Abstract
Anfälligkeit für Neuronen Zelltod zu Neurodegeneration und Ischämie verbunden sind außerordentlich im Alter von Gehirn erhöht, sondern Mechanismen verantwortlich sind schlecht bekannt. Exzitotoxizität, ein Verfahren angenommen, um Neuronenschaden durch beide Beleidigungen induzierte beizutragen, wird durch Aktivierung der Glutamat-Rezeptoren, Ca2 + -Einstrom und mitochondriale Ca 2+ Last fördert vermittelt. Eine wesentliche Änderung der intrazellulären Ca 2+ Homöostase oder Umbau von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase kann Neuronenschäden in alten Nervenzellen begünstigen. Zur Untersuchung von Ca 2+ Umbau im Altern haben wir Live Cell Imaging in Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampus-Neuronen, die in einigen Aspekten im Alter von Neuronen in vivo ähnlich verwendet. Zu diesem Zweck Hippocampus-Zellen sind, in erster Linie frisch aus neugeborenen Ratten-Hippocampus dispergiert und auf poli-D-Lysin beschichteten Deckgläser plattiert. Dann Kulturen werden in kontrollierten Medien für mehrere Tage aufbewahrt oder mehrere wochen zur Untersuchung von jung und alt Neuronen auf. Zweitens werden kultivierten Neuronen mit Fura2 verladen und nach Messungen des cytosolischen Ca 2+ -Konzentration mit digitalen Fluoreszenzverhältnis Bildgebung unterzogen. Drittens werden kultivierten Neuronen mit Plasmiden ein Tandem von geringer Affinität Aequorin und GFP zu Mitochondrien ziel transfiziert. Nach 24 Stunden wird Aequorin in Zellen mit Coelenterazin rekonstituiert und Neuronen zu Biolumineszenz-Bildgebung für die Überwachung der mitochondrialen Ca 2+ -Konzentration ausgesetzt. Dieses Drei-Schritt-Verfahren erlaubt die Überwachung der cytosolischen Ca 2+ und mitochondriale antwortet relevante Stimuli wie zum Beispiel die Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA und Vergleichen, ob diese und andere Ergebnisse werden durch Alterung beeinflußt. Dieses Verfahren kann neue Erkenntnisse darüber, wie Alterungs Einfluss zytosolischen und mitochondrialen Ca 2+ Antworten auf ausgewählte Stimuli sowie die Prüfung der ausgewählten Medikamente zur Verhinderung von Neuronenzelle gerichtet ergebenTod im altersbedingten Krankheiten.
Introduction
Exzitotoxizität ist einer der wichtigsten Mechanismen, der einen Beitrag zur Neuronenschädigung und Zelltod in neurologischen Beleidigungen wie Ischämie und in einigen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit ein. Diese Art von Neurotoxizität wird hauptsächlich durch Glutamat wirkend auf Ca 2+ vermittelte -durchlässigen, ionotropen NMDA-Rezeptoren (NMDAR) 2. Exposition von kultivierten Neuronen Glutamat kann Exzitotoxizität 3, die neuronale Apoptose 4 verursacht führen. Wir und andere haben bereits berichtet, dass die neuronale Anfälligkeit für NMDA-induzierte Apoptose bei der Entwicklung in vitro und Alterungs 5-8 ändern.
Es ist weithin anerkannt, daß eine Erhöhung der cytosolischen freies Ca 2+ -Konzentration ([Ca 2+] cyt) führt zu Zellen-Aktivierung. Allerdings, wenn dieser Anstieg zu hoch ist und / oder genug aufrechterhalten, kann Zelltod 9 auszulösen. Außerdem wurde vorgeschlagen,daß Exzitotoxizität erfordert mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme 10, da die Behandlung von Neuronen mit einem mitochondrialen Entkoppler geschützt Neuronen gegen Glutamat-induzierte Zelltod 11. Wenn Mitochondrien zu viel Ca 2+ kann die Öffnung der mitochondrialen Permeability Transition Pore auftreten, was zu von Cytochrom c und andere pro-apoptotischen Faktoren und Induktion von Apoptose zu lösen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme ist direkt mit der altersabhängigen Anfälligkeit Exzitotoxizität verwandte, durch direktes Messen NMDA-induzierten mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme in einzelnen Neuronen des Hippocampus 5, ein Verfahren, das in diesem Artikel berichtet wird. Der Hippocampus, in physiologischen Prozessen, wie Lernen, Gedächtnis und kognitiven Prozessen 12 beteiligt ist, sehr anfällig für Alterung und neurodegenerativen Störungen 13. Hat, die vorgeschlagen, nach mehreren Wochen in vitro kultiviertHippokampus-Neuronen zeigen eine Reihe von typischen Merkmale Alter von 14 Neuronen. Dementsprechend kann langfristige kultivierten Hippokampus-Neuronen bieten ein umfassendes Modell zur Ca 2+ vermittelte Mechanismen der verstärkten Exzitotoxizität in Alterung zu untersuchen.
Das übergeordnete Ziel des vorgestellten Verfahrens ist daher die wesentliche Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Homöostase oder Ca 2+ Umbau im alternden Gehirn untersuchen, einschließlich der Differential Ca 2+ Reaktionen, die durch NMDA-Rezeptor-Agonisten in einer langfristigen kultivierten Hippokampus-Neuronen ausgelöst . Das Verfahren enthält eine detaillierte Beschreibung der Kultur von Ratten-Hippocampus-Neuronen und die Überwachung der cytosolischen und mitochondriale Ca 2+ Konzentrationen von Fluoreszenz und Biolumineszenz-Bildgebung in einzelnen Neuronen auf. Fluoreszenz-Imaging der cytosolischen Ca 2+ in kultivierten Neuronen ist ein Standardverfahren. Jedoch ist dieses Verfahren zum Unter unzuverlässigerzelluläre Ca 2+ Messungen einschließlich mitochondrialen Ca 2+. Gründe dafür sind mangelhafte Ausrichtung der synthetischen Sonden und unangemessen Affinität für Ca 2+ Konzentrationen, die in den Mitochondrien von dem niedrigen Niveau uM sogar zum mM Ebene ändern können. Die Verwendung von Ca 2+ Sonden der Basis von Proteinen, wie zum Beispiel Aequorin, gestattete es dem Targeting subzellulären Organellen und die Verwendung von Derivaten unterschiedlichen Ca 2+ mit unterschiedlichen Affinitäten Coelenterazine oder mutierte Sonden fehlt spezifischen Ca 2+ Bindungsstellen 15. Auf diese Weise können Biolumineszenz-Bildgebung von Zellen Mitochondrien ziel Aequorin Expression der Überwachung der mitochondrialen Ca 2+ -Konzentrationen in einzelnen Neuronen zu ermöglichen. Doch kann dieses Verfahren erfordern die Verwendung von Photonenzählung Kameras oder CCD-Kameras für ultra Biolumineszenz-Bildgebung 16-18. Diese Methode kann neue Ergebnisse, die in mehr establ bestätigt werden sollteIshed Gehirnaltern Modelle wie zum Beispiel Gehirnschnitten von alten Tieren.
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Protocol
Ethics Statement: Verfahren mit Versuchstieren wurden unter Protokolle, die von der Universität Valladolid Stallanlage in Übereinstimmung mit der Europäischen Konvention 123 / Europarat und der Richtlinie 86/609 / EWG zugelassen abgewickelt.
1. Kurz und Langzeitkultur von Ratten-Hippokampus-Neuronen
- Herstellung von Poly-D-Lysin-beschichtete 12 mm-Glasdeckgläschen.
- Sterilisieren, Durchmesser 12 mm Deckgläser in Ethanol für mindestens 24 Stunden. Lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen zu trocknen.
- Verteilen Sie die Deckgläser auf einem Streifen von Parafilm in einer Petrischale. Decken die Oberfläche jedes Deckglas mit 200 ul 1 mg / ml Poly-D-Lysin. Lassen Sie die Behandlung von O / N.
- Am nächsten Tag waschen Sie die Deckgläser mit doppelt destilliertem sterilem Wasser alle 15 min für 90 min unter sterilen Bedingungen.
- Füllen Sie eine vier auch Multischale Platte mit 500 ul Neurobasal Kulturmedium pro Vertiefung. Neurobasal Kulturmedium sollte ergänzt werden,10% fötales Rinderserum, 2% B27, 1 & mgr; g / ml Gentamycin und 2 mM L-Glutamin.
- Legen Sie die Deckgläser in der Multischale Platte. Halten sie in einer angefeuchteten 37 ºC und 5% CO 2 -Inkubator bis zur Verwendung.
- Isolierung von Neuronen im Hippocampus von neugeborenen Ratten.
- Vorbereitung 1,8 ml Papainlösung (direkt erworben) in einem Glasfläschchen (20 ul / ml) unter sterilen Bedingungen: bis zu einer Endkonzentration von 20 & mgr; l zu erhalten / ml etwa 40 & mgr; l Papain in 1,8 ml Hank plus 0,6% BSA hinzuzufügen (ul berechnet werden in Abhängigkeit von den Lieferanten Bedingungen). Hanks 0,6% BSA wird durch Mischen von 85 ml HBSS Medium mit 15 ml 4% iges Rinderserumalbumin (BSA, hergestellt Lösung 4 g BSA in 100 ml HBSS). Bereiten Sie es in einer sterilen Haube.
- Inkubieren Papain in Hank plus 0,6% BSA für 30 Minuten bei 37 ºC vor der Verwendung. Filtern der Lösung unter Verwendung eines 0,22 um Filter vor der Verwendung.
- Vorbereitung Hams F-12-Medium durch Zugabe von Dulbecco-Modifiziertem Eagle-Medium-Pulver (13,5 g pro Liter) in 900 ml doppelt destilliertem sterilem Wasser. Fügen Sie dann 6 g HEPES und 336 mg NaHCO 3 und den pH auf 7,42 mit NaOH 4 N. In sterilem Wasser, um eine 1 L Lösung zu erhalten und filtern es mit einem 0,20 um Polyethersulfon (PES) Flaschenaufsatzfilter. Führen Sie diesen Vorgang in einer sterilen Haube. Schließlich sättigt die Lösung mit CO 2 unter sterilen Bedingungen vor der Verwendung. Shop-Lösungen bei 4 ° C und verwenden Sie sie gekühlt.
- Euthanize Neugeborenen (P0) Rattenjungen durch Enthauptung und waschen Sie den Kopf in sterile HBS Medium. Öffnen Sie den Schädel mit Hilfe einer sterilen Schere. Extrahieren Sie das Gehirn mit einem Spatel und waschen Sie ihn schnell in Hams F-12-Medium.
- Machen Sie einen Schrägschnitt mit Hilfe eines Skalpells in jeder Hemisphäre (1B), und tragen sie zu einer Petrischale mit Ham-F-12-Medium.
- Verwerfen Meningen sorgfältig mit Hilfe von Pinzetten und Dissektion unter einer Lupe. <li> Geben Sie den Hippocampus in einem charakteristischen konkaven Stelle über dem Kortex mit Lupe. Dann trennen den Hippocampus von der Rinde durch vorsichtiges Ziehen von einer Grenze und Entfernen von seiner Position mit Augen Schere.
- Übertragen Sie die Hippocampus-Gewebe bis zu einer 4-Well-Platte mit steriler Hanks Medium ohne Ca 2+ und Mg 2+ und 0,6% BSA aufgefüllt und waschen Hippocampus-Gewebe. Ohne dass die Medien zu schneiden das Gewebe in kleine Stücke (ca. 2 x 2 mm) mit den gleichen Augen Schere.
- Übertragen hippocampalen Stücke zu einer Ampulle, die 1,8 ml vorfiltriert Papainlösung. Dann inkubieren sie bei 37 ° C unter gelegentlichem, leichtem Schütteln. 15 Minuten später, fügen Sie 90 ul DNase I-Lösung (50 ug / ml final) und Inkubation für weitere 15 min.
- Übertragen Sie das Gewebe mit einem 10 ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Bruchstücke mit frischen Neurobasal Kulturmedium. Erhalten Zellsuspension, indem Gewebefragmente durch eine 5 ml-Kunststoff pipette.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 160 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit einem Kunststoff sterilen Pasteur-Pipette und Pellet auszusetzen vorsichtig mit 1 ml automatisierte Pipette in 1 ml Neurobasal Kulturmedium.
- Messung der Zelldichte unter Verwendung eines Neubauer-Zählkammer. Legen Sie das Deckglas über die Neubauer-Kammer. Zugabe von 10 & mgr; l Zellsuspension. Stellen Sie sicher, die Zellsuspension in die Kammer gleichmäßig und macht keine Blasen. Zählen die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop und führen entsprechenden Berechnungen, um eine geeignete Tropfen 40-80 ul, enthaltend 30 x 10 3 Zellen erhalten. Die Gesamtzahl der Zellen wird von der Anzahl der verwendeten Tiere ab.
- Im Laufe der vier auch Multischale Platte mit 500 ul Neurobasal Kulturmedium hergestellt, bevor und in den Inkubator, Platte aufbewahrt ca. 30 x 10 3 Zellen in einem Rückgang von etwa 50 & mgr; l zu jedemauch der Multischale Platte mit einem Poly-D-Lysin-beschichtete, Durchmesser 12 mm Deckglas.
- Pflegen primären Hippocampus-Zellen in einem befeuchteten 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 2-5 Tage in vitro (DIV, kurzfristige, junge Kulturen) oder> 15 DIV (langfristige, im Alter von Kulturen), bevor Experimente ohne die Kultur Medien.
2. Fluorescence Imaging der cytosolischen Ca 2+ -Konzentration
- Herstellung von Testlösungen für Fluoreszenz-Imaging.
- Vorbereitung eines externen HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) Lösung, die in mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl 2 1, CaCl 2 1, Glucose 10, Natrium-HEPES 10 (pH 7,42).
- Vorbereitung eines externen, Mg 2+ -frei, HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) Lösung, die in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl 2 1, Glucose 10 und 10 HEPES (pH 7,42).
- Lösen NMDA in Mg 2+ -frei, HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) mit einem FINAl Konzentration von 100 & mgr; M und ergänzen Sie es mit 10 uM Glycin.
- Vorbereitung einer HBS enthaltende Lösung KCl anstelle von NaCl durch die Lösung (in mM): KCl 145, MgCl 2 1, CaCl 2 1, Glucose 10 und 10 HEPES (pH 7,42).
- Laden des Hippocampus-Zellen mit fluoreszierenden Calciumsonde Fura2 / AM.
- Nehmen Sie die Zellkultur enthält Deckgläser aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit HBS-Medium bei RT durch Übertragung auf ein neues Vier auch Multischale Platte, die 500 & mgr; l HBS pro Vertiefung.
- Inkubieren Zellen mit Fura2 / AM 4 & mgr; M für 60 min bei RT (25 ° C) an einem dunklen Ort (in der gleichen HBS Medium hergestellt).
- Nach 60 min waschen Deckgläser mit frischen HBS Medium.
- Aufnahme von Fluoreszenzbildern von zytosolischen [Ca 2+] in kultivierten Zellen.
- Schalten Sie die Lampe, Mikroskop, Perfusionssystem, Fluoreszenz-Kamera und Computer.
- Legen Sie die Deckgläser in einem thermostatisierten Plattform fürOpen 12 mm Deckgläser auf der Bühne des inversen Mikroskop und wählen Sie einen mikroskopischen Bereich unter Verwendung eines 40X-Objektiv (Öl, NA: 1,3). Perfundieren Zellen kontinuierlich mit vorgewärmten (37 ° C) HBS Mediums in Abwesenheit oder Anwesenheit von Testsubstanzen. Aufrechterhaltung der Strömung mit einer Rate von ungefähr 5-10 ml / min.
Hinweis: Handy Perfusionssystem für lebende Zellen in einem thermostatisierten Plattform für offene 12 mm Deckgläser montiert. 8-Linien schwerkraftgetriebenen Perfusionssystem mit einer Ventilsteuerung ausgerüstet ist, um die Lösungen zu perfundieren. Eine Vakuumpumpe ist für das Entfernen überschüssigen Mediums verantwortlich. Lösungen werden unter Verwendung eines in-Rohr-Heizung erwärmt. - Nehmen Sie ein Hintergrundbild mit der Verschluss an beiden Anregungswellenlängen geschlossen.
- Epi-Zellen leuchten abwechselnd bei 340 und 380 nm. Record Licht bei 520 nm alle 5-10 s mit einer Fluoreszenzkamera, die von einer Fura-2 dichroitischen Spiegel gefiltert wird emittiert.
- Wenn die Aufzeichnungszeit beendet ist, speichern Sie die vollständige Sequenz of Bilder bei 520 nm emittiert im Computer zur weiteren Analyse.
- Analyse von aufgezeichneten Fluoreszenzbilder.
- Öffnen Sie das Experiment-Datei. Unter Verwendung des Aquacosmos Software, klicken Sie auf "Verhältnis" und wählen Sie die gewünschte Übersetzungsbereich. Berechnung der pixel-Verhältnis in den resultierenden Bildern, um eine Sequenz von Verhältnis Bilder zu erhalten.
- Subtrahieren Hintergrund durch Einstellen der 'Hintergrund Beseitigung'. Drücken Sie "Start Berechnung '.
- Drücken Sie 'Alle Zeitfolge "Knopf und löschen die alten Regions of Interest (ROIs). Zur quantitativen Analyse von Einzelzellen herzustellen neuen Regionen von Interesse oder ROIs entsprechend einzelnen Neuronen. Durchschnitt alle Verhältniswerte in jedem Pixel entsprechend jedem ROI und jedes Bild, um eine Aufnahme von Verhältnisfluoreszenzwerte für einzelne ROIs (Zellen) zu erhalten.
- Um die einzelnen Aufnahmen anzuzeigen exportieren Verhältnis Fluoreszenzwerte entsprechend jeder ROI auf eine grafische progrbin.
- Stellen die entsprechenden Berechnungen zur Bestimmung der Größe des Anstiegs der Fluoreszenz-Verhältnis in Reaktion auf jede Stimulierung unter Verwendung einer geeigneten Datenanalyse und grafische Software.
3. Biolumineszenz-Bildgebung der mitochondrialen Ca2 + -Konzentration
- Transfektion von kultivierten Hippocampusneuronen mit der mitGAmut Plasmid.
HINWEIS: Die Zellen werden zunächst mit dem mitGAmut Plasmid, das ein Mitochondrien-Targeting-Sequenz und eine mutierte Aequorin fehlt ein Ca 2+ Bindungsstelle an das grün fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert transfiziert. Diese Konstruktion erkennt große Anstiege in der mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme und ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen durch das GFP-Fluoreszenz. Das Plasmid wurde entwickelt und freundlicherweise von P. Brulet und Mitarbeiter 18 (CNRS, Paris) zur Verfügung gestellt.- Bereiten Neurobasal TF, enthält Neurobasal Kulturmedium ohne fötales Rinderserum, B27, gentamicin und 2 mM L-Glutamin.
- Bereiten Sie 50 ul Neurobasal TF plus 2,5 ul Transfektionsreagenz in einem Fläschchen (Lösung A). Bereiten Sie 50 ul Neurobasal TF plus 4 ug mitGAmut Plasmid in einem Fläschchen (Lösung B). Sanft hinzufügen Lösung B über Lösung A. Lassen Mischen während 20 min ohne Schütteln.
- Übertragen Sie die Deckgläser haltigen Neuronen im Hippocampus, neue Multischale Platten, enthaltend 200 & mgr; l frisches Neurobasal TF.
- In tropfenweise 100 ul Lösung A + B über jedes Deckglas. Inkubation für 30 min. Entfernen Sie das Medium. Einmal Zellen mit frischem Neurobasal TF waschen. Bringen Sie die Deckgläser auf den ursprünglichen Neurobasal Kulturmedium.
- Kultur Neuronen für zusätzliche 24 h bei 37 ºC und 5% CO 2 nach der Transfektion, um eine effiziente Expression und Ausrichtung der Sonde zu ermöglichen.
- Herstellung von Testlösungen für Biolumineszenz-Bildgebung.
- Bereiten HBS Lösungen, die NMDA-100 um oder 145 mM KCl alsoben beschrieben (Schritt 2.1). Vorbereitung HBS-Lösung, die 10 mM Ca 2+ und Digitonin 100 uM.
- Rekonstitution von Mitochondrien-Targeting Aequorin mit Coelenterazin n.
- Transferdeck transfiziert Hippocampusneuronen zu einem Vier-Loch-Platte, die 200 & mgr; l HBS.
- In 4 ul Coelenterazin n (200 & mgr; M) zu 200 ul HBS für eine Endkonzentration von 4 & mgr; M und vorsichtig mischen. Inkubation für 2 Stunden bei RT (25 ° C) und bei Dunkelheit.
- Aufzeichnungs Biolumineszenz Bilder mitochondriale [Ca 2+].
- Schalten Sie das Mikroskop, die Lampe, das Perfusionssystem, Biolumineszenz-Kamera und dem Computer.
- Übertragen rekonstituiert Deckgläser in eine thermostatisierte (37 ° C) Perfusionskammer und perfundieren kontinuierlich mit vorgewärmter HBS-Lösung mit einer Rate von 5-10 ml / min.
- Unter Verwendung eines 40X-Objektiv (Öl, NA: 1,3), wählen Sie eine mikroskopische Feld mit Zellen, die einpoaequorins wie durch Fluoreszenzemission mit der Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) assoziiert mit den FITC-Filter dargestellt. Eine typische Feld kann 1-2 transfizierte Zellen enthalten. Nehmen Sie das GFP-Fluoreszenzbild, mit einer CCD-Kamera.
- Schalten Sie das Mikroskop Licht. Entfernen Sie die dichroitischen haltigen Box in der Lichtpfad befindet. Schalten Sie das Anregungslicht und schließen Sie die Dunkelfeld für völliger Dunkelheit.
- Perfundieren Zellen in 5-10 ml / min mit HBS Medium mit oder ohne Testlösungen bei 37 ° C vorgewärmt.
- Erfassen Photonenemissions Bilder alle 10 sec mit einer Photonenzählung Kamera mit einem Bildprozessor abgewickelt.
- Am Ende jedes Experiments permeabilisieren Zellen mit 0,1 mM Digitonin in 10 mM CaCl 2 in HBS, um alle verbleibenden Photonenemissionen zu lösen.
Hinweis: Diese photonischen Emissionen müssen, um die Gesamtphotonenemissionen, eine für die Kalibrierung in Ca 2+ Konzentrationen erforderlichen Wert zu schätzen hinzugefügt werden <./ li> - Speicher Biolumineszenz Bilder in dem Computer mit dem GFP assoziiert Fluoreszenzbild vor der Photonenzählung Bildgebung erfasst.
- Analyse der Biolumineszenz Bilder reflektieren mitochondriale [Ca 2+].
- Quantifizierung photonischen Emissionen unter Verwendung spezifischer Software. Photonic-Emissionen zu mitochondrialen freien Ca unter Verwendung des von Brini et al. 15 beschriebenen Algorithmus umgewandelt werden 2+ -Konzentration ([Ca 2+] mit).
- Öffnen Sie das Experiment und die GFP-Fluoreszenz Bild. Ausgewählte Bereiche von Interesse (ROIs) mit Hilfe spezifischer Software, indem die Form der transfizierten Zellen nach den Fluoreszenzbildern zu Beginn des Experiments eingefangen.
- Fügen Sie die gleichen ROIs für jedes Bild. Gesamtphotonenemissionen in jedem ROI mit spezifischer Software, die Lumineszenzemission Wert (L) für jede Zelle in jedem Zeitpunkt zu erhalten, berechnet.
- Alle photonischen EMISS hinzufügenIonen in der Biolumineszenz-Bilder, einschließlich der nach der Digitonin Permeabilisierung, mit der spezifische Software, um eine Biolumineszenz-Bild alle photonischen Emissionen zu erhalten, die erhalten diejenigen.
- Exportwerte von Photonenemissionen für jeden Bereich von Interesse zu einer spezifischen Software für die Berechnungen. Um dies zu tun, klicken Sie auf "Grafik", um die Biolumineszenz-Werte für jeden ROI zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Wählen Sie 'Gesamtwert' und 'verwenden aktuelle ROI für alle Bilder. Drücken Sie 'berechnen'. Speichern Sie die 'txt.file' und Export von Daten auf ein Arbeitsblatt. Für jede ROI, [Ca 2+] mit berechnet wird unter Verwendung des folgenden Algorithmus:
[Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)];
woher,
R = [L / (L Gesamt λ)] 1 / n
L die Lumineszenz zu dem Zeitpunkt der Messung in jedem interessierenden Bereich emittiert.
L Gesamt istdas nach Zugabe der in dem Gewebe zu diesem Zeitpunkt zu dem Zeitpunkt der Messung für jeden interessierenden Bereich vorhanden Zählungen verbleibende Gesamt Lumineszenz. λ, K TR, K R und n Konstanten, dessen Werte auf Kombination von Aequorin (Wildtyp oder mutierte) und coelenterazin verwendet (Wildtyp oder n-Typ) als auch die Aufzeichnungstemperatur 16. Für die hier verwendete Kombination (mutiert AEQ und coelenterzine n), bei 37 ° C, haben wir die folgenden Werte: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 × 10 3, n = 1204 und λ = 0138.
- Stellen die entsprechenden Berechnungen zur Bestimmung der Größe des Anstiegs der Biolumineszenz als Antwort auf jeden Stimulus unter Verwendung eines geeigneten Datenanalyse und grafische Software.
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Representative Results
Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Ca 2+ Umbau und die Effekte von NMDA auf cytosolische und mitochondriale beurteilen [Ca 2+] in gealterten Neuronen. 1 zeigt die schematische Darstellung des Verfahrens zum Isolieren und Kultivieren von hippocampalen Neuronen aus neugeborenen Ratten. Bevor Sie beginnen, müssen wir sterile, Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläser vorbereiten und suchen Sie sie in einem 4-Well-Platte. Dann werden neonatalen Ratten getötet und das Gehirn entfernt. Nach Isolierung des Hippocampus, wird Gewebe sorgfältig dispergiert mit Papain. Isolierten Zellen werden gewaschen und auf beschichteten Deckgläsern ausplattiert. Dann Zellen sind für 2-5 DIV oder> 15 DIV, um junge oder alte Kulturen, die jeweils zu kultiviert und für die Ca 2+ Imaging-Experimenten verwendet.
Verwendung des obigen Strategie ist es möglich, und Klein Neuronen aus derselben Probe zu testen, zum Beispiel, ob NMDA induziert unterschiedliche Auswirkungen auf cytosolische [Ca 2+] in jungen cultures als bei älteren Kulturen. 2 zeigt, dass 100 uM NMDA induziert stärkere Zunahme der cytosolischen [Ca 2+] in älteren Kulturen als in jungen Kulturen. Ebenso NMDA induziert Zelltod in alten Nervenzellen, nicht aber in jungen Neuronen 5. In Fällen, in denen Ca 2+ Reaktionen sind sehr hoch, ähnliche Experimente können mit Ca 2+ Sonden mit weniger Affinität für Ca 2+ durchgeführt werden, um die Farbstoffsättigung zu vermeiden, wie zum Beispiel fura4F 5. In gleicher Weise ist es auch möglich, zu erfahren, ob Pulsbereich cytosolischer [Ca 2+] verschieden sind. Darüber hinaus kann die Kombination dieses Protokoll mit quantitative Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für NMDAR Einheiten Korrelat Veränderungen der Ansprechempfindlichkeit mit Unterschieden in der Expression von NMDA-Rezeptor-Untereinheiten zu ermöglichen, daß spezifische Antikörper zur Verfügung stehen. 5 Messungen der cytosolischen [Ca 2+] kann auch zur Untersuchung anderer relevanter paramete verwendet werdenrs einschließlich Ca 2+ Speicherinhalt, Ruhedurchlässigkeit gegenüber Ca 2+, Ca 2+ Clearance-Raten und deren mögliche Unterschiede zwischen jungen und alten Neuronen.
In ähnlicher Weise ist es auch möglich, die Wirkungen solcher Reize auf die mitochondriale testen [Ca 2+]. 3 zeigt ein Beispiel eines Biolumineszenz-Bildgebung von Hippokampus-Neuronen mit Mitochondrien-Targeting Aequorin transfiziert. Freisetzung von Photonenemissionen nach der Stimulation eine Funktion des Anstiegs der mitochondrialen [Ca 2+] erreicht. Beachten Sie, dass NMDA-induzierten Anstieg der mitochondrialen [Ca 2+] sind in im Alter von Neuronen viel größer als bei jungen Neuronen im Hippocampus, in dem NMDA erhöht kaum Photonenemissionen. Diese Ergebnisse können dazu beitragen zu erklären, warum NMDA induziert Apoptose nur im Alter von Nervenzellen, nicht aber in jungen Kulturen des Hippocampus-Zellen 5. In gleicher Weise ist es möglich, zusätzliche Unterschiede in mitochondrialen testenCa 2+ Umgang zwischen jungen und alten Nervenzellen unter Verwendung von Protokollen speziell entwickelt, um zu testen, zum Beispiel Ca 2+ Ausstieg aus Mitochondrien, mitochondriale Ca 2+ Aufnahme in permeabilisierten Neuronen und mitochondriale Ca 2+ Aufnahme durch Ca 2+ Freisetzung aus intrazellulären Speichern induziert. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um Drogen, die mitochondriale Ca 2+ Last, die von Interesse für die Neuroprotektion gegen Exzitotoxizität kann testen.
Figur 1: Verfahren zur Isolierung von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen (A) Poly-D-Lysin, 12 mm Glas beschichtete Deckgläser werden in eine Petrischale hergestellt und schließlich zu einer 4-Well-Platte transferiert.. (B) Dorsalansicht eines Rattenhirns. Die gestrichelte Linie zeigt, wo der Schnitt gemacht werden soll. (C) erhalten wird, wieUSSETZUNG primärer Hippocampus Nervenzellen. Nach dem Entfernen des Hippocampus, wird eine Zellsuspension erhalten. Dann Zellen in 4-Well-Platten, die die Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläser plattiert. (D) Hellfeld Bild, das primäre Ratten-Hippocampus-Neuronen in der Kultur. Balken stellt 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 2: NMDA erhöht cytosolische [Ca 2+] in hippokampalen Neuronen Kurz- und langfristige kultivierten Hippokampus-Neuronen wurden mit Fura2 / AM beladen und Fluoreszenz-Bildgebung unterzogen. Bilder zeigen repräsentative Hellfeld und Pseudofarbbilder (Verhältnis F340 / F380) von kurzfristigen (A) und langfristige (B [Ca 2+] (Pseudo Skalen sind am unteren Rand dargestellt). Die Spuren zeigen repräsentative, Einzelzellableitungen von zytosolischen [Ca 2+] in Reaktion auf 100 uM NMDA in kurzfristige (A) und langfristige (B) kultivierten Hippocampus-Neuronen. Man beachte, dass cytosolische [Ca 2+] Erhöhungen sind in Langzeit viel größer als der kurzfristigen kultivierten Neuronen. Balken stellt 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 3: NMDA induziert mitochondrialen Ca 2+ Last in hippokampalen Neuronen kultivierte Hippocampus neurons wurden mit geringer Affinität transfizierte Mitochondrien ziel Aequorin an GFP fusioniert, mit 4 & mgr; M Coelenterazin inkubiert und Biolumineszenz-Bildgebung mitochondriale [Ca 2+] unterzogen. Bilder zeigen die Fluoreszenz (GFP) und die kumulierten Photonenemissionen (Aequorin-Biolumineszenz) Bilder von repräsentativen kurz- (A) und langfristige (B) kultivierten Hippocampus-Neuronen. Lumineszenz-Intensität ist in Falsch codiert (1 bis 16 Photonenemissionen pro Pixel). Aufnahmen zeigen die Freisetzung von photonischen Emissionen in Kurz- (A) und langfristige (B) kultivierten Hippokampus-Neuronen (als mitochondriale [Ca 2+] ausgedrückt). 100 uM NMDA erhöhte mitochondriale [Ca 2+] in gealterten Neuronen jedoch nicht in jungen kultivierten hippocampalen Neuronen. Balken stellt 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ a>
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Discussion
Der Umbau von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase im alternden Gehirn an kognitiven Verluste in Zusammenhang gebracht, erhöhte Anfälligkeit für ischämische Schädigung, Exzitotoxizität und Neurodegeneration. Um diese Hypothese in vitro zu untersuchen, sind Ca 2+ bildgebenden Verfahren zur Verfügung. Leider lebensfähige Kulturen von Hippocampusneuronen alt sind nicht zuverlässig. Vor kurzem wurde beobachtet, dass die Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampusneuronen vorliegenden viele der typischen Kennzeichen der Alterung in vivo einschließlich ROS Akkumulation Bildung Lipofuszingranula, hetero Foci Aktivierung pJNK und p53 / p21-Signalwege, Cholesterin Verlust und Änderungen der Dichte des Ca 2+ -Kanäle und NMDA-Rezeptoren 14. Dementsprechend kann Ca2 + Imaging Experimente in jung und alt Kulturen von Ratten-Hippocampus-Neuronen neue Erkenntnisse von Ca 2+ Umbau im alternden Gehirn liefern. Eine Bedingung, die für die Kultivierung hippoca istMPAL Neuronen langfristig ist zweifach. Zunächst ist es wichtig, die Zellen bei einer sehr geringen Dichte der Platte wie oben angegeben. Zweitens werden die Zellen in ergänzt Neurobasalmedium ohne Wechsel des Mediums kultiviert. Dieser Ansatz ermöglicht es das Vorhandensein von Gliazellen sondern die Vermeidung ihrer allzu Wachstum. Das Schema für eine solche Kultur wird in Abbildung 1 dargestellt.
Fluoreszenzbildgebung mit synthetischem Ca 2+ Sonden erlaubt die Überwachung von cytosolischen [Ca 2+] in einzelnen Neuronen 19. Die Verwendung dieses Ansatzes bei jungen und alten Neuronen erlaubt die Überwachung von Veränderungen bei den Reaktionen mit dem Alter der Kultur. Zum Beispiel zeigt Abbildung 2 typischen Hellfeld und Ca 2+ Bilder der Anstieg der [Ca 2+] cyt von NMDA in jungen Nervenzellen und Neuronen aus Alter von Kulturen induziert. Feststellen, dass die Antworten in gealterten Neuronen sind viel größer als bei jungen Neuronen. Jedoch ist dieses Verfahren nicht zuverlässig für [Ca 2+] Messungen innerhalb subzellulären Organellen, zum Beispiel Mitochondrien, wo [Ca 2+] kann von unterhalb des & mgr; M bis über die Ebene mM variieren. In jenen Fällen, auf Proteinbasis, Mitochondrien-Targeting-Sonden wurden als entwickelt worden, zum Beispiel Aequorin. Diese Sonde ist besonders interessant, da seine Affinität für Ca 2+ können fein abgestimmte, sehr niedrige oder sehr hohe [Ca 2+] wie die, die im Inneren Mitochondrien erreicht in ruhenden und stimulierten Bedingungen zu überwachen, bzw. werden. Genauer gesagt ist es möglich, entweder die Wildtyp-Aequorin oder ein mutiertes Aequorin ohne Ca 2+ Bindungsstellen, um die Affinität zu ändern wählen. Die Feinabstimmung wird erreicht, wenn verschiedene Coelenterazine (Wildtyp, h, n) werden in Kombination mit verschiedenen Aequorine 17 verwendet. , Wohingegen die Verwendung von Fluoreszenz für Ca 2+ Bildgebung ist weit verbreitet, Überwachung Biolumineszenz ist jedoch nicht einfach und kann Photonenzählung Kameras benötigen. Glücklicherweise AequorinSonden, wie die hier verwendeten, wurden verbessert, um koexprimieren GFP 18 macht sie stabiler, um mehr Photonenemissionen zu lösen und das die einfache Identifizierung von transfizierten Zellen durch das GFP assoziiert Fluoreszenz. Erfolg bei der Biolumineszenz-Bildgebung in Neuronen hängt nicht nur von der Effizienz der Photonenzählung Kamera verwendet, sondern auch auf die Effizienz der Transfektion der Mitochondrien-Targeting-Sonde. Im Falle von Neuronen im Hippocampus kann eine einfache chemische Transfektion vorgesehen, dass eine hochempfindliche Photonenzählung Kamera ist zu arbeiten. Abbildung 2 zeigt Beispiele von Hellfeld, GFP-Fluoreszenz und Biolumineszenz Bilder der jungen und alten Kultur Hippokampus-Neuronen. Ebenfalls gezeigt sind die Erhöhungen in der mitochondrialen [Ca 2+] von NMDA in transfizierten Hippocampusneuronen aufgezeichnet induziert. Feststellen, dass die Wirkung von NMDA in gealterten kultivierten Neuronen viel größer als bei jungen Neuronen. In anderen Fällen wird der Wirkungsgrad des transfection kann durch Verwendung Virus abgeleitete Vektoren 16,18 erhöht werden. Alternativ ist die Entwicklung transgener Mäuse, auf Proteinbasis, subzellulären Ca 2+ Sonden eine aufstrebende Option für die zukünftige Ansätze, vielleicht sogar in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
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