Introduction
O estudo da plasmonics tem atraído grande interesse devido às suas aplicações em diversos campos 1-4. Um dos campos mais investigados em plasmonics é plasmonics superfície, em que a oscilação colectiva de electrões de condução casais com uma onda electromagnética externa numa interface entre um metal e dielétrico. Plasmônica de superfície tem sido explorado por suas potenciais aplicações em subwavelength óptica, biophotonics, e microscopia 5,6. O aprimoramento campo forte no volume ultra-pequenas de nanopartículas metálicas, devido à localizada ressonância de plasma de superfície (LSPR) tem atraído grande atenção, não só por causa de sua sensibilidade excepcional para tamanhos de partículas, formas de partículas, e as propriedades dielétricas do meio circundante 7 -10, mas também por causa de sua capacidade de aumentar inerentemente fracos efeitos ópticos não-lineares 11. A sensibilidade excepcional de LSPR é valioso para bio-sensores e near-fietécnicas de imagem ld 12,13. Por outro lado, a não-linearidade melhorada de estruturas plasmonic podem ser utilizados em circuitos integrados em aplicações fotónicas tais como a comutação óptica e de processamento de sinal totalmente óptica 14,15. É bem sabido que a absorção plasmonic é linearmente proporcional à intensidade de excitação em baixos níveis de intensidade. Quando a excitação é suficientemente forte, a absorção atinge a saturação. Curiosamente, em intensidades mais elevadas, a absorção aumenta novamente. Estes efeitos não lineares são chamados de absorção saturada (SA) 15-17 e absorção saturada reversa (RSA) 18, respectivamente.
Sabe-se que, devido à LSPR, dispersão é particularmente forte em estruturas plasmonic. Com base em electromagnetics fundamentais, a resposta de espalhamento versus intensidade incidente deverá ser linear. No entanto, em nanopartículas, dispersão e absorção estão intimamente ligados através da teoria de Mie, e tanto pode ser de expressed em termos de partes real e imaginária da constante dieléctrica. Sob a hipótese de que uma única GNS comporta-se como um dipolo sob iluminação de luz, o coeficiente de dispersão (Q SCA) e coeficiente de absorção (abs Q) a partir de um único plasmonic nanopartículas de acordo com a teoria de Mie pode ser expresso como 19
em que x é 2 πa / λ, a é o raio da esfera, e m é 2 ε m / ε d. Aqui, m ε e ε d correspondem às constantes dieléctricas do metal e dos dieléctricos envolventes, respectivamente. Uma vez que a forma do coeficiente de dispersão é semelhante ao do thcoeficiente de absorção e, portanto, espera-se observar dispersão saturable em uma única nanopartícula plasmonic 20.
Recentemente, espalhamento saturável e não linear em uma partícula plasmonic isolado foi demonstrado pela primeira vez 21. É notável que a saturação de profundidade, a intensidade de dispersão, de facto, diminuiu ligeiramente quando a intensidade de excitação aumentada. Ainda mais surpreendentemente, quando a intensidade de excitação continuou a aumentar após a dispersão tornou-se saturado, a intensidade de dispersão aumentou de novo, mostrando o efeito de dispersão inversa 20 saturável. Wavelength- e estudos dependentes de tamanho têm demonstrado uma forte relação entre LSPR e não-linear dispersão 21. As dependências de intensidade e comprimento de onda de dispersão plasmonic são muito semelhantes aos de absorção, o que sugere um mecanismo comum subjacente a estas condutas não-lineares.
Em termos de aplicações, é bem known que não linearidade ajuda a melhorar a resolução de microscopia óptica. Em 2007, a excitação saturada microscopia (SAX) foi proposto, o qual pode melhorar a resolução através da extracção do sinal saturado através de uma modulação sinusoidal temporal do feixe de excitação 22. Microscopia SAX baseia-se no conceito de que, para um ponto focal de laser, a intensidade é mais forte no centro do que na periferia. Se o sinal (quer de fluorescência ou dispersão) apresenta um comportamento de saturação, a saturação deve começar a partir do centro, enquanto a resposta linear permanece na periferia. Por isso, se existe um método para extrair apenas a parte saturada, que vai deixar apenas a parte central, enquanto que rejeita a parte periférica, aumentando assim eficazmente a resolução espacial. Em princípio, não há nenhum limite de resolução mais baixa em microscopia SAX, contanto saturação tão profundo é alcançado, e não há danos amostra devido à iluminação intensa.
Tem sido demonstrado que a Resoluçãon de imagens de fluorescência pode ser significativamente melhorada através da utilização da técnica SAX. No entanto, sofre de fluorescência o efeito fotobranqueamento. Combinando a descoberta de espalhamento não-linearidade e do conceito de SAX, microscopia super-resolução com base no espalhamento pode ser realizado 21. Em comparação com microscopias de super-resolução convencionais, a técnica baseada no espalhamento fornece um novo método de contraste não-branqueamento. Neste trabalho, uma descrição passo-a-passo é dado para delinear os procedimentos necessários para obter e extrair a não-linearidade da dispersão plasmonic. Os métodos de identificação de dispersão não-linearidades introduzidas pela mudança na intensidade incidente são descritos. Mais detalhes serão fornecidos para desvendar como esses não-linearidades afeta as imagens de nanopartículas individuais e como resolução espacial pode ser melhorada em conformidade, mediante a técnica SAX.
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Protocol
1. GNS Preparação de Amostras
- Antes de preparar a solução de colóide Sonicar GNS 1 ml da amostra para pelo menos 15 minutos a cerca de 40 kHz a evitar a agregação das partículas, o que pode fazer com que o pico LSPR a mudar.
- Largar 100-200 mL de GNS colóide em uma lâmina de vidro com silicato de alumínio e magnésio (MAS) de revestimento comercial para corrigir o GNSS.
- Depois de pelo menos 1 min, remover o colóide adicional, através de lavagem com água destilada. O tempo de espera depende da densidade de distribuição requerido do GNSS. Tipicamente, 1-3 min resulta numa densidade adequada que permite que as partículas a ser facilmente identificado uma vez que a maior parte deles são isolados uns dos outros. Agregação significativa pode ocorrer se o tempo de espera é muito longo.
- Seca-se a amostra por purga com azoto gasoso.
- (Opcional) Para mapear o GNSS no vidro com alta resolução, realizar microscopia eletrônica de varredura (MEV), nesta fase, 23. Uma imagem de exemplo é fornecido em Figure 1, que mostra a densidade característica de GNSS. Usar um SEM de emissão de campo para obter a imagem. Uma vez que o óleo é adicionado sobre a amostra (passo seguinte), que vai ser difícil de remover o óleo e observar a amostra com o SEM.
- Adicionar uma gota de óleo com o mesmo índice de refracção para a amostra para o cobrir GNSS e para eliminar a forte reflexão a partir do substrato de vidro.
- Coloque uma tampa de vidro no topo da amostra e selá-lo com unha polonês.
- Espere pelo menos 5 minutos até que a unha polonês seca. A amostra está pronta agora.
2. Alinhamento da Home-construído microscópio confocal
- Veja a Figura 2 para o esquema de configuração. Alinhe o caminho iluminação de luz branca do próprio corpo do microscópio. Ligue a fonte de luz de halogénio do microscópio, e seguir o manual do fabricante do microscópio para alcançar a condição de iluminação Köhler. Certifique-se de que os brancos feixes de luz halógena são quase paralelo na parte de trásabertura da objectiva, parcialmente reflectido pelo divisor de feixe a 50/50, e, em seguida, propagar para o laser.
- Ligar os espelhos galvano para garantir que se mantêm na posição inicial correcta, isto é, no centro da gama de varrimento.
- Coloque pelo menos dois alvos, feitas por uma fina folha de papel com anéis concêntricos sobre ele, ao longo do trajeto de luz halógena, e alinhá-los com o feixe de halogéneo.
- Para realizar imagem, selecione o laser de 532 nm. Para executar medidas de espectroscopia, selecione o laser super-continuum. Durante o alinhamento, a potência dos lasers deve ser inferior a 10 mW na abertura traseira do objectivo de evitar a não-linearidade. Em seguida, colimar o feixe de laser incidente oposta ao feixe de saída de halogéneo, com o auxílio dos dois alvos. Quando este processo estiver completo, o alinhamento grosseiro do feixe de laser que foi alcançado.
- Alinhar o feixe de laser através do centro da abertura da parte de trás da lente objectiva. Tipicamente, usar um oiobjetivo l-imersão. Adicionar uma gota de óleo entre a lente objectiva de imersão em óleo e a amostra GNS. Utilizar um tubo fotomultiplicador (PMT), como o detector para recolher os sinais de espalhamento do GNSS.
- Coloque uma pinhole 20 mícrons de diâmetro na frente da PMT para bloquear fora de foco espalhando sinais. Ligue os espelhos galvano e PMT (via software home-construído), ajuste a posição pinhole e altura do estágio da amostra para maximizar os sinais de retroespalhamento do GNSS, e, em seguida, observar um GNS individuais em uma tela de computador. A imagem de amostra xy do GNSS com o alinhamento correto é mostrado na Figura 2B.
- Alterar um pouco a altura da fase de amostra para verificar a concentricidade do foco. Se não é concêntrica, ajustar o feixe com os dois espelhos em frente do scanner até que o centro do GNS permanece na mesma posição enquanto que a altura da plataforma da amostra é alterada. Certifique-se de que a imagem xz do PSF é semelhante à Figura 2Cpara garantir o alinhamento correto do feixe. Processar essas duas imagens com low-pass e filtros lisos Gauss.
3. Caracterização de Scattering Nonlinearity
- Em baixa intensidade de excitação (menos de 10 4 W / cm 2), adquirir uma imagem de nanopartículas de ouro, seguindo protocolo 2.6.
- Abra a imagem no ImageJ (ou qualquer outro software de análise de imagem). Desenhar uma linha que atravessa um dos GNSS na imagem (ver Figura 2B), e usar Análise -> perfil Lote das ferramentas ImageJ para recuperar o perfil de intensidade de espalhamento. Se encaixa no perfil do PSF escolhido por uma função de Gauss:
em que y é o valor da leitura PMT, y 0 é o valor de fundo (se houver), A é a amplitude de pico, W é a largura, X é a coordenada espacial, e X c é o centro coordinatE da função de Gauss. A FWHM do PSF correspondente é (½ln2) w. Com base na abertura numérica (AN) da objectiva, a FWHM teórica do PSF confocal pode ser estimado como sendo de aproximadamente 0.43l / NR, onde L é o comprimento de onda de excitação. Compare esses dois números para verificar o alinhamento do sistema de imagem. - Aumente a intensidade de excitação, alterando manualmente o filtro de densidade neutra (ND) na Figura 2A, e gravar as imagens de retroespalhamento em cada nível de intensidade. Pegue o valor do sinal de espalhamento do centro de cada GNS em diferentes intensidades de excitação, e traçar a curva de dispersão sinais contra intensidades de excitação. Verifique a linearidade dos primeiros pontos, que devem exibir uma relação linear, quando a intensidade de excitação é suficientemente baixo. Desenhar uma linha com base no ajuste linear dos primeiros pontos. Se as intensidades de dispersão dos pontos subsequentes cair abaixo desta tendência linear, saturatioN ocorreu.
- Depois de observar a dispersão saturable, diminuir gradualmente a intensidade abaixo do limiar de saturação e imagem do mesmo GNSS novamente para garantir a reversibilidade dos comportamentos não-lineares.
4. Medição de uma Dispersão de Espectro de um único ouro Nanosphere
- Para medir o espectro de retroespalhamento a partir de uma única GNS, utilizar o laser super-contínuo como a fonte de laser. O comprimento de onda do laser inicial varia de 450 nm a 1.750 nm. Para remover o excesso de energia de infravermelhos que pode causar dano à amostra e os componentes ópticos, colocar um ou dois espelhos logo após o laser super-contínuo de modo a reflectir a luz visível, e usar feixe despeja para recolher o excesso de luz infravermelha.
- Siga os procedimentos de alinhamento na Seção 2 para dirigir o laser super-contínuo no microscópio confocal de varredura a laser. Use uma banda larga 50/50 BS para garantir a cobertura espectral em toda a gama visível.
- Adquirir umaimagem dos GNSS no vidro. Localizar um único sinal de GNS na imagem, e fixar a focagem da luz incidente de banda larga sobre a partícula.
- Usar um espelho lançando na frente da PMT para dirigir o sinal para o espectrómetro de retroespalhamento, a qual está equipada com um dispositivo de acoplamento de carga, e, em seguida, tomar um espectro das GNS individuais seleccionados. Ter cuidado para que o espectro é aqui uma mistura de GNS espalhamento e de fundo devido a reflexões a partir de outras superfícies.
- Alterne de volta para o detector PMT, e tomar uma outra imagem para confirmar que a posição da partícula não mudou. Em seguida, mudar o foco para um ponto em que nenhuma partícula está presente. Alterne de volta para o espectrômetro, e dar mais um espectro, o que representa o fundo.
- Subtrair o espectro de fundo a partir do passo 4.5 do espectro do passo 4.4 para obter um espectro backscattering clara de uma única GNS.
5. Alinhamento do SAX Microscópio
- Ver Figura 3para o esquema do microscópio SAX, onde uma modulação temporal, sinusoidal ideal é obtido a partir da freqüência de batimento entre dois moduladores acusto-óptica (OMA). Em primeiro lugar, ajustar o tamanho do feixe do laser para cumprir a exigência dos OMAs subseqüentes. Dividir a luz do laser de 532 nm em dois feixes usando um divisor de feixe 50/50.
- Orientar os dois feixes através dos dois OMA, com um feixe passa através de cada OMA. As frequências de modulação dos dois OMAs deve ser diferente. Por exemplo, um pode ser pelo 40,000 MHz e o outro em 40.010 MHz, obtendo-se uma diferença de frequência de 10 kHz. Esta freqüência diferença será a frequência de modulação fundamentais f m para os sinais SAX.
- Pegue a primeira ordem feixes difratados de ambas as OMA, e combinar os dois feixes usando outro divisor de feixe 50/50. Ajustar os espelhos após as OMA para colimar os dois feixes.
- Adicionar um fotodetector, que é ligado a um osciloscópio para monitorar o modulatio temporaisn. Dividir uma pequena porção do laser com uma lâmina de vidro, e enviá-lo para o fotodetector, tal como mostrado na Figura 3. Com modulação correcta e a sobreposição do feixe, observar modulação de intensidade sinusoidal no principal de frequência f m, semelhante ao da forma de onda mostrada na Figura 4.
Nota: O fundo da modulação precisa de ser tão baixa quanto possível para obter a máxima profundidade de modulação. Além disso, usar a função de análise de Fourier do osciloscópio para verificar se a distorção harmônica da modulação está diminuindo. Para atingir implementação SAX bem sucedido, garantir uma sinusoidal modulação de intensidade de excitação perfeito com não-linearidade inicial minimizado. - Desligue a saída elétrica do fotodetector do osciloscópio e conectar-se a entrada de referência de um amplificador lock-in.
- Como mostrado na Figura 3, alinhar o feixe de laser no sistema confocal seguindo os protocolos anteriores. Here, ligar a saída eléctrica do PMT ao amplificador lock-in como a entrada de sinal.
- Utilizar um vidro de cobertura em branco como a amostra, e verificar a linearidade do sistema de detecção eléctrica, aumentando gradualmente a potência de excitação ,, como mostrado na Figura 5, em que o detector é linear abaixo de um valor de leitura de 1-V. Em todas as medições posteriores, ter o cuidado de restringir a leitura para abaixo deste valor.
- Definir a saída do amplificador lock-in para exportar a grandeza absoluta do sinal de tensão. Ao alterar a componente harmónica fixação no canal de referência, obter as amplitudes dos sinais Sax, A 1, A 2, e assim por diante.
- Exportar a sinais linear e não linear do amplificador lock-in para um cartão de aquisição de dados, que também recebe os sinais de tensão de condução dos espelhos galvano digitalização raster. Com o auxílio de um programa personalizado Labview, sincronizar os sinais do amplificador e do lock-ingalvano espelhos para formar uma imagem.
- Para optimizar a relação de sinal-para-ruído nas imagens, seleccionar adequadamente a aquisição de pixel e o tempo de integração do amplificador lock-in. Por exemplo, quando a frequência de modulação principal M H de excitação é de 10 kHz, ou seja, quando o período é de 100 ms, definir o tempo de integração do amplificador lock-in que ser pelo menos três vezes mais do que o período. Adicionando o tempo do movimento espelho galvano, a velocidade de aquisição é de 1.500 pixels por segundo no modo de imagem SAX.
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Representative Results
A Figura 6 mostra o espectro medido a partir de um 80 GNS nm. Uma curva calculada com base na teoria de Mie está dada no mesmo plano, que mostra uma excelente concordância. O pico LSPR é de cerca de 580 nm. Na experiência seguinte, o comprimento de onda do laser foi 532 nm, que foi escolhida, pois está localizado dentro da banda plasmonic para melhorar a dispersão óptica com efeito plasmonic e permitir espalhando saturação 21.
A Figura 7 mostra que dispersam as imagens de uma única nanopartícula de ouro em diferentes intensidades de excitação, ea linha de fundo fornece o perfil de linha de cada partícula para destacar a não-linearidade. O tamanho da imagem é de 600 nm × 600 nm, e o tamanho do pixel é de 13,8 nm. A velocidade de aquisição foi de 234.000 pixels por segundo no modo de imagem xy normal. Cada imagem foi uma média de mais de cinco aquisições para melhorar a relação sinal-ruído.
Quando a intensidade de excitação é inferior1,5 x 10 6 W / cm 2, a dispersão é linearmente dependente da intensidade de excitação, de modo que a imagem resultante de um único nanopartículas se assemelha a PSF do feixe de excitação, com um perfil gaussiano padrão. No entanto, quando os aumentos de intensidade de excitação a 1,7 x 10 6 W / cm2, não só achatamento clara na parte superior do PSF é observado, mas também alargar do FWHM, indicando saturação. Muito interessante, a um nível ligeiramente mais altas intensidades, a intensidade do centro torna-se menor do que a periférica, resultando em um PSF em forma de anel. Então, como a intensidade de excitação continua a aumentar, a intensidade de dispersão aumenta novamente, revelando saturação reversa e resultando em um novo pico no centro do PSF.
Ao traçar as intensidades centrais das PSFs em diferentes intensidades de excitação, a dependência da intensidade de dispersão é obtido, como mostrado pelos pontos na Figura 8. Esta curva clearly revela as tendências de saturação e comportamentos de saturação reversa. Como esperado, ele se parece muito semelhante à dependência da intensidade de absorção não-linear 15-17. Seguindo o método típico de analisar a absorção não-linear, uma função polinomial foi usado para ajustar o resultado de dispersão não-linear. No entanto, diferente da maioria dos estudos de absorção não-lineares, em que de terceira ordem não-linearidade é suficiente para modelar os resultados, aqui de quinta ordem não-linearidade foi necessária para melhorar o ajuste da curva de dispersão.
Tal como mencionado na secção 5, os componentes de frequência harmónicas podem ser experimentalmente extraída por um amplificador lock-in, e os resultados são apresentados na Figura 9A. Por outro lado, os componentes harmónicos pode ser calculado a partir da Figura 8. Em primeiro lugar, utiliza uma função polinomial, onde I é a intensidade de excitação, para caber Figura 8, portanto, têm os parâmetros de ajuste α, β, γ .... Podemos então expressar as intens de excitaçãodade como função modulada temporalmente I (t) = I 0 (1 + cos (2 πf m t)) / 2, onde t é o tempo, f m é a frequência de modulação, e 0 é a intensidade máxima excitação. Ao substituir I (t) em S (I), e fazer uma transformada de Fourier para converter o resultante S (I (t)) em domínio da freqüência, temos a seguinte equação composta de múltiplas funções delta (ô):
O coeficiente de cada função delta (A 0, A 1, A 2, etc.) representa a amplitude do sinal de SAX na frequência harmónica correspondente. Estes coeficientes, que correspondem aos Signa SAXl em diferentes pontos fortes harmónicas, pode ser escrita como funções dos parâmetros de ajuste a, p, γ ...:
Os resultados dos cálculos são mostrados na Figura 9B. As parcelas experimentais e de cálculo concordar de perto, em especial nos dois aspectos seguintes.
Em primeiro lugar, as curvas de 2 f m f m e 3 não são lisas, mostrando depressões em intensidades específicas ao longo das curvas. Em ambas as figuras, existem três depressões nas curvas m 2 F, enquanto duas depressões são vistos nas curvas m 3 f. Em segundo lugar, as pistas são diferentes com diferentes intensidades de excitação. Quando a intensidade de excitação não é alta, as pistas de f 1 m, 2 m F, 3-F e m são 1, 2, e 3, respectivamente. No entanto, depois de cada mergulho, as inclinações das curvas não-lineares correspondentes tornam-se maiores.
Com os mergulhos e as variações de inclinação, PSFs não convencionais são esperados se os componentes não-lineares são extraídos através da técnica de SAX, quando a intensidade de excitação aumenta entre os mergulhos. Figura 10A mostra os exemplos de imagens SAX do 1 f m, 2 f m, e 3 f m componentes de freqüência em diferentes intensidades de excitação. Na primeira linha, a intensidade de excitação é de 0,7 mW / cm 2, o que é suficiente para induzir os componentes não lineares, mas a amplitude é relativamente fraca. A este nível de intensidade, o declive do sinal 2 f m é 2, e 3 é para o sinal f 3 m, como se mostra na Figura 9A. Se a intensidade de excitação aumenta para o nível da primeira imersão do sinal 2 f m, as imagens a SAX de 2f m sinal tornam-se em forma de anel, como mostrado na segunda linha da Figura 10A. Ambas as imagens 1 m m f f 3 e permanecem sólidos, ao passo que a FWHM da 3 f m PSF é significativamente menor do que a do sinal f 1 m, manifestando melhoria notável resolução. A partir do perfil de sinal, no painel mais à direita da mesma linha, a FWHM da 2 f anel de donut m é de cerca de 110 nm. Por outro lado, a terceira linha da Figura 10A mostra que, quando a intensidade de excitação aumenta para a primeira imersão do sinal f 3 m, apenas a imagem torna-se m 3 f em forma de anel, com um anel de largura de 65 nm. Neste intensidade, aprimoramento de resolução notável é encontrada quando se compara o sinal 2 f m à 1 m f um.
Figuras 10B e 10C mostram o calculado PSFs dos sinais de m e 2 m f f 3, respectivamente, nas intensidades correspondentes que resultam em formas de rosca. Os cálculos basearam-se o ajuste de curva polinomial na Figura 9B. As curvas calculadas reproduzir bem as características das PSFs experimentais nos painéis mais à direita na Figura 10A, confirmando de novo a adequabilidade de um ajuste polinomial de quinta ordem para a dispersão não-linear.
Figura 1. imagem SEM de GNSS. Ao realizar os processos de preparação descritos na primeira parte do protocolo, suficientemente separadas GNSS são observados. Com mais de 100 nm entre GNSS, os seus efeitos não são LSPR acoplados uns aos outros. Barra de escala:. 100 nm Por favor, clique aqui para veruma versão maior desta figura.
Figura 2. (A) Configuração de home-construído microscópio confocal 24. (B) imagem xy com GNSS em foco. 2 (c):. Xz imagem de PSF com o alinhamento correto Há duas fontes de laser para este sistema. Um deles é um nm do laser de onda contínua 532, e o outro é um laser pulsado de super-contínuo. Ao medir os sinais de espalhamento, um laser de onda contínua 532 nm foi utilizada como a fonte e um PMT como o detector (com um filtro de linha de laser inserido). Para medir o espectro, um laser super-contínuo foi adotada como a fonte de laser e um espectrómetro como o detector. O laser seleccionado é enviado através de um conjunto de filtros de densidade neutra e para controlar a intensidade de excitação. Um divisor de feixe 50/50 orienta o laser para o microscópio de varrimento e permite que metade dos sinais para trás para o espalhamento-PM T ou o espectrômetro, que é selecionado por um espelho lançando. No sistema de verificação, existem dois espelhos galvano que formam vertical e horizontal exploração de quadro no plano focal de um objectivo. O espalhamento para trás é recolhido por o mesmo objectivo e convertidos em sinais eléctricos pelos detectores. Os sinais são sincronizados com o sistema de varrimento confocal para formar imagens. O estágio PI foi utilizado para adquirir a imagem xz movendo o GNSS axial. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Configuração de microscopia SAX. A maior parte dos componentes são os mesmos que os obtidos a partir de um microscópio confocal (rectângulo vermelho), mas a modulação sinusoidal foi adicionado ao feixe de laser de excitação. Retângulo azul mostra modulconfiguração do ator. Em primeiro lugar, o laser de excitação foi dividida em dois feixes e enviada separadamente por meio de dois OMAs para produzir modulações de alta frequência, com frequências ligeiramente diferentes. Em seguida, os dois feixes modulados foram combinadas para produzir modulação senoidal na freqüência de batimento entre as duas OMA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A modulação de feixes combinados depois OMAs medidos pelo osciloscópio. Y1 e Y2 indicam valores de intensidade máxima modulação (52,1 mW) e mínimo (1,2 mW), respectivamente. Y2 deve ser zero para conseguir a modulação perfeito. Frequência de modulação atual foi de 10 kHz. Por favor clique aqui para ver um grander versão desta figura.
Figura 5. Teste de linearidade do sistema de detecção. Ao colocar uma tampa de vidro no plano focal, o reflexo do laser de excitação da interface vidro / ar foi usada para verificar a linearidade do sistema de detecção. A saída de sinal versus intensidade de excitação mostra linearidade inferior a um valor de leitura de 1-V. Além disso, o nível de ruído é bastante inferior a 10 -4 V, de modo que o sistema fornece uma gama dinâmica de pelo menos 10 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura espectro 6. Dispersão de 80 nm GNS. Os pontos vermelhos indicam experimmedições ental e linha preta representa cálculo da teoria Mie. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. imagens dispersão de GNS de linear para reverter saturação. Top linha mostra imagens retroespalhamento, e linha de baixo dá perfis de sinal de nanopartículas selecionados em várias intensidades de excitação. Transição da linearidade à saturação para reverter a saturação é claramente observado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. intensidade Scatteringversus intensidade de excitação do GNS individuais. Os pontos azuis correspondem a dispersão intensidades no centro do PSF em diferentes intensidades de excitação, mostrando respostas muito não-lineares, incluindo a saturação ea saturação inversa. Curva vermelha indica o ajuste da curva com base na função polinomial de quinta ordem. (Imagens reproduzidas a partir de Ref. 25). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. dependências de intensidade dos sinais SAX acordo com (a) experiência e cálculo (B). (A) Os sinais SAX foram extraídos pelo amplificador lock-in, e cada ponto de dados experimentais foi calculada como média durante quatro GNSS 80 nm. As linhas pontilhadas indicam pistas de sinais SAX 25. (B) Seguindo o protocolo 5, SAX signals foram calculados com base em quinta ordem ajuste polinomial na Figura 8. (Imagens reproduzidas a partir de 25 Ref.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. SAX imagens em diferentes intensidades de excitação. (A) observado experimentalmente f 1 m, 2 m f, e f 3 m SAX imagens em diferentes intensidades de excitação. Tamanho do pixel é de 20 nm, e cada tamanho de imagem é de 750 nm × 750 nm. Perfis de intensidade de donuts no 2 f m f m e 3 estão representados nos painéis da extremidade direita. (B) perfil de imagem Calculado imagem 2 M de f a 0,75 mW / cm 2. (C) Calculado perfil de imagem de 3 f </ em> m imagem em 1,1 MW / cm2. (Imagens reproduzidas a partir de Ref. 25). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No protocolo, existem vários passos críticos. Em primeiro lugar, quando da preparação das amostras, a densidade de nanopartículas não deve ser demasiado elevada, a fim de evitar o acoplamento entre as partículas plasmonic. Se duas ou mais partículas são muito próximos uns dos outros, os resultados de engate, no comprimento de onda LSPR mudando para comprimentos de onda maiores, reduzindo assim significativamente a não-linearidade. No entanto, esta técnica de imagiologia, na verdade, mapeia a distribuição dos modos plasmonic, em vez das próprias partículas. Portanto, espera-se que, com um comprimento de onda de excitação apropriado, os modos plasmonic acopladas também podem apresentar uma forte dispersão e não linearidade pode ser trabalhada com maior resolução. Em segundo lugar, é muito importante para a produção de modulação sinusoidal pura dentro do feixe de excitação, motivando assim a utilização de bater entre os dois OMAs. Desde aprimoramento de resolução baseia-se na extração de partes não-lineares (componentes de freqüência harmônica) da modulação do sinal de espalhamento, se não lineardistorção está presente na modulação de excitação, em seguida, extracção, será mais difícil. Além disso, no esquema de corrente, uma configuração interferómetro é utilizado para produzir a modulação de batimento, de modo que o alinhamento das duas vigas no interferômetro também é crítico para conseguir tão grande de uma profundidade de modulação que possível. Em terceiro lugar, é muito importante assegurar-se que a não linearidade do sinal não surge a partir do sistema de detecção (o qual inclui o detector, amplificador, conversor A / D, e o computador de I / O). Portanto, é necessário uma atenção especial para garantir que o sistema de detecção está a funcionar dentro da gama dinâmica. A gama dinâmica é definido como a região de linearidade do sistema de detecção, isto é, a partir do nível de ruído do detector para saturação. No caso atual, o sinal de tensão detectado é linear abaixo de 1 V, eo nível de ruído é inferior a 10 -4 V. Portanto, o sistema proporciona uma gama dinâmica de pelo menos 4 10. Para garantir que a não linearidade do sinal origina a partir deo próprio nanopartículas de ouro, não a partir do sistema de detecção, é necessário para manter o valor da leitura dentro da gama dinâmica. A quarta é factor crítico a estabilidade mecânica da amostra. Durante a caracterização não linearidade, é essencial que as nanopartículas permanecem no mesmo plano focal. Tração axial da nanopartícula ou o estágio da amostra afectaria gravemente a precisão da avaliação não-linearidade. Portanto, quando se trabalha com nanopartículas, é importante encontrar partículas que não se mover facilmente, sob excitação de luz. Por outro lado, também é possível trabalhar com amostras cultivadas a partir de litografia. Neste caso, a estabilidade estágio microscópico é o principal fator limitante. Há fases com controle de feedback de posição que podem melhorar muito a estabilidade. Alternativamente, uma vez que o movimento fase é tipicamente muito lenta (por exemplo, 1 M em 10 min), é útil para adquirir uma imagem XYZ pilha 3D, tais como imagens 10 com 100 nm axial separation entre as imagens adjacentes, em cada valor de intensidade diferente. Em seguida, durante a fase de análise, a imagem mais brilhante de cada pilha deve ser escolhida como a imagem representativa em que intensidade.
Em princípio, a resolução das técnicas baseadas em saturação, que incluem a microscopia e a SAX-iluminação estruturada saturado (SSIM) 26, exibe nenhum limite inferior, desde que não linearidade de ordem elevada (alto componentes de frequência harmónicas) pode ser alcançado. No entanto, na prática, a resolução é limitada pela relação sinal-para-ruído (SNR), especialmente quando se extrai de ordem superior de desmodulação componentes harmónicas. Existem algumas estratégias que podem melhorar o SNR. Por exemplo, demonstrou-se que a frequência de modulação afecta gravemente o SNR 27. É também possível aumentar o SNR pelo cálculo da diferença entre a intensidade de sinais não-saturados e saturados para extrair apenas o sinal saturado (manuscrito em preparação).
28-30, oupor saturação de emissão de fluorescência 22,26,31. No entanto, a fluorescência apresenta um problema intrínseco de foto-branqueamento, especialmente sob forte iluminação de luz. Este estudo demonstrou que a dispersão saturable do GNSS é um método promissor de microscopia de super-resolução uma vez que não há nenhum problema de branqueamento 21. Em comparação com estudos anteriores de microscopia de fluorescência utilizando SAX, o aprimoramento de resolução com espalhamento saturable foi muito maior nesta investigação, possivelmente devido à não-linearidade de ordem superior 22. Além disso, com excepção microscopia SAX, existe uma outra técnica de super-resolução baseado em saturação: SSIM 26. SSIM explora modulação espacial das franjas para extrair os sinais não-lineares, enquanto microscopia SAX utiliza modulação temporal. Com a propriedade de saturação desta dispersão não-branqueamento, é, por conseguinte, espera-se que esta descoberta pode ser combinado com SSIM para melhorar a resolução espacial de campo amplo sob doentesumination.
Em futuras aplicações, esta técnica SAX plasmonic serão úteis não só para resolver as distribuições de modo de ressonância e dinâmica em circuitos plasmonic, mas também para melhorar a resolução de imagem de tecidos biológicos. Resolução acessório semelhante foi demonstrada com outras matérias, tais como plasmonic prata (não publicado), bem como materiais não-plasmonic, tais como silício 32. No campo de imagem de super-resolução, microscopia SAX tem vantagens em vários aspectos. Em comparação com microscopia óptica reconstrução estocástico (STORM) e activado foto-microscopia de localização (PALM), microscopia SAX tem uma velocidade de varredura mais rápida de apenas alguns segundos por imagem. Em comparação com depleção emissão estimulada microscopia (STED), apenas um laser é necessária para microscopia SAX, reduzindo de forma significativa a complexidade óptico. Em comparação com SSIM, a resolução de SAX é melhorada simultaneamente em ambas as direcções laterais e axiais. Além dealcançar uma profundidade de imagem suficiente, espalhamento aleatório ao longo do percurso do feixe de excitação ou de recolha é crítica. Para técnicas de campo amplo como STORM, PALM, e SSIM, as imagens são capturadas com uma câmera, que é altamente suscetível a dispersão aleatória de fótons de fluorescência emitidas nos tecidos. Para técnicas de ponto de verificação como STED e SAX, os sinais de fluorescência são recolhidos por um detector de ponto, por isso eles são mais robustos contra a dispersão do tecido. No entanto, STED requer uma placa de fase para criar um perfil do feixe filhós no foco, e a informação de fase pode estar deteriorada durante a propagação do feixe em tecidos. Portanto, microscopia SAX deve ser o melhor entre essas modalidades de tecidos profundos super-resolução de imagem.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
References
- Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. Sub-diffraction-limited optical imaging with a silver superlens. Science. 308 (5721), 534-537 (2005).
- Lee, B., Kim, S., Kim, H., Lim, Y. The use of plasmonics in light beaming and focusing. 34 (2), 47-87 (2010).
- Lal, S., Link, S., Halas, N. J. Nano-optics from sensing to waveguiding. Nature Photon. 1 (11), 641-648 (2007).
- Kawata, S., Inouye, Y., Verma, P. Plasmonics for near-field nano-imaging and superlensing. Nature Photon. 3 (7), 388-394 (2009).
- Homola, J., Yee, S. S., Gauglitz, G. Surface plasmon resonance sensors: review. Sensor. Actuat. B-Chem. 54 ((1-2)), 3-15 (1999).
- Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
- Hache, F., Ricard, D., Flytzanis, C. Optical nonlinearities of small metal particles - surface-mediated resonance and quantum size effects. J. Opt. Soc. Am. B. 3 (12), 1647-1655 (1986).
- Balamurugan, B., Maruyama, T. Evidence of an enhanced interband absorption in Au nanoparticles: Size-dependent electronic structure and optical properties. Applied Physics Letters. 87 (14), 143105 (2005).
- Link, S., El-Sayed, M. A. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles. J. Phys. Chem. B. 103 (21), 4212-4217 (1999).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Kauranen, M., Zayats, A. V. Nonlinear plasmonics. Nature Photon. 6 (11), 737-748 (2012).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Au nanoparticles target cancer. Nano Today. 2 (1), 18-29 (2007).
- Wada, O. Femtosecond all-optical devices for ultrafast communication and signal processing. New J. Phys. 6 (183), Forthcoming.
- Elim, H. I., Yang, J., Lee, J. Y., Mi, J., Ji, W. Observation of saturable and reverse-saturable absorption at longitudinal surface plasmon resonance in gold nanorods. Appl. Phys. Lett. 88 (8), 083107 (2006).
- Ros, I., Schiavuta, P., Bello, V., Mattei, G., Bozio, R. Femtosecond nonlinear absorption of gold nanoshells at surface plasmon resonance. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (41), 13692-13698 (2010).
- De Boni, L., Wood, E. L., Toro, C., Hernandez, F. E. Optical Saturable Absorption in Gold Nanoparticles. Plasmonics. 3 (4), 171-176 (2008).
- Gurudas, U., et al. Saturable and reverse saturable absorption in silver nanodots at 532 nm using picosecond laser pulses. J. Appl. Phys. 104 (7), 073107 (2008).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and scattering of light by small particles. , John Wiley & Sons Inc. (1983).
- Chu, S. W., et al. Saturation and reverse saturation of scattering in a single plasmonic nanoparticle. ACS Photon. 1 (1), 32-37 (2014).
- Chu, S. W., et al. Measurement of a saturated emission of optical radiation from gold nanoparticles: application to an ultrahigh resolution microscope. Phys. Rev. Lett. 112 (1), 017402 (2014).
- Fujita, K., Kobayashi, M., Kawano, S., Yamanaka, M., Kawata, S. High-resolution confocal microscopy by saturated excitation of fluorescence. Phys. Rev. Lett. 99 (22), 228105 (2007).
- Smith, K. C. A., Oatley, C. W. The scanning electron microscope and its fields of application. Brit. J.Appl. Phys. 6 (11), (1955).
- Yu, J. Y., et al. A diffraction-limited scanning system providing broad spectral range for laser scanning microscopy. Rev. Sci. Instru. 80 (11), 113704 (2009).
- Lee, H., et al. Point spread function analysis with saturable and reverse saturable scattering. Opt. Express. 22 (21), 26016-26022 (2014).
- Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Yonemaru, Y., Yamanaka, M., Smith, N. I., Kawata, S., Fujita, K. Saturated Excitation Microscopy with Optimized Excitation Modulation. ChemPhysChem. 15 (4), 743-749 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Heintzmann, R., Jovin, T. M., Cremer, C. Saturated patterned excitation microscopy - a concept for optical resolution improvement. J. Opt. Soc. Am. A. 19 (8), 1599-1609 (2002).
- Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity. Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).
