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Neuroscience

लेजर निर्देशित Neuronal का पता लगाने में ब्रेन Explants

Published: November 25, 2015 doi: 10.3791/53333
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado School of Medicine

Summary

हम इन विट्रो तैयारी का उपयोग कर मस्तिष्क नाभिक में अग्रगामी या प्रतिगामी अनुरेखक इंजेक्शन के माध्यम से न्यूरॉन्स और उनकी प्रक्रियाओं लेबल करने के लिए एक तकनीक का वर्णन है। हम मैं n लेबलिंग शुद्धता को बढ़ाने के क्रम में लाभ की fluorescently लेबल माउस म्यूटेंट और बुनियादी ऑप्टिकल उपकरण लेने से दरियाफ्त इलेक्ट्रोपोरेशन विट्रो के एक मौजूदा पद्धति को संशोधित किया।

Abstract

हम प्रक्रिया के दौरान लक्षित लेजर रोशनी और मिलान फिल्टर चश्मे के साथ मस्तिष्क explants में electroporation के माध्यम से डाई तेज बढ़ाने के लिए बिजली और दबाव दालों की एक श्रृंखला का उपयोग करता है, जो इन विट्रो दरियाफ्त इंजेक्शन प्रोटोकॉल को जोड़ती है, जो एक तकनीक मौजूद है। स्वयं के द्वारा इन विट्रो electroporation की वर्णित तकनीक मस्तिष्क के कुछ क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए अपेक्षाकृत अच्छा दृश्य नियंत्रण अर्जित करता है। लेजर फ्लोरोसेंट आनुवंशिक मार्करों की उत्तेजना और उनके पढ़ने के लिए बाहर बैंड गुजर फिल्टर चश्मे के माध्यम से, आनुवंशिक रूप से लेबल की कोशिकाओं / नाभिक और फ्लोरोसेंट ट्रेसिंग डाई के उत्सर्जन को चुन सकते हैं, जो एक शोधकर्ता काफी इंजेक्शन की सटीकता को बढ़ा सकते हैं के साथ संयोजन से रुचि के क्षेत्र को खोजने और अधिक कुशलता से इंजेक्शन क्षेत्र में डाई-प्रसार / तेज के लिए नियंत्रित करने से। इसके अलावा, लेजर रोशनी तकनीक नीति से एक दिया neurocircuit की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता हैGFP अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स की एक उप-जनसंख्या द्वारा व्यक्त ट्रांसमीटर के प्रकार से जुड़ा हुआ है जहां मामलों में एक निश्चित क्षेत्र के लिए पेश न्यूरॉन्स के प्रकार के बारे में जानकारी iding।

Introduction

एक निश्चित न्यूरोनल (माइक्रो) सर्किट को परिभाषित करने के लिए, एक ने कहा कि सर्किट, और उनके कनेक्शन पैटर्न के विभिन्न प्रतिभागियों को खोजने के द्वारा शुरू करनी चाहिए। कभी lesioning 1 के माध्यम से neuroanatomical ट्रेसिंग तकनीक की एक बड़ी विविधता ट्रेसिंग neurofiber के बारे में वालर के प्रकाशन स्थापित किया गया है के बाद से। 1971 5-6 में खोज के रूप में इन तकनीकों में से कुछ तय ऊतक पोस्टमार्टम 2-4 में लागू किया जा सकता है, दूसरों को, जी न्यूरॉन्स में डाई की सक्रिय परिवहन पर भरोसा करते हैं। बाद के आगे (एक दिया प्रक्षेपण के स्रोत, यानी करने के लिए इंजेक्शन क्षेत्र से। क्षेत्र कहा करने के लिए पेश कर रहे हैं कि न्यूरॉन्स के somata) सक्रिय प्रतिगामी का लाभ लेने के तरीकों के बीच भेदभाव को दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है और सक्रिय अग्रगामी (इंजेक्ट से एक दिया प्रक्षेपण का लक्ष्य है, यानी। axonal अनुमानों और लेबल न्यूरॉन्स) परिवहन की axonal टर्मिनलों के लिए क्षेत्र। इसके अलावा, कुछ मामलों में टीआरएप्रमाणपत्र सामग्री तो अन्य मामलों में explanted दिमाग इंजेक्ट कर रहे हैं, जबकि (विवो दरियाफ्त इंजेक्शन में) कई दिनों या हफ्तों के द्वारा इंजेक्शन जीवित और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में इंजेक्शन के बाद कई घंटे के लिए सेते हैं जो जीवित पशुओं में इंजेक्ट किया जाता है (इन विट्रो दरियाफ्त इंजेक्शन) ।

इस प्रोटोकॉल में हम इन विट्रो electroporation तकनीक 7-8 में मौजूदा एक ट्रेसिंग पदार्थ के रूप में choleratoxin सबयूनिट-बी और tetramethylrhodamine dextran का उपयोग अग्रगामी और प्रतिगामी ट्रेसिंग प्रयोगों में neuronal somata और प्रक्रियाओं को लेबल करने के लिए संशोधित किया। इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य दरियाफ्त इंजेक्शन के दौरान निशाना बना शुद्धता को बढ़ाने के क्रम में उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस लाइनों और बुनियादी ऑप्टिकल उपकरण का लाभ ले रही है, जबकि अलग मस्तिष्क नाभिक के बीच न्यूरोनल कनेक्टिविटी पैटर्न का पता लगाने के लिए एक कुशल उपकरण के साथ neuroscientists प्रदान करना है। अग्रगामी और प्रतिगामी ट्रेसिंग की विधि का उपयोग हालांकिcholeratoxin और dextran अमाइन और उनके संबंधित fluorescently लेबल conjugates 9-13 नया नहीं है (उदाहरण के लिए। हास एट अल electroporation की विधि के रूप में है। 14), मस्तिष्क के ऊतकों के ब्लॉक से जुड़े इन विट्रो तैयारी में electroporation के साथ दरियाफ्त इंजेक्शन के संयोजन एक और अधिक हाल ही में विकास 7 है। जीवित पशुओं में दरियाफ्त रंगों का एक ही प्रकार का उपयोग न्यूरोनल ट्रेसिंग तकनीक पर इसका मुख्य लाभ क्योंकि electroporated डाई न्यूरॉन्स द्वारा लिया जा रहा है, जिसके साथ उच्च दक्षता की वृद्धि हुई है, लेबलिंग तीव्रता है। प्रयोगकर्ता इंजेक्शन का लक्ष्य क्षेत्र से अधिक दृश्य नियंत्रण नहीं है क्योंकि एक अतिरिक्त लाभ, ट्रेसर इंजेक्शन के दौरान (डाई परिवहन के लिए आवश्यक) छोटा ऊष्मायन अवधि और इसकी वृद्धि लक्ष्य सटीकता है। बाद में भी कोई महंगा स्टीरियोटैक्टिक उपकरण ब्याज के नाभिक या मस्तिष्क क्षेत्र को खोजने के लिए आवश्यक है कि इसका मतलब है।

Addi करने के लिएtionally हम 405 एनएम तरंगदैर्ध्य और मिलान बैंड पास छानने के चश्मे की एक हाथ से आयोजित लेजर सूचक (450 से मिलकर न्यूरॉन्स 15 और बुनियादी ऑप्टिकल उपकरण के अपने glycinergic उप-जनसंख्या में GFP व्यक्त करता है जो एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन का फायदा उठाया, सटीकता को लक्षित वृद्धि - 700 एनएम)। इस प्रकार, हम अपने फ्लोरोसेंट संकेत के माध्यम से इंजेक्शन क्षेत्र की पहचान करके सटीकता को निशाना बनाने में और स्वदेशी GFP संकेत और दरियाफ्त के बीच बातचीत का अवलोकन के माध्यम से इंजेक्शन क्षेत्र के भीतर डाई प्रसार के लिए नियंत्रित करने के लिए एक महीन तरीका प्रदान करके एक महत्वपूर्ण और वृद्धि हासिल की प्रतिदीप्ति। हमारी तकनीक भी दरियाफ्त से भर गया है कि (अन्य माउस लाइनों में या उत्तेजक) ने अपने GFP पॉजिटिव निरोधात्मक न्यूरॉन्स की पहचान करके कनेक्टिविटी के साथ एक सर्किट की कार्यक्षमता को उजागर करने की अनुमति देता है।

सारांश में, हम आगे कशेरुकी मस्तिष्क के connectome अध्ययन और टी का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली neuroscientific उपकरण बढ़ायावह एक दिया neurocircuit के विभिन्न neuroanatomical सुविधाओं। सस्ती और व्यापक रूप से उपलब्ध ऑप्टिकल उपकरण के साथ-साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके हम काफी हमारे इंजेक्शन का निशाना बना शुद्धता बढ़ाने के लिए सक्षम थे। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों श्रवण brainstem में एक निरोधात्मक microcircuit की कार्यक्षमता को उजागर करने में मदद मिली है, जो पता लगाया कनेक्शन, के प्रकार की पहचान करने की अनुमति दी।

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Protocol

1. ऑप्टिकल जीनोटाइपिंग

माउस पिल्ले की 1. ऑप्टिकल जीनोटाइपिंग

  1. उचित उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के एक लेजर सूचक का उपयोग संबंधित फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए चेक (यहाँ वर्णित प्रयोगों में 405 एनएम) और उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को अवरुद्ध फिल्टर चश्मे इसी लेकिन उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य से गुजर रहा है (450 - यहाँ वर्णित प्रयोगों में 700 एनएम) । सिर या माउस पिल्ला की रीढ़ की हड्डी के पीछे लेजर सूचक बिंदु (चित्रा 1 देखें)। आंखों और लेजर प्रकाश में त्वचा का लंबा जोखिम में लेजर चमक से बचें।

बड़े पशुओं के 2. ऑप्टिकल जीनोटाइपिंग

  1. गहराई से एक intraperitoneal इंजेक्शन (120 मिलीग्राम / किग्रा वजन) के माध्यम से pentobarbital की अधिक मात्रा के साथ (यहाँ वर्णित प्रयोगों में p138 के लिए वृद्ध P14) माउस anesthetize। पशु की सजगता की जाँच करके उचित संज्ञाहरण की पुष्टि (संक्षिप्त वीं की नोक चुटकीई कान या पिछले पैरों में से एक कान या पैर) का त्याग पलटा बटोर।
  2. नोट: पशु अभी भी आदर्श (यानी अपने दिल अभी भी धड़क रहा है) जिंदा है क्योंकि pentobarbital (120 मिलीग्राम / किग्रा वजन) की अधिक मात्रा के उपयोग के बावजूद हम, बजाय इच्छामृत्यु की 'गहरी संज्ञाहरण "के रूप में इंजेक्शन प्रक्रिया का उल्लेख है, जब सर्जरी और छिड़काव शुरू करते हैं। यह मस्तिष्क सहित भीतरी अंगों के लिए एक अधिक कुशल छिड़काव सुनिश्चित करता है।
  3. पशु किसी भी सजगता प्रदर्शित नहीं करता है एक बार, ध्यान से सिर के पीछे के कवर त्वचा में एक चीरा और खोपड़ी के midsection को काटने से खोपड़ी (2A चित्रा) overlying त्वचा को हटा दें। लेजर प्रकाश में खुला खोपड़ी बेनकाब और ऊपर वर्णित के रूप में फिल्टर चश्मे के माध्यम से प्रतिदीप्ति निरीक्षण करते हैं। एक सकारात्मक GFP संकेत मनाया जाता है, तो निम्न इच्छामृत्यु के रूप सुनिश्चित /, कत्ल के माध्यम से पशु बलि नहीं करता है, तो दूसरा (2 कदम आगे बढ़ना हमारेIACUC विनियम)।

नोट: प्रतिदीप्ति जानवर की आँखों के माध्यम से देखा जा सकता है (> 1 महीना) भी बड़े चूहों में।

2. Transcardial छिड़काव और ब्रेन तैयारी

  1. ठंडा फॉस्फेट बफर खारा साथ transcardially छिड़कना, मोटे तौर से खून निकालने के लिए एक 30 जी सिरिंज सुई का उपयोग (पीबीएस सोडियम क्लोराइड: 10 मिमी 137 मिमी, KCl: 2.7 मिमी, के.एच. 2 पीओ 4: 1.76 मिमी, ना 2 4 HPO) पशु।
    1. सबसे पहले, ध्यान से तेज कैंची से रिब पिंजरे खुला और फिर दिल के बाएं वेंट्रिकल में सुई धक्का। दिल और महाधमनी में पीबीएस पम्पिंग और तुरंत इस कदम के शरीर से बाहर निकलने के लिए रक्त के लिए अनुमति देने के लिए कैंची से दिल के सही प्रांगण खोलने के बाद शुरू करो। नोट: छिड़काव 5 लेता है - जानवर के आकार के आधार पर 10 मिनट।
  2. छिड़काव के माध्यम से exsanguination के बाद, पशु सिर काटना पिन एन के साथ अपने सिर को सुरक्षितeedles (या 30 जी सिरिंज सुई) एक तैयारी डिश में आँख कुर्सियां ​​के माध्यम से उन्हें भेदी और खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने से।
    1. सबसे पहले, खोपड़ी overlaying त्वचा नाश करने के लिए तेज कैंची का उपयोग करें: सिर के पीछे एक छोटा सा चीरा बनाने, तो बस दुमदारी जानवर की आँखों के पक्ष में कटौती, सिर के पृष्ठीय पक्ष पर midline के साथ काटा और दुम दिशा में अंत में कटौती पूरी तरह से सिर के पीछे में त्वचा के फ्लैप को दूर करने के लिए।
    2. यह काफी अंत में ब्रेन स्टेम के हटाने सरल होगा क्योंकि इसके बाद, खोपड़ी खुद के लिए ही काटने पैटर्न दोहराने, इस प्रक्रिया में दोनों cochleas दूर करने के लिए सुनिश्चित करें। इस प्रक्रिया के बाद मस्तिष्क की दुम आधा पूरी तरह से उजागर झूठ चाहिए।
    3. अगले चरण में, सेरिबैलम से लगभग 45 डिग्री और के बारे में 2 मिमी व्याख्यान चबूतरे के कोण पर पूरे अग्रमस्तिष्क के माध्यम से कटौती करने के लिए एक तेज धार या एक छुरी का उपयोग करें। एबी के साथ मस्तिष्क के अलग सामने आधा बाहर निकालनाईएनटी रंग।
    4. अपने व्याख्यान चबूतरे अंत में मस्तिष्क की दुम आधा तरक्की और बाद में अभी भी अपने उदर पक्ष पर ब्रेन स्टेम से जुड़े हैं कि कपाल नसों के माध्यम से कटौती करने के लिए रंग का प्रयोग करें। एक अंतिम परिणाम के रूप में, मस्तिष्क सहित मस्तिष्क की दुम आधा तैयार पशु सिर के बाकी बंद स्वतंत्र रूप से गिर चाहिए।
    5. अपने उदर पक्ष को बेनकाब करने के लिए मस्तिष्क के हटा दिया दुम आधा पलटें और चतुर्भुज शरीर युक्त पेट के बल स्थित "बल्बों" की (अग्रगामी इंजेक्शन के लिए) बस व्याख्यान चबूतरे राज्याभिषेक विमान के साथ काटा या (प्रतिगामी इंजेक्शन के लिए) सिर्फ दुम (कदम देखना 2.3)।
      1. हमेशा ऊतक पर अत्यधिक यांत्रिक तनाव की वजह से कोशिका मृत्यु को कम करने के काटने की प्रक्रिया के लिए एक तेज धार या एक छुरी का उपयोग करें। एक अंतिम परिणाम के रूप में, लंबाई में लगभग 1 सेमी फैले और मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों के साथ पूरा बेहतर वर्तुलिका जटिल युक्त मस्तिष्क explant प्राप्त किया जाना चाहिए था।
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नोट: इस प्रोटोकॉल श्रवण brainstem में स्थित चतुर्भुज शरीर में एक ट्रेसर इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया को दर्शाता है। जरूरत के रूप में काटने के विमानों और इंजेक्शन साइटों के स्थान और ओरिएंटेशन को अपनाना। वे पहचान की है और मस्तिष्क को काटने के बिना इंजेक्शन जा सकता है, ताकि मस्तिष्क की सतह के काफी करीब ब्याज झूठ का fluorescing मस्तिष्क क्षेत्रों (चित्रा 2B देखें) है, तो राज्याभिषेक काटने कदम छोड़ा जा सकता है।

  1. चतुर्भुज शरीर (VNTB) के उदर नाभिक युक्त दो उदर प्रमुख "बल्बों" के रूप में चतुर्भुज शरीर को पहचानें।

नोट: इन काटने विमानों की अनुमानित स्टीरियोटैक्टिक स्थान के बारे में आगे की संरचनात्मक संदर्भ के लिए, मिमी Tz "के रूप में चिह्नित चतुर्भुज शरीर (= MNTB) की औसत दर्जे का नाभिक से पता चलता है, शीर्षस्थान ~ -5.7 एटलस की फ्रैंकलिन और Paxinos, 2008 पैनल 78 देखना "। पैनल 69 चतुर्भुज बो के उदर नाभिक से पता चलता है"MVPO" (medioventral periolivary नाभिक) 19 के रूप में चिह्नित डीवाई (VNTB)।

3. अग्रगामी / प्रतिगामी ट्रेसिंग

नोट: आर टी (25 डिग्री सेल्सियस) पर सभी निम्न प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।

  1. 125 मिमी, KCl: 2.5 मिमी, 2 MgCl: 1 मिमी, 2 CaCl: 0.1 मिमी, ग्लूकोज काटने के बाद, (95% ओ 2, 5% सीओ 2) विदारक समाधान (सोडियम क्लोराइड ऑक्सीजन युक्त तैयारी डिश में मस्तिष्क explant जगह : 25 मिमी, नाह 2 पीओ 4: 1.25 मिमी, 3 NaHCO: 25 मिमी, एस्कॉर्बिक एसिड: 0.4 मिमी, म्यो-inositol: 3 मिमी, पाइरुविक अम्ल: 2 मिमी), 30 जी सिरिंज की सुई के साथ इसे हासिल। इंजेक्शन के क्षेत्र के ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ रहा है कि सुनिश्चित करें।
  2. Borosilicate ग्लास से इंजेक्शन pipettes खींचो और निम्नलिखित तीन समाधानों में से एक के साथ उन्हें भरने: choleratoxin सबयूनिट-बी पीबीएस 12-13 में एक एलेक्सा fluorophore 555 संयुग्मित (मुख्य रूप से प्रतिगामी परिवहन के लिए प्रयोग किया जाता है), बी के एक) एक 1.0 मिलीग्राम / एमएल समाधान ) एक 1% -d10,000 मेगावाट dextran-TRITC 555 की 0.9% खारा में dextran (मुख्य रूप से प्रतिगामी परिवहन के लिए इस्तेमाल किया 3,000 मेगावाट), tetramethylrhodamine 555 या ग) एक 1% -dilution के 0.9% खारा में ilution (मुख्य रूप से) अग्रगामी परिवहन के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. 4 खींच चक्र - 2.5 से 3.5 MOhm करने के लिए और वे 3 में निर्मित किए गए हैं कि इंजेक्शन पिपेट प्रतिरोध रेंज सुनिश्चित करें। यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए, पिपेट खींचने पर एक पूर्व क्रमादेशित खींच एल्गोरिथ्म का चयन करके इस लक्ष्य को हासिल।
  3. उचित तरंग दैर्ध्य के एक स्थिर रुप से मुहिम शुरू की लेजर सूचक का उपयोग कर मस्तिष्क explant रोशन (चित्रा 3 ए में आइटम नंबर 2, यहाँ वर्णित प्रयोगों में 405 एनएम तरंगदैर्ध्य)। इंजेक्शन के लिए एक गाइड के रूप में लेजर सूचक का उपयोग करें, और fluorescently लेबल मस्तिष्क नाभिक या इंजेक्ट किया जाएगा कि ब्याज की कोशिकाओं पर लेजर बीम लक्ष्य।
  4. 70 - संगत फिल्टर चश्मे (450 पहने हुए मिल और एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रबुद्ध लक्ष्य क्षेत्र का निरीक्षणयहाँ वर्णित प्रयोगों) में 0 एनएम बैंड पास फिल्टर। रुचि के क्षेत्र में micromanipulator के माध्यम से इंजेक्शन इलेक्ट्रोड डालें।
  5. दरियाफ्त पदार्थ इंजेक्षन। मस्तिष्क अनुभाग के भीतर ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र में सीधा निर्देशित एक दबाव इंजेक्शन उपकरण का उपयोग कर, 50 मिसे प्रत्येक के लिए 15 साई पर 10 दबाव दालों - इंजेक्शन 2 से मिलकर बनता है। डाई प्रसार करने के लिए अनुमति देने के लिए 15 सेकंड - 10 के अंतराल पर प्रत्येक दबाव पल्स प्रशासन।
  6. Tetramethylrhodamine (TRITC) इंजेक्शन के मामले में, अतिरिक्त (यहाँ वर्णित प्रयोगों में MNTB और VNTB) ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में रखा इलेक्ट्रोड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से डाई तेज वृद्धि करने के लिए विद्युत प्रोत्साहित।
    1. एक उत्तेजना अलगाव इकाई (चित्रा 3 बी में आइटम नंबर 7 और 9) के साथ 55 वी के लिए एक उत्तेजक द्वारा संचालित और प्रवर्धित अंतराल interpulse 50 मिसे के साथ 50 मिसे के लिए 8 वोल्ट के 8 टीटीएल दालों का प्रयोग करें। इस प्रोटोकॉल, प्रशासन के 20 repetitions - 10 उपयोगकई मिनट 7.8 ओवर tered। ठीक से इलेक्ट्रोड से जमीन के लिए सुनिश्चित करें - ग्राउंडिंग तार स्नान समाधान से जुड़ा होना चाहिए!
  7. इंजेक्शन की सफलता के लिए जाँच करें। एक लंबे समय तक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर भी तरंग दैर्ध्य के साथ लेजर उत्तेजना पर एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जन होता है, नेत्रहीन लेजर के साथ क्षेत्र रोशन और फिल्टर चश्मे के माध्यम से अवलोकन करते हुए इंजेक्शन के लक्ष्य क्षेत्र में फैल डाई तेज / के लिए जाँच करें।

4. ऊष्मायन

  1. इंजेक्शन के बाद, ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में (ACSF brainstems सेते हैं, सोडियम क्लोराइड: 125 मिमी, KCl: 2.5 मिमी, 2 MgCl: 1 मिमी, 2 CaCl: 2 मिमी, ग्लूकोज: 25 मिमी, नाह 2 पीओ 4: 1.25 मिमी, 3 NaHCO: 25 मिमी, एस्कॉर्बिक एसिड: 0.4 मिमी, म्यो-inositol: 3 मिमी, पाइरुविक अम्ल: 2 मिमी, 95% ओ 2 के साथ bubbled - कमरे के तापमान पर 5% सीओ 2) के लिए 1 (आरटी, 25 डिग्री सेल्सियस) - 4 घंटा, जबकिडाई ले जाया जा रहा है। बुलबुला पूरे ऊष्मायन अवधि के दौरान समाधान।
  2. रातोंरात (हे / एन) के बाद निर्धारण अनुमति देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें और सेते हैं; (पीएफए ​​/ पीबीएस मिश्रण के लिए 7 पीएच। लगभग 100 मिलीलीटर) इसके बाद, पीबीएस में भंग 4% paraformaldehyde (पीएफए) में brainstems हस्तांतरण।

5. ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया और बढ़ते

  1. अगले दिन, पीबीएस में मस्तिष्क (प्रत्येक धोने कदम के लिए 5 मिनट) तीन बार धोने, 4% अगर में इसे कवर और फिर 50 में काट - एक vibratome पर 80 माइक्रोन मोटी स्लाइस। एक गिलास स्लाइड, और coverslip पर एक बढ़ते माध्यम का उपयोग कर माउंट स्लाइस।
  2. वैकल्पिक रूप से, (: अटल बिहारी मीडिया में 100 कमजोर पड़ने एक 1 में उदाहरण के लिए नीले Nissl) 25 मिनट के लिए फ्लोरोसेंट Nissl के साथ वर्गों लेबल।
    1. एबी मीडिया तैयार 0.2 एम फॉस्फेट बफर के 250 मिलीलीटर मिश्रण करने के लिए (पीबी; 51 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, 150 मिमी ना 2 HPO 4), 15 मिलीलीटर 5 एम NaCl, 15 मिलीलीटर 10% ट्राइटन एक्स, 220 मिलीलीटर DDH 2 हे और 5 ग्राम गोजातीय सीरम albumine।
    2. Preceडी पीबीएस में 3 धोने कदम से Nissl लेबलिंग कदम (10 मिनट प्रत्येक) को सफल और।

नोट: मोटा वर्गों मुहिम शुरू की और विश्लेषण करने की जरूरत है, जहां मामलों में (जैसे स्लाइस यहाँ वर्णित प्रयोगों में 100 थे - बड़ा दूरी पर axonal संबंध को बचाए रखने के लिए मोटी 500 माइक्रोन), तकनीक ऊतक समाशोधन के साथ जोड़ा जा सकता है। हम ClearT2 12 से 20 सफल हो पाया। एक ऊतक समाशोधन कदम भी शामिल किया जाता है, वर्गों बढ़ते से पहले यह प्रदर्शन करते हैं।

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Representative Results

लेजर सूचक और लेजर चश्मे जल्दी से और सस्ते में एक कूड़े से GFP सकारात्मक जानवरों जीनोटाइप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 1 और 2 शो आंकड़े। युवा माउस पिल्ले के मामलों में, तकनीक noninvasively खोपड़ी और overlying त्वचा (- डी चित्रा 1 ए) के माध्यम से जानवर के दिमाग में GFP लेबल की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उत्सर्जित प्रतिदीप्ति कम से कम प्रसव के बाद 3 दिन (चित्रा 1 सी) के लिए त्वचा और माउस पिल्ले की खोपड़ी के माध्यम से देखा जा सकता है। प्रक्रिया हमारे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए चित्र 1 में दिखाया गया है न्यूरॉन्स की अपनी glycinergic उप-जनसंख्या (GlyT2 GFP) में GFP व्यक्त माउस लाइन लेबल। मोटा खोपड़ी और pigmented त्वचा के साथ बड़े पशुओं में, GFP लेबल त्वचा और हड्डी के माध्यम से कम अच्छी तरह से पता चलता है, और इसलिए सिर और / या गर्दन पर त्वचा ऑप्टिकल जीनोटाइपिंग (2A चित्रा) से पहले हटा दिया जाना चाहिए।

Perfusing के बादपशु मस्तिष्क बाहर ले लिया है और ब्याज की fluorescently लेबल नाभिक लगाने के लिए फिर से प्रकाशित किया जाता है। करीब चित्रा 2 बी में मस्तिष्क के उदर की सतह के लिए कि प्रकाश उज्ज्वल संरचनाओं हम अपने दरियाफ्त इंजेक्शन के लिए एक गाइड और एक लक्ष्य के रूप में दोनों का इस्तेमाल किया जो चतुर्भुज शरीर के दो उदर नाभिक हैं। 4 और 5 के प्रतिनिधि परिणाम दिखाने के आंकड़े और choleratoxin सबयूनिट-बी का उपयोग कर चतुर्भुज शरीर की औसत दर्जे का नाभिक (MNTB) में दो प्रतिगामी इंजेक्शन (ब्यूरो, चतुर्भुज शरीर (VNTB) का उपयोग tetramethylrhodamine dextrane (। चित्रा 4 TRITC); के उदर नाभिक में एक अग्रगामी इंजेक्शन आंकड़े 5 ए और बी) और TRITC (आंकड़े 5C और डी)। MNTB को VNTB से अनुमानों (इस मामले निरोधात्मक में) का संकेत ब्राइट axonal लेबलिंग VNTB (चित्रा 4) में एक अग्रगामी इंजेक्शन के बाद देखा जा सकता है। 5 ए के आंकड़े और 5C साइट पर एक सिंहावलोकन दिखानेयह अगले प्रतिगमनपूर्वक लेबल की कोशिकाओं (VNTB) युक्त नाभिक के साथ इंजेक्शन (MNTB) की। चित्रा 5 ए और 5C में दिखाया के रूप में ही वर्गों में glycinergic VNTB कोशिकाओं के somata लेबल प्रतिगमनपूर्वक की 5 ब और 5 डी शो बढ़ाया छवियों आंकड़े। ब्यूरो के साथ प्रतिगामी ट्रेसिंग एक अधिक कबरा पैटर्न 12-13 (चित्रा 5 ब) में यह परिणाम कैसे प्रतिगमनपूर्वक TRITC के साथ लेबल VNTB कोशिकाओं को एक बहुत ही घने गॉल्जी-तरह लेबलिंग 21 (चित्रा 5 डी) प्रदर्शित जबकि, ध्यान दें।

चित्र 1
चित्रा 1:। GlyT2-GFP पॉजिटिव की ऑप्टिकल जीनोटाइपिंग और GlyT2-GFP नकारात्मक चूहे GFP पॉजिटिव चूहों ग्रीन बिना एक 405 एनएम लेजर सूचक के साथ लेजर रोशनी पर (ए) सामान्य प्रकाश व्यवस्था की स्थिति, (बी) के तहत फोटो खींच रहे थे छानने के चश्मे और (सी)लेजर और यूवी सुरक्षा चश्मे के साथ लेजर रोशनी पर। एक मजबूत GFP संकेत सेरिबैलम और मस्तिष्क से ऊपर के क्षेत्र में दिखाई दे रहा है। (डी) इसके विपरीत, एक ही माउस लाइन और उम्र (P2) से GlyT2-GFP नकारात्मक पिल्ले (एक ही क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति के कोई लक्षण नहीं दिखा है वापस सिर और रीढ़ की हड्डी) के। नीले लेजर प्रकाश को प्रभावी ढंग से काले चश्मे से फ़िल्टर है।

चित्र 2
चित्रा 2: ऑप्टिकल जीनोटाइपिंग और एक तैयार ब्रेन Explant। (ए) एक पी 4 GlyT2-GFP माउस पिल्ला की खोपड़ी लेजर रोशनी के संपर्क में है और बैंड पास छानने के चश्मे के माध्यम से देखा जाता है। fluorescing GFP खोपड़ी के माध्यम से देखा जा सकता है। (बी) एक मस्तिष्क explant ही पिल्ला से लेजर रोशनी पर एक तैयारी डिश में, छानने के चश्मे के माध्यम के रूप में देखा। ऐसे चतुर्भुज शरीर (VNTB) के उदर नाभिक के रूप में Glycinergic एक्सोन और मस्तिष्क नाभिक, देखें के रूप में देखा जा सकता हैमस्तिष्क की सतह के करीब Y उज्ज्वल संरचनाओं।

चित्र तीन
चित्रा 3: इन विट्रो दबाव इंजेक्शन और electroporation सेटअप पर अवलोकन। (ए) 1: त्रिविमदर्शी, 2: घुड़सवार लेजर सूचक (405 एनएम तरंगदैर्ध्य), 3: इंजेक्शन पिपेट साथ headstage एक micromanipulator पर मुहिम शुरू की, 4: स्थापित एम सी उत्तेजना सॉफ्टवेयर, 6 के साथ एक पीसी: मस्तिष्क explant, 5 युक्त तैयारी पकवान: ट्यूबिंग के माध्यम से इंजेक्शन पिपेट से जुड़ा दबाव इंजेक्शन उपकरण, (बी) 7:। उत्तेजना अलगाव इकाई, 8: उच्च तीव्रता प्रकाशक: 9, उत्तेजक। उत्तेजक उत्तेजना अलगाव इकाई के माध्यम से पिपेट में इलेक्ट्रोड से जुड़ा है और पीसी से प्रेरित है।

चित्रा 4
चित्रा 4: चतुर्भुज शरीर की औसत दर्जे का न्यूक्लियस को VNTB से निरोधात्मक कनेक्शन के अग्रगामी ट्रेसिंग (MNTबी)। एक P14 GlyT2-GFP माउस की एक मंजूरी दे दी मस्तिष्क में गहराई में लगभग 200 माइक्रोन फैले एक क्षैतिज टुकड़ा में ले लिया एक confocal ढेर की एक अधिकतम प्रक्षेपण दिखाया गया है। VNTB की caudo औसत दर्जे हिस्से में एक tetramethylrhodamine dextrane (TRITC) इंजेक्शन के बाद, चमकते axonal कनेक्शन लेबल (और कुछ मामलों में उनके टर्मिनल अंत में) MNTB को VNTB से मनाया जा सकता है। स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन।

चित्रा 5
चित्रा 5:। VNTB में MNTB में प्रतिगामी अनुरेखक इंजेक्शन भरा प्रकट Glycinergic प्रकोष्ठों दिखाया अधिकतम अनुमानों हैं कोंफोकल एक P88 के राज्याभिषेक स्लाइस में लिया ढेर (ए, बी) और एक P80 (सी, डी (ओवर लगभग फैले 50 माइक्रोन।) MNTB की औसत दर्जे का भाग में) GlyT2-GFP माउस। (ए) एक choleratoxin सबयूनिट-बी के एक सिंहावलोकन (ब्यूरो) इंजेक्शन। (बी) VNTB में Glycinergic कोशिकाओं सीटी से भर रहे हैंचित्रा 5 ए में दिखाया इंजेक्शन का एक परिणाम के रूप में बी (सेल somata अंदर लाल puncta)। Puncta के कुछ (उदाहरण के लिए, क्योंकि इंजेक्शन के क्षेत्र में पारित होने के घायल फाइबर के) के रूप में अच्छी तरह से भरा जा रहा है VNTB में अन्य GFP नकारात्मक (गैर glycinergic) सेल प्रकार का संकेत हो सकता है, जो कोशिकाओं के बाहर दिखाई । (सी) MNTB को लक्षित एक प्रतिगामी TRITC इंजेक्शन की एक और सिंहावलोकन। ध्यान दें, कोशिकाओं की संख्या (चित्रा 5 ए में विशुद्ध रूप से दबाव इंजेक्शन ब्यूरो के खिलाफ) इलेक्ट्रोपोरेशन निम्नलिखित MNTB में TRITC से भर जाता है कैसे। (डी) MNTB में एक TRITC इंजेक्शन के बाद glycinergic VNTB कोशिकाओं के प्रतिगामी लेबलिंग (एक ही इंजेक्शन ) चित्रा 5C में दिखाया गया है। कोशिकाओं के अधिकांश क्योंकि दो फ्लोरोसेंट संकेतों (स्वदेशी GFP अभिव्यक्ति और लाल TRITC साथ भरने) के मिश्रण का एक घने पीले या नारंगी लेबलिंग प्रदर्शित करते हैं। एक GFP पॉजिटिव सेल के साथ तुलना करें कि किसी कारण के लिएडाई (नीले तीर) और गहरा लाल और संभवतः क्योंकि इंजेक्शन (लाल तीर) के क्षेत्र में एक axonal चोट की, भरा प्रदर्शित होने के एक दरियाफ्त लेबल GFP नकारात्मक सेल ऊपर से नहीं लिया। ब्यूरो (चित्रा 5 ब) और TRITC (चित्रा 5 डी) का उपयोग कर प्रतिगामी अनुरेखक इंजेक्शन में सेल somata के विभिन्न धुंधला पैटर्न पर ध्यान दें। स्केल सलाखों: आंकड़े 5 ए और 5C: 20 माइक्रोन: 200 माइक्रोन, 5 ब और 5 डी आंकड़े।

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Discussion

, इन विवो ट्रेसिंग के अध्ययन के लिए विरोध के रूप में इन विट्रो दरियाफ्त electroporation की एक सामान्य शक्ति, महंगा स्टीरियोटैक्टिक (और अक्सर electrophysiological) उपकरण शामिल नहीं है, यह शोधकर्ताओं इसलिए ब्याज और मस्तिष्क क्षेत्र के लिए बेहतर पहुँच देता है। Dextran amines और अन्य ट्रेसर के उपयोग पर एक विस्तृत समीक्षा (देखें इन विवो दरियाफ्त इंजेक्शन के मामले में के बजाय दिन या सप्ताह - इसके अलावा, मस्तिष्क explants के लिए आवश्यक अस्तित्व की अवधि केवल कुछ ही घंटे (4 1) तक फैला Lanciego और Wouterlood, 2011 में 22, लेकिन यह भी रोड्रिगेज-कॉंट्रेराज़, एट अल।, 2008 23), द्वारा विवो इंजेक्शन में इसलिए असफल इंजेक्शन के रूप में जल्दी इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान ही पता लगाया जा सकता है कि या तो अगले दिन पर, हाल ही में इंजेक्शन के मापदंडों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। मस्तिष्क explants के लिए कम अस्तित्व की अवधि भी <बीच एक छोटा सा अंतर आम तौर पर मतलब है कि वहाँउन्हें> प्रभावी (डाई अग्रगामी में न्यूरॉन्स या प्रतिगामी इंजेक्शन में axonal टर्मिनलों द्वारा लिया गया था, जहां क्षेत्र,) और इंजेक्शन के स्थल स्पष्ट (डाई लिया जा रहा बिना, गिरा जहां क्षेत्र), इस अंतर की संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता है, हालांकि पूरी तरह से और केवल पोस्ट-हॉक, कुछ मामलों में पूरी तरह से असंभव हो सकता है, जिसके लिए नियंत्रित / मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (देखें अल्ब्रेक्ट एट अल।, 2014 एक अधिक विस्तृत चर्चा के लिए 24 के लिए)।

यह लगभग किसी भी लंबाई के कनेक्शन के रूप में लंबे समय प्रयोगकर्ता इंजेक्ट क्षेत्र और मस्तिष्क के ऊतकों में से एक टुकड़ा में axonal अनुमानों के अपने लक्ष्य या स्रोत क्षेत्र दोनों की रक्षा करने में सक्षम है, के रूप में इस विधि के साथ अध्ययन किया जा सकता है कि, बताया जाना चाहिए। ऐसे कनेक्शनों के दृश्य स्पष्ट ऊतक को क्रियान्वित करने के बाद (यहाँ वर्णित है) करने की क्रिया और मस्तिष्क बढ़ते के बाद अधिग्रहीत कोंफोकल छवि के ढेर या पूरे मस्तिष्क / मस्तिष्क स्लैब इमेजिंग तकनीक के दोनों पुनर्निर्माण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकताआईएनजी प्रोटोकॉल (एक उदाहरण के लिए इस प्रोटोकॉल में धारा 5 देखें)।

लेजर निर्देशित विट्रो electroporation में की हमारी तकनीक का प्रमुख लाभ दरियाफ्त इंजेक्शन के दौरान सटीकता को निशाना बनाने में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है। इन विट्रो electroporation की मूल विधि निश्चित स्थलाकृतिक मार्कर को निशाना बनाने या इंजेक्शन के क्षेत्र के लिए उन के रूप में अनुमानित गाइड का उपयोग करके सिर्फ दृश्य नियंत्रण पर निर्भर करता है। एक ही लक्ष्य क्षेत्र में डाई प्रसार के लिए सच है: एक फैल रहा डाई निरीक्षण कर सकते हैं, लेकिन यह एक महीन रास्ते में डाई प्रसार को नियंत्रित करने के लिए आसान नहीं है। इस विधि का लेजर संशोधन के साथ, एक शोधकर्ता आसानी नाभिक और ब्याज की कोशिकाओं को मिल सकता है और स्वदेशी आनुवंशिक रूप से संचालित प्रतिदीप्ति की बातचीत और डाई की प्रतिदीप्ति के माध्यम से ब्याज के नाभिक / सेल की आबादी में डाई प्रसार निरीक्षण करते हैं। इस प्रकार, antero- या प्रतिगामी में झूठी सकारात्मक कम करके उसकी / उसके ट्रेसिंग प्रयोग पर एक शोधकर्ता लाभ अधिक नियंत्रणभराई, ब्याज के नाभिक / क्षेत्र के बाहर कोशिकाओं / axonal टर्मिनल के रूप में अच्छी तरह से इंजेक्शन के दौरान भरे गए थे। जाहिर है, यह पहले उल्लेख किया है, के रूप में स्पष्ट साइट से अलग कर सकते हैं जो इंजेक्शन के प्रभावी साइट है, पर एक पूर्ण नियंत्रण मतलब नहीं है। इस तकनीक का एक चेतावनी है कि स्पष्ट रूप से आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों की उपलब्धता है। चूहे भी श्रवण क्षेत्र के लिए जो सच है के स्तनधारी अध्ययन, में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया आनुवंशिक मॉडल जीव हैं, लेकिन वे और अधिक ठीक मानव श्रवणलेख जैसे लगते हैं, क्योंकि कुछ स्तनधारी मॉडल, बेहतर माना जा सकता है। इस प्रकार, अन्य तकनीकों के अनुसंधान के क्षेत्र के एक खास प्रकार के लिए बेहतर अनुकूल अन्य प्रजातियों के wildtype पशुओं में neuronal आबादी (श्रवण प्रणाली 25-28 की पढ़ाई में जैसे gerbils या चिन्चिला) लेबल करने के लिए नियोजित किया जा सकता है: इस का लाभ लेने वायरल इंजेक्शन शामिल हो सकते हैं मस्तिष्क और व्यक्त fluoresc के केवल कुछ डिब्बों को निशाना निश्चित प्रमोटरोंमस्तिष्क की कोशिकाओं का केवल एक सबसेट में ईएनटी मार्करों। स्वाभाविक रूप से, अतिरिक्त देखभाल ऐसे निर्माणों तोड़े में माउस लाइनों में स्वदेश में wildtype पशुओं में virally व्यक्त कर रहे हैं या कोई फर्क नहीं पड़ता न्यूरॉन्स की सही उप-जनसंख्या में व्यक्त आनुवंशिक निर्माणों की वैधता सुनिश्चित करने के लिए उठाए जाने की जरूरत है।

पहले ने कहा, न्यूरॉन्स के कुछ उप-जनसंख्या में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त माउस म्यूटेंट का लाभ भी (हमारे मामले में हम से शुद्ध दृश्य द्वारा एक और 24 के लिए एक श्रवण brainstem नाभिक से निरोधात्मक अनुमानों को चिह्नित करने में सक्षम थे, मस्तिष्क circuitry के कार्यात्मक विशेषताओं के लिए अनुमति देता है हमारे ट्रेसिंग प्रयोगों के परिणामों)। ट्रेसिंग प्रयोगों के परिणामों के किसी भी व्याख्या जगह नहीं ले सकता से पहले फिर से व्यक्त आनुवंशिक निर्माणों की वैधता की पुष्टि करने की जरूरत है।

इन विट्रो electroporation की एक और सामान्य ताकत अन्य संगठनों के साथ अपनी संगतता हैइस तरह के (इम्युनो) ऊतकरसायनशास्त्र और मस्तिष्क समाशोधन के रूप में एर संरचनात्मक तरीकों,। पहले 24 प्रदर्शन के रूप में, यह एक ऐसी Nissl के रूप में अतिरिक्त धुंधला तकनीक के आवेदन, या ClearT2 12 20,24 नामक एक मस्तिष्क समाशोधन विधि से प्रभावित नहीं है। एक को ध्यान में रखना है कि बड़ी खामी एक अतिरिक्त (इम्युनो) के सिग्नल की शक्ति histochemical बनाम मोटा स्लाइस में axonal प्रक्रिया संरक्षण के विकल्पों को तौलना है तो Nissl और एंटीबॉडी के दाग के प्रवेश गहराई, बढ़ती ऊतक मोटाई के साथ कम हो जाएगा कि है दोनों संरचनात्मक लेबलिंग तरीकों की जरूरत है, जहां प्रयोगों में धुंधला हो जाना। लेबल की न्यूनतम संख्या के इस बिंदु (स्वदेशी फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति, ट्रेसर और Nissl / एंटीबॉडी लेबलिंग) पर तीन मार्कर में शुरू होता है के बाद से बेशक, विचार करने के लिए एक और पहलू अलग फ्लोरोसेंट लेबल की उत्तेजना / उत्सर्जन बैंडविड्थ जुदाई है।

जाहिर है, हमारे वर्णित विधि के लिए विस्तारित किया जा सकता हैमस्तिष्क explants या ट्रांसजेनिक चूहों की भी मस्तिष्क स्लाइस में (क्वांटम मोती सहित) फ्लोरोसेंट मार्करों के किसी भी प्रकार के इंजेक्शन। इंजेक्शन शुद्धता दोनों पर निर्भर करता है, एक स्पष्ट लक्ष्य का पता लगाने (fluorescently लेबल नाभिक और कोशिकाओं का अवलोकन) और फ्लोरोसेंट डाई की फैल पर एक बेहतर नियंत्रण, उन दो कारकों में से केवल एक में वृद्धि हुई, इंजेक्शन सटीकता के लिए पर्याप्त होना चाहिए, तब भी जब अन्य अनुपस्थित है। यह (वायरल निर्माणों या अन्य डीएनए / आरएनए वैक्टर) की तरह अलग अलग गैर फ्लोरोसेंट मार्कर के रूप में लंबे समय तक लक्ष्य नाभिक स्पष्ट रूप से प्रयोगकर्ता को दिखाई दे रहे हैं, के रूप में ब्याज की मस्तिष्क नाभिक में अधिक से अधिक परिशुद्धता के साथ इंजेक्शन जा सकता है कि इसका मतलब है। इलेक्ट्रोपोरेशन इंजेक्शन के इस प्रकार के लिए हमारे विधि लगभग आदर्श बना रही है, साथ ही 29-30, डीएनए सामग्री की प्रभावी तेज के लिए अनुमति नहीं है क्योंकि यह बाद आवेदन, विशेष रूप से दिलचस्प है। विचार करने की जरूरत है कि केवल दोष डीएनए निर्माणों और जीने तिवारी की समस्या को व्यक्त करने के लिए समय ले रहा हैssue संरक्षण उठता है। इस organotypic मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों की स्थापना के द्वारा दूर किया जा सकता 31-32 हफ्तों के आदेश पर जीवित ऊतक संरक्षण के लिए अनुमति देते हैं जो इंजेक्शन के मस्तिष्क के स्लाइस (या फिर से कटा हुआ मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक), पर आधारित है।

और निश्चित रूप से अन्य ट्रांसजेनिक माउस म्यूटेंट कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स की तरह अन्य neuronal प्रकार की कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे चैट-GFP चूहों 33 में), इस विधि कनेक्टिविटी और मस्तिष्क (माइक्रो) सर्किट की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण बना रही है।

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एनआईएच द्वारा समर्थित / NIDCD R01 डीसी 011582. इमेजिंग प्रयोगों कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैम्पस उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी कोर विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया गया एनआईएच / NCRR कोलोराडो CTSI अनुदान संख्या UL1 RR025780 और रॉकी पर्वत Neurlogical विकार कोर केंद्र अनुदान एनआईएच P30NS048154 द्वारा समर्थित। सॉल्क संस्थान से डॉ साशा डू लैक GlyT2 GFP के चूहों के साथ हमें प्रदान की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride  P9333
Potassium phosphate monobasic P5655
Sodium phosphate di-basic S907
Magnesium chloride M2670
Calcium chloride C5080
Glucose G7528
Sodium bicarbonate S6297
Ascorbic acid A4544
Myo-inositol I5125
Sodium pyruvate P2256
Bovine serum albumine A2153 optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100 X100 optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MW P2139 optional, for brain clearing
Formamide Fisher Scientific F84 optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-b Molecular Probes C-34776 (Alexa 555) 
Dextrane tetramethyl-rhodamine Molecular Probes D-7162 (Alexa 555)
Fluorescent Nissl Invitrogen N-21479 (blue) optional
Paraformaldehyde Fisher Scientific SF93
Agarose Invitrogen 16520
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Pentobarbi-tal Vortech Pharmaceuticals Fatal-Plus 
Borosilicate glass filaments Harvard Apparatus G150F-10
Pipette puller Zeitz Instruments, Germany DMZ Universal Puller
Perfusion setup Custom-made
Laser pointer  laserpointerpro.com, Hong Kong HK-88007294 (405 nm)
Filter/safety goggles Dragon Lasers, China LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope  Wild Heerbrugg, Switzerland Wild M3 Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) 
Picospritzer Parker Instruments Picospritzer III
PC with installed MC Stimulus software Multi Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulator Multi Channel Sys-tems, Germany STG-1002
Stimulation isolation unit A.M.P.I., Israel Iso-Flex
Micromanipulator Narishige, Japan YOU-1
Vibratome Leica, Germany VT1000S

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References

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