Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Laserstyrte Neuronal Tracing i Brain eksplantater

Published: November 25, 2015 doi: 10.3791/53333

Summary

Vi beskriver en teknikk for å merke nevroner og deres prosesser via anterograd eller retrograd tracer injeksjoner i hjernekjerner benytter en in vitro forberedelse. Vi endret en eksisterende metode for jeg n vitro tracer elektroporering ved å utnytte fluorescensmerket mus mutanter og grunnleggende optisk utstyr for å øke merking nøyaktighet.

Abstract

Vi presenterer en teknikk som kombinerer en in vitro tracer injeksjon protokollen, som bruker en rekke elektriske og trykkpulsene å øke fargestoff opptak gjennom elektroporering i hjernen eksplantater med målrettede laser belysning og matchende filterbriller under inngrepet. Den beskrevne teknikk for in vitro electroporation av seg selv gir relativt god visuell kontroll for målretting av visse områder av hjernen. Ved å kombinere det med laser eksitasjon av fluorescerende genetiske markører og deres lese ut gjennom bånd passerer filterbriller, som kan plukke opp utslippene av de genetisk merkede celler / kjerner og fluorescerende sporing fargestoff, kan en forsker øke nøyaktigheten av injeksjoner ved å finne området av interesse og kontrollerende for dye-spredning / opptak i injeksjon området mye mer effektivt. I tillegg gjør laserbelysning teknikk for å undersøke funksjonaliteten til en gitt neurocircuit av providing informasjon om typen av nerveceller som rager til et bestemt område i de tilfeller hvor GFP uttrykk er knyttet til sendertype uttrykt ved en subpopulasjon av neuroner.

Introduction

For å definere en viss neuronal (mikro) krets, må man begynne med å finne de forskjellige deltagerne i nevnte krets, og deres forbindelse mønster. Helt siden Waller publikasjon om neurofiber sporing gjennom lesioning en et stort utvalg av nevroanatomi følgeteknikk er etablert. Noen av disse teknikkene kan anvendes i fast vev post mortem 2-4, andre er avhengige av den aktive transport av fargestoffet i levende neuroner, som ble oppdaget i 1971 5-6. Det sistnevnte kan videre deles i to grupper diskriminere mellom fremgangsmåter som benytter seg av aktiv retrograd (fra det injiserte område til kilden for et gitt fremspring, dvs. Den somata av nevroner som projiserer til nevnte område) og aktiv antero (fra det injiserte område til målet på en gitt projeksjon, altså. de aksonale projeksjoner og aksonale terminalene på merket nevroner) transport. Også, i noen tilfeller tracer materiale injiseres i levende dyr som deretter overlever injeksjonen av flere dager eller uker (in vivo spor injeksjoner), mens i andre tilfeller eksplanterte hjerner er injisert, og inkuberes i flere timer etter injeksjonen i kunstig cerebrospinalvæske (in vitro tracer injeksjoner) .

I denne protokollen endret vi en eksisterende in vitro electroporation teknikken 7-8 å merke nevronale somata og prosesser i anterograd og retrograd Tracing eksperimenter med choleratoxin subenhet-b og tetramethylrhodamine dekstran som tracing stoffer. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi nevrologer med et effektivt verktøy for å spore nevronale tilkoblingsmønsteret mellom ulike hjernekjerner, og samtidig utnytte tilgjengelige transgene mus linjer og grunnleggende optisk utstyr for å øke målretting nøyaktighet under tracer injeksjoner. Selv om metoden for antero og retrograd sporing ved hjelpcholeratoxin og dekstran amin og deres respektive fluorescerende merkede konjugater er ikke ny 9-13 (som er den metode for elektroporering, f.eks. Haas et al. 14), kombinasjonen av tracer injeksjoner med elektroporering i en in vitro-preparatet omfatter blokker av hjernevev er en nyere utvikling 7. Dens viktigste fordel i forhold til neuronal følgeteknikk ved bruk av samme type tracer fargestoffer i levende dyr er den økte merking intensitet, på grunn av den høyere effektivitet med hvilken elektroporert fargestoffet blir tatt opp av nerveceller. En ytterligere fordel er den forkortede inkubasjonsperioden (nødvendig for fargestoffet transport) og dens target øket nøyaktighet i løpet av sporstoffinjeksjons, fordi experimenter har visuell kontroll over målområdet av injeksjonen. Det sistnevnte betyr også at ingen dyre stereoutstyr er nødvendig for å finne kjernen eller hjerneområde av interesse.

Til Addinalt øke målretting nøyaktighet, vi tok fordel av en transgen mus linje, som uttrykker GFP i sin glycinergic undergruppe av nevroner 15 og grunnleggende optisk utstyr som består av en håndholdt laserpeker over 405 nm bølgelengde og matchende band-pass filtrering briller (450 - 700 nm). Således oppnådde vi en betydelig ytterligere økning av målretting nøyaktighet ved å identifisere injeksjonsstedet gjennom sin fluorescerende signal, og ved å tilveiebringe en bedre måte å kontrollere for fargestoffet spredning innenfor injeksjonsstedet gjennom observasjon av interaksjonen mellom egne GFP signalet og tracer fluorescens. Vår teknikk gjør det også mulig å avdekke funksjonaliteten til en krets sammen med sin tilkobling ved å identifisere GFP-positive hemmende nerveceller (eller eksitatoriske i andre mus linjer) som ble fylt med tracer.

I sammendraget, vi ytterligere forsterket et kraftig nevrovitenskapelig verktøy for å studere connectome av virveldyr hjernen og vurdere tHan ulike nevroanatomi funksjoner i en gitt neurocircuit. Ved å bruke transgene mus sammen med billig og allment tilgjengelig optisk utstyr var vi i stand til å betydelig øke målretting nøyaktigheten av våre injeksjoner. Videre transgene mus tillatt oss å identifisere hvilken type de spores tilkoblinger, som bidro til å avdekke funksjonaliteten til en hemmende mikrokrets i den auditive hjernestammen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optisk Genotyping

1. Optisk Genotyping av Muse Pups

  1. Se etter ekspresjon av det respektive fluoriserende fargestoff ved hjelp av en laserpeker av det passende eksitasjonsbølgelengde (405 nm i eksperimentene som er beskrevet her), og tilsvarende filterbriller blokkerer eksitasjonsbølgelengden men passerer emisjonsbølgelengden (450 - 700 nm i eksperimentene som er beskrevet her) . Pek laserpeker på baksiden av hodet eller ryggmargen av musen pup (se figur 1). Unngå skinner laseren inn i øynene og langvarig eksponering av huden til laserlys.

2. Optisk Genotyping av eldre dyr

  1. Dypt bedøve mus (alderen P14 til p138 i eksperimentene beskrevet her) med en overdose av pentobarbital gjennom en intraperitoneal injeksjon (120 mg / kg kroppsvekt). Bekreft skikkelig anestesi ved å sjekke dyrets reflekser (kort klype tuppen av the øret eller ett av bakbena for å fremkalle tilbaketrekningen refleks av øret eller ben).
  2. Merk: Til tross for anvendelse av en overdose av pentobarbital (120 mg / kg kroppsvekt) vises det til injeksjonsprosedyren som "dyp anestesi" i stedet for eutanasi, fordi dyret er ideelt fortsatt i live (dvs. dens hjerte fremdeles slo), når kirurgi og perfusjon begynne. Dette sikrer en mer effektiv perfusjon av de indre organer, inkludert hjernen.
  3. Når dyret ikke viser noen reflekser, forsiktig fjerne huden overliggende skallen (Figur 2A) ved å lage et snitt i huden som dekker baksiden av hodet og kutte til midsection av skallen. Utsett avdekket skallen til laserlys og observere fluorescens gjennom filterbriller som beskrevet ovenfor. Hvis en positiv GFP signal er observert, går du til trinn 2, hvis ikke, ofre dyr gjennom halshogging (andre / sikre form for aktiv dødshjelp følge vårIACUC forskriften).

Merk: I enda eldre mus (> 1 måned) fluorescens kan observeres gjennom øynene til dyret.

2. Transcardial Perfusjons og Brain Forberedelse

  1. Perfuse tran med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS; NaCl: 137 mM, KCl 2,7 mM, KH 2PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mM) under anvendelse av en 30 G sprøytenål ​​i stor grad å fjerne blod fra Dyret.
    1. Først nøye åpner brystkassen med skarp saks og skyv nålen inn i venstre hjertekammer av hjertet. Starte pumpingen PBS inn i hjertet og i aorta, og umiddelbart etter dette trinnet åpne høyre atrium av hjertet med saks for å tillate blod å gå ut av kroppen. Merk: Perfusjon tar 5 - 10 minutter, avhengig av størrelsen på dyret.
  2. Etter blodtapping gjennom perfusjon, halshogge dyret, sikre hodet sitt med pin needles (eller 30 G sprøytespisser) ved piercing dem gjennom øyehulene i en forberedelse fatet og fjerne hjernen fra skallen.
    1. Først bruker skarp saks for å kutte av huden overliggende skallen: lage et lite snitt i bakhodet, og deretter klippe langs midtlinjen på dorsal siden av hodet, kuttet til sidene bare caudally av øynene til dyret og til slutt kuttet i caudal retning for fullstendig å fjerne flikene i huden på baksiden av hodet.
    2. Deretter gjentar den samme klippemønster for skallen selv, sørg for å fjerne både cochleas i prosessen, fordi dette vil gi en betydelig forenkle fjerning av hjernestammen til slutt. Etter denne fremgangsmåten kaudal hjernehalvdel skal ligge fullstendig eksponert.
    3. I det neste trinn, med en skarp barberblad eller en skalpell til å skjære gjennom hele forhjernen i en vinkel på omtrent 45 ° og omtrent 2 mm rostralt fra cerebellum. Grav ut skilt foran halvparten av hjernen med abent slikkepott.
    4. Bruk slikkepott for å heve halehalvparten av hjernen på sitt rostralt enden og deretter skjære gjennom hjernenerver som fortsatt koblet til hjernestammen på sin ventral side. Som et sluttresultat, bør kaudal halvparten av hjernen, inkludert hjernestammen falle fritt av resten av den fremstilte dyrehode.
    5. Vend fjernet halehalvparten av hjernen til å eksponere sin ventral side og skjær langs den koronale flyet bare rostralt (for de anterograd injeksjoner) eller bare hale (for de retrograde injeksjoner) av ventralt plassert "pærer" som inneholder den trapes kroppen (se trinn 2,3).
      1. Bruk alltid et skarpt barberblad eller en skalpell for skjære prosedyre for å redusere celledød forårsaket av overdreven mekanisk stress på vevet. Som et sluttresultat, skulle ha blitt oppnådd en hjerne eksplantat som strekker seg over omtrent 1 cm i lengde og inneholdende den komplette overlegne olivary kompleks langs andre hjerneregioner.
    </ li>

Merk: Denne protokollen viser prosedyren for en tracer injeksjon i trapes kroppen ligger i det auditive hjernestammen. Tilpasse plassering og orientering av skjære fly og injeksjonssteder etter behov. Dersom fluorescerende hjerneregioner av interesse ligger nær nok til hjernens overflate, slik at de kan identifiseres og injiseres uten å kutte i hjernen (se figur 2B), og den koronale skjæretrinnet kan utelates.

  1. Identifiser trapes kroppen som to ventral fremtredende "pærer" som inneholder ventral kjernen av trapes kroppen (VNTB).

Merk: For ytterligere anatomisk henvisning om den omtrentlige stereo plasseringen av disse klippe flyene, se Franklin & Paxinos 2008. Panel 78 av atlaset, Bregma ~ -5,7 mm viser mediale kjernen av trapes kroppen (= MNTB) merket som "Tz ". Panel 69 viser ventral kjernen av trapes body (VNTB) merket som "MVPO" (medioventral periolivary nucleus) 19.

3. Antero / Retrograde Tracing

Merk: Utfør alle følgende prosedyrer ved RT (25 ° C).

  1. Etter kutting, plasserer hjernestammen eksplantatet i et preparat skål inneholdende oksygenert (95% O 2, 5% CO2) dissekere løsning (NaCl: 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glukose : 25 mM, NaH 2PO 4: 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, askorbinsyre: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, pyrodruesyre: 2 mM), sikre den med 30 G sprøytespisser. Sørg for at området av injeksjon er vendt oppover.
  2. Trekk injeksjon pipetter fra borsilikatglass og fylle dem med en av de tre følgende oppløsninger: a) en 1,0 mg / ml oppløsning av choleratoxin subenhet-b konjugert til en Alexa fluoroforen 555 i PBS 12 til 13 (som hovedsakelig brukes for retrograd transport), b ) en 1% -dilution i 0,9% saltvann av dekstran tetramethylrhodamine 555 (3000 MW, som hovedsakelig brukes for retrograd transport) eller c) en 1% -dilution i 0,9% saltvann på 10.000 MW dekstran-TRITC 555 (hovedsaklig brukt for antero transport).
    1. Sikre at injeksjon pipette motstander range 2,5 til 3,5 MOhm og at de er produsert i 3 - 4 trekke sykluser. For de eksperimenter som er beskrevet her, for å oppnå dette ved å velge en forhåndsprogrammert trekke algoritme på pipetten avtrekker.
  3. Belyse hjernen eksplantatet ved hjelp av en statisk montert laserpeker av passende bølgelengde (element nr 2 figur 3A; 405 nm bølgelengde i eksperimentene som er beskrevet her). Bruk laserpekeren som en guide for injeksjoner, og tar sikte på laserstrålen på fluoresceinmerket hjernen kjernen eller celler av interesse som vil bli injisert.
  4. Finne og observere opplyst målområdet gjennom en kikkert mikroskop mens iført de kompatible filterbriller (450 - 700 nm band-pass filter i forsøkene beskrevet her). Sett injeksjonen elektrode via mikromanipluatoren inn i området av interesse.
  5. Injiser sporstoff. Injeksjonene består av 2 - 10 trykkpulser ved 15 psi i 50 millisekunder hver, ved hjelp av en trykkinjeksjonsanordning, er rettet vinkelrett inn i området av interesse (ROI) i hjernen delen. Administreres i intervaller på 10 hver trykkpuls - 15 sekunder for å tillate fargestoffet å spre seg.
  6. I tilfelle av tetra (TRITC) injeksjoner, i tillegg stimulerer elektrisk for å forbedre fargestoffopptaket ved elektroporering med elektroden plassert i hjernen området av interesse (MNTB og VNTB i eksperimentene som er beskrevet her).
    1. Bruk 8 TTL pulser av 8 volt for 50 ms med 50 msek interpuls intervaller, drevet av en stimulator og forsterket til 55 V med en stimulering Isolat (eks nr 7 og 9 i Figur 3B). Bruk 10 - 20 repetisjoner av denne protokollen, adminisholds over flere minutter 7,8. Sørg for å jorde elektrode riktig - jordledningen skal kobles til badet løsning!
  7. Sjekk for suksessen til injeksjon. Siden et fluoriserende sporstoff med en lengre emisjonsbølgelengden er også sender ut et fluorescerende signal på laser eksitasjon med kortere bølgelengder, visuelt kontrollere for farveopptaks / spres i det injiserte målområdet mens belysning av området med laseren og observere gjennom filterbriller.

4. Inkubasjon

  1. Etter injeksjonen, inkuber brainstems i oksygenert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, NaCl: 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2 2 mM, glukose 25 mM, NaH 2PO 4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, askorbinsyre: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, pyrodruesyre: 2 mM, gjennomboblet med 95% O2 - 5% CO2) ved romtemperatur (RT, 25 ° C) i 1 - 4 timer, mensfargestoffet blir transportert. Boble oppløsningen under hele inkubasjonsperioden.
  2. Deretter overfører brainstems i 4% paraformaldehyd (PFA) oppløst i PBS (ca. 100 ml;. PH 7 for PFA / PBS mix) og inkuber dem ved 4 ° C for å tillate etterfiksering over natten (O / N).

5. Tissue Kutting og Montering

  1. Neste dag, vaske hjernestammen tre ganger i PBS (5 min for hvert vasketrinn), dekke det i 4% agar og deretter kuttet i 50 - 80 mikrometer tykke skiver på en vibratome. Mount skiver ved hjelp av en monteringsmedium på en glassplate, og dekk.
  2. Eventuelt merke seksjoner med fluorescerende Nissl for 25 min (for eksempel blå Nissl på en 1: 100 fortynning i AB media).
    1. For å fremstille AB media, bland 250 ml 0,2 M fosfatbuffer (PB; 51 mM KH 2PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml DDH 2 O og 5 g bovint serum-albumin.
    2. Precede og lykkes Nissl merking steg 3 vasketrinn i PBS (10 min hver).

Bemerk: I de tilfeller hvor tykkere seksjoner må monteres og analyseres (i eksperimentene som beskrives her slike stykker var 100 - 500 mikron tykke for å bevare aksonal tilkoblinger over større avstander), kan teknikken kombineres med vev clearing. Vi fant ClearT2 12 for å være vellykket 20. Når en vev clearing trinn er inkludert, utføre det før montering seksjonene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 og 2 viser hvordan laserpeker og laserbriller kan brukes til å raskt og rimelig genotype GFP positive dyr fra et kull. I tilfelle av unge mus unger, kan den teknikk som brukes til å identifisere ikke-invasivt GFP etikett i dyrets hjerne gjennom skallen og overliggende hud (figur 1 A - D). Emittert fluorescens kan ses gjennom huden og skallen museunger i det minste opp til postnatal dag 3 (figur 1C). Fremgangsmåten er vist i figur 1 for vår grønt fluorescerende protein (GFP) merket muselinje som uttrykker GFP i sin glycinergic subpopulasjon av nevroner (GlyT2-GFP). I eldre dyr med tykkere hodeskaller og pigmentert hud, viser GFP etiketten mindre godt gjennom hud og bein, og derfor huden på hodet og / eller hals må fjernes før den optiske genotyping (Figur 2A).

Etter perfusert dendyr hjernen tas ut og tennes igjen for å finne de fluorescensmerkede kjerner av interesse. De lyse strukturer som lyser opp i nærheten av ventral overflaten av hjernestammen i figur 2B er de to ventrale kjerner i trapes kroppen, som vi brukte som både en guide og et mål for våre tracer injeksjoner. Figurene 4 og 5 viser representative resultater av en antero injeksjon i ventral kjernen av trapesens legemet (VNTB) ved hjelp tetramethylrhodamine dekstran (TRITC;. figur 4), og to retrograd injeksjoner i den mediale kjernen av trapesens legemet (MNTB) ved hjelp choleratoxin subenhet-b (CTB, figurene 5A og B) og TRITC (Tall 5C og D). Bright axonal merking indikerer (i dette tilfellet hemmende) anslag fra VNTB til MNTB kan sees etter en antero injeksjon i VNTB (figur 4). Figur 5A og 5C viser en oversikt over områdetinjeksjons (MNTB) med kjernen inneholder retrograd merkede celler (VNTB) ved siden av den. Figurene 5B og 5D viser forstørret bilder av retrograd merket somata av glycinergic VNTB celler i de samme seksjonene som vist i figur 5A og 5C. Legg merke til hvordan den retrograde tracing med CTB resulterer i en mer punktformet mønster 12-13 (figur 5B), mens VNTB celler retrograd merket med TRITC vise en meget tett Golgi-lignende merking 21 (figur 5D).

Figur 1
Fig. 1: Optisk genotyping av GlyT2-GFP-positive og GlyT2-GFP-negative mus GFP-positive mus ble fotografert under (A) normale lysforhold, (B) ved laser belysning med en 405 nm laser pekeren uten drivhus filtrering briller og (C)upon laser belysning med laser og UV vernebriller. En sterk GFP signal er synlig i området over lillehjernen og hjernestammen. (D) Som kontrast, trenger GlyT2-GFP-negative valper fra samme mus linje og alder (p2) ikke viser noen tegn til fluorescens i de samme områdene ( baksiden av hodet og ryggmarg). Den blå laserlys effektivt filtrert av brillene.

Figur 2
Figur 2: Optisk Genotyping og en Forberedt Brain Eksplantering. (A) En p4 GlyT2-GFP mus valp skallen er utsatt for laserbelysning og sett gjennom band-pass filtrering briller. Den fluorescerende GFP kan observeres gjennom skallen. (B) En hjerne eksplantering fra samme valpen i en forberedelse fatet på laser belysning, sett gjennom filtrering briller. Glycinergic aksoner og hjernen kjerner, slik som den ventrale kjernen av trapesens legemet (VNTB) kan ses på som very lyse strukturer nær hjernens overflate.

Figur 3
Figur 3: Oversikt Over en In Vitro Trykk Injection og Electroporation Setup. (A) 1: stereoskop, 2: montert laserpeker (405 nm bølgelengde), 3: heads med injeksjon pipette montert på en micromanipulator, 4: forberedelse fatet inneholder hjernen explant, 5: en PC med installert MC Stimulus programvare, 6: trykkinjeksjonsanordning, som er koblet til injeksjons pipetten via rør (B). 7: stimulus isoleringsenhet, 8: høyintensiv illuminator, 9: stimulator. Stimulatoren er forbundet med elektroden i pipetten via stimulering isolatet og drives av PC-en.

Figur 4
Figur 4: Antero Sporing av Inhibitoriske Tilkoblinger fra VNTB til Medial Nucleus av Trapezoid Body (MNTB). Vist er maksimalt projeksjon av en confocal stabel tatt i en horisontal skive som spenner over ca 200 mikrometer i dybden i en ryddet hjernen til en P14 GlyT2-GFP mus. Etter en tetramethylrhodamine dekstran (TRITC) injeksjon i caudo-medial del av VNTB, lyst merket aksonale forbindelser (og i noen tilfeller sine terminale avslutninger) fra VNTB til MNTB kan observeres. Skala: 200 mikrometer.

Figur 5
Figur 5:. Retrograde Tracer Injeksjoner i MNTB Reveal Fylt Glycinergic Celler i VNTB vises er maksimal projeksjoner av konfokale stabler tatt i koronale skiver av en P88 (A, B) og en p80 (C, D (spenner over ca 50 mikrometer.) ) GlyT2 GFP-mus. (A) En oversikt over et choleratoxin subenhet-b (CTB) injeksjon inn i den midtre delen av MNTB. (B) Glycinergic celler i VNTB er fylt med CTB (red puncta inne i cellen somata) som et resultat av injeksjonen er vist i figur 5A. Noen av puncta vises på utsiden av cellene, som kan være en indikasjon på andre GFP-negative (ikke-glycinergic) celletyper i VNTB blir fylt, så vel (på grunn av skadede fibre av passasjen i området for injeksjon, for eksempel) . (C) En annen oversikt over en retrograd TRITC injeksjon rettet mot MNTB. Note, hvor et antall celler er fylt med TRITC i MNTB Etter elektroporering (i motsetning til den rent trykkinnsprøytning CTB figur 5A). (D) Retrograd merking av glycinergic VNTB celler etter en TRITC injeksjon i MNTB (samme injeksjons som vist i figur 5C). De fleste av cellene viser en tett gul eller orange merking, på grunn av blanding av to fluorescerende signaler (innfødte GFP uttrykk og fylling med det røde TRITC). Sammenligne med en GFP-positive celle som en eller annen grunnikke ta opp fargestoff (blå pil) og et sporstoff-merket GFP-negative celle vises dypt rødt og eventuelt fylt, på grunn av en aksonal skade i området for injeksjon (rød pil). Legg merke til de forskjellige fargemønster av celle somata i retrograd tracer injeksjoner bruker CTB (Figur 5B) og TRITC (figur 5D). Skala barer: Figurene 5A og 5C: 200 mikrometer, figur 5B og 5D: 20 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En generell styrken in vitro tracer electroporation, i motsetning til in vivo-studier tracing, er at det gir forskere bedre adgang til hjernen område av interesse og derfor ikke innebærer dyrt stereotaktisk (og ofte elektro) utstyr. I tillegg overlevelsesperioden som er nødvendig for hjerne eksplantater spenner over bare noen få timer (1 - 4) i stedet for dager eller uker i tilfelle av in vivo tracer injeksjoner (en detaljert redegjørelse for anvendelse av dekstran aminer og andre sporstoffer i in vivo injeksjoner av Lanciego og Wouterlood 2011 22, men også Rodriguez-Contreras, et al., 2008 23), slik at mislykkede injeksjoner kan oppdages så tidlig som i løpet av injeksjonsprosedyren eller senest på neste dag, så at injeksjonsparametre kan justeres tilsvarende. Den korte overlevelsesperioden for hjerne eksplantater betyr også at det vanligvis er en mindre forskjell mellom de <em> effektive (område, hvor fargestoffet ble tatt opp av nevroner i antero eller aksonal terminaler i retrograd injeksjoner), og den tilsynelatende (område hvor fargestoffet sølt, uten å bli tatt opp) injeksjonssted, selv om denne forskjellen kan aldri utelukkes helt og kun kan kvantifiseres / kontrolleres for post-hoc, som i noen tilfeller kan være helt umulig (se Albrecht et al., 2014 for en mer detaljert diskusjon 24).

Det skal påpekes, at forbindelser av praktisk talt hvilken som helst lengde kan studeres med denne metoden, så lenge experimenter er i stand til å opprettholde både den injiserte området og dens mål, eller kildeområdet av aksonale projeksjoner i ett enkelt stykke av hjernevev. Visualisering av slike tilkoblinger kan oppnås gjennom enten rekonstruksjon av konfokale bildestakker ervervet etter kutting og montering av hjernen (som beskrevet her) eller hel-hjerne / hjerne skive avbildningsteknikker etter gjennomføring av vev klaring protokoller (se kapittel 5 i denne protokollen for et eksempel).

Den store fordelen med vår teknikk av laserstyrte in vitro elektroporering er den betydelige økningen i målretting nøyaktighet under tracer injeksjoner. Den opprinnelige metoden for in vitro elektroporering avhengig bare visuell kontroll ved å målrette visse topografiske markører eller bruke dem som omtrentlige guider for området injeksjon. Det samme gjelder for farvestoff spredning i målområdet: man kan observere fargestoff sprer seg, men det er ikke lett å kontrollere spredningen fargestoff i en bedre måte. Med laser modifikasjon av denne metoden, kan en forsker får kjerner og celler av interesse og observere fargestoffet spredningen i kjernen / cellepopulasjon av interesse gjennom samspillet av de innfødte genetisk drevne fluorescens og fluorescens av fargestoffet. Dermed en forsker får mer kontroll over hans / hennes tracing eksperiment ved å minimere falske positiver i antero- eller retrogradfyllinger, fordi celler / aksonal terminaler utenfor kjernen / området av interesse ble fylt i løpet av injeksjonen, så vel. Selvfølgelig betyr ikke en absolutt kontroll over den effektive injeksjonsstedet, som, som nevnt tidligere, kan være forskjellig fra den tilsynelatende området. En påminnelse av denne teknikken er åpenbart tilgjengeligheten av genmodifiserte organismer. Mus er en mye brukt genetisk modellorganisme i pattedyr undersøkelser, noe som også gjelder for det auditive felt, men enkelte pattedyrmodeller kan anses bedre, fordi de ligner den humane audiogram mer presist. Dermed kan andre teknikker benyttes til å merke nevronale populasjoner i villtype dyr av andre arter som er bedre egnet for en bestemt type forskningsfelt (f.eks ørkenrotte eller chinchillaer i studier av hørselssystemet 25-28): Dette kan inkludere virus injeksjoner utnytter enkelte arrangører målretting bare enkelte avdelinger av hjernen og uttrykke fluorescerendeent markører i bare en undergruppe av hjerneceller. Naturligvis trenger ekstra omsorg for å bli tatt for å sikre gyldigheten av de uttrykte genkonstruksjoner i riktig undergruppe av nevroner, uansett om slike konstruksjoner er uttrykt viralt i villtype dyr eller indigenously i knock-in mus linjer.

Som nevnt tidligere, tillater også den fordel mus mutanter som uttrykker fluorescerende proteiner i visse subpopulasjoner av nerveceller for den funksjonelle karakterisering av hjernekrets (i vårt tilfelle var vi i stand til å karakterisere inhiberende anslag fra en hørbar hjernestammen kjernen til et annet 24 av ren visualisering av resultatene av våre tracing eksperimenter). Igjen må gyldigheten av de uttrykte genkonstruksjoner bekreftes før noen tolkning av resultatene av oppsporingen eksperimenter kan finne sted.

En annen generell styrke av in vitro elektroporering er kompatibilitet med otheh anatomiske metoder, for eksempel (immun) histokjemi og hjernen clearing. Som vist tidligere er 24, blir den ikke påvirket av bruk av ytterligere fargeteknikker slik som Nissl, eller en hjerne lysning metode som kalles ClearT2 12 20,24. Den store ulempen at man må huske på er at inntrengningsdybde Nissl og antistoff flekker vil avta med økende vevstykkelse så man må veie alternativene av aksonal prosessen bevaring i tykkere skiver versus signalstyrke på ekstra (immun) histokjemisk farging i eksperimenter hvor begge anatomiske merkingsmetoder er nødvendig. Selvfølgelig er en annen faktor å vurdere-eksitasjons- / emisjons båndbredde separasjon av de forskjellige fluorescerende markører, ettersom det minimale antall etiketter begynner ved tre markører på dette punktet (egne fluorescerende protein ekspresjon, tracer og Nissl / antistoff-merking).

Selvsagt kan vår beskrevne fremgangsmåten kan utvides til åinjeksjoner av enhver form for fluorescerende markører (inkludert quantum perler) i hjernen eksplantater eller hjerneskiver av transgene mus. Ettersom injeksjons nøyaktighet er avhengig av både en klar måldetektering (observasjon av fluorescerende merkede kjerner og celler), og en bedre kontroll over utslippet av det fluorescerende fargestoff, bare en av disse to faktorer skulle være tilstrekkelig for økt nøyaktighet injeksjon, selv når andre er fraværende. Dette betyr at forskjellige ikke-fluorescerende markører (slik som på virus-konstruksjoner eller andre DNA / RNA-vektorer) kan bli injisert med større presisjon i hjernen kjerner av interesse, så lenge målet Kjernene er klart synlig for experimenter. Denne sistnevnte anvendelse er spesielt interessant, fordi elektroporering ikke tillater for effektivt opptak av DNA-materiale, samt 29 til 30, slik at vår fremgangsmåte nesten ideell for denne type injeksjoner. Den eneste ulempen som må vurderes er at DNA-konstruksjoner tar tid til å uttrykke og problemet med levende tissue bevaring oppstår. Dette kan overvinnes ved å etablere organotypiske hjerne skive kulturer 31-32 basert på injiserte hjerneskiver (eller re-skiver hjernevev blokker), som gir mulighet for levende vev bevaring av størrelsesorden uker.

Og selvfølgelig andre transgene mus mutanter kan brukes til å undersøke tilkobling av andre neuronale typer som kolinerge neuroner (for eksempel i ChAT-GFP mus 33), noe som gjør denne fremgangsmåte en allsidig verktøy for å studere tilkobling og funksjonaliteten av hjerne (mikro) kretser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Støttet av NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging eksperimenter ble utført ved universitetet i Colorado Anschutz medisinske høyskole Avansert lysmikroskopi Kjerne støttes delvis av NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Antall UL1 RR025780 og Rocky Mountain Neurlogical Disorders Kjernesenter Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac fra Salk Institute gitt oss de GlyT2-GFP mus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride  P9333
Potassium phosphate monobasic P5655
Sodium phosphate di-basic S907
Magnesium chloride M2670
Calcium chloride C5080
Glucose G7528
Sodium bicarbonate S6297
Ascorbic acid A4544
Myo-inositol I5125
Sodium pyruvate P2256
Bovine serum albumine A2153 optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100 X100 optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MW P2139 optional, for brain clearing
Formamide Fisher Scientific F84 optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-b Molecular Probes C-34776 (Alexa 555) 
Dextrane tetramethyl-rhodamine Molecular Probes D-7162 (Alexa 555)
Fluorescent Nissl Invitrogen N-21479 (blue) optional
Paraformaldehyde Fisher Scientific SF93
Agarose Invitrogen 16520
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Pentobarbi-tal Vortech Pharmaceuticals Fatal-Plus 
Borosilicate glass filaments Harvard Apparatus G150F-10
Pipette puller Zeitz Instruments, Germany DMZ Universal Puller
Perfusion setup Custom-made
Laser pointer  laserpointerpro.com, Hong Kong HK-88007294 (405 nm)
Filter/safety goggles Dragon Lasers, China LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope  Wild Heerbrugg, Switzerland Wild M3 Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) 
Picospritzer Parker Instruments Picospritzer III
PC with installed MC Stimulus software Multi Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulator Multi Channel Sys-tems, Germany STG-1002
Stimulation isolation unit A.M.P.I., Israel Iso-Flex
Micromanipulator Narishige, Japan YOU-1
Vibratome Leica, Germany VT1000S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
  2. Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
  3. Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
  4. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
  5. Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
  6. Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
  7. Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
  8. Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
  9. Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
  10. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
  11. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
  12. Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
  13. Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
  14. Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
  15. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
  16. Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
  17. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  18. Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
  19. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  21. Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
  22. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  23. Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
  24. Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
  25. Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
  26. Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
  27. Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  28. Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
  29. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
  30. Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
  31. Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
  32. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  33. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).

Tags

Nevrovitenskap Farging og merking nevroanatomi Tract-Tracing Teknikker Electroporation genotyping Techniques nevroanatomi nevroanatomi neuronal tracing tetramethylrhodamine choleratoxin subenhet-b fluorescens in-vitro elektroporering optisk genotyping
Laserstyrte Neuronal Tracing i Brain eksplantater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albrecht, O., Klug, A. Laser-guidedMore

Albrecht, O., Klug, A. Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants. J. Vis. Exp. (105), e53333, doi:10.3791/53333 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter