneler kan være nødvendig.
ve_title "> 8. Flow Farging

  1. Overføring 1-3 millioner miltceller i 200 pl komplett medium i individuelle 5 ml rundbunnet rør, eller i separate brønner i en 96-brønns U-bunnplate.
    MERK: Ved hjelp av en 96-brønns plate er en effektiv måte å farge flere prøver, men ta vare på plate prøver i alle andre brønnen for å hindre krysskontaminering. En 96-brønns plate kan følgelig holde 24 prøver.
  2. Sentrifuger plate ved 500 xg i 3 min., Deretter flick supernatant fra plate til passende (biohazard) container.
  3. Resuspender cellepelletene med 100 mL av strømnings buffer (1% FBS i PBS) inneholdende et fargestoff fikseres levedyktighet ved produsentens anbefalte konsentrasjon og renset anti-CD16 / anti-CD32-antistoff cocktail ved 1 pg / ml. Inkuber i 10 min ved 20-25 ° C, og deretter legge 100 mL kalde komplette media å slukke levedyktighet fargestoff.
    MERK: Splenocytter fra syke mus vanligvis inneholder relativt høye antallet døde eller døende celler;Derfor er inkluderingen av en levedyktighet fargestoff anbefalt å unngå ikke-spesifikt antistoff merking av døende celler, noe som resulterer i renere, mer pålitelige data. På lignende måte er anti-CD16 / anti-CD32 cocktail inkludert for å blokkere ikke-spesifikk fluorescens-merkede antistoff-binding av Fc-reseptorer.
  4. Sentrifuger plate ved 500 xg i 3 min., Deretter flick supernatant fra plate til biohazard container. Resuspender celler i 200 ul buffer. Strømning Sentrifuger plate ved 500 xg i 3 min., Deretter flick supernatant fra plate til biohazard container.
  5. Resuspender celler i 50 pl buffer inneholdende antistoff strømnings cocktail (tabell 2). Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C, tilsett deretter 150 ul strømnings buffer. Gjenta vasketrinn 8.4.
  6. Resuspender cellene med 100 ul 2% paraformaldehyd i PBS. Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C, tilsett deretter 100 ul strømnings buffer. Sentrifuger plate ved 500 xg i 3 min., Deretter flick supernatant fra plate til biohazard container.
  7. Resuspend i 200 ul flyt buffer, overføre til å flyte tube innstikk eller standard strømningsrørene, legge til en ekstra 100-200 mL flyt buffer, og oppbevares ved 4 ° C i mørket til å anskaffe på strømningscytometer.
  8. Tilegne seg på en flowcytometer utstyrt med de riktige lasere og PMTs for de valgte antistoffpaneler i flere dager etter farging. Record forover spredning bredde og / eller høyde, i tillegg til å videresende spredningsområdet, sidespredning området, og området av de fluoriserende parametere utnyttes. For pålitelige resultater, erverve ≥1,000 donorceller i hver WT prøve, eller et tilsvarende antall totale lymfocytter i genmodifiserte eller på annen måte manipulert mus som viser minimal utvidelse av donorceller, der samling av så mange hendelser ikke kan være gjennomførbart.
    MERK: Flowcytometri analyser er beskrevet i detalj i den representative resultater seksjonen (figur 3 - 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Syke mus utvikler splenomegaly i så lite som 14 dager, viser spleens 2-3 ganger størrelsen av sunn mus i form av masse og cellularity (figur 2).

Splenocytter sekvensielt inngjerdet på lysspredning (FSC-A ved SSC-A), eliminering av dubletter (FSC-W eller -H av FSC-A), levedyktige celler (lav farging av levedyktighet fargestoff), og CD4 + TCRβ + (figur 3A). Donorceller skiller seg fra mottakerceller basert på CD45.1 og CD45.2 (figur 3B, nederst til venstre). Donorceller hovedsakelig innta en follikulær T hjelper (TFH) celle-fenotype, som kjennetegnes ved oppregulering av PD-1, CXCR5, Bcl-6, og ICOS (figur 3B, C). En del av mottaker CD4 T-cellepopulasjonen som skiller også inn i TFH (figur 3B, nederst til høyre). Etter en innledende pres av og / eller migrering av celler som overføres, er utvidelsen av donor-avledede TFH logaritmisk, reaching 10-20 millioner celler i milten hos mus 14 dager etter injeksjonen (figur 3D).

CFSE-merking av overførte lymfocytter viste at donor CD4 T-celler differensierer til TFH tidlig etter aktivering; hovedsak alle delt celler observert på dag 3, 7 og 14 oppregulert CXCR5 og PD-1 (figur 4). De spredning rush profiler tyder også på at en relativt lav andel av donor CD4 T-celler gikk alloactivation og divisjon. Ved dag 14 var de fleste av de detekterbare donorcellene er de som har delt utover det maksimale antallet inndelinger målbare ved CFSE.

Utvidelsen av donor-avledede TFH er ledsaget av en tilsvarende akkumulering av endogent GC-B-celler og plasmaceller (Figur 5A). Plasmacelle akkumulering i milten er forsinket i forhold til den for TFH, som ikke viser noen økning i forhold til ubehandlede dyr på dag 3 eller 7 (figur 5B). Accordingly, anti-nukleære antistoffer er ikke lett detekterbare før dag 9 (data ikke vist), men kan kvantifiseres på dag 14 11.

Gjennom bruk av congenic markører, har vi observert avvisning av donorceller i flere stammer. Selv om dette er et vanlig problem når mus ikke er tilstrekkelig backcrossed til C57BL / 6 bakgrunn, vi også observert avvisning når bm12 cellene ble overført til B6.PL- Thy1 a / ​​CyJ (CD90.1) mus som er generelt ansett for å være fullt backcrossed. Derfor blir mus rutinemessig undersøkt ved dag ~ 3 ved flow fargingsblodprøver for å bedømme effektiviteten av den første CD4 T-celle-transplantat; Vi vet fra CFSE spredning eksperimenter som podet celler har utvidet svært lite på dette tidlige tidspunkt. Disse resultatene blir deretter sammenlignet med resultatene som oppnås ved dag 14 innhøsting. I et eksempel tilfelle for avvisning, ble 30 millioner CD45.1 + bm12 lymfocytter overført til Cardif - / - Mus som var blitt backcrossed til C57BL / 6 mus i 12 generasjoner. På dag 5, alle musene viste tilsvarende poding (2-3% av sirkulerende CD4 T-celler), men ved dag 14, ble bm12 donorceller fullstendig eliminert fra genetisk modifiserte mottager (figur 6).

Figur 2
Figur 2. Spleen vekstkinetikk etter injeksjon av bm12 lymfocytter Miltene ble veid på en høy presisjon balanse direkte etter eksisjon (til venstre).. Levende celletall ble bestemt ved telling med et hemocytometer ved hjelp av trypan-blått for å ekskludere døde celler (høyre). Resultatene er avbildet som gjennomsnitt ± SEM, der n = 9, 4, 3 og 6, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

jpg "/>
Figur 3. Analyse av T-hjelpercelle follikulært ekspansjon i bm12 modell for SLE. CD45.1 + bm12 lymfocytter ble overført til C57BL / 6 mottakere og miltene ble analysert 14 dager senere. (A) Representant gating strategi som viser "lymfocytter" (første panel), "enkeltceller" (andre panel), "levende celler" (tredje panel), og "CD4 T-celler" (fjerde panel). (B) Donor-celler skiller seg fra mottaker CD4 T-celler ved CD45.1 og CD45.2 farging og analysert for ekspresjon av PD-1 og CXCR5. (C) donorceller innta TFH fenotype, som angitt ved oppregulering av flere proteiner som vanligvis forbindes med TFH. (D) Typiske resultater som viser utvidelse av donor-avledede TFH (definert som CD4 + CD45.1 + PD-1 + CXCR5 + levende celler) på dag 3, 7 og 14 etter overføring. Resultatene er avbildet ens gjennomsnitt ± SEM, der n = 5, 4, 3 og 6, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. PD-1 og CXCR5 er oppregulert på delende celler. Bm12-celler ble merket med CFSE forut for injeksjon i C57BL / 6 mottakere. Representative strømnings tomter er vist for donor CD4 T-celler på 3, 7 og 14 dager etter injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Utvidelse av miltplasmaceller og GC B-celler. (A) Representative strømnings plott fra naive mus spleens, eller de framus 14 dager etter CD45.1 + bm12 overføring. Plasmaceller er definert som CD138 + CD19 lave levende celler (topp paneler). GC B-celler er en undergruppe av CD19 + B-celler, som uttrykker GL-7 og Fas (bunnflater). (B) kvantitative data viser akkumuleringen av miltplasmaceller over tid. Resultatene er avbildet som gjennomsnitt ± SEM, der n = 5, 4, 3 og 6, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Bm12 grafts er avvist av noen genmodifiserte resipientmus. CD45.1 + bm12 lymfocytter ble overført til enten genmodifiserte mus (topp paneler) eller C57BL / 6 (bunn paneler) resipientmus. Mus ble tappet på 5 dager etter injeksjon og vurdert for pode effektivitet. Splenocytts fra de samme musene ble analysert 14 dager senere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Primer Name Sekvens (5 '- 3') Gløding Temperatur
Bm12F CGTGGTCCCCGCTGTCCCCC * 65 ° C
Bm12R GGGCAGAGGGCAGAGGTGAG
Segment Antall sykluser Temperatur Varighet
1 1 95 ° C 2 min.
2 40 95 ° C 15 sek.
* 65 til 0,5 ° C / step 15 sek.
72 ° C 45 sek.
3 1 72 ° C 10 min.

Tabell 1:. Primere og termo betingelser for bm12 genotyping termo Optimale betingelser vil være avhengig av de nøyaktige reagenser og instrumenter som brukes. Disse forholdene har blitt optimalisert for en termo stand til å endre glødetemperatur på alle trinn, men protokollen kan også arbeide med en statisk utglødningstemperatur.

Tabell 2
Tabell 2:. Antistoff paneler for splenic TFH, GC B og plasma celle identifisering av flowcytometri Presentert er paneler vi har brukt med hellfor å vurdere pode effektivitet på dag 3 (til venstre) og analyse av T- og B-celler på dag 14 etter bm12 celle injeksjon (i midten). Disse har blitt optimalisert for en LSRII med 5 lasere (355, 405, 488, 561 og 640 nm). Anbefalt filtersett for hver fluorokrom er listet opp (til høyre), selv om disse ikke kan være det beste alternativet for hver maskin. Avhengig av hva laser, PMT, og filter set kombinasjoner er tilgjengelige, separering av T- og B-celle analyse panelet inn flere paneler kan være nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den bm12 induserbare modellen er en forholdsvis enkel og effektiv måte å studere de molekylære og cellulære prosesser av SLE. Kronisk aktivering av adoptivt overført CD4 T-celler rettet mot selvantigener fører til akkumulering av TFH, GC-B-celler og plasmaceller som kan bli målt ved strømningscytometri, som beskrevet her. Fremtidige studier ved hjelp av denne modellen kan raskt og enkelt avhøre rolle kandidat gener og nye behandlingsformer i autoimmune germinale midt prosesser som ligner de som forekommer hos pasienter med SLE, og i siste instans styrer patologisk akkumulering av autoantistoffer. Videre kan flowcytometrisk analyse som er beskrevet her kan brukes til å studere ytterligere musemodeller som involverer utvikling av immunoglobuliner, inkludert, men ikke begrenset til autoimmunitet, infeksjon, og allergi.

Som alle dyremodeller av menneskelig sykdom, har denne modellen også sine begrensninger. Gitt hvor raskt sykdommen utvikops og dens størrelse, ikke alle gener som er involvert i utviklingen av SLE er sannsynlig å være nødvendig for patogenisiteten i denne modellen. I tillegg må man sørge for å utelukke podingsforkastelse når data tyder på minimal utvidelse av TFH i genmodifiserte mottakere. Congenic markører skal brukes for å bekrefte tilstedeværelsen av donorceller ved slakt spesielt siden mottakercellene kan differensiere til TFH (figur 3B), som ellers kunne maskere fravær av donorceller. Ved hjelp av congenic markører, observerte vi fullstendig eliminering av donorceller som tydeligvis næret avvisningsantigener ved dag 14 (figur 6). Vi har med hell brukt CD45.1 + bm12 og CD45.2 + bm12 mus som givere, og CD45.1 + BoyJ (B6.SJL- Ptprc en Pepc b / BoyJ) og CD45.2 + C57BL / 6 mus som mottakere (Tall 3, 6, 7, og upubliserte data). Imidlertid villtype congenicCD90.1 + -celler fra B6.PL- Thy1 a / ​​CyJ musestamme ikke graft godt, og heller ikke CD90.2 + bm12 celler pode brønn i en CD90.1 + mottaker (upubliserte data), et fenomen som er tydeligvis ikke er unik for denne modellen 26.

Enten C57BL / 6 eller bm12 mus kan tjene som en donor eller mottakeren, som opprinnelig beskrevet av Morris et al. 9 Men i vårt laboratorium finner vi overføring av bm12 celler til B6 mus produserer mer konsistent ekspansjon av T-celle og B-celle bestander på dag 14. Videre giver- og mottaker mus fra ulike grupper bør være kjønns- og alders matchet. Selv om forsøkene som er rapportert i den første beskrivelsen av bm12 modell funnet ingen signifikant forskjell i noen sykdom parameter mellom hann → hann- og hunn → kvinnelige overføringer 9, er hann → hunn overføringer ikke anbefales, da male antigen (HY) uttrykt av overførte CD4 T-celler kan indusere pode fettet av, gresskDette skjer i kvinnelige mottakere 27.

Ved valg av antistoffer og fluorokromer for congenic markører, bør det bemerkes at donorcellene blir positiv for mottakeren congenic markør i varierende grad, slik at en CD45.2 - gate vil ikke utgjøre hele CD45.1 + pode. Fenomenet er klart illustrert i en sammenligning av CD45.2 uttrykk ved CD45.1 + naive, CD45.1 + donor, og CD45.2 + mottaker CD4 T-celler (figur 7). Spesielt, donorceller synes også å oppregulere ekspresjon av sine egne congenic markør, sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 7). Lignende resultater er også sett med CD45.2 + bm12 overføring til CD45.1 + BoyJ mus (data ikke vist). Antagelig kjøp av mottaker CD45 resultater fra trogocytosis 28 av aktiverte CD4 T-celler etter gjentatte interaksjoner med mottaker B-celler. Faktisk bm12 modusl kan vise seg å være et nyttig verktøy i å studere fremgangs trogocytosis in vivo.

Figur 7
Figur 7. Donor celler skaffe mottaker CD45 congenic markør. CD45.1 + bm12 lymfocytter ble overført til CD45.2 + C57BL / 6 mottakere. Donor, mottaker, og naive (CD45.1 +) CD4 T-celler, vurderes for CD45.1 og CD45.2 uttrykk 14 dager etter overføring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Det har vist seg at overføringen av rensede bm12 CD4 T-celler til C57BL / 7 mus er tilstrekkelig til å initiere 29 sykdom; Men tilsvarende sykdommen utvikler seg når hele lymfocytter blir overført, og rensing er ikke nødvendigvis nødvendig for å studere sykdom avhengighet av T cell-egenverdi genuttrykk. Eisenberg og kolleger, viste tydelig at antistoffproduserende celle i bm12 modellen er nesten utelukkende av mottakeren opprinnelse 30. Videre er kravet for mottaker CD4 T-celler 10 begrenset til "pleie" av B-celler i løpet av deres utvikling, som kan være off-set ved tilsetning av eksogent IL-4 31, selv om våre data indikerer at mottakeren T-celler kan delta noe i germinal sentrum respons, som noen av dem gjør utvikle en TFH fenotype (figur 3B, nederst til høyre).

En viktig beslutning som må gjøres for hver bm12 eksperimentet er når man skal høste vev for analyser. Selvfølgelig beslutningen avhenger av nøyaktig hvilke faktorer som er viktige for denne studien, som kan variere. Forsøkene som beskrives her ta opp til 14 dager, som de fokuserer på den første utviklingen av TFH celler og plasmaceller; men siden denne modellen er en kroniskGVHD modell av SLE, kan sykdommen bli overvåket mye lenger. Faktisk visse kliniske trekk ved SLE, inkludert glomerulonefritt, utvikle senere. Proteinuri har blitt oppdaget så tidlig som 2 uker etter injeksjon, men når toppnivåer på 4-8 uker etter injeksjon 10,31. I tillegg analyserer flowcytometrisk beskrevet her har blitt optimalisert for eksperimenter som varer 2 uker. Vi finner en betydelig antall GC B-celler og plasmaceller på dette tidspunkt; selv, gitt ekstra tid, kan en stor andel av ANA-utskiller plasmaceller ligge i benmargen 32. Videre er de plasmaceller som er identifisert av denne strøm farging panel sannsynlig også omfatte plasmablasts-for å kunne skille mellom disse to celletyper, ville ytterligere antistoffer være nødvendig. TFH utvidelse antagelig når en topp på et tidspunkt etter at 14-dagers vindu som vi har fokusert. Men til vår kunnskap, har ingen studier rapportert bm12 donor celle nummer utover 2 uker, eller brukd congenic markører for å spore adoptivt overførte cellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ The Jackson Laboratory 001162 CD45.1+ BoyJ mouse strain
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ The Jackson Laboratory 001162 Bm12 mouse strain
FastDigest PsuI Life Technologies FD1554 Restriction digest enzyme for genotyping
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57
IMDM GE Healthcare SH30228.01
Plasma Separation Tube (PST) BD 365974 Blood collection tube with Dipotassium EDTA
Serum Separation Tube (SST) BD 365967 Blood collection tube with Clot activator / SST Gel
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02  High density cell separation solution
Lympholyte-M Cedarlane CL5030 High density cell separation solution
GL-7-biotin eBioscience 13-5902-82 
Streptavidin-BUV395 BD 564176
CD138-BV421 BioLegend 142508
CD4-BV510 BioLegend 100559
TCRβ-BV605 BD 562840
CD45.1-BV711 BioLegend 110739
CD45.2-FITC BioLegend 109806
PD-1-PE BioLegend 135206
CD19-PerCP BioLegend 115532
Fas-PE-Cy7 BD 557653
CXCR5-APC BioLegend 145506
Fixable Viability Dye ef780 eBioscience 65-0865-18
CD4-BV421 BioLegend 100443
1.2 ml FACS tube inserts, racked USA Scientific 1412-1400
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes BD 352017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
  2. Lupus Foundation of America Web Site. , Available from: http://www.lupus.org/answers/entry/what-is-lupus (2015).
  3. Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
  4. Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694 (2011).
  5. Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
  6. Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
  7. Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
  8. Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899 (1976).
  9. Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
  10. Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
  11. Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
  12. Petri, M., Orbai, A. -M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
  13. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012).
  16. Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265 (2007).
  17. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  18. Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , Available from: http://eulep.pdn.cam.ac.uk/Necropsy_of_the_Mouse/index.php?file=Chapter_3.html (2009).
  19. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259 (2010).
  20. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319 (2007).
  21. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771 (2012).
  22. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
  23. Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928 (2012).
  24. Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20 (2003).
  25. Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5 (2011).
  26. McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
  27. Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y. Nature. 376, 695-698 (1995).
  28. Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815 (2003).
  29. Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
  30. Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
  31. Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
  32. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).

Tags

Medisin T follikulær hjelpecelle (TFH) Germinal senter (GC) B-celle plasma celle ascites flowcytometri dyremodell anti-kjernekraft antistoff (ANA) autoimmunitet nefritt trogocytosis kronisk transplantat-mot -host sykdom (cGVHD) type I interferon (IFN)
Den bm12 Induserbare Modell av systemisk lupus erythematosus (SLE) i C57BL / 6 Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klarquist, J., Janssen, E. M. The… More

Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (105), e53319, doi:10.3791/53319 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter