Introduction
Изучение плазмоники привлекла большой интерес в связи с его применения в различных областях 1-4. Один из наиболее изученных месторождений в плазмоники поверхности Плазмоника, в которых коллектив колебаний электронов проводимости пары с внешней электромагнитной волны на границе раздела между металлом и диэлектриком. Поверхностные Плазмоника была изучена для ее потенциального применения в оптике, субволновую биофотонике и микроскопии 5,6. Сильный усиление поля в ультра-малых объема металлических наночастиц в связи с локализованной поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) привлек широкое внимание не только из-за его исключительной чувствительности к размерам частиц, формы частиц, и диэлектрических свойств окружающей среды 7 -10, но также из-за его способность стимулировать сути слабые нелинейные оптические эффекты 11. Исключительная чувствительность LSPR является ценным для био-зондирования и около-тьфуметоды визуализации LD 12,13. С другой стороны, усиливается нелинейность плазмонных структур могут быть использованы в фотонных интегральных схем в таких приложениях, как оптической коммутации и полностью оптической обработки сигналов 14,15. Хорошо известно, что плазмонный поглощения линейно пропорциональна интенсивности возбуждения при низких уровней интенсивности. Когда возбуждение достаточно сильным, поглощение достигает насыщения. Интересно, при более высоких интенсивностях, поглощение снова возрастает. Эти нелинейные эффекты называются насыщаемым поглощения (SA), 15-17 и обратного поглощения насыщающегося (RSA) 18, соответственно.
Известно, что из-за LSPR, рассеяние особенно сильна в плазмонных структур. На основании фундаментальных электромагнитных, реакция рассеяния по сравнению с интенсивности падающего должна быть линейной. Тем не менее, в наночастицах, рассеяние и поглощение тесно связаны через теории Ми, и оба могут быть электроннойxpressed точки зрения реальных и мнимых частей диэлектрической проницаемости. В предположении, что один ГНС ведет себя как диполь под светового облучения, коэффициент рассеяния (Q SCA) и коэффициент поглощения (Q абс) из одного плазмонного наночастицы согласно теории Ми может быть выражена как 19
где х 2 П А / λ, а есть радиус сферы, а м 2 ε м / ε d. Здесь ε ε м и д соответствуют диэлектрических констант металла и окружающих диэлектриков, соответственно. Так виде коэффициента рассеяния аналогичен гокоэффициент поглощения е, поэтому оно должны соблюдать насыщающегося рассеяние в одном плазмонного наночастицы 20.
Недавно нелинейной насыщающийся рассеяние в изолированной плазмонного частицы была продемонстрирована в первый раз 21. Примечательно, что при глубоком насыщении, интенсивность рассеяния на самом деле немного снизился, когда интенсивность возбуждения увеличивается. Еще более удивительно, когда интенсивность возбуждения продолжала расти после рассеяния насыщается, интенсивность рассеяния воскрес, показывающий влияние обратного рассеяния насыщающийся 20. Wavelength- и зависящие от размера исследования показали тесную взаимосвязь между LSPR и нелинейного рассеяния 21. Интенсивность и длина волны плазмонного зависимости рассеяния очень похожи на те, поглощения, предлагая общий механизм, лежащий в основе этих нелинейных поведения.
С точки зрения приложений, это хорошо KNOWn, что нелинейность помогает улучшить оптическое разрешение микроскопа. В 2007 году насыщенный возбуждения (SAX) микроскопии было предложено, что может повысить разрешение путем экстракции насыщенный сигнал через временной синусоидальной модуляции пучка 22 возбуждения. SAX микроскопия основана на концепции, что для фокального пятна лазерного интенсивность сильнее в центре, чем на периферии. Если сигнал (или флуоресценции или рассеяния) имеет поведение насыщения, насыщение должно начать от центра, в то время как линейный отклик остается на периферии. Таким образом, если существует способ, чтобы извлечь только часть насыщенный, он оставит только центральную часть, отклоняя периферийную часть, таким образом, эффективно повышение пространственного разрешения. В принципе, нет нижнего предела разрешения в SAX микроскопии, так долго, как глубокое насыщение достигается и нет никаких повреждений образца из-за интенсивного освещения.
Было показано, что Resolutioп флуоресценции может быть значительно повышена за счет использования техники SAX. Однако флуоресценции страдает от фотообесцвечивания эффекта. Сочетание открытие рассеяния нелинейности и концепцию SAX, супер-разрешение микроскопии на основе рассеяния могут быть реализованы 21. По сравнению с обычными микроскопии сверхвысокого разрешения, метод рассеяния на основе обеспечивает новый способ контрастности без отбеливания. В этой статье, описание шаг за шагом дано наметить процедуры, необходимые для получения и извлечения нелинейность плазмонного рассеяния. Методы выявления рассеяния нелинейности, вносимые изменения интенсивности падающего описаны. Более подробная информация будет предоставлена разгадать, как эти нелинейности влияют изображения одиночных наночастиц и как пространственное разрешение может быть повышена соответственно по методике SAX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ГНС для подготовки образцов
- Перед приготовлением образца, соникатные 1 мл ГНС коллоидный раствор, по крайней мере 15 мин при температуре около 40 кГц, чтобы предотвратить агрегацию частиц, которые могут вызвать пик LSPR меняться.
- Оставьте 100-200 мкл ГНС коллоида на предметное стекло с коммерческой алюмосиликат магния (MAS) покрытия для фиксации GNSS.
- После по меньшей мере 1 мин, удалить лишнюю коллоид промывкой дистиллированной водой. Время ожидания зависит от требуемой плотности распределения GNSS. Как правило, 1-3 мин приводит к соответствующей плотности, что позволяет частицам быть легко идентифицированы, поскольку большинство из них изолированы друг от друга. Значительное скопление может произойти, если время ожидания слишком долго.
- Сушат образец, продувки газообразным азотом.
- (Необязательно) Чтобы отобразить GNSS на стекле с высоким разрешением, выполните сканирующей электронной микроскопии (SEM) на данном этапе 23. Пример изображения обеспечивается в Figurе 1, показывая характерную плотность GNSS. Используйте поле излучения SEM приобрести изображение. После добавления масла на образец (следующий шаг), то будет трудно удалить масло и наблюдать образца с SEM.
- Добавить каплю масла с таким же показателем преломления на образец, чтобы покрыть GNSS и устранить сильное отражение от стеклянной подложки.
- Поставьте покровного стекла в верхней части образца и запечатать его с лаком для ногтей.
- Подождите, по крайней мере, 5 мин, пока лак для ногтей не высохнет. Образец готов.
2. Выравнивание Главная построенный конфокальный микроскоп
- На рисунке 2 схемы установки. Совместите белый свет подсветки путь самого тела микроскопа. Включите галогенной источника света микроскопа, и по инструкции микроскопом производителя для достижения освещенности состояние Колер. Убедитесь, что белые галогена световые лучи почти параллельны на заднейапертура объектива, частично отражается 50/50 светоделитель, а затем распространяются в сторону лазера.
- Включите Galvano зеркал, чтобы обеспечить, что они остаются в правильном исходном положении, то есть в центре области сканирования.
- Поместите по крайней мере, две цели, сделанные тонкого листа бумаги с концентрическими кольцами на нем, по пути галогенные света, и совместите их с галогенной луча.
- Для выполнения изображений, выберите 532 нм лазера. Для проведения измерений спектроскопии, выберите супер-континуум лазера. Во выравнивания, мощность лазеров должна быть не менее 10 мкВт на задней отверстия объектива, чтобы избежать нелинейности. Затем коллимации падающего лазерного пучка, противоположную исходящего галогена пучка с помощью двух целей. Когда этот процесс будет завершен, грубый выравнивание лазерного луча была достигнута.
- Выравнивание лазерный луч через центр задней апертуры в объектива. Как правило, использовать OIл-иммерсионный объектив. Добавить каплю масла между нефтью погружения объектива и образцом ГНС. Используйте ФЭУ (ФЭУ) в качестве детектора для сбора рассеяния сигналов ГНСС.
- Поставьте крошечное отверстие 20 мкм диаметр перед ФЭУ, чтобы блокировать фокуса рассеяния сигналов. Включите гальваника зеркал и ФЭУ (через домашний построенный программного обеспечения), отрегулируйте положение обскуры и высоту сцены образца максимального обратного рассеяния сигналов ГНСС, а затем наблюдать отдельные GNS на экране компьютера. Образец ху образ GNSS с правильного выравнивания показан на рисунке 2B.
- Немного изменить высоту сцены образца для проверки концентричности фокуса. Если это не концентрические, регулировки пучка с двумя зеркалами в передней части сканера до центра GNS остается в том же положении, а высота ступени выборки изменяется. Убедитесь, что XZ образ PSF похож на рис 2Счтобы обеспечить правильное выравнивание луча. Процесс эти два изображения с низким проход и гауссовских гладких фильтров.
3. Характеристика рассеяния нелинейности
- В низкой интенсивностью возбуждения (менее 10 4 Вт / см 2), получить изображение наночастиц золота, следуя протоколу 2.6.
- Откройте изображение в ImageJ (или любое другое программное обеспечение для анализа изображений). Нарисуйте линию поперек одной из ГНСС в изображении (рис 2B), и использовать анализ -> земля профиль из ImageJ инструментов для извлечения профиля интенсивности рассеяния. Установите профиль выбранного PSF функцией Гаусса:
где у значение считывания ФЭУ, у 0 фоновое значение (если таковые имеются), А максимальная амплитуда, ш ширина х равен от пространственной координаты, а х С является центром coordinatе гауссовой функции. Полувысоте соответствующего PSF является (½ln2) ж. Основываясь на числовой апертурой (NA) объектива, теоретическая полуширина конфокальной PSF может быть оценена приблизительно в 0.43l / Н.А., где л длина волны возбуждения. Сравните эти два числа, чтобы проверить выравнивание системы формирования изображения. - Увеличение интенсивности возбуждения, вручную изменив нейтральной плотности (ND) фильтр на рисунке 2А, и записывать обратного рассеяния изображения на каждом уровне интенсивности. Возьмите значение сигнала рассеяния от центра каждого GNS на разных уровнях возбуждения, и кривую рассеяния сигналов в сравнении интенсивностей возбуждения. Проверьте линейность первых пунктов, которые должны обладать линейную зависимость, когда интенсивность возбуждения адекватно низкой. Нарисуйте линию на основе линейной арматуры из первых пунктов. Если интенсивность рассеяния последующих пунктов упасть ниже этого линейного тренда saturatioп произошло.
- После наблюдения насыщающегося рассеяние, постепенно уменьшить интенсивность ниже порога насыщения, и то же самое изображение GNSS раз, чтобы обеспечить обратимость нелинейных поведения.
4. Измерение спектра рассеяния Единого Gold Nanosphere
- Для измерения обратного рассеяния спектр от одного GNS, использовать супер-континуум лазера в качестве источника лазерного излучения. Начальное длины волны лазера, в диапазоне от 450 нм до 1750 нм. Чтобы удалить избыток мощность инфракрасного излучения, что может привести к повреждению образца и оптических компонентов, разместить один или два зеркала сразу после супер-континуума лазера для отражения видимого света, а также использовать ловушках для сбора избыточного инфракрасного света.
- Выполните процедуры, выравнивания в разделе 2, чтобы направить супер-лазер континуум в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Использовать широкополосный 50/50 BS для обеспечения спектральный диапазон по всей видимой области.
- ПриобрестиОбраз ГНСС на стекле. Найдите одиночные GNS в изображении, и зафиксировать фокус широкополосного света, падающего на частицу.
- Используйте листать зеркало перед ФЭУ, чтобы направить сигнал обратного рассеяния в направлении спектрометра, который оборудован с зарядовой связью, а затем принять спектр выбранных одиночных GNS. Будьте осторожны, что спектр здесь представляет собой смесь ГНС рассеяния и фона из-за отражений от других поверхностей.
- Вернитесь к детектору ФЭУ, и сделать еще один снимок, чтобы подтвердить, что позиция частицы не изменилась. Затем перенести центр в точке, в которой частица не присутствует. Переключитесь на спектрометре, а сделать еще один спектр, который представляет фон.
- Вычтите фоновый спектр с шагом 4,5 из спектра, начиная с шага 4.4 для получения четкого обратного рассеяния спектр одного GNS.
5. Выравнивание SAX микроскоп
- См Рисунок 3для схемы SAX микроскопом, где идеально синусоидальной временной модуляции получается из частоты биений между двумя акустооптических модуляторов (АОМ). Во-первых, регулировать размер луча лазера, чтобы удовлетворить требование последующих АОМ. Сплит 532 нм лазерный свет на два луча с помощью разветвителя 50/50 луча.
- Руководство двух пучков через два АОМ, с одним пучок, проходящий через каждую АОМ. Модулирующие частоты двух АОМ должны быть разными. Например, один может быть в 40.000 МГц, а другой на 40.010 МГц, что дает разностную частоту 10 кГц. Эта разница частоты будет фундаментальная частота модуляции F м для SAX сигналов.
- Возьмите первого порядка дифракционных пучков с обеих АОМ, и объединить два луча с помощью другой сплиттер 50/50 луча. Отрегулируйте зеркала после АОМ коллимировать двух пучков.
- Добавить фотодетектор, который подключен к осциллографу для наблюдения за временной modulatioп. Сплит небольшую часть лазера с предметном стекле, и отправить его на фотодетектор, как показано на рисунке 3. При правильном модуляции и пучка перекрытия, наблюдать синусоидальную модуляцию интенсивности на основной частоте F M, аналогично сигнала, показанного на рисунке 4.
Примечание: Фон модуляции должна быть как можно более низкой, чтобы обеспечить максимальную глубину модуляции. Кроме того, используйте функцию Фурье анализа осциллографа проверить, что гармонические искажения модуляции уменьшается. Для достижения успешного осуществления SAX, обеспечивают идеальную синусоидальную модуляцию интенсивности возбуждения при минимальной начальной нелинейности. - Отключите электрический выход фотоприемника с осциллографа и подключиться к опорному входу усилителя замком в.
- Как показано на рисунке 3, совместите луч лазера в конфокальной системе следующую предыдущих протоколов. ЧАСпрежде чем подключить электрический выход ФЭУ к усилителю блокировки в качестве входного сигнала.
- Используйте пустой покровного стекла в качестве образца, и проверить линейность электрической системы обнаружения, постепенно увеличивая мощность возбуждения ,, как показано на рисунке 5, где детектор линейной ниже значения считывания 1-V. Во всех последующих измерений, заботиться, чтобы сдерживать считывания ниже этой величины.
- Установите выход усилителя блокировки для экспорта абсолютную величину сигнала напряжения. Изменяя настройки гармонической составляющей в опорном канале, получить амплитуд сигналов, SAX A 1, A 2, и так далее.
- Экспорт линейных и нелинейных сигналов от усилителя блокировки, чтобы карты сбора данных, который также принимает сигналы напряжения возбуждения растрового сканирования гальваника зеркал. С помощью настроенной программы LabVIEW, синхронизировать сигналы усилителя блокировки в агальвано- зеркал для формирования изображения.
- Для оптимизации соотношения сигнал-шум на изображениях, выберите соответственно приобретение пикселей и времени интеграции усилителя блокировки в. Например, когда главный частота модуляции F M возбуждения 10 кГц, то есть, когда период 100 мкс, установить время интеграции замка-усилителем, по крайней мере в три раза дольше, чем период. Добавление времени движения гальваника зеркало, скорость сбора устанавливается на 1500 пикселей в секунду в режиме изображения SAX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 6 показывает измеренный спектр от 80 нм GNS. Расчетное кривая на основе теории Ми дается в том же участке, показывая отличную соглашение. Пик LSPR около 580 нм. В следующем эксперименте, длина волны лазера 532 нм, который был выбран, поскольку он расположен внутри плазмонного группы, чтобы повысить оптическую рассеяние с плазмонного эффекта и позволяют насыщенность 21 рассеяния.
Рисунок 7 представляет рассеяния изображения одного золота наночастицы при различных интенсивностях возбуждения, и нижний ряд обеспечивает профиль линии каждой частицы, чтобы подчеркнуть нелинейность. Размер изображения 600 нм × 600 нм, а размер пикселя 13,8 нм. Скорость приобретение было 234,000 пикселей в секунду в нормальном режиме ху изображения. Каждое изображение было усреднено в течение пяти приобретения для усиления сигнала к шуму.
Когда интенсивность возбуждения ниже, чем1.5 × 10 6 Вт / см 2, рассеяние линейно зависит от интенсивности возбуждения, так что в результате изображение одиночной наночастицы напоминает PSF пучка возбуждения, со стандартным гауссовым профилем. Тем не менее, при увеличении интенсивности возбуждения в 1,7 × 10 6 Вт / см 2, не только четкого выравнивания в верхней части PSF наблюдается, но также расширение в FWHM, указывая насыщение. Очень интересно, при слегка более высокой интенсивности, центральный интенсивность становится ниже, чем периферийная, в результате чего в форме пончика PSF. Затем, как интенсивность возбуждения продолжает расти, интенсивность рассеяния вновь возрастает, открывая обратный насыщенность и в результате нового пика в центре PSF.
Построив центральных интенсивностей PSFs на разных уровнях возбуждения, зависимость интенсивность рассеяния получается, как показано точками на рисунке 8. Эта кривая clearlу раскрывает тенденции насыщения и обратных поведения насыщения. Как и ожидалось, это выглядит очень похоже на зависимость интенсивности нелинейного поглощения 15-17. После типичного метода анализа нелинейного поглощения, полиномиальная функция используется, чтобы соответствовать нелинейный результат рассеяния. Тем не менее, отличается от большинства нелинейных исследований поглощения, в котором третьего порядка нелинейности достаточно, чтобы моделировать результаты, вот пятого порядка нелинейности требуется, чтобы лучше соответствовать кривой рассеяния.
Как упоминалось в разделе 5, гармонические частотные составляющие могут быть экспериментально экстрагировали усилитель блокировки в, и результаты приведены на рисунке 9А. С другой стороны, гармонические составляющие можно вычислить из рис 8. Во-первых, использовать полиномиальное функцию, где я есть интенсивность возбуждения, чтобы соответствовать рис 8, таким образом, мы имеем подходящие параметры α, β, γ .... Мы можем затем выразить Intens возбужденияность как временно модулированного функции я (т) = I 0 (1 + соз (2 πf м т)) / 2, где Т время, е м частота модуляции, и я 0 Максимальная интенсивность возбуждения. Подставляя (Т) в S (I), и сделать преобразование Фурье для преобразования полученного S (Я (т)) в частотной области, мы следующее уравнение состоит из нескольких функций дельта ():
Коэффициент каждой дельта-функции (А 0, А 1, А 2, и т.д.) представляет собой амплитуду сигнала SAX на соответствующей частоте гармоники. Эти коэффициенты, которые соответствуют SAX Signaл сильные в различных гармоник, можно записать в виде функций подгоночных параметров А, В, γ ...:
Результаты расчета показаны на рис 9В. Экспериментальные и расчетные участки согласен тесно, особенно в следующих двух аспектах.
Во-первых, кривые 2 F м и 3 F M не являются гладкими, показывая провалы в определенных интенсивности вдоль кривых. На обоих рисунках, есть три провалы в кривых м 2 F, в то время как два провала видны в кривых м 3 ф. Во-вторых, склоны отличаются с различной интенсивностью возбуждения. Когда интенсивность возбуждения не является высокой, склоны 1 F M 2 F M, и 3 F M 1, 2, 3 и, соответственно. Тем не менее, после каждого погружения, склоны соответствующих нелинейных кривых становится больше.
С провалов и вариаций наклона, нетрадиционные НПФ ожидается, если нелинейные компоненты экстрагируют с помощью техники SAX, когда интенсивность возбуждения увеличивает через провалы. 10А показывает примеры SAX изображения на 1 F M, 2 F м и 3 Компоненты м частота F при различных интенсивностях возбуждения. В первом ряду, интенсивность возбуждения 0,7 мВт / см 2, что является достаточным, чтобы вызвать нелинейные компоненты, но амплитуда является относительно слабым. На этом уровне интенсивности, наклон м сигнала 2 F 2, и это 3 для м сигнала 3 F, как показано на фиг.9А. Если интенсивность возбуждения возрастает до уровня первого провала в м 2 сигнала F, саксофон изображения 2F M сигнал становится пончик формы, как показано во втором ряду на фиг.10А. Оба 1 F M и 3 F M изображения остаются твердыми, а полуширина 3 F M PSF значительно меньше, чем в м сигнала 1 F, проявляя удивительную повышение разрешения. Из профиля сигнала на крайней правой панели в той же строке, полуширина 2 F м пончик кольца составляет около 110 нм. С другой стороны, третий ряд фиг.10А показывает, что при интенсивности возбуждения возрастает до первого провала на м 3 F сигнала, только м е изображение становится 3 пончика формы, с 65 нм шириной кольцевой. В этой интенсивности, замечательный увеличения разрешения находится при сравнении м сигнал 2 F к 1 F M одном.
Цифры 10В и 10С показывают расчетную PSФС 2 F M и F 3 м сигналов, соответственно, на соответствующих интенсивностей, в результате которых пончик форм. Расчеты были основаны на полиномиальной аппроксимации кривой на рис 9В. Расчетные кривые хорошо воспроизводят особенности экспериментальных PSFs в правых панелей на рисунке 10А, подтверждающие снова пригодности пятого порядка полиномом для нелинейного рассеяния.
Рисунок 1. СЭМ-изображение GNSS. При выполнении процессов подготовки, описанные в первой части протокола, достаточно отделены наблюдаются GNSS. С более чем 100 нм между GNSS, их влияние LSPR не связаны друг с другом. Масштабная линейка:. 100 нм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотретьувеличенная версия этой фигуры.
Рисунок 2. (А) Настройка домашней сборки конфокальной микроскопии 24. (B), ху изображение с ГНСС фокусе. 2 (с):. XZ образ PSF с правильного выравнивания Есть два лазерных источников для этой системы. Одним из них является нм лазер 532 непрерывного излучения, а другой представляет собой импульсный лазер супер-континуума. При измерении сигналов рассеяния, непрерывного излучения лазера на 532 нм использовали в качестве источника и ФЭУ в качестве детектора (с фильтром лазера линии установлена). Для измерения спектра, супер-лазер континуум был принят в качестве источника лазерного излучения и спектрометра в качестве детектора. Выбранный лазера направляется через набор фильтров нейтральной плотности для контроля интенсивности возбуждения. 50/50 светоделитель направляет лазер в сканирующем микроскопе и позволяет половину сигналами обратной рассеяния вЛС Т или спектрометр, который выбран с помощью листать зеркало. В сканирующей системы, существует два Galvano зеркал, которые образуют вертикальную и горизонтальную растрового сканирования в фокальной плоскости объектива. Обратного рассеяния собирают той же целью и преобразуется в электрические сигналы детекторами. Сигналы синхронизации с конфокальной сканирующей системы для формирования изображений. Этап П. был использован для приобретения хг изображение, перемещая ГНСС оси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Установка по SAX микроскопии. Большинство компонентов такие же, как те, полученный из конфокальной микроскопии (красный прямоугольник), но синусоидальной модуляции был добавлен в возбуждающего лазерного луча. Синий прямоугольник показывает ModulНастройка АТОР. Во-первых, лазерное возбуждение был разделен на два пучка, и отдельно отправляется через два АОМ производить высокочастотные модуляции со слегка различными частотами. Тогда, два модулированные пучки были объединены, чтобы произвести синусоидальную модуляцию на частоте биений между двумя АОМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. модуляции комбинированных балок после АОМ измеренных осциллографа. Y1 и Y2 указывают максимум (52,1 МВт) и минимум (1.2 мВт) значения интенсивности модуляции, соответственно. У2 должен быть равен нулю, чтобы достичь идеального модуляции. Текущая частота модуляции 10 кГц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большоеR версии этой фигуры.
Рисунок 5. Линейность тест системы обнаружения. Размещая покровного стекла на фокальной плоскости, отражение лазерного возбуждения от границы стекло / воздух используется для проверки линейности системы обнаружения. Выходной сигнал по сравнению с интенсивностью возбуждения показывает линейность ниже значения считывания 1-V. Кроме того, уровень шума значительно ниже 10 -4 V, так что система обеспечивает динамический диапазон не менее 10 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Спектр рассеяния 80-нм GNS. Красные точки указывают experimИзмерения СИХИЧЕСКОЕ, и черная линия представляет расчет из теории Ми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. рассеяния изображения GNS из линейных отменить насыщенность. Верхний ряд показывает обратного рассеяния изображения, и нижняя строка дает сигнал профили выбранного наночастицы при различных интенсивностях возбуждения. Переход от линейности к насыщению отменить насыщения четко наблюдается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8. Интенсивность рассеянияпо сравнению с интенсивностью возбуждения от одиночных GNS. Синие точки соответствуют рассеянию интенсивности в центре PSF при различной интенсивности возбуждения, показывая очень нелинейные ответов, в том числе и насыщения обратного насыщения. Красный Кривая показывает подходящую кривую, основанную на полиномиальной функции пятого порядка. (Изображения воспроизводятся из работы. 25). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9. Интенсивность зависимости SAX сигналов в соответствии с (А) эксперимента и (б) расчет. (A) SAX сигналы были извлечены синхронный усилитель, и каждый экспериментальные данные указывают усредняли четыре 80 нм GNSS. Пунктирные линии показывают склоны SAX сигналов 25. (Б) в соответствии с протоколом 5, SAX сибыли рассчитаны на основе gnals пятого порядка аппроксимации в рисунке 8. (Изображения воспроизводятся из работы. 25) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10. SAX изображения на различных уровнях возбуждения. (А) Экспериментально наблюдалось 1 F M, 2 F м, и 3 F м SAX изображения на различных уровнях возбуждения. Размер пикселя составляет 20 нм, и каждый размер изображения 750 × 750 нм нм. Интенсивность профили пончики на 2 F м и 3 F M приведены на правых панелях. (В), рассчитанный профиль изображения 2 F M изображения на 0,75 МВт / см 2. (С) Расчетное изображение профиля из 3 е </ EM> м изображение в 1.1 МВт / см 2. (Изображения воспроизводятся из работы. 25). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В протоколе, есть несколько важных шагов. Во-первых, при изготовлении образцов, плотность наночастиц не должна быть слишком высокой, чтобы избежать плазмонных сцепление между частицами. Если два или более частицы очень близко друг к другу, результаты связи в длине волны сдвига LSPR в длинноволновую сторону, таким образом, значительно уменьшая нелинейность. Тем не менее, этот метод визуализации на самом деле отображает распределение плазмонных мод, а не самих частиц. Таким образом, можно ожидать, что при соответствующем длине волны возбуждения, спаренные плазмонных режимы могут также показывать сильную нелинейность рассеяния и могут быть отображены с улучшенным разрешением. Во-вторых, это очень важно для получения чистого синусоидальную модуляцию в пучке возбуждения, таким образом, движущей использование биений между двумя АОМ. С улучшения разрешения полагается на извлечение нелинейных частей (гармонические частотные составляющие) модуляции сигнала рассеяния, если нелинейнаяИскажение присутствует в модуляции возбуждения, затем экстрагируют будет сложнее. Кроме того, в существующей схеме, операции установки интерферометр используется для получения биение модуляции, так что выравнивание двух пучков в интерферометре также имеет важное значение для достижения такого размера, из глубины модуляции, насколько это возможно. В-третьих, очень важно, чтобы убедиться, что сигнал нелинейность возникает не от системы обнаружения (который включает в себя детектор, усилитель, A / D конвертер и компьютер I / O). Поэтому особое внимание необходимо гарантировать, что система обнаружения работает в пределах динамического диапазона. Динамический диапазон определяется как область системы обнаружения линейности, то есть, от уровня шума с насыщением детектора. В данном случае, значение сигнала напряжения является линейной ниже 1 В, а уровень шума не превышает 10 -4 В. Таким образом, система обеспечивает динамический диапазон по меньшей мере 10 4. Чтобы гарантировать, что сигнал исходит от нелинейностизолото само по себе наночастицы, а не от системы обнаружения, необходимо поддерживать значение считывания в пределах динамического диапазона. Четвертый важным фактором является механическая стабильность образца. В нелинейности характеристики, очень важно, чтобы наночастицы остаются в том же фокальной плоскости. Осевая дрейф наночастицы или стадии образца может серьезно повлиять на точность оценки нелинейности. Таким образом, при работе с наночастицами, важно, чтобы найти частицы, которые не легко перемещать вокруг под возбуждении светом. С другой стороны, это также можно работать с образцами выращенных из литографии. В этом случае микроскопическое стабильность этап является основным ограничивающим фактором. Есть этапы с управлением обратной связи по положению, которые могут значительно повысить стабильность. Кроме того, поскольку движение стадии, как правило, очень медленно (например, 1 мкм в течение 10 мин), было бы полезно, чтобы приобрести 3D стека изображений XYZ, например 10 изображений с 100 нм в осевом separatioп между соседними изображениями, в каждой отдельной значения интенсивности. Затем на этапе анализа, самая яркая изображения из каждого стека должен быть выбран в качестве репрезентативного изображения в этой интенсивности.
Не, в принципе, разрешение методов насыщения на основе, в том числе и SAX насыщенный структурно-подсветки микроскопии (SSIM) 26 экспонатов не нижний предел, пока высокого порядка нелинейности (высокие гармонические частотные составляющие) может быть достигнута. Тем не менее, на практике, разрешение ограничено отношением сигнал-шум (SNR), особенно при извлечении более высокого порядка компоненты гармоники демодуляции. Есть несколько стратегий, которые могут улучшить SNR. Например, было показано, что частота модуляции значительно влияет на SNR 27. Кроме того, можно повысить SNR путем вычисления разности между интенсивность ненасыщенных и насыщенных сигналов для извлечения только насыщенный сигнал (рукопись в процессе подготовки).
28-30, илинасыщением флуоресценции 22,26,31. Тем не менее, флуоресценции имеет внутреннюю проблему фото-отбеливание, особенно в сильном световом освещении. Это исследование показало, что насыщаемым рассеяние GNSS является перспективным методом супер-разрешением микроскопии, так как нет ни одного вопроса, отбеливание 21. По сравнению с предыдущими исследованиями SAX микроскопии с использованием флуоресценции, повышение разрешения с насыщающимся рассеяния была значительно выше в данном исследовании, возможно, из-за нелинейности 22 высшего порядка. Кроме того, кроме SAX микроскопии, есть еще один метод супер-разрешения на основе насыщения: SSIM 26. SSIM использует пространственную модуляцию полос для извлечения нелинейных сигналов, в то время как SAX микроскопии используют временную модуляцию. С помощью свойства насыщения этого без отбеливания рассеяния, то, следовательно, ожидается, что это открытие может быть в сочетании с SSIM, чтобы улучшить пространственное разрешение при широком поле жестокогоumination.
В будущих приложений, это плазмонное техника SAX будет полезна не только для решения распределения резонансных режимов и динамику плазмонных цепей, но и для повышения разрешения изображений биологических тканей. Подобно увеличения разрешения была продемонстрирована с другими плазмонных материалов, таких как серебро (не опубликовано), а также не-плазмонных материалов, таких как кремний 32. В области изображения сверхвысокого разрешения, SAX микроскопия имеет преимущества в нескольких отношениях. По сравнению с стохастической оптической микроскопии реконструкции (STORM) и фото-активированный локализации микроскопии (PALM), SAX микроскопия имеет высокую скорость сканирования всего несколько секунд на изображении. По сравнению с обедненной стимулировали выбросов (STED) микроскопии, только один лазер, необходимое для SAX микроскопии, что значительно снижает оптическую сложности. По сравнению с ДНЮС, разрешение SAX одновременно улучшены в обеих боковых и осевых направлениях. В дополнении кдостижения достаточной глубины изображения, случайное рассеяние вдоль пути луча возбуждения или коллекции имеет решающее значение. Для методов широко поле, как буря, PALM, и SSIM, что изображения будут захвачены с камеры, которая является весьма чувствительны к случайным рассеяния, испускаемых фотонов флуоресценции в тканях. Для методов точки сканирования, как STED и SAX, флуоресцентные сигналы собираются с помощью детектора точки, поэтому они более устойчивы к рассеянию ткани. Тем не менее, STED требует фазовой пластинки, чтобы создать профиль пончик пучка в фокусе, и информация о фазе может ухудшиться при распространении пучка в тканях. Поэтому, SAX микроскопии должен быть лучшим среди этих методов для глубоких тканей супер-разрешением изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
References
- Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. Sub-diffraction-limited optical imaging with a silver superlens. Science. 308 (5721), 534-537 (2005).
- Lee, B., Kim, S., Kim, H., Lim, Y. The use of plasmonics in light beaming and focusing. 34 (2), 47-87 (2010).
- Lal, S., Link, S., Halas, N. J. Nano-optics from sensing to waveguiding. Nature Photon. 1 (11), 641-648 (2007).
- Kawata, S., Inouye, Y., Verma, P. Plasmonics for near-field nano-imaging and superlensing. Nature Photon. 3 (7), 388-394 (2009).
- Homola, J., Yee, S. S., Gauglitz, G. Surface plasmon resonance sensors: review. Sensor. Actuat. B-Chem. 54 ((1-2)), 3-15 (1999).
- Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
- Hache, F., Ricard, D., Flytzanis, C. Optical nonlinearities of small metal particles - surface-mediated resonance and quantum size effects. J. Opt. Soc. Am. B. 3 (12), 1647-1655 (1986).
- Balamurugan, B., Maruyama, T. Evidence of an enhanced interband absorption in Au nanoparticles: Size-dependent electronic structure and optical properties. Applied Physics Letters. 87 (14), 143105 (2005).
- Link, S., El-Sayed, M. A. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles. J. Phys. Chem. B. 103 (21), 4212-4217 (1999).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Kauranen, M., Zayats, A. V. Nonlinear plasmonics. Nature Photon. 6 (11), 737-748 (2012).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Au nanoparticles target cancer. Nano Today. 2 (1), 18-29 (2007).
- Wada, O. Femtosecond all-optical devices for ultrafast communication and signal processing. New J. Phys. 6 (183), Forthcoming.
- Elim, H. I., Yang, J., Lee, J. Y., Mi, J., Ji, W. Observation of saturable and reverse-saturable absorption at longitudinal surface plasmon resonance in gold nanorods. Appl. Phys. Lett. 88 (8), 083107 (2006).
- Ros, I., Schiavuta, P., Bello, V., Mattei, G., Bozio, R. Femtosecond nonlinear absorption of gold nanoshells at surface plasmon resonance. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (41), 13692-13698 (2010).
- De Boni, L., Wood, E. L., Toro, C., Hernandez, F. E. Optical Saturable Absorption in Gold Nanoparticles. Plasmonics. 3 (4), 171-176 (2008).
- Gurudas, U., et al. Saturable and reverse saturable absorption in silver nanodots at 532 nm using picosecond laser pulses. J. Appl. Phys. 104 (7), 073107 (2008).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and scattering of light by small particles. , John Wiley & Sons Inc. (1983).
- Chu, S. W., et al. Saturation and reverse saturation of scattering in a single plasmonic nanoparticle. ACS Photon. 1 (1), 32-37 (2014).
- Chu, S. W., et al. Measurement of a saturated emission of optical radiation from gold nanoparticles: application to an ultrahigh resolution microscope. Phys. Rev. Lett. 112 (1), 017402 (2014).
- Fujita, K., Kobayashi, M., Kawano, S., Yamanaka, M., Kawata, S. High-resolution confocal microscopy by saturated excitation of fluorescence. Phys. Rev. Lett. 99 (22), 228105 (2007).
- Smith, K. C. A., Oatley, C. W. The scanning electron microscope and its fields of application. Brit. J.Appl. Phys. 6 (11), (1955).
- Yu, J. Y., et al. A diffraction-limited scanning system providing broad spectral range for laser scanning microscopy. Rev. Sci. Instru. 80 (11), 113704 (2009).
- Lee, H., et al. Point spread function analysis with saturable and reverse saturable scattering. Opt. Express. 22 (21), 26016-26022 (2014).
- Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Yonemaru, Y., Yamanaka, M., Smith, N. I., Kawata, S., Fujita, K. Saturated Excitation Microscopy with Optimized Excitation Modulation. ChemPhysChem. 15 (4), 743-749 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Heintzmann, R., Jovin, T. M., Cremer, C. Saturated patterned excitation microscopy - a concept for optical resolution improvement. J. Opt. Soc. Am. A. 19 (8), 1599-1609 (2002).
- Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity. Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).
