Introduction
L'étude de la plasmonique a suscité un grand intérêt en raison de ses applications dans de nombreux domaines différents 1-4. L'un des domaines les plus étudiés dans la plasmonique est plasmonique de surface, dans lequel l'oscillation collective des électrons de conduction couples avec une onde électromagnétique externe à une interface entre un métal et diélectrique. Plasmonique de surface a été exploré pour ses applications potentielles dans Subwavelength optique, la biophotonique, la microscopie et 5,6. L'amélioration forte de champ dans le volume ultra-faible de nanoparticules métalliques en raison de localisée résonance plasmonique de surface (LSPR) a attiré une grande attention, non seulement en raison de sa sensibilité exceptionnelle à des tailles de particules, des formes de particules, et les propriétés diélectriques du milieu environnant 7 -10, mais aussi en raison de sa capacité à stimuler intrinsèquement faibles effets optiques non linéaires 11. La sensibilité exceptionnelle de LSPR est précieux pour la bio-détection et quasi-FIELes techniques d'imagerie ld 12,13. D'autre part, la non-linéarité améliorée de structures plasmoniques peut être utilisé dans des circuits intégrés photoniques dans des applications telles que la commutation optique et tout-optique de traitement de signal 14,15. Il est bien connu que l'absorption plasmonique est linéairement proportionnelle à l'intensité d'excitation à un niveau de faible intensité. Lorsque l'excitation est assez forte, l'absorption devient saturé. Curieusement, à des intensités plus élevées, l'absorption augmente à nouveau. Ces effets non linéaires sont appelés absorption saturable (SA) 15-17 et arrière absorption saturable (RSA) 18, respectivement.
Il est connu qu'en raison de la LSPR, la diffusion est particulièrement forte dans les structures plasmoniques. Basé sur l'électromagnétisme fondamentaux, la réponse de diffusion par rapport à l'intensité de l'incident doit être linéaire. Cependant, dans des nanoparticules, diffusion et l'absorption sont étroitement liés par la théorie de Mie, et les deux peuvent être expressed en termes de parties réelle et imaginaire de la constante diélectrique. Dans l'hypothèse où un seul GNS se comporte comme un dipôle sous illumination de lumière, le coefficient de diffusion (Q SCA) et coefficient d'absorption (Q abs) à partir d'une unique nanoparticule plasmonique en fonction de la théorie de Mie peuvent être exprimées comme 19
où x est 2 πa / λ, a est le rayon de la sphère, et m 2 est ε m / ε d. Ici, ε et ε m d correspondent aux constantes diélectriques du métal et des diélectriques environnantes, respectivement. Etant donné que la forme du coefficient de diffusion est similaire à celle de thcoefficient d'absorption de e, il est donc prévu d'observer la diffusion saturable en une seule nanoparticule plasmonique 20.
Récemment, la diffusion saturable non linéaire dans une particule plasmonique isolé a été démontrée pour la première fois 21. Il est remarquable que, à saturation de profondeur, l'intensité de diffusion en fait légèrement diminué lorsque l'intensité d'excitation augmente. Encore plus remarquable, lorsque l'intensité d'excitation continué à augmenter après la diffusion est saturé, l'intensité de diffusion a de nouveau augmenté, montrant l'effet de la diffusion inverse saturable 20. En longueur d'onde et les études de taille-dépendante ont montré une forte relation entre LSPR et non linéaire de diffusion 21. Les dépendances d'intensité et de longueur d'onde de la diffusion plasmonique sont très semblables à ceux de l'absorption, ce qui suggère un mécanisme commun qui sous-tend ces comportements non linéaires.
En termes d'applications, il est bien knoWN que la non-linéarité contribue à améliorer la résolution de la microscopie optique. En 2007, saturé excitation (SAX) microscopie a été proposé, ce qui peut améliorer la résolution en extrayant le signal saturé via une modulation sinusoïdale temporelle du faisceau d'excitation 22. Microscopie SAX est basée sur le concept selon lequel, pour un foyer de laser, l'intensité est plus forte au centre qu'à la périphérie. Si le signal (soit fluorescence ou diffusion) présente un comportement de saturation, la saturation doit commencer à partir du centre, tandis que la réponse linéaire reste à la périphérie. Par conséquent, si il existe un procédé pour extraire uniquement la partie saturée, on laisse seulement la partie centrale tout en rejetant la partie périphérique, améliorant ainsi efficacement la résolution spatiale. En principe, il n'y a pas de limite inférieure de la résolution en microscopie SAX, aussi longtemps que la saturation est atteinte profonde et il n'y a pas de dégâts de l'échantillon en raison de l'éclairage intense.
Il a été démontré que la resolution de l'imagerie par fluorescence peut être considérablement améliorée en utilisant la technique de SAX. Cependant, la fluorescence souffre de l'effet de photoblanchiment. La combinaison de la découverte de la non-linéarité de diffusion et le concept de SAX, la microscopie de super-résolution basée sur la diffusion peut être réalisée 21. Par rapport aux microscopies classiques de super-résolution, sur la base de la technique de diffusion-fournit un procédé de contraste non blanchiment roman. Dans cet article, une description étape par étape est donnée de décrire les procédures nécessaires pour obtenir et extraire la non-linéarité de la diffusion plasmonique. Méthodes d'identification des non-linéarités introduites par diffusion changeant l'intensité incidente sont décrites. Plus de détails seront fournis à démêler comment ces non-linéarités affectent images de nanoparticules simples et comment résolution spatiale peuvent être améliorées en conséquence par la technique de SAX.
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Protocol
1. GNS de préparation d'échantillons
- Avant de préparer l'échantillon, sonication 1 ml GNS solution colloïdale pendant au moins 15 min à environ 40 kHz pour empêcher l'agrégation des particules, qui peut provoquer le pic LSPR de changer.
- Déposez 100-200 pi de GNS colloïde sur une lame de verre avec commerciale silicate de magnésium aluminium (MAS) pour fixer le revêtement GNSS.
- Après au moins 1 min, retirez le colloïde supplémentaire par rinçage avec de l'eau distillée. Le temps d'attente dépend de la densité de distribution requise du GNSS. Typiquement, les résultats de 1-3 min dans une densité appropriée qui permet aux particules d'être facilement identifiées puisque la plupart d'entre eux sont isolés les uns des autres. Agrégation significative peut se produire si le temps d'attente est trop long.
- Sécher l'échantillon en le purgeant avec de l'azote gazeux.
- (Facultatif) Pour la carte du GNSS sur la vitre avec une haute résolution, effectuer la microscopie électronique à balayage (MEB) à ce stade 23. Une image d'exemple est fourni dans Figure 1, montrant la densité caractéristique du GNSS. Utiliser une émission de champ MEB d'acquérir l'image. Une fois que l'huile est ajoutée à l'échantillon (étape suivante), il sera difficile d'enlever l'huile et à observer l'échantillon par SEM.
- Ajouter une goutte d'huile avec le même indice de réfraction sur l'échantillon pour couvrir le GNSS et à éliminer la forte réflexion à partir du substrat de verre.
- Placez un couvercle en verre sur le dessus de l'échantillon et le sceller avec du vernis à ongles.
- Attendez au moins 5 min jusqu'à ce que le vernis à ongles sèche. L'échantillon est maintenant prêt.
2. Alignement du microscope confocal maison construite
- Voir Figure 2 pour le schéma de l'installation. Aligner le blanc trajet d'illumination de la lumière du corps de microscope lui-même. Allumez la source de lumière halogène du microscope, et suivre le manuel du fabricant de microscope pour obtenir la condition d'éclairage Köhler. Veiller à ce que les blancs faisceaux de lumière halogène sont à peu près parallèle à l'arrière deouverture de l'objectif, partiellement réfléchie par le diviseur de faisceau 50/50, puis se propage vers le laser.
- Allumez les miroirs de galvanoplastie à veiller à ce qu'ils restent dans la position initiale correcte, qui est, au centre de la plage de balayage.
- Placez au moins deux cibles, faites par une mince feuille de papier avec des anneaux concentriques sur elle, le long du chemin de lumière halogène, et les aligner avec le faisceau d'halogène.
- Pour effectuer l'imagerie, sélectionnez le laser de 532 nm. Pour effectuer des mesures de spectroscopie, sélectionnez le laser super-continuum. Au cours de l'alignement, la puissance des lasers doit être inférieure à 10 mW à l'ouverture arrière de l'objectif d'éviter la non-linéarité. Ensuite, collimater le faisceau laser incident opposé au faisceau sortant d'halogène à l'aide des deux cibles. Lorsque ce processus est terminé, l'alignement grossier du faisceau laser a été atteint.
- Aligner le faisceau laser à travers le centre de l'ouverture arrière de la lentille d'objectif. Typiquement, utiliser un oiobjectif l-immersion. Ajouter une goutte d'huile entre l'huile d'immersion objectif et l'échantillon GNS. Utilisez un tube photomultiplicateur (PMT) que le détecteur de recueillir les signaux de diffusion du GNSS.
- Placez un sténopé de 20 um de diamètre à l'avant de la PMT pour bloquer out-of-focus signaux de diffusion. Tourner sur les miroirs de galvanoplastie et PMT (via le logiciel maison construite), ajuster la position sténopé et la hauteur de la scène de l'échantillon afin de maximiser les signaux de rétrodiffusion du GNSS, puis observer une GNS individuels sur un écran d'ordinateur. Un exemple d'image xy du GNSS avec un alignement correct est montré dans la figure 2B.
- Modifiez légèrement la hauteur de la scène de l'échantillon pour vérifier la concentricité de la mise au point. Dans le cas contraire concentrique, ajuster le faisceau avec les deux miroirs en avant du scanner jusqu'à ce que le centre du GNS reste à la même position tandis que la hauteur de la platine porte-échantillon est changé. Assurez-vous que l'image de XZ de la PSF est similaire à la figure 2Cpour assurer l'alignement du faisceau correcte. Traiter ces deux images avec passe-bas et filtres lisses gaussiennes.
3. Caractérisation de la diffusion non-linéarité
- A faible intensité d'excitation (moins de 10 4 W / cm 2), acquérir une image de nanoparticules d'or en suivant le protocole 2.6.
- Ouvrez l'image dans ImageJ (ou tout autre logiciel d'analyse d'image). Tracez une ligne sur l'un des GNSS dans l'image (voir la figure 2B), et utiliser l'analyse -> profil du terrain des outils de ImageJ pour récupérer le profil d'intensité de diffusion. Monter le profil de la PSF choisi par une fonction gaussienne:
où y est la valeur de lecture de PMT, y 0 est la valeur de fond (le cas échéant), A est l'amplitude de crête, w est la largeur, x est la coordonnée spatiale, et x c est le centre Coordonnateure de la fonction gaussienne. Le FWHM de la PSF correspondante est (½ln2) w. Sur la base de l'ouverture numérique (NA) de l'objectif, la FWHM théorique de la PSF confocal peut être estimée à environ 0.43l / NA, où l est la longueur d'onde d'excitation. Comparez ces deux numéros pour vérifier l'alignement du système d'imagerie. - Augmenter l'intensité d'excitation en modifiant manuellement le filtre à densité neutre (ND) sur la figure 2A, et d'enregistrer les images de rétrodiffusion à chaque niveau d'intensité. Prendre la valeur du signal de diffusion du centre de chaque GNS à différentes intensités d'excitation, et de tracer la courbe de diffusion des signaux par rapport aux intensités d'excitation. Vérifier la linéarité des premiers points qui doivent présenter une relation linéaire lorsque l'intensité d'excitation est suffisamment faible. Tracez une ligne sur la base de montage linéaire des quelques premiers points. Si les intensités de diffusion des points suivants tombent en dessous de cette tendance linéaire, saturation est produite.
- Après avoir observé la diffusion saturable, diminuer progressivement l'intensité en dessous du seuil de saturation, et l'image de la même GNSS à nouveau pour assurer la réversibilité des comportements non linéaires.
4. Mesure de la diffusion d'un spectre d'un simple Or Nanosphere
- Pour mesurer le spectre de rétrodiffusion partir d'un seul GNS, utiliser le laser super-continuum que la source laser. La longueur d'onde initial du laser est comprise entre 450 nm et 1750 nm. Pour supprimer la puissance infrarouge excès qui pourraient causer des dommages à l'échantillon et les composants optiques, placer un ou deux miroirs juste après le laser super-continuum pour réfléchir la lumière visible, et utiliser faisceau décharges pour recueillir l'excès de lumière infrarouge.
- Suivez les procédures d'alignement de la section 2 pour diriger le laser super-continuum dans le microscope à balayage laser confocal. Utilisez une large bande 50/50 BS pour assurer une couverture spectrale sur toute la gamme visible.
- Acquérir uneimage des GNSS sur verre. Repérer un seul GNS dans l'image, et de fixer la mise au point de l'incident à large bande de lumière sur la particule.
- Utilisez un miroir de retournement en face de la PMT pour diriger le signal de rétrodiffusion vers le spectromètre, qui est équipé d'un dispositif à couplage de charge, et ensuite prendre un spectre des GNS simples sélectionnés. Veillez à ce que le spectre est ici un mélange de GNS diffusion et de fond dû à des réflexions d'autres surfaces.
- Revenez au détecteur de PMT, et de prendre une autre image pour confirmer que la position des particules n'a pas changé. Ensuite, déplacer le focus à un point où aucune particule est présente. Revenez au spectromètre, et de prendre un spectre plus large, qui représente l'arrière-plan.
- Soustraire le spectre de l'étape 4.5 de fond à partir du spectre de l'étape 4.4 pour obtenir un spectre de rétrodiffusion clairement d'une seule GNS.
5. Alignement de Microscope SAX
- Voir la Figure 3pour le régime du microscope SAX, où une modulation temporelle sinusoïdale idéale est obtenue à partir de la fréquence de battement entre deux modulateurs acousto-optiques (AOM). Tout d'abord, régler la taille du faisceau du laser pour répondre à l'exigence des AOM ultérieures. Diviser la lumière laser 532 nm en deux faisceaux à l'aide d'un diviseur de faisceau 50/50.
- Guider les deux faisceaux à travers les deux AOM, avec un faisceau traversant chaque AOM. Les fréquences de modulation des deux AOM doivent être différents. Par exemple, on peut être à 40,000 MHz et l'autre à 40,010 MHz, ce qui donne une différence de fréquence de 10 kHz. Cette fréquence de différence fondamentale sera la fréquence de modulation f m pour les signaux de SAX.
- Prenez le premier ordre des deux faisceaux diffractés AOM, et de combiner les deux faisceaux en utilisant un autre diviseur de faisceau 50/50. Réglez les rétroviseurs après les AOM pour collimater les deux faisceaux.
- Ajouter un photodétecteur qui est relié à un oscilloscope pour surveiller la temporel modulation. Diviser une petite partie du laser avec une lame de verre, et de l'envoyer vers le photodétecteur, comme représenté sur la figure 3. Avec modulation correcte et le chevauchement de faisceau, observer la modulation d'intensité sinusoïdale à la fréquence principale f m, similaire à celle de la forme d'onde montrée la figure 4.
Remarque: Le fond de la modulation doit être aussi faible que possible pour atteindre la profondeur de modulation maximale. En outre, utiliser la fonction de l'analyse de Fourier de l'oscilloscope pour vérifier que la distorsion harmonique de la modulation diminue. Pour réaliser la mise en œuvre de SAX succès, d'assurer une modulation de l'intensité d'excitation sinusoïdale parfaite avec non-linéarité initial minimisé. - Déconnecter la sortie électrique du photodétecteur de l'oscilloscope et connecter à l'entrée d'un amplificateur lock-in référence.
- Comme le montre la Figure 3, aligner le faisceau laser dans le système confocal suivant les protocoles précédents. Havant, connecter la sortie électrique du PMT à l'amplificateur lock-in que l'entrée de signal.
- Utiliser un couvercle en verre blanc comme l'échantillon, et vérifier la linéarité de l'installation de détection électrique en augmentant progressivement la puissance d'excitation ,, comme le montre la Figure 5, où le détecteur linéaire est inférieure à une valeur de lecture de 1-V. Dans toutes les mesures ultérieures, prendre soin de restreindre l'affichage au-dessous de cette valeur.
- Réglez la sortie de l'amplificateur lock-in pour exporter l'amplitude absolue du signal de tension. En changeant la composante harmonique la mise à la voie de référence, obtenir les amplitudes des signaux de Sax, A 1, A 2, et ainsi de suite.
- Export de la linéaires et non linéaires des signaux de l'amplificateur lock-in à une carte d'acquisition de données, qui reçoit également les signaux de tension d'entraînement de miroirs de galvanoplastie de numérisation les raster. A l'aide d'un programme de mesure Labview, synchroniser les signaux de l'amplificateur et le lock-ingalvano miroirs pour former une image.
- Pour optimiser le rapport signal-sur-bruit dans les images, sélectionner de manière appropriée l'acquisition de pixel et des temps d'intégration de l'amplificateur lock-in. Par exemple, lorsque le principal fréquence de modulation f m de l'excitation est de 10 kHz, qui est, quand la période est de 100 microsecondes, régler l'heure de l'intégration de l'amplificateur lock-in pour être au moins trois fois plus longtemps que la période. L'ajout de l'heure du mouvement de miroir galvano, la vitesse d'acquisition est fixée à 1500 pixels par seconde dans le mode d'imagerie SAX.
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Representative Results
La figure 6 montre le spectre mesuré partir d'un GNS 80 nm. Une courbe calculé sur la théorie de Mie est donnée dans la même parcelle, montrant excellent accord. Le pic est de l'ordre LSPR 580 nm. Dans l'expérience suivante, la longueur d'onde du laser était de 532 nm, qui a été choisi car il est situé à l'intérieur de la bande plasmon pour améliorer diffusion optique avec effet plasmonique et de permettre la diffusion de saturation 21.
Figure 7 présente diffusion des images d'une seule nanoparticule d'or à différentes intensités d'excitation, et la rangée du bas fournit le profil de ligne de chaque particule de mettre en évidence la non-linéarité. La taille de l'image est de 600 nm x 600 nm, et la taille du pixel est de 13,8 nm. La vitesse d'acquisition était de 234.000 pixels par seconde en mode d'imagerie xy normale. Chaque image a été en moyenne plus de cinq acquisitions pour améliorer le rapport signal sur bruit.
Lorsque l'intensité d'excitation est inférieure à1,5 × 10 6 W / cm 2, la dispersion est linéairement dépendant de l'intensité d'excitation, de sorte que l'image résultante d'un seul nanoparticule ressemble à la PSF du faisceau d'excitation, avec un profil gaussien standard. Toutefois, lorsque l'excitation intensité augmente à 1,7 × 10 6 W / cm 2, non seulement aplatissement d'avance en tête de la PSF est observé, mais aussi l'élargissement de la FWHM, indiquant la saturation. Très intéressant, légèrement à des intensités plus élevées, l'intensité central devient inférieure à la périphérique, résultant en une PSF en forme de beignet. Puis, comme l'intensité de l'excitation continue à augmenter, la intensité de diffusion augmente à nouveau, révélant saturation inverse et aboutissant à un nouveau sommet dans le centre de la PSF.
En traçant les intensités centraux des PSF à différentes intensités d'excitation, la dépendance à l'intensité de diffusion est obtenu, comme indiqué par les points sur la figure 8. Cette courbe clearly révèle les tendances de saturation et de comportements de saturation inverse. Comme prévu, il est très similaire à la dépendance de l'intensité d'absorption de 15 à 17 non linéaire. Suite à la méthode typique de l'analyse de l'absorption non linéaire, une fonction polynomiale a été utilisé pour ajuster le résultat de diffusion non linéaire. Cependant, différent de la plupart des études d'absorption non linéaires, dans lequel troisième ordre non-linéarité est suffisante pour modéliser les résultats, voici cinquième ordre non-linéarité était nécessaire pour mieux répondre à la courbe de diffusion.
Comme mentionné dans la section 5, les composantes de fréquence harmoniques peuvent être extraites expérimentalement par un amplificateur lock-in, et les résultats sont donnés sur la figure 9A. D'autre part, les composantes harmoniques peuvent être calculées à partir de la figure 8. Tout d'abord, utiliser une fonction polynomiale, où I est l'intensité d'excitation, pour adapter Figure 8, nous avons donc les paramètres d'ajustement α, β, γ .... Nous pouvons puis exprimer les intens d'excitationlité en fonction temporellement modulé I (t) = I 0 (1 + cos (2 πf m t)) / 2, où t est le temps, f m est la fréquence de modulation, et I 0 est l'intensité d'excitation maximale. En substituant I (t) dans S (I), et de faire une transformée de Fourier pour convertir la résultante S (I (t)) dans le domaine des fréquences, nous avons l'équation suivante composée de multiples fonctions de delta (A):
Le coefficient de chaque fonction delta (A 0, A 1, A 2, etc.) représente l'amplitude du signal de SAX à la fréquence harmonique correspondant. Ces coefficients, qui correspondent à des signa SAXL forces à différentes harmoniques, peuvent être écrites comme des fonctions des paramètres d'ajustement a, ß, γ ...:
Les résultats des calculs sont présentés dans la figure 9B. Les parcelles expérimentales et de calcul conviennent de près, en particulier dans les deux aspects suivants.
Tout d'abord, les courbes de f 2 m et 3 m f ne sont pas lisses, montrant trempettes à des intensités spécifiques sur les courbes. Dans les deux chiffres, il ya trois creux dans les courbes m 2 f, tandis que deux trempettes sont vus dans les courbes 3 m f. Deuxièmement, les pentes sont différentes avec des intensités d'excitation. Lorsque l'intensité d'excitation est pas élevé, les pentes de 1 m f, f 2 m, et f 3 m sont 1, 2, 3 et, respectivement. Cependant, après chaque plongeon, les pentes des courbes non linéaires correspondant deviennent plus grands.
Avec les creux et les variations de la pente, les SP non conventionnelles sont prévues si les composants non linéaires sont extraits par l'intermédiaire de la technique de SAX, lorsque l'intensité d'excitation augmente à travers les creux. La figure 10A montre des exemples d'images de SAX du 1 f M, 2 f m, et 3 f m composantes de fréquence à différentes intensités d'excitation. Dans la première ligne, l'intensité d'excitation est de 0,7 MW / cm 2, ce qui est suffisant pour induire les composants non linéaires, mais l'amplitude est relativement faible. A ce niveau d'intensité, la pente du signal de m 2 f est égal à 2, 3 et il est pour le signal de m 3 f, comme représenté sur la Figure 9A. Si l'intensité d'excitation augmente au niveau de la première baisse du signal de m 2 de f, les images SAX de la 2signal F m devenir en forme de beignet, comme indiqué dans la deuxième rangée de la figure 10A. Les deux f 1 m et 3 m f images restent solides, tandis que la valeur FWHM de la PSF m 3 f est significativement plus petite que celle du signal de m 1 f, manifestant l'amélioration de la résolution remarquable. Du profil de signal sur le panneau de droite de la même ligne, la FWHM de l'anneau m de beigne 2 f est d'environ 110 nm. D'autre part, la troisième rangée de la figure 10A montre que lorsque l'intensité d'excitation augmente au premier plongeon du signal de m 3 de f, seule l'image de m 3 de f devient beigne en forme, avec une largeur de bague 65 nm. A cette intensité, l'amélioration de la résolution se trouve remarquable lorsque l'on compare le signal de m 2 f 1 f de la m une.
Figures 10B et 10C montrent le PS calculéeFs des 2 f m et 3 m f signaux, respectivement, à des intensités correspondantes qui en résultent dans les formes de beignet. Les calculs ont été basés sur l'ajustement de courbe polynomiale sur la figure 9B. Les courbes calculées et reproduisent les caractéristiques des PSF expérimentales dans les panneaux les plus à droite dans la figure 10A, confirmant à nouveau la pertinence d'une adaptation polynomiale du cinquième ordre pour la diffusion non linéaire.
Figure 1. Image MEB du GNSS. En effectuant les procédés de préparation décrits dans la première partie du protocole, suffisamment séparé GNSS sont observés. Avec plus de 100 nm entre le GNSS, leurs effets LSPR ne sont pas couplées à l'autre. Barre d'échelle:. 100 nm S'il vous plaît cliquer ici pour voirune version plus grande de cette figure.
Figure 2. (A) Configuration de la maison construite microscope confocal 24. (B) image xy avec GNSS au foyer. 2 (c):. Image XZ de PSF avec un alignement correct Il ya deux sources laser pour ce système. L'un est un laser 532 nm à onde continue, et l'autre est un laser pulsé super-continuum. Lors de la mesure des signaux de diffusion, un laser 532 nm à onde continue a été utilisé comme source et un détecteur PMT comme le (avec un filtre à ligne laser est insérée). Pour mesurer le spectre, un laser super-continuum a été adopté comme la source laser et un spectromètre que le détecteur. Le laser sélectionné est envoyé à travers un ensemble de filtres de densité neutre pour contrôler l'intensité d'excitation. Un diviseur de faisceau 50/50 guide le laser dans le microscope à balayage et permet moitié des signaux rétro-diffusion dans lePM T ou le spectromètre, qui est sélectionné par un miroir de retournement. Dans le système de balayage, il y a deux miroirs galvano qui forment balayages vertical et horizontal trame dans le plan focal d'un objectif. La diffusion vers l'arrière est recueilli par le même objectif et convertie en signaux électriques par les détecteurs. Les signaux sont synchronisés avec le système de balayage à foyer commun pour former des images. Le stade de la PI a été utilisé pour acquérir l'image de XZ en déplaçant le GNSS axialement. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Configuration de microscopie SAX. La plupart des composants sont les mêmes que ceux obtenus à partir d'un microscope confocal (rectangle rouge), mais modulation sinusoïdale a été ajouté au faisceau laser d'excitation. Le rectangle bleu indique Modulconfiguration teur. Tout d'abord, le laser d'excitation a été divisé en deux faisceaux et envoyé séparément par deux AOM pour produire des modulations à haute fréquence avec des fréquences légèrement différentes. Puis, les deux faisceaux modulés ont été combinées pour produire une modulation sinusoïdale à la fréquence de battement entre les deux AOM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. La modulation des faisceaux combinés après AOM mesurées par oscilloscope. Y1 et Y2 indiquent les valeurs d'intensité de modulation maximale (52,1 mW) et minimum (1,2 mW), respectivement. Y2 devrait être de zéro pour atteindre la modulation parfaite. Courant de modulation de fréquence est de 10 kHz. S'il vous plaît cliquez ici pour afficher une grandeversion R de cette figure.
Figure 5. Test de linéarité du système de détection. En plaçant un verre de recouvrement au niveau du plan focal, la réflexion du laser d'excitation à partir de l'interface verre / air a été utilisé pour vérifier la linéarité de l'installation de détection. La sortie du signal par rapport à l'intensité d'excitation présente une linéarité inférieure à une valeur de lecture de 1-V. En outre, le niveau de bruit est bien en dessous de 10 -4 V, de sorte que le système fournit une gamme dynamique d'au moins 10 4. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. spectre de diffusion de 80 GNS Nm. Les points rouges indiquent expérimmesures ent, et ligne noire représente calcul à partir de la théorie de Mie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. images de diffusion de GNS de linéaire pour inverser la saturation. Rangée du haut montre des images de rétrodiffusion, et rangée du bas donne des profils de signaux de nanoparticules sélectionné à différentes intensités d'excitation. Transition de la linéarité de la saturation pour inverser la saturation est clairement observée. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. intensité de diffusionfonction de l'intensité d'excitation de GNS simples. Les points bleus correspondent à des intensités de diffusion au centre de PSF à différentes intensités d'excitation, montrant des réponses très non linéaires, y compris la saturation et la saturation inverse. Courbe rouge indique ajustement de la courbe sur la base du cinquième ordre fonction polynomiale. (Images reproduites à partir Réf. 25). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9. dépendances de l'intensité des signaux de SAX selon (a) expérience et (B) calcul. (A) Les signaux SAX ont été extraites par amplificateur lock-in, et chaque point de données expérimentales a été en moyenne plus de quatre 80 nm GNSS. Les lignes pointillées indiquent les pentes de signaux SAX 25. (B) Après le protocole 5, SAX SIgnaux ont été calculées sur la base du cinquième ordre du polynôme dans la figure 8. (Images reproduites à partir de 25 Réf.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 10. images Sax à différentes intensités d'excitation. (A) observés expérimentalement 1 f m, 2 f m et 3 m f images de Sax à différentes intensités d'excitation. La taille des pixels est de 20 nm, et chaque taille de l'image est de 750 nm x 750 nm. Profils d'intensité de beignets à 2 m et 3 f f m sont tracées dans les panneaux les plus à droite. (B) Calculé profil d'image de 2 f image de m à 0,75 MW / cm 2. (C) Calculé image de profil de 3 f </ em> l'image de m à 1,1 MW / cm 2. (Images reproduites à partir Réf. 25). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans le protocole, il ya plusieurs étapes critiques. Tout d'abord, lors de la préparation des échantillons, la densité de nanoparticules ne doit pas être trop élevée, pour éviter un couplage plasmonique entre particules. Si deux ou plus de particules sont très proches les uns des autres, les résultats de couplage à la longueur d'onde LSPR déplacent vers des longueurs d'onde, réduisant ainsi de façon significative la non-linéarité. Cependant, cette technique d'imagerie en fait correspondre la répartition des modes plasmoniques, au lieu des particules elles-mêmes. Par conséquent, il est prévu que, avec une longueur d'onde d'excitation appropriée, les modes plasmoniques couplés peuvent également montrer une forte non-linéarité et de diffusion peuvent être imagé avec une résolution améliorée. Deuxièmement, il est très important de produire une modulation sinusoïdale pur dans le faisceau d'excitation, motivant ainsi l'utilisation de battement entre les deux AOM. Depuis amélioration de la résolution repose sur l'extraction de parties non linéaires (composantes de fréquence harmoniques) de la modulation de signal de diffusion, si non linéairedistorsion est présent dans la modulation d'excitation, puis extraction sera plus difficile. En outre, dans le système actuel, une configuration d'interféromètre est utilisé pour produire la modulation de battage, de sorte que l'alignement des deux faisceaux de l'interféromètre est également critique pour obtenir un aussi grand de la profondeur de modulation possible. En troisième lieu, il est très important d'assurer que la non-linéarité du signal ne provient pas de l'installation de détection (qui inclut le détecteur, un amplificateur, un convertisseur A / N, et l'ordinateur E / S). Par conséquent, une attention particulière est nécessaire pour garantir que le système de détection fonctionne dans la plage dynamique. La gamme dynamique est définie comme la région de linéarité du système de détection, qui est, par rapport au niveau de bruit de saturation du détecteur. Dans le cas actuel, le signal de tension détectée est linéaire en dessous de 1 V, et le niveau de bruit est inférieur à 10 -4 V. Par conséquent, le système fournit une gamme dynamique d'au moins 10 4. Pour garantir que la non-linéarité du signal provient dela nanoparticule d'or lui-même, et non pas à partir du système de détection, il est nécessaire de maintenir la valeur de lecture à l'intérieur de la plage dynamique. Le quatrième facteur critique est la stabilité mécanique de l'échantillon. Lors de la caractérisation de non-linéarité, il est essentiel que les nanoparticules restent dans le même plan focal. Dérive axiale de la nanoparticule ou le stade de l'échantillon affecterait gravement la précision de l'évaluation de la non-linéarité. Par conséquent, lorsque l'on travaille avec des nanoparticules, il est important de trouver des particules qui ne se déplacent pas facilement sous excitation autour de la lumière. D'autre part, il est également possible de travailler avec des échantillons issues de la lithographie. Dans ce cas, la stabilité de la scène microscopique est le principal facteur limitant. Il ya des étapes avec asservissement de position qui peuvent grandement améliorer la stabilité. Alternativement, puisque le mouvement de la scène est généralement très lente (par exemple, 1 pm à 10 min), il est utile d'acquérir une image 3D xyz pile, comme 10 images avec 100 nm axiale separation entre des images adjacentes, à chaque valeur d'intensité différente. Puis au cours de l'étape de l'analyse, l'image la plus claire sur chaque pile doit être choisi comme représentant à l'image que l'intensité.
En principe, la résolution des techniques basées sur la saturation, qui comprennent SAX et saturé microscopie illumination structurée (SSIM) 26, ne présente pas de limite inférieure tant que non-linéarité d'ordre élevé (composants de fréquences harmoniques élevées) peut être atteint. Néanmoins, dans la pratique, la résolution est limitée par le rapport signal-sur-bruit (SNR), en particulier lors de l'extraction des composants d'ordre supérieur de démodulation harmonique. Il ya quelques stratégies qui peuvent améliorer le SNR. Par exemple, il a été montré que la fréquence de modulation affecte sévèrement le 27 SNR. Il est également possible d'améliorer le SNR en calculant la différence d'intensité entre des signaux non saturés et saturés à extraire uniquement le signal saturée (manuscrit en préparation).
28-30, oupar saturation de l'émission de fluorescence 22,26,31. Cependant, la fluorescence présente un problème intrinsèque de la photo-blanchiment, en particulier sous l'éclairage de forte lumière. Cette étude a démontré que la diffusion saturable du GNSS est une méthode prometteuse de microscopie de super-résolution car il n'y a pas de problème de blanchiment 21. En comparaison avec des études antérieures de la microscopie de fluorescence en utilisant SAX, l'amélioration de la résolution avec la diffusion saturable était beaucoup plus élevé dans cette enquête, peut-être en raison de la non-linéarité d'ordre supérieur 22. En outre, autre que la microscopie SAX, il est une autre technique de super-résolution basée sur la saturation: 26 SSIM. SSIM exploite modulation spatiale de franges pour extraire les signaux non linéaires, tout en microscopie SAX utilise modulation temporelle. Avec la propriété de saturation de cette dispersion non-blanchiment, il est donc prévu que cette découverte peut être combiné avec SSIM pour améliorer la résolution spatiale en vertu grand champ maladesumination.
Dans les applications futures, cette technique de SAX plasmonique sera utile non seulement pour résoudre les distributions et la dynamique de résonance de mode dans les circuits plasmoniques, mais aussi pour améliorer la résolution de l'imagerie de tissus biologiques. Amélioration similaire de résolution a été démontrée avec d'autres matériaux tels que l'argent plasmoniques (non publié), ainsi que des matériaux non-plasmoniques, tels que le silicium 32. Dans le domaine de l'imagerie de super-résolution, microscopie SAX présente des avantages à plusieurs égards. Par rapport à la microscopie optique stochastique de reconstruction (STORM) et photo-activé microscopie de localisation (PALM), la microscopie SAX a une vitesse de balayage plus rapide de seulement quelques secondes par image. Par rapport à l'épuisement de l'émission stimulée (STED) microscopie, un seul laser est nécessaire pour la microscopie SAX, réduisant considérablement la complexité optique. Comparé à SSIM, la résolution de SAX est simultanément améliorée dans les deux directions latérale et axiale. En plus deobtenir une profondeur d'imagerie suffisante, la dispersion aléatoire le long de la trajectoire du faisceau d'excitation ou la collecte est critique. Pour les techniques à champ large comme STORM, PALM, et SSIM, les images sont capturées avec un appareil photo, ce qui est très sensible à la dispersion aléatoire de photons de fluorescence émis dans les tissus. Pour les techniques de numérisation comme point STED et SAX, les signaux de fluorescence sont collectés par un détecteur de point, de sorte qu'ils sont plus robustes contre la diffusion tissulaire. Néanmoins, STED nécessite une plaque de phase pour créer un profil de faisceau de beigne au foyer, et l'information de phase peut être détériorée lors de la propagation du faisceau dans les tissus. Par conséquent, la microscopie SAX devrait être le meilleur parmi ces modalités de tissus profonds de super-résolution imagerie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
References
- Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. Sub-diffraction-limited optical imaging with a silver superlens. Science. 308 (5721), 534-537 (2005).
- Lee, B., Kim, S., Kim, H., Lim, Y. The use of plasmonics in light beaming and focusing. 34 (2), 47-87 (2010).
- Lal, S., Link, S., Halas, N. J. Nano-optics from sensing to waveguiding. Nature Photon. 1 (11), 641-648 (2007).
- Kawata, S., Inouye, Y., Verma, P. Plasmonics for near-field nano-imaging and superlensing. Nature Photon. 3 (7), 388-394 (2009).
- Homola, J., Yee, S. S., Gauglitz, G. Surface plasmon resonance sensors: review. Sensor. Actuat. B-Chem. 54 ((1-2)), 3-15 (1999).
- Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
- Hache, F., Ricard, D., Flytzanis, C. Optical nonlinearities of small metal particles - surface-mediated resonance and quantum size effects. J. Opt. Soc. Am. B. 3 (12), 1647-1655 (1986).
- Balamurugan, B., Maruyama, T. Evidence of an enhanced interband absorption in Au nanoparticles: Size-dependent electronic structure and optical properties. Applied Physics Letters. 87 (14), 143105 (2005).
- Link, S., El-Sayed, M. A. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles. J. Phys. Chem. B. 103 (21), 4212-4217 (1999).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Kauranen, M., Zayats, A. V. Nonlinear plasmonics. Nature Photon. 6 (11), 737-748 (2012).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Au nanoparticles target cancer. Nano Today. 2 (1), 18-29 (2007).
- Wada, O. Femtosecond all-optical devices for ultrafast communication and signal processing. New J. Phys. 6 (183), Forthcoming.
- Elim, H. I., Yang, J., Lee, J. Y., Mi, J., Ji, W. Observation of saturable and reverse-saturable absorption at longitudinal surface plasmon resonance in gold nanorods. Appl. Phys. Lett. 88 (8), 083107 (2006).
- Ros, I., Schiavuta, P., Bello, V., Mattei, G., Bozio, R. Femtosecond nonlinear absorption of gold nanoshells at surface plasmon resonance. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (41), 13692-13698 (2010).
- De Boni, L., Wood, E. L., Toro, C., Hernandez, F. E. Optical Saturable Absorption in Gold Nanoparticles. Plasmonics. 3 (4), 171-176 (2008).
- Gurudas, U., et al. Saturable and reverse saturable absorption in silver nanodots at 532 nm using picosecond laser pulses. J. Appl. Phys. 104 (7), 073107 (2008).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and scattering of light by small particles. , John Wiley & Sons Inc. (1983).
- Chu, S. W., et al. Saturation and reverse saturation of scattering in a single plasmonic nanoparticle. ACS Photon. 1 (1), 32-37 (2014).
- Chu, S. W., et al. Measurement of a saturated emission of optical radiation from gold nanoparticles: application to an ultrahigh resolution microscope. Phys. Rev. Lett. 112 (1), 017402 (2014).
- Fujita, K., Kobayashi, M., Kawano, S., Yamanaka, M., Kawata, S. High-resolution confocal microscopy by saturated excitation of fluorescence. Phys. Rev. Lett. 99 (22), 228105 (2007).
- Smith, K. C. A., Oatley, C. W. The scanning electron microscope and its fields of application. Brit. J.Appl. Phys. 6 (11), (1955).
- Yu, J. Y., et al. A diffraction-limited scanning system providing broad spectral range for laser scanning microscopy. Rev. Sci. Instru. 80 (11), 113704 (2009).
- Lee, H., et al. Point spread function analysis with saturable and reverse saturable scattering. Opt. Express. 22 (21), 26016-26022 (2014).
- Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Yonemaru, Y., Yamanaka, M., Smith, N. I., Kawata, S., Fujita, K. Saturated Excitation Microscopy with Optimized Excitation Modulation. ChemPhysChem. 15 (4), 743-749 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Heintzmann, R., Jovin, T. M., Cremer, C. Saturated patterned excitation microscopy - a concept for optical resolution improvement. J. Opt. Soc. Am. A. 19 (8), 1599-1609 (2002).
- Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity. Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).
