Abstract
Känslighet för neuron celldöd associerad med neurodegeneration och ischemi är ytterst ökat i åldrarna hjärnan men mekanismer som är dåligt kända. Excitotoxicitet, en process tros bidra till euronskada inducerad av båda förolämpningar, medieras genom aktivering av glutamatreceptorer som främjar Ca2 + inflöde och mitokondriell Ca2 + överbelastning. En väsentlig förändring i intracellulär Ca2 + homeostas eller ombyggnad av intracellulär Ca2 + homeostas kan gynna euronskada i gamla nervceller. För att undersöka Ca2 + ombyggnad i åldrandet har vi använt levande cell imaging i långsiktiga kulturer av rått hippocampusneuroner som liknar i vissa avseenden åldern nervceller in vivo. För detta ändamål, hippocampus celler är i första hand, nyligen sprids från nya född råtta hippocampi och ströks ut på poli-D-lysin belagda glastäck. Då kulturer hålls i kontrollerade medierna under flera dagar eller flera wEeks för att undersöka unga och gamla neuroner, respektive. För det andra, är odlade nervceller laddade med fura2 och utsattes för mätningar av cytosoliskt Ca2 + koncentration med digital fluorescensförhållande bildbehandling. För det tredje, är odlade nervceller transfekteras med plasmider som uttrycker en tandem med låg affinitet aequorin och GFP riktade till mitokondrierna. Efter 24 timmar, är aequorin inuti celler spädas med coelenterazin och nervceller utsätts för mareld bildhantering för övervakning av mitokondriell Ca2 + koncentration. Denna procedur tre-steg möjliggör övervakning av cytosoliska och mitokondriella Ca2 + responser till relevanta stimuli såsom exempelvis glutamatreceptoragonist NMDA och jämför huruvida dessa och andra svar påverkas av åldring. Detta förfarande kan ge nya insikter om hur åldrande inflytande cytosoliskt och mitokondrie Ca2 + svar till utvalda stimuli samt testning av utvalda läkemedel syftar till att förebygga neuron celldöd i åldersrelaterade sjukdomar.
Introduction
Excitotoxicitet är en av de viktigaste mekanismerna som bidrar till neuronal skada och celldöd i neurologiska förolämpningar såsom ischemi, och i vissa neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom en. Denna typ av neuro huvudsakligen medieras av glutamat agerar på Ca2 + -permeable, jonotropa NMDA-receptorer (NMDAR) 2. Exponering av odlade nervceller till glutamat kan leda till excitotoxicitet 3, vilket orsakar neuronal apoptos 4. Vi och andra har tidigare rapporterat att neuronala sårbarhet för NMDA-inducerad apoptos kan förändras med utvecklingen in vitro och åldrande 5-8.
Det är allmänt accepterat att en ökning i den cytosoliska fria Ca2 + koncentration ([Ca2 +] cyt) leder till celler aktivering. Men om denna ökning är för hög och / eller ihållande nog, kan det utlösa celldöd 9. Vidare har det föreslagitsatt excitotoxicitet kräver mitokondriell Ca2 + upptag 10, eftersom behandling av nervceller med en mitokondriell frikopplare skyddade neuroner mot glutamatinducerad celldöd 11. Om mitokondrier tar upp för mycket Ca2 +, kan öppnandet av den mitokondriella permeabilitetstransition porer uppstå, vilket leder till frisättning av cytokrom c och andra pro-apoptotiska faktorer, och inducera apoptos. Vi har nyligen visat att denna mitokondriella Ca2 + upptag är direkt relaterad till åldersberoende känslighet för excitotoxicitet, genom att direkt mäta NMDA-inducerad mitokondriell Ca2 + upptag i enstaka hippocampusneuroner 5, en metod som redovisas i den här artikeln. Hippocampus, involverade i fysiologiska processer såsom inlärning, minne och andra kognitiva processer 12, är mycket känsliga för åldrande och neurodegenerativa sjukdomar 13. Det har föreslagits att, efter flera veckor in vitro, odladeshippocampus nervceller visar ett antal typiska kännetecknen för åldern nervceller 14. Följaktligen kan långsiktiga odlade hippocampusneuroner ge en heltäckande modell för att undersöka Ca2 + medierad mekanismer för förbättrad excitotoxicity i åldrandet.
Det övergripande målet för den metod som presenteras är därför att undersöka väsentliga förändringar i intracellulär Ca2 + homeostas eller Ca2 + remodeling i den åldrande hjärnan, inklusive differential Ca2 + svar framkallade av NMDA-receptoragonister i ett långsiktigt odlade hippocampusneuroner . Metoden innehåller en detaljerad beskrivning av kultur råtta hippocampus nervceller och övervakning av cytosoliska och mitokondriella Ca2 + koncentrationer av fluorescens och mareld avbildning i enskilda neuroner, respektive. Fluorescens avbildning av cytosoliska Ca 2 + i odlade nervceller är ett standardförfarande. Dock är denna metod mindre tillförlitliga för subcellulär Ca 2 + mätningar inklusive mitokondriell Ca2 +. Orsaker till detta är bland annat bristande målinriktning av syntetiska prober och olämpligt affinitet för Ca 2 + koncentrationer som kan ändras i mitokondrier från låga iM nivå även till mM nivå. Användningen av Ca2 + prober baserade på proteiner som till exempel aequorin, har gjort det möjligt för målsökning till subcellulära organeller och användning av derivat olika Ca2 + tillhörighet med olika coelenterazines eller muterade prober som saknar specifik Ca2 + bindningsställen 15. På detta sätt kan mareld avbildning av celler som uttrycker mitokondrier inriktade aequorin möjliggöra övervakning av mitokondriella Ca2 + koncentrationer i enskilda nervceller. Ändå kan detta förfarande kräver användning av fotonräknings kameror eller ultra CCD-kameror för mareld avbildning 16-18. Denna metod kan ge nya resultat som bör bekräftas i mer establdiga hjärnans åldrande modeller som, till exempel, hjärnan skivor från gamla djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har skötts i enlighet med protokoll som godkänts av Valladolid University djurstallar anläggning i överenskommelse med Europakonventionen 123 / Europarådet och direktiv 86/609 / EEG.
1. kort och lång sikt kultur råtta hippocampus nervceller
- Framställning av poly-D-lysin belagda, 12 mm täckglas.
- Sterilisera 12 mm diameter glastäck i etanol under minst 24 timmar. Låt dem torka under sterila förhållanden.
- Fördela täckglasen på en remsa av parafilm i en petriskål. Täcka ytan av varje täckglas med 200 pl 1 mg / ml poly-D-lysin. Tillåt behandla O / N.
- Nästa dag tvättas täckglasen med dubbeldestillerat sterilt vatten var 15 min under 90 minuter under sterila betingelser.
- Fyll en fyra väl multidish platta med 500 mikroliter av Neurobasal odlingsmedium per brunn. Neurobasal odlingsmedium bör kompletteras med10% fetalt bovint serum, 2% B27, 1 | ig / ml gentamicin och 2 mM L-glutamin.
- Placera täckglasen i multidish plattan. Hålla dem i en fuktig 37 ° C och 5% CO2 inkubator fram till användning.
- Isolering av hippocampala neuroner från neonatala råttor.
- Förbered 1,8 ml papain lösning (direkt köpt) i en injektionsflaska (20 ul / ml) under sterila förhållanden: För att få en slutlig koncentration av 20 ul / ml lägga cirka 40 pl papain i 1,8 ml Hanks plus 0,6% BSA (pl ska beräknas beroende på förhållandena leverantör). Hanks 0,6% BSA framställs genom att blanda 85 ml HBSS-medium med 15 ml 4% bovint serumalbumin (BSA, framställd lösa 4 g BSA i 100 ml HBSS). Förbereda den i en steril huva.
- Inkubera papain i Hanks plus 0,6% BSA under 30 min vid 37 ° C före användning. Filtrera lösningen med användning av ett 0,22 ^ m filter före användning.
- Förbered Hams F-12-medium genom tillsats av DulbeccosModified Eagles Medium pulver (13,5 g per liter) i 900 ml dubbeldestillerat sterilt vatten. Sedan till 6 g HEPES och 336 mg NaHCOa 3 och justera pH till 7,42 med användning av NaOH 4 N. Lägg sterilt vatten för att erhålla en 1 N lösning och filtrera den med användning av ett 0,20 fim polyetersulfon (PES) flaska övre filter. Bär denna process i en steril huva. Slutligen mätta lösningen med CO2 under sterila betingelser före användning. Butikslösningar vid 4 ºC och använda dem kylda.
- Euthanize nyfödd (P0) råttungar genom halshuggning och tvätta huvudet i sterilt HBS medium. Öppna skallen med hjälp av steril sax. Extrahera hjärnan med en spatel och tvätta den snabbt i Hams F-12-medium.
- Gör en diagonal skärning med hjälp av en skalpell i varje hemisfär (Figur 1B), och bär den till en petriskål med Hams F-12-medium.
- Kasta hjärnhinnorna noggrant med hjälp av dissektion pincett och under ett förstoringsglas. <li> Identifiera hippocampus i en karakteristisk konkav plats över cortex använder förstoringsglas. Sedan separera hippocampus från cortex genom att dra försiktigt från en gräns och ta bort den från sin position med hjälp av ögon sax.
- Överför hippocampusvävnad till en 4-brunnar fylls med sterilt Hanks medium utan Ca2 + och Mg2 + plus 0,6% BSA och tvätta hippocampusvävnad. Utan att ta bort media skär vävnaden i små bitar (ca 2 x 2 mm) med användning av samma ögon sax.
- Överför hippocampus bitar till en flaska innehållande 1,8 ml i förväg filtrerad papainlösning. Sedan inkubera dem vid 37 ° C med tillfällig försiktig skakning. 15 min senare, tillsätt 90 | il DNas I-lösning (50 | j, g / ml slutlig) och inkubera i 15 ytterligare minuter.
- Överför vävnaden till ett 10 ml centrifugrör och tvätta fragmenten med färsk Neurobasal odlingsmedium. Skaffa cellsuspensionen genom att vävnadsfragment genom en 5 ml plast pipette.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 160 xg under 5 minuter. Avlägsna supernatanten med hjälp av en plast steril pasteurpipett och suspendera pelleten försiktigt med en 1 ml automatiserad pipett i 1 ml Neurobasal odlingsmedium.
- Mät celldensitet med användning av en Neubauer-räkningskammare. Placera glastäck över Neubauer kammare. Tillsätt 10 pl av cellsuspensionen. Se till cellsuspensionen in i kammaren likformigt och gör inga bubblor. Räkna antalet celler under mikroskop och utföra motsvarande beräkningar för att erhålla en lämplig droppe 40-80 il innehållande 30 x 10 3 celler. Det totala antalet celler kommer att bero på antalet använda djur.
- Under fyra väl multidish platta innehållande 500 pl Neurobasal odlingsmedium beredd före och hålls i inkubatorn, plattan ca 30 x 10 3 celler i en droppe av omkring 50 pl till varjebrunn av multidish platta innehållande ett poly-D-lysin-belagda, 12 mm diameter glastäckglas.
- Behåll primära hippocampus celler i en fuktig 37 ° C och 5% CO 2 inkubator för 2-5 dagar in vitro (DIV kortfristiga unga kulturer) eller> 15 DIV (Långsiktiga, äldre kulturer) före experiment utan att ändra kulturen media.
2. fluorescens avbildning av cytosoliska Ca 2 + Koncentration
- Framställning av testlösningar för fluorescensavbildning.
- Förbered en extern HEPES-buffrad saltlösning (HBS) lösning innehållande, i mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, glukos 10, natrium-HEPES 10 (pH 7,42).
- Förbered en extern, Mg2 + -fri, HEPES-buffrad saltlösning (HBS) lösning innehållande, i mM: NaCl 146, KCl 5, CaCb 2 1, glukos 10 och HEPES 10 (pH 7,42).
- Lös NMDA i Mg2 + -fri, HEPES-buffrad saltlösning (HBS) vid en final koncentration av 100 | iM och komplettera den med 10 iM glycin.
- Bered en HBS-lösning innehållande KCl i stället för NaCl genom att lösa (i mM): KCl 145, MgCl2 1, CaCl2 1, glukos 10 och HEPES 10 (pH 7,42).
- Laddning av hippocampus celler med fluorescerande kalcium sond fura2 / AM.
- Ta cellodling innehållande täck från inkubatorn och tvätta dem med HBS medium vid RT genom att överföra dem till ett nytt fyra väl multidish platta innehållande 500 pl HBS per brunn.
- Inkubera cellerna med fura2 / AM 4 iM (som framställts på samma HBS medium) under 60 minuter vid RT (25 ºC) i en mörk plats.
- Efter 60 minuter, tvätta täck med färsk HBS medium.
- Inspelning fluorescens bilder av cytosoliskt [Ca2 +] i odlade celler.
- Slå på lampan, mikroskop, perfusionssystemet, fluorescens kameran och datorn.
- Placera täckglas i en termostaterad plattform föröppna 12 mm täckglas på scenen av den inverterade mikroskop och välj en mikroskopisk fält med en 40X mål (olja, NA: 1,3). Perfundera celler kontinuerligt med förvärmd (37 ° C) HBS medium i frånvaro eller närvaro av testsubstanser. Upprätthålla flödet med en hastighet av ca 5-10 ml / min.
Obs: Cell perfusionssystem för levande celler är monterad i en termostaterad plattform för öppna 12 mm täckglas. 8-linjer gravitationsdriven perfusion system utrustat med en ventilstyrenhet används för att perfundera lösningarna. En vakuumpump är ansvarig för att avlägsna eventuellt överskott av mediet. Lösningar värms med hjälp av ett i-rör värmesystem. - Fånga en bakgrundsbild med slutaren stängd i båda excitationsvåglängder.
- Epi-belysa cellerna omväxlande vid 340 och 380 nm. Spela in ljus emitterat vid 520 nm varje 5-10 sek med en fluorescens kamera, som filtreras av ett fura-2 dikroiska spegeln.
- När inspelningsperioden är slut, lagra den fullständiga sekvensen of bilder som avges vid 520 nm i datorn för vidare analys.
- Analys av inspelade fluorescerande bilder.
- Öppna experimentet filen. Med hjälp av aquacosmos mjukvaran, klicka på "Ratio" och välj önskat förhållande området. Beräkna pixel för pixel förhållandet i de resulterande bilderna för att erhålla en sekvens av förhållandebilder.
- Subtrahera bakgrund genom att justera "bakgrunds eliminering". Tryck "start beräkning".
- Tryck "alla tider sekvens" knappen och radera de gamla områden av intresse (ROI). För kvantitativ analys av enskilda celler, skapa nya regioner av intresse eller ROI motsvarande enskilda nervceller. Genomsnittliga alla förhållandevärden i varje pixel motsvarar varje ROI och varje bild för att få en inspelning av förhållandet fluorescensvärdena för enskilda ROI (celler).
- För att plotta de enskilda inspelningarna exportera förhållande fluorescensvärdena motsvarar varje ROI till en graf program.
- Gör motsvarande beräkningar för att uppskatta storleken på ökningar av förhållandet fluorescenser som svar på varje stimulering med hjälp av en lämplig dataanalys och graf programvara.
3. Bioluminescence Imaging av mitokondrie Ca2 + Koncentration
- Transfektion av odlade hippocampusneuroner med mitGAmut plasmiden.
OBS: Celler först transfekteras med mitGAmut plasmid innehållande en mitokondrier-målsekvensen och en muterad aequorin som saknar en Ca2 + bindningsställe fuserad till grönt fluorescerande protein (GFP). Denna konstruktion upptäcker stora ökningar i mitokondriell Ca2 + upptag och möjliggör identifiering av transfekterade celler genom GFP fluorescens. Plasmiden utvecklades och vänligen av P. Brûlet och medarbetare 18 (CNRS, Paris).- Förbered Neurobasal TF, innehållande Neurobasal Odlingsmedium, som saknar fetalt bovinserum, B27, gentamici och 2 mM L-glutamin.
- Förbered 50 il Neurobasal TF plus 2,5 pl transfektion reagens i en injektionsflaska (lösning A). Förbered 50 il Neurobasal TF plus 4 mikrogram mitGAmut plasmid i en injektionsflaska (lösning B). Lägg försiktigt lösning B under lösning A. Tillåt blandning under 20 minuter, utan att skaka.
- Överför täck innehåller hippocampusneuroner till nya multidish plattor innehållande 200 pl av färskt Neurobasal TF.
- Lägg droppvis 100 pl av lösning A + B över varje täck. Inkubera under 30 minuter. Ta bort mediet. Tvätta en gång celler med färskt Neurobasal TF. Återgå täckglasen till den ursprungliga Neurobasal odlingsmedium.
- Kultur nervceller för ytterligare 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 efter transfektion för att möjliggöra effektiv uttryckning och inriktning av sonden.
- Beredning av testlösningar för mareld avbildning.
- Bered HBS lösningar innehållande NMDA 100 pM eller 145 mM KCl somovan (Steg 2,1). Bered HBS lösning innehållande 10 mM Ca2 + plus digitonin 100 iM.
- Beredning av mitokondrier riktade aequorin med coelenterazin n.
- Överför täck innehåller transfekterade hippocampusneuroner till fyra brunnar innehåller 200 pl HBS.
- Tillsätt 4 | il coelenterazin n (200 pM) till 200 pl HBS för en slutlig koncentration av 4 | iM och blanda försiktigt. Inkubera i 2 h vid RT (25 ° C) och i mörker.
- Inspelning mareld bilder av mitokondrie [Ca2 +].
- Slå på mikroskopet, lampan, perfusionssystemet, mareld kameran och datorn.
- Överför rekonstituerade täckglas till en termostaterad (37 ° C) perfusionskammaren och BEGJUTA kontinuerligt med förvärmda HBS-lösning med en hastighet av 5-10 ml / min.
- Med hjälp av en 40X mål (olja, NA: 1,3), välj en mikroskopisk fält som innehåller celler som uttrycker enpoaequorins såsom visas av fluorescensemission i samband med uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP) under användning av FITC filter. Ett typiskt fält kan innehålla 1-2 transfekterade celler. Fånga GFP fluorescens bilden, med hjälp av en CCD-kamera.
- Stäng av mikroskopet ljus. Ta bort dikroiska innehållande låda placerad i ljuset vägen. Stäng av excitationsljuset och stäng mörk box för fullständigt mörker.
- Perfundera celler vid 5-10 ml / min med HBS medium med eller utan testlösningar förvärmas vid 37 ° C.
- Fånga fotoniska utsläpps bilder varje 10 sek med en fotonräknande kamera hanteras med en bildprocessor.
- Vid slutet av varje experiment, permeabilisera celler med 0,1 mM digitonin i 10 mM CaCl2 i HBS för att frigöra alla återstående fotoniska emissioner.
Obs: Dessa fotoniska utsläpp måste läggas upp för att uppskatta den totala fotoniska utsläppen, ett värde som krävs för kalibrering i Ca2 + koncentrationer <./ li> - Butiks mareld bilder i datorn med GFP tillhörande fluorescensbild fångas innan fotonräknande avbildning.
- Analys av mareld bilder som speglar mitokondrie [Ca2 +].
- Kvantifiera fotoniska utsläpp med hjälp av särskild programvara. Fotoniska utsläppen kan omvandlas till mitokondriella fria Ca2 + -koncentrationen ([Ca2 +] mit) användning av algoritmen beskriven av Brini et al., 15.
- Öppna experimentet och GFP fluorescens bild. Välj områden av intresse (ROI) med hjälp av särskilda program genom att dra formen av de transfekterade cellerna enligt fluorescens bilder som tagits vid början av experimentet.
- Klistra samma ROI på varje bild. Totalt fotoniska utsläppen i varje ROI beräknas med särskild programvara för att erhålla värdet luminiscens utsläpp (L) för varje cell vid varje tidpunkt.
- Lägg upp alla fotoniska Emissjoner i mareld bilder, inklusive de som erhållits efter digitonin permeabilisering, med hjälp av specifika program, för att erhålla en bioluminiscens bild som innehåller alla fotoniska emissioner.
- Exportvärdet av fotoniska utsläpp varje region av intresse för en särskild programvara för beräkningar. För att göra detta, klicka på "Graph" för att beräkna mareld värden för varje ROI vid varje tidpunkt. Välj "totalt värde" och "använda aktuella ROI till alla bilder. Tryck på 'calculate ". Spara "txt.file" och exportera data till ett kalkylblad. För varje ROI, [Ca2 +] mit beräknas med användning av följande algoritm:
[Ca2 +] (M) = [R + (R 'K TR) - 1] / [K R - (R' K R)];
var,
R = [L / (L total λ)] 1 / n
L är luminescensen avges vid tidpunkten för mätningen i varje region av intresse.
L totala ärden totala luminiscens återstår efter tillsats av räkningarna som finns i vävnaden vid den tiden vid tidpunkten för mätningen för varje region av intresse. λ, K TR, K R och n är konstanter vars värden beror på en kombination av aequorin (vildtyp eller muterad) och coelenterazin används (vild typ eller n typ) samt inspelningstemperaturen 16. För kombinationen som används här (muterade AEQ och coelenterzine n), vid 37 ° C, använde vi följande värden: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 och λ = 0138.
- Gör motsvarande beräkningar för att uppskatta storleken på ökningar av mareld som svar på varje stimulus med en lämplig dataanalys och graf programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi en enkel metod för att bedöma Ca2 + ombyggnad och effekterna av NMDA på cytosoliskt och mitokondrie [Ca2 +] i åldern nervceller. Figur 1 visar den schematiska av förfarandet för isolering och odling hippocampusneuroner från neonatala råttor. Innan du börjar, måste vi förbereda sterila, poly-D-lysin belagda, glastäck och lokalisera dem i ett 4-bra maträtt. Därefter neonatala råttor avlivas och hjärnan avlägsnades. Efter isolering av hippocampus, är vävnad försiktigt sprids med hjälp av papain. Isolerade celler tvättas och stryks ut på belagda täckglas. Då cellerna odlas under 2-5 DIV eller> 15 DIV att få unga eller äldre kulturer, respektive, och används för Ca 2 + avbildning experiment.
Med hjälp av ovanstående strategi, är det möjligt att ha unga och gamla neuroner från samma prov för att testa, till exempel om NMDA inducerar differentiella effekter på cytosoliskt [Ca2 +] i unga Cultures än i äldre kulturer. Figur 2 visar att NMDA 100 pM framkallar större ökningar av cytosolisk [Ca2 +] i äldre kulturer än hos unga kulturer. Likaså NMDA inducerar celldöd i gamla neuroner men inte i unga nervceller 5. I de fall där Ca 2+ svar är mycket höga, kan liknande experiment utföras med Ca2 + prober med mindre affinitet för Ca2 + för att undvika färgmätt liknande, exempelvis fura4F 5. På samma sätt är det även möjligt att lära sig om vilande nivåer av cytosoliskt [Ca2 +] är olika. Dessutom kan kombinationen av detta protokoll med kvantitativa immunofluorescens med användning av antikroppar som är specifika för NMDAR subenheter tillåta korrelera förändringar i lyhördhet med skillnader i uttryck av NMDA receptorsubenheter under förutsättning att specifika antikroppar finns 5. Mätningar av cytosoliskt [Ca2 +] kan också användas för att bedöma andra relevanta parameters inklusive Ca2 + lagra innehåll, vila permeabilitet för Ca2 +, Ca2 + clearance och deras eventuella skillnader mellan unga och äldre nervceller.
På ett liknande sätt är det även möjligt att testa effekterna av sådana stimuli på mitokondriell [Ca2 +]. Figur 3 visar ett exempel på bioluminescens avbildning av hippocampusneuroner transfekterade med mitokondrier inriktade aequorin. Frigörande av fotoniska utsläpp efter stimulering är en funktion av ökningen av mitokondrie [Ca2 +] uppnås. Lägg märke till att NMDA-inducerade ökningar i mitokondriell [Ca2 +] är mycket större hos äldre neuroner än hos yngre hippocampus nervceller, där NMDA ökar knappt fotoniska utsläpp. Dessa resultat kan bidra till att förklara varför NMDA inducerar apoptos endast i åldern nervceller men inte i unga kulturer av hippocampus celler 5. På samma sätt, är det möjligt att testa med avseende på ytterligare skillnader i mitokondriellCa2 + hantering mellan unga och äldre nervceller med hjälp av protokoll som är särskilt utformade för att testa, till exempel, Ca2 + utträde ur mitokondrier, mitokondriell Ca2 + upptag i permeabilized nervceller och mitokondrie Ca2 + upptag induceras av Ca2 + frisättning från intracellulära butiker. Dessutom kan denna metod användas för att testa för droger påverkar mitokondriell Ca2 + överbelastning som kan vara av intresse för neuroprotektion mot excitotoxicitet.
Figur 1: Förfarande för isolering av primära rått hippocampusneuroner (A) Poly-D-lysin, 12 mm glasbelagda täckglas framställes i en petriskål och slutligen överfördes till en 4-brunnsskål.. (B) Dorsal vy av en råtthjärna. Den streckade linjen anger var snittet skall göras. (C) Erhållande somuspension av primära hippocampala neuronceller. Efter avlägsnande av hippocampus, är en cellsuspension erhålles. Då cellerna stryks i de fyra brunnar innehållande poly-D-lysinbelagda täckglas. (D) Bright fält bild som visar primära råtta hippocampus nervceller i odling. Stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. NMDA ökar cytosoliskt [Ca2 +] i hippocampusneuroner Kort- och långtids odlade hippocampusneuroner laddades med fura2 / AM och utsattes för fluorescens avbildning. Bilderna visar representativa ljusa fält och Pseudo bilder (Ratio F340 / F380) av kortfristiga (A) och lång sikt (B [Ca2 +] (Pseudo skalor visas längst ner). Spår visar representativa, encelliga inspelningar av cytosoliskt [Ca2 +] som svar på 100 iM NMDA på kort sikt (A) och lång sikt (B) odlade hippocampus nervceller. Observera att cytosoliskt [Ca2 +] ökar är mycket större långsiktigt än i kortsiktiga odlade nervceller. Stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. NMDA inducerar mitokondriell Ca2 + överbelastning i hippocampusneuroner Odlade hippocampus neurons transfekterades med låg affinitet, mitokondrier riktade aequorin smält till GFP, inkuberades med 4 ^ M coelenterazin och utsattes för bioluminescens avbildning av mitokondriell [Ca2 +]. Bilderna visar fluorescens (GFP) och ackumulerade fotoniska utsläpp (aequorin mareld) bilder av representativa kort (A) och lång sikt (B) odlade hippocampus nervceller. Luminescensintensiteten är kodad i pseudofärger (1 till 16 fotoniska utsläpp per pixel). Inspelningar visar frisättningen av fotoniska utsläpp (uttryckt som mitokondrie [Ca2 +]) i kort (A) och lång sikt (B) odlade hippocampus nervceller. NMDA 100 iM ökade mitokondrie [Ca2 +] i åldern nervceller men inte i unga odlade hippocampus nervceller. Stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ a>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ombyggnaden av intracellulär Ca2 + homeostas i den åldrande hjärnan har satts i samband med kognitiv förlust, ökad mottaglighet för ischemisk skada, excitotoxicity och neurodegeneration. För att undersöka denna hypotes in vitro, Ca2 + avbildningsförfaranden är tillgängliga. Tyvärr, livskraftiga odlingar av gamla hippocampus nervceller inte är tillförlitliga. Nyligen har det visat sig att långsiktiga kulturer av rått hippocampusneuroner närvarande många av de typiska kännetecknen för åldrande in vivo inklusive ROS ackumulation, bildandet av lipofuscin granulat, heterochromatic fokus, aktivering av pJNK och p53 / p21 vägar, kolesterol förlust, och ändrar tätheten av Ca2 + kanaler och NMDA-receptorer 14. Följaktligen kan Ca2 + imaging experiment hos unga och gamla kulturer rått hippocampusneuroner ge nya insikter i Ca2 + remodeling i den åldrande hjärnan. Ett tillstånd som är kritiskt för odling hippocampal neuroner på lång sikt är tvåfaldig. För det första är det viktigt att plätera cellerna vid en mycket låg densitet enligt ovan. För det andra, celler odlas i kompletterat Neurobasal medium utan att ändra mediet. Detta tillvägagångssätt gör närvaron av glia men undviker deras alltför tillväxt. Den schematiska för sådan kultur visas i fig 1.
Fluorescens avbildning med syntetiska Ca2 + prober möjliggör övervakning av cytosoliskt [Ca2 +] i enskilda nervceller 19. Användningen av denna metod hos unga och äldre nervceller möjliggör övervakning av förändringar i svaren med åldern i kultur. Till exempel Figur 2 visar typiska ljusa fält och Ca2 + bilder av ökningar i [Ca2 +] cyt induceras av NMDA hos unga nervceller och nervceller från äldre kulturer. Lägg märke till att svaren i åldern nervceller är mycket större än hos yngre neuroner. Emellertid är detta förfarande inte tillförlitligt för [Ca2 +] Mätningar inom subcellulära organeller som till exempel mitokondrier, där [Ca2 +] kan variera från under iM till över mM nivå. I dessa fall protein baserad, mitokondrier inriktade prober har utvecklats som, till exempel, aequorin. Denna sond är speciellt intressant eftersom dess affinitet för Ca2 + kan finstämt att mycket låga eller mycket höga [Ca2 +] som de som nådde inuti mitokondrier i vila och stimulerade förhållanden. Närmare bestämt är det möjligt att välja antingen vildtypen aequorin eller en muterad aequorin utan Ca2 + bindningsställen för att modifiera affiniteten. Finjustering åstadkommes när olika coelenterazines (vildtyp, H, N) används i kombination med olika aequorins 17. Men medan användningen av fluorescens för Ca 2 + avbildning är utbredd, är inte lätt att övervaka bioluminiscens och kan kräva fotonräknings kameror. Lyckligtvis, aequorinprober, som den som används här, har förbättrats för att samuttrycka GFP 18 vilket gör dem mer stabila, kunna släppa fler fotoniska emissioner och tillåter enkel identifiering av transfekterade celler genom GFP associerad fluorescens. Framgång i mareld avbildning i nervceller beror inte bara på effektiviteten hos fotonräknande kamera som används utan även på effektiviteten i transfektion av mitokondrier inriktade sond. När det gäller hippocampus nervceller, kan en enkel kemisk transfektion arbete under förutsättning att en högkänslig fotonräknande kamera finns. Figur 2 visar exempel på ljusa fält, GFP fluorescens och mareld bilder av unga och åldrades i kultur hippocampus nervceller. Dessutom visas är ökningar av mitokondrie [Ca2 +] induceras av NMDA registreras i transfekterade hippocampus nervceller. Lägg märke till att effekten av NMDA är mycket större i åldrade odlade neuroner än hos unga neuroner. I andra fall, effektiviteten i transfecningen kan ökas genom användning av virushärledda vektorer 16,18. Alternativt är utvecklingen av transgena möss som härbärgerar proteinbaserade, subcellulära Ca2 + prober en framväxande alternativ för framtida strategier, kanske till och med in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
- Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
- MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
- Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
- Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
- Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
- Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
- Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
- Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
- Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
- Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
- Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
- Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
- Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
- Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).
