Abstract
कीट घ्राण प्रणाली वातावरण में semiochemicals का पता लगाने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। विशेष रूप से, अंदर एक या कई न्यूरॉन्स के घर जो antennal sensilla, रासायनिक उत्तेजनाओं का जवाब देने में प्रमुख योगदान करने के लिए माना जाता है। सीधे उत्तेजनाओं से संपर्क के बाद घ्राण sensillum में संभावित कार्रवाई की रिकॉर्डिंग करके, एकल sensillum रिकॉर्डिंग (एसएसआर) तकनीक रासायनिक उत्तेजनाओं को कीड़े के तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है। एक कुख्यात मानव परजीवी है जो बिस्तर बग, के लिए, घ्राण sensillum के कई प्रकार के लक्षण वर्णन किया गया है। इस अध्ययन में, हम दो रासायनिक उत्तेजनाओं और एसएसआर पद्धति का उपयोग करके उनमें से एक को खुराक पर निर्भर प्रतिक्रियाओं को बिस्तर बग घ्राण sensilla की तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया। यह दृष्टिकोण गतिविधियों के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करेगा जो बिस्तर बग घ्राण sensilla पर अलग-अलग रासायनिक उत्तेजनाओं, के लिए प्रारंभिक जांच का संचालन करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओंनया बिस्तर बग attractants या भगाने और लाभ बिस्तर बग नियंत्रण के प्रयासों की opment।
Introduction
एक अस्थायी ectoparasite के रूप में, अपने अस्तित्व, विकास, और प्रजनन मनुष्यों और पशुओं 1,2 सहित दोनों मेजबानों से खून स्रोतों की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है एक बाध्य खून चूसने कीट है,: आम बिस्तर बग Cimex एल (Cimicidae Hemiptera) lectularius। वायरस संचरण शायद ही कभी सी के कारण सूचना दी गई है lectularius, एक infestation द्वारा उत्पन्न काटने उपद्रव गंभीरता से दोनों शारीरिक और मानसिक 3 मेजबान टीम को प्रभावित करता है। परिचय और रासायनिक कीटनाशकों के व्यापक उपयोग, विशेष रूप से डीडीटी, संक्रमण का खतरा कम है और 1950 के दशक के संक्रमण के अंत तक वे अब एक गंभीर सार्वजनिक चिंता का विषय थे कि इस तरह के एक निम्न स्तर पर थे। हालांकि, संभव कारकों की एक संख्या में इस तरह के कीटनाशकों के कम उपयोग के रूप में दुनिया भर में, बिस्तर बग आबादी में पुनरुत्थान के लिए नेतृत्व किया है, जनता में जागरूकता की गिरावट, गतिविधि यात्रा में वृद्धि हुई है, और कीटनाशकों 4-9 करने के लिए प्रतिरोध का विकास। </ P>
पर्यावरण में रासायनिक संकेतों का पता चला और इस तरह के एंटीना और दाढ़ की हड्डी का palps के रूप में घ्राण अंगों के माध्यम से कीड़ों द्वारा मान्यता प्राप्त हैं। कीट एंटीना पर घ्राण sensilla इन रासायनिक संकेतों का पता लगाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। रासायनिक अणुओं छल्ली सतह पर छिद्रों के माध्यम से antennal छल्ली दर्ज करें। Odorant इन रासायनिक अणुओं को antennal लसीका बाँध में प्रोटीन बंधन और odorant रिसेप्टर्स 10 पर उन्हें परिवहन। odorant रिसेप्टर्स और इन रासायनिक अणुओं एक बार depolarized किया जाएगा, जो तंत्रिका झिल्ली पर गैर चयनात्मक कटियन आयन चैनल से उनके सह रिसेप्टर odorant रिसेप्टर्स 11 से पहचाने जाते हैं।
एकल Sensillum रिकॉर्डिंग (एसएसआर) रासायनिक या गैर रासायनिक उत्तेजनाओं या तो आवेदन की वजह से संभावित कार्रवाई में बाह्य परिवर्तन का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। Sensillum लसीका और एक संदर्भ इलेक्ट्रोड में एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डालने सेकीट शरीर (आमतौर पर यौगिक आँखें या पेट या तो) के किसी अन्य हिस्से में, उत्तेजनाओं के जवाब में न्यूरॉन्स की फायरिंग दर 12 दर्ज किया जा सकता है। Spikes की संख्या में परिवर्तन विशिष्ट उत्तेजनाओं को कीट की संवेदनशीलता का प्रतिनिधित्व करते हैं। अलग पहचान और एकाग्रता की रासायनिक उत्तेजनाओं अलग फायरिंग दरों और अस्थायी ढांचे के साथ, अलग तंत्रिका प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना होगा, और इस तरह विशिष्ट रसायनों के लिए कीट की कोडिंग प्रक्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
नौ अंडाकार खूंटी सी sensilla, 29 बाल की तरह ई (E1 और E2) sensilla, और एक जोड़ी Dα, Dβ, Dγ चिकनी खूंटी के प्रत्येक: आम बिस्तर बग के लिए, दोनों यौन रूपों एंटीना पर घ्राण sensilla का एक ही पैटर्न का हिस्सा sensilla 13,14। कई न्यूरॉन्स sensillum के प्रत्येक प्रकार में पहचान की गई है, यह एक ही sensillum में रखे विभिन्न न्यूरॉन्स से कार्रवाई की क्षमता भेद करने के लिए आसान नहीं है इस प्रयोग तोता के लिए तोकार्रवाई की क्षमता के एल संख्या पहले और उत्तेजना के बाद एक 500 मिसे अवधि के लिए बंद लाइन गिना रहे थे। उत्तेजना के बाद कार्रवाई की क्षमता की संख्या तो उत्तेजना से पहले कार्रवाई की क्षमता की संख्या से घटाया और दूसरा 15 प्रति spikes में प्रत्येक व्यक्ति sensillum में फायरिंग दर में बदलाव यों करने के लिए दो से गुणा किया गया था।
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Protocol
उपकरण, उत्तेजनाओं समाधान, और बिस्तर कीड़े के 1. तैयारी
- एक 20 मिलीलीटर की बोतल में (v / डब्ल्यू) एक 50% KNO 2 समाधान तैयार है।
- बार-बार में और समाधान के बाहर टंगस्टन इलेक्ट्रोड सूई से 5 वी पर KNO 2 समाधान में दो टंगस्टन microelectrodes तेज करें।
- मोटे तौर पर टंगस्टन तार के सामने के छोर का उपभोग बहुत कर सकते हैं जिसके बारे में 5 मिनट के लिए 2 गिरावट / सेकंड की गति से में और KNO 2 समाधान के बाहर टंगस्टन तार के बारे में 10 मिमी सूई से टंगस्टन तार पैनापन।
- इलेक्ट्रोड का जुर्माना और तेज बिंदु बनाने के लिए इतनी के रूप में नाजुक कम से कम 1 मिनट के लिए 2 गिरावट / सेकंड की गति से में और समाधान के बाहर तार टिप के बारे में 1 मिमी सूई से इलेक्ट्रोड पैनापन। यह बिस्तर बग घ्राण sensillum की छल्ली पंचर करने के लिए पर्याप्त ठीक किया जाना चाहिए जो 0.2-0.5 माइक्रोन, जब तक अक्सर खुर्दबीन के नीचे इलेक्ट्रोड टिप व्यास की जाँच करें।
नोट: मैन्युअल तेज करते हुएइलेक्ट्रोड ening, kno 2 समाधान में टंगस्टन तार की सूई गति हर समय स्थिर नहीं है। अधिक अभ्यास के साथ, यह इलेक्ट्रोड sharpening में एक अपेक्षाकृत स्थिर गति रखने के लिए बहुत आसान है। sharpening के समय इलेक्ट्रोड होना चाहिए कि कैसे ठीक आधार पर भी अनिश्चित है। इधर, ~ 0.2 माइक्रोन व्यास के साथ एक इलेक्ट्रोड टिप घ्राण sensillum के माध्यम से पंचर करने के लिए पर्याप्त है।
- एक शेयर के समाधान के रूप में 1:10 वी / वी के एक प्रारंभिक एकाग्रता के लिए स्वच्छ परिसर से डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में रासायनिक उत्तेजनाओं से प्रत्येक पतला। प्रत्येक रासायनिक लिए शेयर समाधान में से प्रत्येक से, DMSO के साथ फिर से प्रयोग में आवश्यक कितने खुराक पर निर्भर करता है decadic dilutions की एक श्रृंखला बनाते हैं। Β पाइनीन और eucalyptol - यहाँ, 10% (+) का उपयोग।
- भूखा या सात दिन की जगह पद-खिला फीट से (पुरुष या महिला) वयस्क बिस्तर कीड़े। डिक्स कॉलोनी (केंटकी के विश्वविद्यालय में डॉ हेन्स से एक उपहार) टी में इस्तेमाल किया जाएगावह एक पेट्री डिश में प्रयोग।
नोट: पेट्री डिश में रखा बिस्तर कीड़े के लिए कोई सटीक संख्या है। यह कुछ या बहुत कुछ किया जा सकता है।
2. बिस्तर बग एंटीना तैयारी
- बर्फ (2-3 मिनट) पर बिस्तर कीड़े बेहोश करना।
- डबल पक्षीय टेप के साथ एक खुर्दबीन coverslip पर एंटीना और कीट शरीर दोनों को ठीक करने और ठीक कैंची के साथ पैर को हटा दें।
- तेजी से टेप पर उन्हें छड़ी के रूप में तो धीरे एंटीना को छूने के लिए एक छोटा सा पिन का प्रयोग करें।
- जोड़-तोड़ की सुविधा और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (चित्रा 1) के लिए एक उपयुक्त कोण (~ 90 डिग्री) के लिए इसे समायोजित करने के लिए दंत मोम की एक छोटी सी गेंद (~ 1 सेमी व्यास) के खिलाफ coverslip आराम करें।
- एक बार, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे बिस्तर बग जगह ठंड प्रकाश स्रोत पर बारी और एंटीना स्पष्ट रूप से प्रस्तुत किया जाता है, जब तक रोशनी की तीव्रता को समायोजित, और उच्च वृद्धि पर बिस्तर बग एंटीना के दूसरे कशाभिका पर खुर्दबीन ध्यान देते हैं, सुरक्षित (720X) ।
ध्यान दें: प्रयोग में इस्तेमाल रोशनी की तीव्रता वास्तव में प्रयोगकर्ता की आँखों की रोशनी की तीव्रता कैसे लग रहा है पर निर्भर करता है, जो quantitated नहीं है।
3. एकल Sensillum रिकॉर्डिंग
- संकेत रिकॉर्डिंग और दृश्य के लिए कंप्यूटर के साथ जुड़ा हुआ है जो संकेत अधिग्रहण नियंत्रक, साथ preamplifier (10X) कनेक्ट करें। कंप्यूटर पर मुड़ें और सॉफ्टवेयर, जैसे, AutoSpike32 शुरू करने और मेनू पट्टी से "रिकार्ड" मोड क्लिक करें। तब लहर संकेतों रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए इतनी के रूप में "लहर" चुनें।
नोट: बार-बार पर नजर रखने के लिए बाएं से दाएं चल रहे एक फ्लैट लाइन अब दिखाई जानी चाहिए। इधर, रिकॉर्डिंग खिड़की 40 सेकंड तक रहता है। मैक्स लहर रिकॉर्डिंग 10 सेकंड है। चयनित नमूना दर 96000 है और डिजिटल नमूना दर 0 ऑफसेट% और कोई छानने, रिकॉर्डिंग संकेतों के लिए कोई सुधार नहीं है 240. है। जरूरत के रूप में सॉफ्टवेयर में इन सभी पैरामीटर सेटिंग्स संशोधित किया जा सकता है। <ली> antennal sensillum से न्यूरोनल प्रतिक्रिया के लिए टोनिंग मोड पेश करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो preamplifier से जुड़ा स्पीकर चालू करें। - स्थिर बिस्तर बग के पेट में संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें।
नोट: संदर्भ इलेक्ट्रोड चुंबकीय हवा-मेज से जुड़ी खड़े एक धातु द्वारा आयोजित किया गया था। - संदर्भ इलेक्ट्रोड बिस्तर बग के पेट से जुड़ा होने के बाद, बिस्तर बग के एंटीना के पीछे के अंत की ओर, एक micromanipulator द्वारा preamplifier से जुड़ा है और चालाकी है जो रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, चलते हैं।
- रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एंटीना की सही टिप के साथ संपर्क में है, माइक्रोस्कोप पर स्विच और कम बढ़ाई इलेक्ट्रोड का पता लगाने।
- इलेक्ट्रोड और antennal sensillum दोनों एक ही विमान में हैं और माइक्रोस्कोप के तहत स्पष्ट रूप से दिखाई तक धीरे-धीरे बढ़ाई वृद्धि करते हुए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को समायोजित करें।
नोट: इस समय तक, माइक्रोस्कोप सामान्य हैउच्चतम बढ़ाई Ly। - Micromanipulator का उपयोग sensillum की शाफ्ट में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डालें और पृष्ठभूमि शोर संभावित कार्रवाई की तुलना में अधिक है, तो थोड़ा गहरा जाना।
- Β पाइनीन - एक बार स्पष्ट कार्रवाई क्षमता दर्ज की sensillum से मनाया जाता है, 10% (+) के साथ एक micropipette भरें। एक गिलास पाश्चर विंदुक के अंदर रखा एक फिल्टर पेपर स्ट्रिप (~ 3 एक्स 15 मिमी) पर β पाइनीन - 10% (+) के 10 μl विभाज्य जमा करने के लिए micropipette का प्रयोग करें।
- प्रोत्साहन नियंत्रक की नब्ज प्रवाह ट्यूब की दुकान करने के लिए लोड पिपेट कनेक्ट और एंटीना की ओर उन्मुख ट्यूब में छोटे से छेद में पिपेट की नोक जगह है।
- इन सभी कनेक्शनों को स्थिर कर दिया है, निरंतर humidified हवा धारा में प्रोत्साहन (/ मिनट 0.5 एल) के एक 0.5 सेकंड कश देने के लिए प्रोत्साहन नियंत्रक के footswitch दबाना। कार्रवाई क्षमता की रिकॉर्डिंग जब footswitc एक साथ शुरू किया जाएगाज उदास है। रिकॉर्डिंग प्रक्रिया उत्तेजना से पहले 1 सेकंड शुरू होने वाले 10 सेकंड के लिए पिछले जाएगा।
- दो 500 मिसे अवधि, पहले एक और उत्तेजना के बाद एक के लिए बंद लाइन कार्रवाई क्षमता की गणना करें। पूर्ववर्ती 500 मिसे के दौरान दर्ज की सहज गतिविधि से 500 मिसे के बाद उत्तेजना के दौरान कील दर में कोई बदलाव घटाना और 2 से उन्हें गुणा करके spikes के / एस के पारंपरिक पैमाने में गिना जाता है परिवर्तित।
एसएसआर में 4. प्रोत्साहन रिप्लेसमेंट
- बिस्तर बग एंटीना पर पिपेट में β पाइनीन और पिपेट निकाल दिया जाता है, जिसके बाद 10 सेकंड के लिए इसे विशिष्ट odorant के जवाब को रिकॉर्ड - footswitch शुरू हो गया है, 10% (+) देने के लिए।
- 0.001% eucalyptol के साथ एक और नया पिपेट लेबल परीक्षण किया जाना है। प्रोत्साहन के 10 μl नई पिपेट में लागू किया गया है, जो पर फिल्टर पेपर का एक छोटा सा टुकड़ा रखें।
- प्रोत्साहन पूरी तरह से Vapori है जब तक 2-5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करेंकांच पिपेट में जेड। नाड़ी प्रवाह ट्यूब की दुकान पर पिपेट संलग्न।
- एंटीना की ओर उन्मुख ट्यूब के छोटे से छेद में पिपेट टिप डालें। Footswitch दबाना और 10 सेकंड रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
- पिपेट डिस्कनेक्ट और 0.01% eucalyptol के साथ एक और पिपेट तैयार करते हैं।
- खुराक पर निर्भर प्रतिक्रियाओं का पालन करने के लिए antennal sensilla पर eucalyptol की खुराक (0.001% से 10% तक) के सभी बाकी का परीक्षण करें। सबसे अधिक से टेस्ट पतला कम से कम खुराक के लिए पतला।
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Representative Results
एकल Sensillum रिकॉर्डिंग कीट रासायनिक पारिस्थितिकी और तंत्रिका शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल एक शक्तिशाली खोजी तकनीक है। विभिन्न अस्थिर यौगिकों सोचा, विशेष रूप से उन लोगों के लिए कीड़े के तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की जांच के कीड़ों के अस्तित्व और विकास के लिए पारिस्थितिकी संबंधित होने के लिए, न केवल अमेरिका कीट महक प्रक्रिया में अमूल्य अंतर्दृष्टि देता है, लेकिन यह भी संभावित नेतृत्व कर सकता है कि होनहार नए रास्ते खोलता है कीट नियंत्रण के लिए उपयोगी नई अभिकर्मकों के विकास के लिए।
आम बिस्तर बग, एक कुख्यात शहरी कीट के रूप में, निश्चित रूप से कई शोधकर्ताओं का ध्यान आकर्षित किया है। बिस्तर कीड़े से संबंधित विभिन्न अध्ययन के क्षेत्रों के अलावा, उनकी महक तंत्र बिस्तर कीड़े की रासायनिक पारिस्थितिकी के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। पिछले अध्ययनों से स्पष्ट मात्रा और बिस्तर पर घ्राण sensillum के विभिन्न प्रकार के वितरण का वर्णन किया हैबग एंटीना। चित्रा 2A में दिखाया गया है, बिस्तर बग एंटीना चार खंडों (अनुसूचित जाति, पे, F1 और F2) के पास है। घ्राण sensilla के बहुमत 2 कशाभिका (F2) के पीछे के अंत पर प्रस्तुत किया है, लेकिन उनके वितरण प्रत्येक प्रकार के लिए अलग अलग है कर रहे हैं: डी sensilla, अर्थात् Dα, Dβ और Dγ, केवल के भीतर की ओर के किनारे स्थित हैं एंटीना (चित्रा -2), सी और ई (E1 और E2) sensilla एंटीना (चित्रा 2 बी) के दोनों किनारों पर पाया जाता है। इसलिए, हम डी sensilla के तंत्रिका प्रतिक्रिया रिकॉर्ड है कि यह सुनिश्चित करने के क्रम में, एंटीना से सावधान स्थिति आवश्यक है।
बिस्तर बग हिस्सेदारी के यौन दोनों रूपों के बाद से sensilla प्रकार के एक ही पैटर्न और उनके एंटीना के भीतर की ओर से इस क्षेत्र को लक्षित यह बहुत आसान एंटीना पर अलग से sensilla के सभी विभिन्न प्रकार के रासायनिक प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए बनाता है, sensilla के सभी प्रकार के होते हैंई (चित्रा 3)। एकल sensillum रिकॉर्डिंग में, विभिन्न घ्राण विशिष्ट विभिन्न संभावित कार्रवाई के प्रकार और आयाम (चित्रा 3 बी) के साथ तंत्रिका संकेतों दिखा रहे sensilla। उदाहरण के लिए, ई sensilla ई या सी sensilla किसी की तुलना में डी प्रकार sensilla घर अधिक न्यूरॉन्स, एक परिणाम के रूप में दूसरों की तुलना में अधिक जटिल कार्रवाई की क्षमता के उत्पादन, जबकि अंदर एक या दो न्यूरॉन्स है करने के लिए जाना जाता है। सी sensilla से तंत्रिका प्रतिक्रियाओं के आयाम अन्य sensillum प्रकार की तुलना में बहुत छोटे होते हैं।
इलेक्ट्रोड कनेक्शन की स्थापना की गई है, एक बार प्रत्येक प्रोत्साहन के लिए sensillum के प्रत्येक प्रकार से तंत्रिका प्रतिक्रियाओं उनकी पहचान और तीव्रता के आधार पर दर्ज किया जा सकता है। बिस्तर कीड़े अत्यंत संवेदनशील होते हैं, जो करने के लिए कुछ उत्तेजनाओं के लिए, तंत्रिका प्रतिक्रिया उत्तेजना की समाप्ति से परे बहुत मजबूत है और पिछले कई सेकंड हो सकता है। उदाहरण के लिए, 10% (+) के जवाब में - β पाइनीन, बिस्तर कीड़े से पता चलाएक विशाल फायरिंग दर (≥200 के spikes / सेकंड) और प्रोत्साहन (चित्रा -4 ए और बी) के रूप में अकेले विलायक के साथ नियंत्रण की तुलना में सुपर-निरंतर लौकिक गतिशीलता के साथ एक मजबूत प्रतिक्रिया। विभिन्न उत्तेजनाओं ही sensillum और एक ही प्रोत्साहन के विभिन्न सांद्रता से पूरी तरह से अलग तंत्रिका प्रतिक्रियाओं बटोर सकता है काफी अलग फायरिंग आवृत्तियों उत्पन्न होने की संभावना है। बढ़ रही है, चित्रा 5 में दिखाया गया है eucalyptol की एकाग्रता एक खुराक पर निर्भर ढंग से 10% से कम 240 के spikes / सेक करने के लिए 0.001% पर 30 के spikes / सेकंड से फायरिंग की आवृत्तियों उठाया।
चित्रा 1. बिस्तर कीड़े के लिए निर्धारण प्रक्रिया दिखा एक योजनाबद्ध आरेख। बिस्तर बग टेप पर तय एंटीना के साथ coverslip पर स्थिर है। इकट्ठे नमूना तो एक चुंबकीय मंच पर रखा गया है। नमूना सी के उन्मुखीकरण और ऊंचाईएक बिस्तर बग एंटीना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के बीच एक उचित कोण करने के लिए समायोजित किया जाना है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
बिस्तर बग एंटीना पर घ्राण sensilla चित्रा 2. वितरण। एक बिस्तर बग एंटीना की (ए) एक स्कैनिंग इलेक्ट्रोड माइक्रोस्कोप (SEM) छवि। एंटीना चार खंडों है, Sculpus (अनुसूचित जाति), Pedecel (पीई), पहली कशाभिका (एफ 1) और दूसरा कशाभिका (F2)। कुछ घ्राण sensilla भी बिस्तर बग 16 के लिए एकत्रीकरण फेरोमोन का पता लगाने के उनके कार्य करने के लिए संबंधित माना जाता है, जो एफ 1, पर पाया गया है, हालांकि घ्राण sensilla से अधिकांश, F2 पर स्थित हैं। सी और ई olfac जो घरों (बी) के एफ 2 के बाहरी पक्ष के एक SEM छवि,इतिहास sensilla। (सी) घ्राण sensilla के सभी विभिन्न प्रकार के घर में पाया गया था, जिसके लिए F2 के भीतर की ओर, एक SEM छवि: डी (Dα, Dβ, Dγ), सी और ई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा बिस्तर बग एंटीना पर घ्राण sensilla के विभिन्न प्रकार के 3. ठेठ तंत्रिका संकेतों। बिस्तर बग एंटीना पर घ्राण sensillum के प्रत्येक प्रकार के (ए) उच्च संकल्प SEM तस्वीरें। (बी) के एक प्रोत्साहन के लिए जोखिम से पहले विभिन्न घ्राण sensilla की विशिष्ट तंत्रिका संकेतों। कई घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के घर जो Dα, Dβ, Dγ और सी sensilla, (OSNs) E1 और E2 sensilla, जो सह से, प्रदर्शनी और अधिक जटिल कार्रवाई की क्षमताकेवल एक या दो OSNs ntain। सी sensilla से कार्रवाई की क्षमता के आयाम अन्य sensillum प्रकार में उन लोगों की तुलना में बहुत छोटे होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. प्रतिनिधि तंत्रिका प्रतिक्रिया है कि बिस्तर कीड़े के प्रति संवेदनशील हैं उत्तेजनाओं को। (ए) सिग्नल का पता लगाने के एकल sensillum रिकॉर्डिंग में नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है, जो विलायक, के लिए एक घ्राण sensillum (Dγ) के विशिष्ट तंत्रिका प्रतिक्रिया दिखा। संकेत निशान प्रोत्साहन के 0.5 सेकंड कश से पहले 1 सेकंड शुरू करने के लिए सेट कर रहे हैं। संकेत निशान प्रोत्साहन कश की शुरुआत के बाद 10 सेकंड के लिए रिकॉर्डिंग जारी है। (बी) सिग्नल एक घ्राण की बेहद मजबूत तंत्रिका प्रतिक्रिया दिखा ट्रेसएक वनस्पति प्रोत्साहन के लिए sensillum (Dγ), 10% (+) - β पाइनीन। (+) के कश के बाद - β पाइनीन Dγ sensillum के लिए दिया है, इस sensillum के अंदर रखे OSNs उच्च आवृत्ति और एक लंबे समय तक चलने वाले अस्थायी गतिशील साथ निकाल रहे हैं। संकेत का पता लगाने के ऊपर सफेद पट्टी प्रोत्साहन जोखिम से पहले 1 सेकंड अंतराल को इंगित करता है, का पता लगाने के ऊपर लाल पट्टी घ्राण sensillum पर प्रोत्साहन कश के वितरण से मेल खाती है, और पता लगाने के ऊपर काली पट्टी की समाप्ति के बाद दर्ज संकेत इंगित करता है प्रोत्साहन कश। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
उत्तेजनाओं को OSNs चित्रा 5. प्रतिनिधि खुराक पर निर्भर के हिमायती हैं। एक EXA के रूप में एक और वनस्पति प्रोत्साहन, eucalyptol का उपयोगmple, Dγ sensilla eucalyptol के विभिन्न सांद्रता के लिए एक खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया। सांद्रता 10% करने के लिए 0.001% से बढ़ के रूप में, फायरिंग की आवृत्तियों 240 के spikes / सेक करने के लिए 30 के spikes / सेकंड से गुलाब। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
एकल Sensillum रिकॉर्डिंग तकनीक बड़े पैमाने पर इस तरह के वातावरण में विभिन्न रासायनिक उत्तेजनाओं को फल मक्खियों, मच्छरों और बिस्तर कीड़े के रूप में कीड़े के तंत्रिका प्रतिक्रियाओं के परीक्षण में इस्तेमाल किया गया है। ये रासायनिक उत्तेजनाओं अक्सर भंग कर दिया और उपचार के विभिन्न खुराक तैयार करने के क्रम में एक आम विलायक में पतला कर रहे हैं। हालांकि, विभिन्न सॉल्वैंट्स उत्तेजनाओं के लिए काफी अलग रिहाई दरों का उत्पादन कर सकते हैं। ऐसे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एनोफ़ेलीज़ gambiae, क्यूलेक्स quinquefasciatus और एडीज एजिप्टी है के रूप में कुछ बड़े पैमाने पर अध्ययन कीड़ों पर पिछले अध्ययनों इन कीड़ों तेल 17-20 आयल करने के लिए अपेक्षाकृत असंवेदनशील हैं के रूप में आमतौर पर, उत्तेजनाओं को भंग करने के लिए विलायक के रूप में पैराफिन तेल का इस्तेमाल किया। पैराफिन तेल भी इसी कारण से 14 के लिए, बिस्तर कीड़े के पहले एकल sensillum रिकॉर्डिंग के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किया विलायक प्रत्येक कीट प्रजातियों के लिए अच्छा नहीं हो सकता। सीए मेंबिस्तर कीड़े भी असंवेदनशीलता का प्रदर्शन करने के लिए जो बिस्तर कीड़े, तेल तेल और DMSO, दोनों के एसई, विभिन्न अध्ययनों 14,15 में उत्तेजनाओं को भंग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन DMSO में पतला उत्तेजनाओं की एक ही खुराक पर ज्यादा मजबूत तंत्रिका प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए दिखाई दिया गया है बिस्तर कीड़े के sensilla। उदाहरण के लिए, DMSO-भंग आर - (+) - लाइमीन और एस - (-) - तेल तेल-भंग लाइमीन ही की तंत्रिका प्रतिक्रियाओं हासिल है, जबकि ≥70 के spikes / बिस्तर बग एंटीना पर Dγ sensilla से सेकंड के उत्पन्न तंत्रिका प्रतिक्रियाओं लाइमीन ≤25 के spikes / Dγ sensilla से सेकंड। तंत्रिका प्रतिक्रियाओं में यह कमी की वजह से शायद DMSO के साथ तुलना में पैराफिन तेल की धीमी रिहाई दर करने के लिए, आयल के तेल के साथ पतला किया गया है कि उत्तेजनाओं में काफी आम है। यह धीमी रिहाई दर sensillum की सतह पर लगाया प्रोत्साहन की राशि कम कर देता है और कुछ semiochemicals करने के लिए कीड़ों की संवेदनशीलता के बारे में एक भ्रामक निष्कर्ष में हो सकता है।
दो महत्वपूर्ण काएंएकल sensillum रिकॉर्डिंग के संचालन के लिए पी एस 1) नमूना तैयार करने और 2) संकेत रिकॉर्डिंग कर रहे हैं। बिस्तर कीड़े बहुत मजबूत पैर और सक्रिय रूप से आगे बढ़ एंटीना के बाद से नमूना तैयार करने के लिए, यह सब पैरों को हटाने और दो तरफा टेप पर कसकर एंटीना छड़ी करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। इलेक्ट्रोड sensillum शाफ्ट में बात करने के लिए संकेत रिकॉर्डिंग प्रक्रिया में, कभी कभी, यह positionally असंभव है। यदि यह मामला है, इलेक्ट्रोड हमेशा बहुत छोटी सी पृष्ठभूमि शोर के साथ एक बहुत साफ और स्पष्ट संकेत देता है, जो sensillum, के पीछे अंत पंचर हो सकती है।
डी और सी प्रकार sensilla में रखे कई न्यूरॉन्स होते हैं, यह एसएसआर के दौरान उत्पादन कार्रवाई की क्षमता के आयाम और आकार के आधार पर अलग-अलग न्यूरॉन्स के बीच भेद करने के लिए अक्सर कठिन है। हालांकि, यह एक ही एस में सभी न्यूरॉन्स के संयुक्त फायरिंग आवृत्ति के आधार पर विभिन्न उत्तेजनाओं को बिस्तर बग की प्रतिक्रियाओं में मतभेदों को देखने के लिए अभी भी संभव हैensillum। सैद्धांतिक रूप से, बिस्तर कीड़े असंवेदनशील है, जबकि एक ही खुराक में कमजोर उत्तेजना के साथ अन्य उत्तेजनाओं को मजबूत उत्तेजना के साथ कुछ उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशील हैं। व्यवहार परीक्षण और इन उत्तेजनाओं को उनके तंत्रिका प्रतिक्रिया की जानकारी को एकीकृत आगे के अध्ययन इसलिए बिस्तर कीड़े के लिए पारिस्थितिकी संबंधित semiochemicals पर सार्थक जानकारी प्रदान करेगा।
इस अध्ययन में, हम भी उत्तेजनाओं के विभिन्न खुराक के लिए घ्राण sensilla की तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के एसएसआर तकनीक का इस्तेमाल किया। हम विभिन्न रसायनों को बिस्तर बग के तंत्रिका प्रतिक्रियाओं में एक खुराक पर निर्भर पैटर्न देखा। हालांकि, बिस्तर कीड़े में रहते जटिल माहौल पर विचार, उनके सामान्य परिवेश में बिस्तर कीड़े द्वारा सामना वाष्पशील के वास्तविक खुराक बहुत कम हो जाएगा। नतीजतन, 01:10 5 वी / वी और 01:10 4 वी / वी अन्य रसायनों टी से बिस्तर कीड़े के लिए जैविक रूप से सार्थक हो जाने की संभावना है करने के लिए नीचे कम मात्रा में मजबूत तंत्रिका प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना है कि semiochemicalsटोपी केवल अधिक मात्रा में कार्य करते हैं। इसलिए, कम मात्रा में है कि अधिनियम के उन semiochemicals शायद प्रतिकूल कारकों एक मेजबान लगाने या से बचने के लिए उन्हें मदद करने, बिस्तर कीड़े की chemoreception में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और इस प्रकार में उपयोग के लिए बिस्तर बग attractants या भगाने का वादा के लिए स्क्रीनिंग में उपयोगी मार्गदर्शन प्रदान करेगा प्रयोगशाला और क्षेत्र assays के दोनों।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | A-M SYSTEMS | #716500 | Used for preparing the electrode |
| KNO2 | Sigma | #310484 | Used for sharpening the tungsten wire |
| AC Power Supply | BK Precision | 1653A | Providing the voltage in sharpening the tungsten wire |
| Leica Z6 APO Microscope | Leica | 10447424 | Used for observing the sensilla on antennae |
| Simulus controller | Syntech | CS-55 | Used for controlling the stimulus application |
| 4-Channel USB Acquisition Controller | Syntech | IDAC-4 | Real-time on screen display of all signals before and during recording |
| Light Source | SCHOTT | A20500 | Providing light sources for observation |
| Micromanupulator | Leica | 115378 | Used for minor movement of electrode |
| Speaker | Juster | 95a | Connected with Acquisition Controller IDAC-4 and providing sound for the signal |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | Used to hold the reference electrode, stablized bed bug and stimulus delivery tube |
| TMC Vibration Isolation Table | TMC | 63-500 | Used for isolating the vibration from the equipments |
| Coverslip | Tedpella | 2225-1 | Used for holding the bed bug |
| Double-sided Tape | 3M | XT6110 | Used for stablizing the bed bug on the coverclip |
| Dental Wax | Dentakit | DK-R012 | Used for supporting the coverclip where bed bug is stablized |
References
- Bartonicka, T., Gaisler, J. Seasonal dynamics in the numbers of parasitic bugs (Heteroptera, Cimicidae): a possible cause of roost switching in bats (Chiroptera, Vespertilionidae). Parasitol Res. 100 (6), 1323-1330 (2007).
- Thomas, I., Kihiczak, G. G., Schwartz, R. A. Bed bug bites: a review. Int J Dermatol. 43 (6), 430-433 (2004).
- Anderson, A. L., Leffler, K. Bed bug infestations in the news: a picture of an emerging public health problem in the United States. J Environ Health. 70 (9), 24-27 (2008).
- Boase, C. Bed bugs (Hemiptera: Cimicidae): an evidence-based analysis of the current situation. Sixth international conference on urban pests. OOK-Press Kft. Robinnson, W., Bajomi, D. Budapest, Hungary, , (2008).
- Doggett, S. L., Geary, M. J., Russell, R. C. The Resurgence of bed bugs in Australia: with notes on their ecology and control. Environ Health. 4 (2), 30-38 (2004).
- Ter Poorten, M. C., Prose, N. S. The return of the common bedbug. Pediatr Dermatol. 22 (3), 183-187 (2005).
- Yoon, K. S., Kwon, D. H., Strycharz, J. P., Craig, S., Lee, S. H., Clark, J. M. Biochemical and molecular analysis of deltamethrin resistance in the common bed bug (Hemiptera: Cimicidae). J Med Entomol. 45 (6), 1092-1101 (2008).
- Wang, L., Xu, Y., Zeng, L. Resurgence of bed bugs (Hemiptera: Cimicidae) in mainland China. Fla Entomol. 96 (1), 131-136 (2013).
- Haynes, K. F., Potter, M. F. Recent progress in bed bug management. Advanced technologies for managing insect pests. Ishaaya, I., Palli, S. R., Horowitz, A. R. , Springer. New York. 269-278 (2013).
- Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 12987-12995 (2011).
- Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annu Rev Entomol. 58, 373-391 (2013).
- Den Otter, C. J., Behan, M., Maes, F. W. Single cell response in female Pieris brassicae. (Lepidoptera: Pieridae) to plant volatiles and conspecific egg odours. J Insect Physiol. 26 (7), 465-472 (1980).
- Levinson, H. Z., Levinson, A. R., Muller, B., Steinbrecht, R. A. Structural of sensilla, olfactory perception, and behavior of the bed bug, Cimex lectularius., in response to its alarm pheromone. J Insect Physiol. 20 (7), 1231-1248 (1974).
- Harraca, V., Ignell, R., Löfstedt, C., Ryne, C. Characterization of the antennal olfactory system of the bed bug (Cimex lectularius). Chem Senses. 35 (3), 195-204 (2010).
- Liu, F., Haynes, K. F., Appel, A. G., Liu, N. Antennal olfactory sensilla responses to insect chemical repellents in the common bed bug, Cimex lectularius. J Chem Ecol. 40 (6), 522-533 (2014).
- Olson, J. F., Moon, R. D., Kells, S. A., Mesce, K. A. Morphology, ultrastructure and functional role of antennal sensilla in off-host aggregation by the bed bug, Cimex lectularius. Arthropod Struct Dev. 43 (2), 117-122 (2014).
- Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30 (2), 537-552 (2001).
- Qiu, Y. T., Loon, J. J. A., Takken, W., Meijerink, J., Smid, H. M. Olfactory coding in antennal neurons of the malaria mosquito, Anopheles gambiae. Chem Senses. 31 (9), 845-863 (2006).
- Ghaninia, M., Ignell, R., Hansson, B. S. Functional classification and central nervous projections of olfactory receptor neurons housed in antennal trichoid sensilla of female yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Eur J Neurosci. 26 (6), 1611-1623 (2007).
- Hill, S. R., Hanson, B. S., Ignell, R. Characterization of antennal trichoid sensilla from female southern house mosquito, Culex quinquefasciatus Say. Chem Senses. 34 (3), 231-252 (2009).
