Introduction
플라즈몬의 연구로 인해 다양한 분야 1-4의 응용 프로그램에 큰 관심을 끌고있다. 플라즈몬 가장 연구 분야 중 하나는, 표면 플라즈몬,되는 금속과 유전체 사이의 계면에서 외부와 전자파 전도 전자 커플 집단적 진동. 표면 플라즈몬은 서브 파장 광학, 바이오 포토닉스 및 현미경 5,6에서의 응용 가능성에 대해 탐구하고있다. 국소 표면 플라즈몬 공명 (LSPR)에 의한 금속 나노 입자의 매우 작은 체적 강전 향상뿐만 아니라 때문에 입자 크기, 입자 형상, 및 주변 매질 (7)의 유전 특성에 탁월한 감도, 광범위한 주목을 받고 -10뿐만 아니라, 때문에 본질적으로 약한 비선형 광학 효과 (11)을 높일 수있는 능력. 저 채도의 뛰어난 감도는 바이오 센싱과 가까운 헛소리에 대한 가치가있다LD 이미징 기술 (12, 13). 한편, 구조물의 플라즈몬 강화 된 비선형 광학 스위칭 및 전광 신호 처리 애플리케이션 (14, 15) 등의 광 집적 회로에 사용될 수있다. 이것은 잘 플라즈몬 흡수가 낮은 세기 레벨의 여진 강도에 정비례하는 것으로 알려져있다. 여진이 충분히 강한 경우, 흡수가 포화에 도달한다. 흥미롭게도, 높은 강도에서 흡수가 다시 증가한다. 이러한 비선형 효과는 포화 흡수 (SA) 15 ~ 17이라고 각각 포화 흡수 (RSA) (18)을 반대로한다.
그것은 LSPR 때문에, 산란 플라즈몬 구조에서 특히 강한 것으로 알려져있다. 기본적인 전자기학에 기초하여, 입사광의 산란 강도에 비해 응답은 선형이어야한다. 그러나, 나노 입자, 산란 및 흡수 밀접 Mie 이론을 통해 연결되어, 두 전자 일 수있다비유 전율의 실수 부 및 허수 부분의 관점에서 xpressed. 단일 GNS 광 조명하 다이폴로서 동작하는 것으로 가정하여, Mie 이론에 따른 단일 플라즈몬 나노 입자로부터의 산란 계수 (Q의 SCA) 및 흡수 계수 (Q의 절대치)를 19로 표현 될 수있다
x가 2이고 πa / λ,이 구 반경이며, m은 2 ε m / ε의 D이다. 여기서, ε를 ε m 및 D는 각각 둘러싸는 금속 절연체의 유전 상수와의 대응. 산란 계수의 형태 번째 이후의 것과 유사전자 흡수 계수, 그것은 따라서 단일 플라즈몬 나노 입자 (20) 가포 산란을 관찰 할 것으로 예상된다.
최근, 고립 된 플라즈몬 입자의 비선형 포화 산란는 처음으로 21 증명되었다. 이 여진 강도가 증가 할 때 포화에서 깊은 사실 산란 강도는 약간 감소하는 것이 현저하다. 여진 강도가 산란을 포화 낳은 후에 계속 증가 할 때 더욱 현저하게, 산란 강도는 가포 리버스 20 산란의 효과를 나타내는, 부활. 파장 - 크기에 의존하는 연구는 21 산란 저 채도 및 비선형 사이에 강한 관계를 보여 주었다. 플라즈몬 산란 강도와 파장 의존성이 비선형 행동을 기본 공통 메커니즘을 제안 흡수의 것과 매우 유사하다.
애플리케이션의 관점에서는 물론이다 KNOWN 그 비선형 광학 현미경의 해상도를 개선하는 데 도움이됩니다. 2007에서, 포화가 여진 (SAX) 현미경은 여기 빔 (22)의 시간적 정현파 변조를 통해 포화 신호를 추출함으로써 해상도를 향상시킬 수있는 제안되었다. SAX 현미경은 레이저 초점 스폿, 강도가 주변부보다 중심에서 더 강한 개념에 기초한다. 신호 (형광 또는 산란 중)가 포화 동작을 나타내는 경우 선형 응답 주위에 남아있는 동안, 채도, 중심에서 시작해야한다. 단지 포화 된 부분을 추출하는 방법이 있으면 주변 부분을 차단하면서도 따라서, 그것은 따라서 효과적으로 공간 분해능을 향상에만 중앙부를 떠날 것이다. 원칙적으로, 깊은만큼 포화에 도달 SAX 현미경없이 낮은 해상도 한계가 있고 강한 조명에 의한 시료에는 손상이 없다.
그것은 resolutio 것으로 나타났다형광 이미징의 N 크게 SAX 기술을 이용함으로써 향상 될 수있다. 그러나, 형광 광표백 효과에서 겪고있다. 산란 비선형의 발견과 SAX의 개념을 조합 산란에 기초하여 수퍼 - 해상도 현미경 (21)을 실현할 수있다. 종래의 수퍼 - 해상도 microscopies에 비해, 산란 기반 기술은 신규 한 비 표백 조영 방법을 제공한다. 본 논문에서는 단계별 설명은 획득 및 플라즈몬 산란 비선형를 추출하기 위해 필요한 절차를 간략하게 설명하기 위해 제공된다. 입사 광량 변경에 의해 도입 비선형 산란을 식별하는 방법은 기술된다. 더 자세한 내용은 이러한 비선형 단일 나노 입자의 이미지에 영향을 미치는 방법 및 공간 해상도 것은 SAX 기술에 의해 적절히 강화 될 수있는 방법을 해명하기 위해 제공 될 것이다.
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Protocol
1. GNS 샘플 준비
- LSPR 피크 시프트가 발생할 수의 입자 응집을 방지하기 위해 약 40 kHz에서 적어도 15 분 동안 샘플을 초음파 처리 GNS 1ml의 콜로이드 용액을 준비하기 전에.
- GNSS를 해결하기 위해 상업 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (MAS) 코팅 된 슬라이드 글라스에 GNS 콜로이드의 100 ~ 200 μl를 삭제합니다.
- 적어도 1 분 후, 증류수로 세척하여 여분의 콜로이드를 제거합니다. 대기 시간은 GNSS의 요구 분포 밀도에 따라 달라집니다. 전형적으로, 이들 대부분은 서로 분리되어 있기 때문에 입자가 쉽게 식별 될 수 있도록 적절한 밀도에서 1-3 분 결과. 대기 시간이 너무 길면 현저한 응집이 발생할 수있다.
- 질소 가스로 퍼징하여 샘플을 건조.
- (선택 사항), 고해상도에 유리 GNSS 매핑이 단계 (23)에서 주사 전자 현미경 (SEM)을 수행한다. 예를 들어, 이미지가 Figur 제공됩니다E 1, GNSS의 특성 밀도를 나타내는. 화상을 취득하는 전계 방출 SEM을 사용한다. 오일 샘플 (다음 단계)에 추가되면, 그 기름을 제거하고, SEM으로 샘플을 관찰하기 어려울 것이다.
- GNSS 다루 시료에 동일한 굴절률 기름 방울을 첨가하고, 유리 기판에서 강한 반사를 제거하기 위해.
- 샘플의 상단에 커버 유리를 놓고 매니큐어로 밀봉.
- 매니큐어가 건조 될 때까지 적어도 5 분을 기다립니다. 샘플은 준비가되었습니다.
홈 제작 된 공 초점 현미경 2. 정렬
- 설정의 방식에 대한 그림 2를 참조하십시오. 현미경 본체 자체의 백색광 조명 경로를 맞 춥니 다. 현미경의 할로겐 광원 켜고 쾰러 조명 조건을 달성하기 위해 현미경 제조업체의 사용 설명서를 따르십시오. 흰색 할로겐 조명 빔의 뒷면에 거의 평행 있는지 확인대물 조리개의 부분적 50/50 빔 스플리터에 의해 반사하고 레이저를 향해 전파.
- 이들이 주사 범위의 중심이다 정확한 초기 위치에서 유지되도록하여 갈바 노 미러를 켜고.
- 할로겐 조명 경로를 따라, 그것에 동심 고리와 종이의 얇은 시트에 의해 두 개 이상의 대상을 놓고 할로겐 빔을 맞 춥니 다.
- 이미징을 수행하려면, 532 nm의 레이저를 선택합니다. 분광 측정을 수행하기 위해, 초 연속 레이저를 선택한다. 정렬 중에, 레이저의 파워는 비선형 성을 피할 목적의 뒤쪽 개구에 10 μW 미만이어야한다. 그리고, 두 타겟의 도움으로 출사 할로겐 빔 입사 레이저 빔을 시준 대향. 이 프로세스가 완료되면, 레이저 빔의 거친 정렬은 달성되었다.
- 대물 렌즈의 후방 개구의 중심을 통해 레이저 빔을 정렬. 통상적으로, OI를 사용L 액침 대물. 오일 침지 대물 렌즈와 GNS 샘플 사이에 오일 한 방울을 추가합니다. GNSS의 산란 신호를 수집하기 위해 검출기로서 광전자 증 배관 (PMT)를 사용한다.
- 신호를 산란 포커스 아웃 차단하는 PMT의 앞에 20 μm의 직경 핀홀를 놓습니다. , 갈바 노 미러 및 (홈 내장 소프트웨어를 통해) PMT를 켜고 GNSS의 후방 산란 신호를 최대화하기 위해 시료 스테이지의 핀홀 위치 및 높이를 조정 한 후 컴퓨터 화면에 개별 GNS 관찰. 올바른 정렬과 GNSS의 샘플 XY 화상도 2b에 도시된다.
- 약간 초점 동심도를 확인 시료 스테이지의 높이를 변경. 이 동심원이 아닌 경우, 시료 스테이지의 높이를 변화시키면서 동일한 위치에 남아 GNS의 중심까지 스캐너 앞의 두 거울 빔을 조정한다. PSF의 XZ 이미지 2C 그림과 유사 있는지 확인정확한 빔 정렬을 보장한다. 저역 통과 및 가우스 부드러운 필터이 두 이미지를 처리합니다.
산란 비선형 3. 특성
- 낮은 여기 강도 (이하 × 104 W / ㎝ 2)에서 2.6 프로토콜에 따라 금 나노 입자의 화상을 취득.
- ImageJ에의 이미지 (또는 다른 이미지 분석 소프트웨어)를 엽니 다. 이미지 GNSS의 하나에 걸쳐 라인 (도 2b 참조) 그릴과 분석을 사용하여 -> ImageJ에 툴 플롯 프로필 산란 강도 프로파일을 검색한다. 가우스 함수에 의해 선택된 PSF의 프로필에 맞는 :
Y는, Y 0 배경 값은 (만약 있다면) PMT 판독 값이고,이 피크 진폭은 폭이 w, x는, 공간 좌표이고,이고, X (C)는 중심 번호 좌표이며가우스 함수의 전자. 해당 PSF의 FWHM은 (½ln2) W입니다. 대물의 개구 수 (NA)에 기초하여, 촛점 PSF의 FWHM은 이론적 L은 여기 파장 약 0.43l / NA 인 것으로 추정 될 수있다. 촬상 시스템의 배열을 확인하는 두 숫자를 비교. - 수동으로도 2a에 감광 (ND) 필터를 변경하여 여진 강도를 증가시키고, 각각의 휘도 레벨에서 산란 이미지를 기록한다. 다른 여진 강도 각 GNS의 중심에서 산란 신호의 값을 취하며, 여기 신호 강도 대 산란 곡선을 플롯. 여기 강도가 충분히 낮은 경우 선형 관계를 보여야 처음 몇 점의 선형성을 확인합니다. 처음 몇 점의 선형 피팅을 기반으로 선을 그립니다. 후속 포인트의 산란 강도는이 선형 추세, saturatio 이하로 떨어질 경우N가 발생했습니다.
- 가포 산란을 관찰 한 후, 서서히 포화 임계치 이하의 강도를 감소시키고, 화상 동일한 GNSS 다시 비선형 행동 가역성을 위해.
단일 금 나노 구체의 산란 스펙트럼 4. 측정
- 단일 GNS로부터 산란 스펙트럼을 측정하기 위해, 레이저 광원과 같은 슈퍼 - 연속 레이저를 사용한다. 레이저의 파장은 초기 450 nm 내지 1,750 nm의 범위이다. 샘플 및 광학 부품에 손상을 줄 수있는 과량의 적외선 힘을 제거하고, 가시광을 반사하는 우측 슈퍼 연속체 레이저 후에 하나 또는 두 개의 미러를 배치하고, 빔이 과잉 적외선을 수집 덤프 사용.
- 레이저 스캐닝 공 초점 현미경으로 슈퍼 연속 레이저를 직접 제 2의 정렬 절차를 따르십시오. 전체 가시 범위에 걸쳐 스펙트럼 범위를 보장하기 위해 광대역에게 50/50 BS를 사용합니다.
- 취득유리에 GNSS의 이미지입니다. 이미지에 하나의 GNS를 찾은 입자에 입사 광대역 빛의 초점을 고정.
- 전하 결합 장치가 장착되어있는 분광계 향해 후방 산란 신호를 지시하는 PMT 앞에 반전 거울을 사용하고 상기 선택된 하나의 스펙트럼 GNS 걸릴. 여기 스펙트럼이 GNS 산란과 배경의 혼합물로 인해 다른 표면에서의 반사에 있음을주의해야합니다.
- 다시 PMT 검출기로 전환 한 입자의 위치가 변경되지 않았 음을 확인하는 또 다른 이미지를 촬영합니다. 그리고, 어떤 입자가 존재하지 않는 점에 포커스를 이동. 다시 분광계로 전환 한 배경을 대표하는 또 하나의 스펙트럼을 취할.
- 단일 GNS의 명확한 산란 스펙트럼을 구하는 단계 4.4 단계 4.5에서 스펙트럼으로부터 배경 스펙트럼을 뺀다.
SAX 현미경 5. 정렬
- 그림 3 참조이상적인 정현파 시간 변조 두 음향 광학 변조기 (버튼 확장 박스 (AOM)) 사이의 비트 주파수에서 얻을 수있다 SAX 현미경의 방식에 대한. 먼저, 다음 버튼 확장 박스 (AOM)의 요건을 충족하도록 상기 레이저 빔의 크기를 조절한다. 50/50 빔 스플리터를 이용하여 두 개의 빔으로 532 nm의 레이저 광을 분할.
- 한 빔이 각 AOM을 통과하여, 두 개의 버튼 확장 박스 (AOM)을 통해 두 개의 빔을 안내합니다. 두 개의 버튼 확장 박스 (AOM)의 변조 주파수는 달라야합니다. 예를 들어, 10 kHz의 주파수 차분을 산출 40.000 MHz 및 40.010 MHz에서 다른에있을 수있다. 이 차이는 주파수 SAX 신호용 기본적인 변조 주파수 (f)의 m 것이다.
- 두 버튼 확장 박스 (AOM)에서 1 차 회절 빔을 받아, 다른 50/50 빔 스플리터를 이용하여 두 개의 빔을 결합한다. 두 개의 빔을 시준하는 버튼 확장 박스 (AOM) 후 거울을 조정합니다.
- 시간적 modulatio을 모니터링하는 오실로스코프에 접속되어, 광 검출기를 추가엔. 슬라이드 유리 레이저의 일부분을 분할하고,도 3에 도시 된 바와 같이, 광 검출기로 보내. 올바른 변조 빔 중첩으로, 주요 주파수 f를 m으로 도시 된 파형과 동일한 정현파 강도 변조 관찰 그림 4.
주 : 변조의 배경이 최대 변조도를 달성하기 위해 가능한 한 낮게 할 필요가있다. 게다가, 변조의 고조파 왜곡이 감소하는지 확인하기 위해 오실로스코프의 푸리에 분석 기능을 사용한다. SAX 성공적인 구현을 달성하기 위해 최소화 된 비선형 성을 가진 초기 완벽한 정현파 여진 강도 변조를 보장한다. - 오실로스코프에서 광 검출기의 전기 출력을 분리하여 종속 앰프의 레퍼런스 입력에 연결합니다.
- 도 3에 도시 된 바와 같이, 이전의 프로토콜 다음 촛점 시스템에 레이저 빔을 정렬. H감수, 신호 입력으로 종속 증폭기 PMT의 전기 출력을 연결한다.
- 시료로 빈 커버 유리를 사용하고, 검출기는 1 V의 판독 값 이하 선형도 5에 도시 된 바와 같이,, 서서히 여기 전력을 증가시킴으로써 전기 검출 시스템의 선형성을 확인한다. 이후의 모든 측정에서,이 값 이하로 판독을 억제하기 위해주의를 기울입니다.
- 전압 신호의 절대 크기를 내보내려면 종속 증폭기의 출력을 설정합니다. 기준 채널로 설정하는 고조파 성분을 변화시킴으로써, 등등 SAX 신호, 1, 2의 진폭을 구하여.
- 또한 래스터 주사 갈바 노 미러의 구동 전압 신호를 수신하는 데이터 수집 카드에 종속 증폭기의 선형 및 비선형 신호를 내보내. 사용자 정의 된 LabVIEW 프로그램의 도움으로, 잠금에 앰프와의 신호를 동기화갈바는 화상을 형성하는 거울.
- 이미지에서의 신호 대 잡음비를 최적화하도록 적절 종속 증폭기의 화소 취득과 통합 시간을 선택한다. 여기의 주요 변조 주파수 (f)의 m이 10 kHz에서, 기간은 100 마이크로 초 경우, 즉 일 때, 예를 들면, 기간보다 적어도 세 배 이상으로 종속 증폭기의 적분 시간을 설정한다. 갈바 노 미러의 이동 시간을 추가 획득 속도 SAX 촬상 모드에서 초당 1500 픽셀로 설정된다.
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Representative Results
그림 6은 80 nm의 GNS에서 측정 된 스펙트럼을 보여줍니다. Mie 이론에 기초하여 계산 된 곡선이 잘 일치를 보여주는, 같은 플롯에 제시되어있다. LSPR 피크는 580 nm의 주위이다. 다음 실험에서, 레이저는 파장이 플라즈몬 광 산란 효과를 향상시키고 포화 21 산란 활성화 플라즈몬 밴드 안에 위치로 선정 된 532 나노 미터였다.
그림 7 다른 여기 강도에 하나의 금 나노 입자의 이미지를 산란 선물 및 하단 행은 비선형 성을 강조하기 위해 각 입자의 라인 프로파일을 제공합니다. 이미지 크기는 600 나노 미터 × 600 ㎚이며, 화소 사이즈는 13.8 ㎚이다. 수집 속도가 정상 XY 촬상 모드에서 초당 234,000 픽셀이었다. 각 이미지는 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 다섯 이상의 인수를 평균화 하였다.
여진 강도가보다 낮을 때1.5 × 106 W / cm 2, 산란 여진 강도를 선형 종속적이므로, 단일 나노 입자의 생성 된 이미지는 표준 가우시안 프로파일과, 여기 빔의 PSF를 닮았다. 1.7 × 106 W / cm 2, PSF의 상단뿐만 아니라 명확한 평탄화에 여진 강도 증가가 관찰되는 경우에는, 또한 채도를 나타내는 FWHM의 확대. 매우 흥미롭게도, 약간 더 높은 농도에서, 중심 강도는 도넛 모양의 PSF 결과 주연보다 낮아진다. 여진 강도가 계속해서 증가하는 것에 따라, 산란 강도는 역방향 포화 드러내는과 PSF의 중심에 새로운 피크 결과 다시 증가한다.
도 8.이 곡선 clearl에 점으로 도시 된 바와 같이 다른 여진 강도에 PSFS의 중심 강도를 플롯하여, 산란 강도 의존성 얻어진다Y는 포화 및 역 포화 행동의 경향을 알 수있다. 예상대로, 비선형 흡수 15-17의 강도 의존성과 매우 비슷. 비선형 흡수 분석의 전형적인 방법에 따라, 다항식 함수는 비선형 산란 결과를 맞추어 사용 하였다. 그러나, 3 차 비선형 성이있어, 5 차 비선형 결과를 모델링하기에 충분하다되는 가장 비선형 흡수 연구 상이한 더 산란 커브를 피팅하는데 요구되었다.
섹션 5에서 언급 된 바와 같이, 고조파 성분은 실험적 로크 인 증폭기에 의해 추출 될 수 있으며, 그 결과를도 9A에 나타내었다. 한편, 고조파 성분은도 8 처음부터 계산 될 수있다,도 8에 맞게, I가 여진 강도를 다항식 함수를 사용하여, 우리는 β, γ .... 우리가 할 수있는, 피팅 파라미터가 α 다음 여진 한 세기를 표현t는 시간이다 시간적 변조 함수 I (t) = I 0 (1 + COS (2 πf m 개의 t)) / 2, 등 성만은 F의 m은 변조 주파수이며, I 0 최대 여진 강도를 나타낸다. S (I)에 I (t)를 대입하고, 확인하여 푸리에 주파수 영역으로 수득 된 S를 (I (t))로 변환하기 위해 변환, 우리는 다음 식에 여러 델타 함수 (δ)로 구성했다 :
각 델타 함수의 계수 (0, 1, 2, 등)은 대응하는 고조파 주파수에서 SAX 신호의 진폭을 나타낸다. SAX의 시그나에 해당이 계수,다른 고조파에서 L 강도는, 피팅 매개 변수 α, ... γ, β의 기능과 같이 쓸 수있다 :
계산 결과를도 9b에 나타낸다. 실험 및 계산 플롯은 특히 다음의 두 측면에서, 밀접 동의.
첫째, 2 F의 M 3 F (M)의 곡선은 곡선을 따라 특정 농도에서 딥을 보여, 부드러운되지 않습니다. 두 강하가 3 m F의 곡선에서 볼 수있는 동안 두 도면에서, F (2)의 m 곡선 세 딥이있다. 둘째, 슬로프는 다른 여기 강도와 다릅니다. 여진 강도가 높지 않을 경우, f를 1 m, 2 m의 F, F, 3 (M)의 경사가 1, 2, 3이다, 각기. 그러나, 각각의 침지 후, 대응하는 비선형 곡선의 기울기는 커진다.
비선형 구성 요소가 여기 강도가 강하에 걸쳐 증가 SAX 기술을 통해 추출하는 경우 강하 및 기울기의 변화로, 틀에 얽매이지 않는 PSFS이 예상된다. 그림 10A는 1 F 분, 2 F 분, 3의 SAX 이미지의 예를 보여줍니다 다른 여진 강도 F m에서 주파수 성분. 첫번째 행에서, 여진 강도가 비선형 성분을 유도하기에 충분하다 0.7 MW / cm 2이지만, 진폭이 상대적으로 약하다. 이 휘도 레벨에, 2 m의 F 신호의 기울기는 (2)이고,도 9a에 도시 된 바와 같이, 그것은, F 3 m의 신호가 3이다. (2)의 여진 강도가 2의 m F 신호의 제 딥 레벨로 증가하는 경우, 이미지 SAX도 10a에 두 번째 행에 도시 된 바와 같이, F에 m 신호는, 도넛 형상이된다. F의 3 m의 PSF의 FWHM이 뛰어난 해상도 향상을 낸, 1 F의 m 신호보다 훨씬 작하면서 모두 1 F의 m 및 3 m F 이미지가 견조. 같은 행의 최 우측 패널에 신호 프로파일로부터, 2 F m 도넛 링의 FWHM은 약 110 ㎚이다. 한편,도 10a의 3 단째는 여진 강도가 3 F의 m 신호의 제 찍어 증가 할 때, 단지 3 F의 m 화상 도넛 65 나노 링 폭으로 형성된다 보여준다. 1 F의 M 하나에 2 F m에 신호를 비교할 때이 강도에서 놀라운 해상도 향상은 발견된다.
도 10B 및 10C는 계산 된 PS를 보여도넛 모양 결과에 각각 대응하는 강도 (F)의 2 m, 3 m F 신호의 FS. 계산은 그림 9B의 다항식 커브 피팅 기반으로했다. 계산 된 곡선은 다시 잘 비선형 산란을위한 5 차 다항식의 적합성을 확인하고,도 10a의 오른쪽 패널에서 실험 PSFS의 기능을 재현.
도 1 GNSS의 SEM 이미지. 프로토콜의 첫번째 부분에서 설명한 제조 공정을 수행함으로써이 충분히 GNSS 분리가 관찰된다. GNSS 사이에 100 개 이상의 나노 미터로, 자신의 저 채도의 효과가 서로 결합되지 않습니다. 스케일 바 :. 100 nm의 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
집에 내장 된 공 초점 현미경 (24) 그림 2. (A) 설정. 초점에서 GNSS와 (B)의 XY 이미지입니다. 2 (C). 올바른 정렬과 PSF의 XZ 이미지를이 시스템에 대한 두 개의 레이저 소스가 있습니다. 하나는 532 nm의 연속파 레이저이고, 다른 하나는 펄스 슈퍼 연속체 레이저이다. 산란 신호를 측정 할 때, 532 nm의 연속파 레이저 소스 (삽입 레이저 라인 필터) PMT 검출기로서 사용 하였다. 스펙트럼을 측정하기 위해, 초 연속 레이저를 레이저 광원과 검출기로서 분광계로 채택 하였다. 선택된 레이저 여진 강도를 조절하는 감광 필터들의 세트를 통해 전송된다. 50/50 빔 스플리터가 주사 현미경으로 레이저를 안내하고으로 후방 산란 신호의 절반을 허용오후 T 또는 반전 거울에 의해 선택된다 분광계. 스캐닝 시스템에있어서, 대물 렌즈의 초점 평면에 수직 및 수평 래스터 스캐닝을 형성 두 갈바 노 미러가있다. 후방 산란은 동일한 목표에 의해 수집하고 검출기에 의해 전기 신호로 변환된다. 신호는 이미지를 형성하기 위해 공 초점 주사 방식으로 동기화된다. PI 단계는 축 방향으로 GNSS를 이동하여 XZ 이미지를 획득하는 데 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대부분의 구성 요소들은 공 초점 현미경 (붉은 사각형)에서 수득 된 것과 동일하다. SAX 3. 현미경의 설치도 있지만 정현파 변조 여기 레이저 빔에 첨가 하였다. 파란색 사각형은 MODUL를 보여줍니다ATOR 설정. 우선, 여기 레이저 빔으로 두 개의 나누어 따로 약간 다른 주파수를 가진 고주파 변조를 생성하기 위해 두 개의 버튼 확장 박스 (AOM)을 통해 전송 된. 그런 다음, 두 변조 빔은 두 개의 버튼 확장 박스 (AOM) 사이의 비트 주파수의 정현파 변조를 생산하기 위해 결합했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
오실로스코프. Y1 및 Y2에 의해 측정 버튼 확장 박스 (AOM) 후 결합 빔 그림 4. 변조는 각각 최대 (52.1 MW) 및 최소 (1.2 MW) 변조 강도의 값을 나타냅니다. Y2 완벽 변조를 달성하기 위해 0이어야합니다. 현재 변조 주파수는 10 kHz로했다. 대형을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 R 버전.
도 5 검출 시스템의 선형성 테스트. 초점면에 커버 글라스를 배치함으로써, 상기 유리 / 공기 인터페이스에서 여기 레이저의 반사를 검출 시스템의 선형성을 확인하는 데 사용 하였다. 여진 강도 대 신호 출력은 V-1의 판독 값 이하 선형성을 나타낸다. 또한, 소음 레벨은 잘 10-4 V 이하, 그래서 시스템은 적어도 104의 동적 범위를 제공한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
80 나노 GNS 그림 6. 산란 스펙트럼. 붉은 점 experim 표시ental 측정, 검은 선이 Mie 이론에서 계산을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
선형에서 GNS 그림 7. 산란 이미지는 채도를 반대합니다. 상단 행은 후방 산란 이미지를 보여줍니다, 아래 행은 다양한 자극 강도에서 선택 나노 입자의 신호 프로파일을 제공합니다. 선형성 전환이 포화 명확하게 관찰된다 반대로 포화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8. 산란 강도단일 GNS에서 여기 강도 대. 파란색 점, 다른 여자 강도에서 PSF의 중심에 강도를 산란 포화 및 역 포화를 포함하여 매우 비선형 반응을 보여주는에 해당합니다. 레드 곡선은 5 차 다항식 기능을 기반으로 맞춤 곡선을 나타냅니다. (이미지 참조에서 재생. 25.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 (A) 실험 및 (B)의 계산에있어서 SAX 신호들의 제 강도 의존성. (A) SAX 신호는 락 - 인 증폭기에 의해 추출하고, 각각의 실험 데이터 포인트는 네 80nm의 GNSS에 대해 평균 하였다. 점선은 SAX 신호 (25)의 경사를 나타냅니다. (B) 다음 프로토콜 5, SAX의시gnals는 그림 8의 5 차 다항식에 맞는 기준으로 계산했다. (사진 참조에서 재생. 25) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다른 여기 강도에서 10 SAX 이미지를 그림. (A)의 F 실험적 1 m, 2 m의 F 및 다른 여진 강도 F에서 3 m의 SAX 이미지를 관찰 하였다. 픽셀 크기가 20 ㎚이며, 각 화상의 크기가 750 나노 미터 × 750 나노 미터이다. 2 F m 3 F의 m에서 도넛 강도 프로파일은 가장 오른쪽 패널에 플롯된다. (B) 2 (F)의 m 화상의 계산 된 이미지 프로파일을 0.75 MW / cm 2에서. 3 F <의 (C) 계산치 화상 프로필/ EM> 1.1 MW / ㎠에서 M 이미지입니다. (이미지 참조에서 재생. 25.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜에서, 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 샘플을 준비 할 때 먼저, 나노 입자 밀도는 입자 사이 플라즈몬 결합을 피하기 위해 너무 높은이어야한다. 두 개 이상의 입자가 서로 매우 근접 할 경우, LSPR 파장 결합 결과는 따라서 크게 비선형 성을 감소시키는, 장파장 측으로 시프트. 그러나,이 영상 법은 실제로 입자 자체 대신에, 플라즈몬 모드의 분포를 매핑한다. 따라서, 적합한 여기 파장과, 플라즈몬 모드 커플 링은 또한 강한 산란 비선형 성을 나타낼 수 향상된 해상도로 묘화 될 수있을 것으로 기대된다. 둘째, 이렇게 두 개의 버튼 확장 박스 (AOM) 사이의 박동 동기 사용, 여기 빔 내의 순수 정현파 변조를 생성하기 위해 매우 중요하다. 해상도 향상 비선형 경우, 산란 신호 변조 비선형 부분을 추출 (고조파 성분)에 의존하고 있기 때문에왜곡은 여기에서 변조 한 후 추출이 더 어려울 것이다 존재한다. 또한, 현재의 방식에서, 간섭계 설치 고해 변조를 생성하기 위해 사용되므로, 간섭계의 두 빔의 정렬은 또한 가능한 변조도의 큰 달성하는데 중요하다. 셋째, 상기 신호는 비선형 (검출기, 증폭기, A / D 컨버터, 컴퓨터 I / O를 포함하는) 검출 시스템에서 발생되지 않도록하는 것이 매우 중요하다. 따라서, 특별한주의가 검출 시스템은 동적 범위 내에서 작동되는 것을 보장 할 필요가있다. 다이내믹 레인지는 노이즈 레벨에서 검출기 포화, 즉, 검출 시스템 선형성의 영역으로 정의된다. 현재의 경우, 검출 된 전압 신호를 1 V 이하 선형이고, 잡음 레벨은 10-4 이하 V. 따라서, 시스템은 적어도 10 (4)의 동적 범위를 제공한다. 신호 비선형 성에서 비롯되도록하려면금 나노 입자는 그 자체가 아니라 검출 시스템에서, 상기 동적 범위 내의 판독 값을 유지하는 것이 필요하다. 넷째 중요한 요소는 샘플의 기계적 안정성이다. 비선형 특성 동안, 나노 입자는 동일한 초점 평면에서 유지하는 것이 필수적이다. 나노 입자 또는 시료 스테이지의 축 드리프트 심한 비선형 성 평가의 정확도에 영향을 미칠 것이다. 나노 입자로 작업 할 때 따라서, 용이하게 광 여기하에 주위를 이동하지 않는 입자를 발견하는 것이 중요하다. 한편, 리소그래피에서 성장한 샘플로 작업 할 수있다. 이 경우, 미세한 단 안정성이 주요 제한 요소이다. 크게 안정성을 향상시킬 수있는 위치 피드백 제어 단계가 있습니다. 스테이지의 이동이 일반적으로 매우 느리므로 대안 적으로, (예를 들면, 10 분에서 1 ㎛)을, 그것은, XYZ 3 차원 화상을 취득 스택 (10)과 같은 100 nm의 이미지 축으로하는 separatio 유용n은 각각 다른 세기 값에서 인접한 이미지 사이. 그런 다음 분석 단계에서, 각 스택 중 가장 밝은 이미지는 강도의 대표 이미지로 선택해야합니다.
원칙적으로, SAX 포화 구조화 조명 현미경 (SSIM) (26)를 포함 포화 기반 기술의 분해능은 전시품이 더 낮게 고차 비선형 (높은 고조파 주파수 성분)이 달성 될 수있는 한 제한되지. 고차 고조파 복조 성분 추출 특히 그러나 실제로는, 해상도, 신호대 잡음비 (SNR)에 의해 제한된다. SNR을 향상시킬 수있는 몇 가지 전략이있다. 예를 들어, 변조 주파수가 27 심각 SNR에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 단지 포화 신호 (제조에서 원고)를 추출하는 비 포화 및 포화 신호의 강도 차이를 계산하여 SNR을 향상시키는 것도 가능하다.
스위칭 28-30 포함한 형광체의 비선형에 의존했거나형광 방출 22,26,31의 포화에 의해. 그러나, 형광 특히 강한 빛 조명 아래에서 사진 표백의 본질적인 문제를 나타낸다. 본 연구는 전혀 문제 표백 21 없으므로 GNSS의 가포 산란 초해 현미경 유망한 방법임을 보여 주었다. SAX는 형광 현미경을 이용하여 이전의 연구와 비교할 때, 가포 산란 해상도 향상 때문인 고차 비선형 (22), 본 연구에서 훨씬 높았다. SSIM 26 : 또한, SAX 현미경 이외, 채도에 기초하여 다른 초 해상 기술이있다. SAX 현미경은 시간 변조를 사용하는 동안 SSIM은 비선형 신호를 추출하는 변두리의 공간 변조를 이용한다. 이 비 표백 산란 포화 속성, 그것은 따라서 넓은 필드 병에게 아래의 공간 해상도를 향상시키기 위해 이러한 발견은 SSIM과 조합 될 수있을 것으로 기대된다umination.
장래의 응용에서,이 플라즈몬 SAX 기법뿐만 플라즈몬 공진 회로의 모드 분포와 역학을 해결하기 위해, 또한 생체 조직의 화상의 해상도를 향상시키는 데 유용 할 것이다. 유사 해상도 향상은 실리콘 (32)과 같은 다른 플라즈몬 예컨대 실버 (미공개)와 같은 재료뿐만 아니라, 비 - 플라즈몬 물질로 입증되었다. 수퍼 - 해상도 이미징 필드 SAX 현미경은 여러면에서 장점을 갖는다. 스토캐스틱 광학 재구성 현미경 (STORM) 및 광 활성화 지역화 현미경 (PALM)에 비해, SAX 현미경 이미지 당 몇 초의 빠른 주사 속도를 갖는다. 유도 방출 고갈 (STED) 현미경에 비해, 하나의 레이저 광은 상당히 복잡성을 감소 SAX 현미경 필요하다. SSIM에 비해, SAX의 해상도는 동시에 측면 및 축 방향으로 개선된다. 또한, 행충분한 화상 농도를 달성 여진 또는 컬렉션의 빔 경로를 따라 임의의 산란이 매우 중요하다. 폭풍, 팜, 그리고 SSIM 같은 넓은 분야 기술의 경우, 이미지는 조직에서 방출되는 형광 광자의 임의의 산란에 매우 민감 카메라로 촬영하고 있습니다. STED SAX과 같은 점 - 스캔 기술을 위해, 형광 신호가 포인트 검출기에 의해 수집하고, 그래서 그들은 조직 산란에 대해 더 견고된다. 그럼에도 STED는 초점에서 도넛 빔 프로파일을 작성하는 위상 판을 필요로하고, 위상 정보는 조직에서의 빔의 전파 동안에 저하 될 수도있다. 따라서, SAX 현미경 깊은 조직 슈퍼 해상도 이미징을위한 이러한 양식 중 가장해야합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
References
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