Introduction
El estudio de la plasmónica ha atraído un gran interés por sus aplicaciones en muchos campos diferentes 1-4. Uno de los campos más investigados en la plasmónica es plasmónica de superficie, en el que la oscilación colectiva de electrones de conducción parejas con una onda electromagnética externa en una interfaz entre un metal y dieléctrico. Plasmónica de superficie ha sido explorado por sus potenciales aplicaciones en óptica sublongitud de onda, biofotónica, y microscopía 5,6. El fuerte aumento del campo en el volumen ultra pequeño de nanopartículas metálicas debido a localizada resonancia de plasmón superficial (LSPR) ha atraído una amplia atención, no sólo por su excepcional sensibilidad a los tamaños de partículas, forma de las partículas, y las propiedades dieléctricas del medio circundante 7 -10, pero también debido a su capacidad para estimular efectos ópticos no lineales inherentemente débiles 11. La sensibilidad excepcional de LSPR es valiosa para bio-detección y casi fietécnicas de imagen ld 12,13. Por otro lado, el aumento de la no linealidad de las estructuras plasmónicas puede ser utilizado en circuitos integrados fotónicos en aplicaciones tales como conmutación óptica y procesamiento de señales totalmente óptico 14,15. Es bien sabido que la absorción plasmónica es linealmente proporcional a la intensidad de excitación a niveles de baja intensidad. Cuando la excitación es lo suficientemente fuerte, la absorción alcanza la saturación. Curiosamente, a intensidades más altas, la absorción aumenta de nuevo. Estos efectos no lineales se llaman absorción saturable (SA) 15-17 y revertir la absorción saturable (RSA) 18, respectivamente.
Se sabe que debido a la LSPR, la dispersión es particularmente fuerte en las estructuras plasmónicas. Basado en electromagnetismo fundamentales, la respuesta de la dispersión frente a la intensidad incidente debe ser lineal. Sin embargo, en las nanopartículas, dispersión y absorción están estrechamente vinculados a través de la teoría de Mie, y ambos pueden ser correoxpressed en términos de partes real e imaginaria de la constante dieléctrica. Bajo el supuesto de que una sola GNS se comporta como un dipolo bajo iluminación de luz, el coeficiente de dispersión (sca Q) y coeficiente de absorción (Q abs) a partir de una única nanopartícula plasmónica de acuerdo con la teoría de Mie se pueden expresar como 19
donde x es 2 πa / λ, a es el radio de la esfera, y m es 2 ε m / ε d. Aquí, m ε y ε d corresponden a las constantes dieléctricas del metal y de los dieléctricos que rodean, respectivamente. Puesto que la forma del coeficiente de dispersión es similar a la de THcoeficiente de absorción de correo, por lo tanto se espera para observar la dispersión saturable en una sola nanopartícula plasmónica 20.
Recientemente, la dispersión saturable no lineal en una partícula plasmónica aislado se demostró por primera vez 21. Es notable que en la saturación profunda, la intensidad de dispersión de hecho disminuyó ligeramente cuando la intensidad de excitación aumenta. Aún más notablemente, cuando la intensidad de excitación continuó aumentando después de la dispersión se saturó, la intensidad de dispersión se levantó de nuevo, que muestra el efecto de dispersión inversa saturable 20. De longitud de onda y los estudios dependientes del tamaño han demostrado una fuerte relación entre LSPR y no lineales de dispersión 21. La intensidad y longitud de onda de dispersión de dependencias plasmónica son muy similares a los de la absorción, lo que sugiere un mecanismo común que subyace a estos comportamientos no lineales.
En términos de aplicaciones, es kno bienwn que no linealidad ayuda a mejorar la resolución de la microscopía óptica. En 2007, la excitación saturada se propuso (SAX) microscopía, que puede mejorar la resolución mediante la extracción de la señal saturada a través de una modulación sinusoidal temporal del haz de excitación 22. Microscopía SAX se basa en el concepto de que, para un punto focal del láser, la intensidad es más fuerte en el centro que en la periferia. Si la señal (ya sea de la fluorescencia o dispersión) exhibe un comportamiento de saturación, la saturación debe comenzar desde el centro, mientras que la respuesta sigue siendo lineal en la periferia. Por lo tanto, si hay un método para extraer sólo la parte saturada, dejará sólo la parte central mientras rechaza la parte periférica, mejorando así de manera efectiva la resolución espacial. En principio, no existe límite de ningún menor resolución en microscopía SAX, siempre que se alcance la saturación tan profundo y no hay daños muestra debido a la iluminación intensa.
Se ha demostrado que la resolution de imágenes de fluorescencia se puede mejorar significativamente mediante la utilización de la técnica de SAX. Sin embargo, la fluorescencia sufre del efecto photobleaching. Combinando el descubrimiento de la no linealidad de dispersión y el concepto de SAX, microscopía de super-resolución basada en la dispersión se puede realizar 21. En comparación con microscopías de super-resolución convencionales, la técnica basada en la dispersión proporciona un método de contraste no blanqueo novela. En este trabajo, una descripción paso a paso se da a esbozar los procedimientos necesarios para obtener y extraer la no linealidad de la dispersión plasmónica. Se describen métodos para identificar las no linealidades introducidas por dispersión cambiando la intensidad incidente. Más detalles serán proporcionados a desentrañar cómo estos afectan linealidades imágenes de nanopartículas individuales y cómo resolución espacial se pueden mejorar en consecuencia por la técnica de SAX.
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Protocol
1. GNS preparación de muestras
- Antes de preparar la muestra, la solución de coloide sonicado 1 ml GNS durante al menos 15 min a aproximadamente 40 kHz para evitar la agregación de partículas, que puede causar el pico LSPR se desplace.
- Caída de 100 a 200 l de GNS coloide en un portaobjetos de vidrio con silicato de aluminio y magnesio (MAS) de recubrimiento comercial para fijar el GNSS.
- Después de al menos 1 minuto, retire el coloide adicional mediante el lavado con agua destilada. El tiempo de espera depende de la densidad de distribución requerida del GNSS. Típicamente, 1-3 resultados min en una densidad adecuada que permita que las partículas se pueden identificar fácilmente ya que la mayoría de ellos están aislados unos de otros. Agregación significativa puede ocurrir si el tiempo de espera es demasiado largo.
- Secar la muestra purgando con gas nitrógeno.
- (Opcional) Para asignar el GNSS en el cristal de alta resolución, realice microscopía electrónica de barrido (SEM) en esta etapa 23. Una imagen de ejemplo se proporciona en Figure 1, que muestra la densidad característica del GNSS. Utilice una emisión de campo SEM para adquirir la imagen. Una vez que el aceite se añade sobre la muestra (paso siguiente), será difícil para eliminar el aceite y observar la muestra con SEM.
- Añadir una gota de aceite con el mismo índice de refracción sobre la muestra para cubrir el GNSS y para eliminar la fuerte reflexión desde el sustrato de vidrio.
- Coloque una cubierta de vidrio en la parte superior de la muestra y sellarlo con esmalte de uñas.
- Espere al menos 5 minutos hasta que el esmalte de uñas se seque. La muestra está lista ahora.
2. Alineación de Inicio incorporado confocal Microscopio
- Vea la Figura 2 para el esquema de configuración. Alinear el blanco camino iluminación de luz del cuerpo del microscopio en sí. Encienda la fuente de luz halógena del microscopio, y seguir el manual del fabricante del microscopio para lograr la condición de iluminación Köhler. Asegúrese de que los blancos rayos de luz halógena son casi paralelos al fondo deabertura del objetivo, que se refleja parcialmente por el divisor de haz 50/50, y luego se propagan hacia el láser.
- Encienda los espejos galvano para garantizar que se mantienen en la posición inicial correcta, es decir, en el centro del rango de exploración.
- Coloque al menos dos objetivos, hechos por una delgada hoja de papel con anillos concéntricos en él, a lo largo de la trayectoria de luz de halógeno, y alinearlos con el haz de halógeno.
- Para llevar a cabo de imagen, seleccione el láser de 532 nm. Para realizar mediciones de espectroscopia, seleccione el láser súper continuo. Durante la alineación, la potencia de los láseres debe ser inferior a 10 mW en la abertura posterior de el objetivo de evitar la no linealidad. Entonces, colimar el haz de láser incidente opuesto a la viga de halógeno saliente con la ayuda de los dos objetivos. Cuando este proceso se haya completado, la alineación aproximada del rayo láser se ha logrado.
- Alinear el rayo láser a través del centro de la abertura posterior de la lente objetivo. Por lo general, utilice un oil objetivo de inmersión. Añadir una gota de aceite entre la lente objetivo de inmersión en aceite y la muestra GNS. Use un tubo fotomultiplicador (PMT) como el detector para recoger las señales de dispersión de los GNSS.
- Coloque un alfiler de 20 micras de diámetro delante de la PMT para bloquear fuera de foco de dispersión señales. Encienda los espejos galvano y PMT (a través del software de fabricación casera), ajuste la posición del agujero de alfiler y la altura de la etapa de la muestra para maximizar las señales de retrodispersión del GNSS, y luego observar un GNS individuales en una pantalla de ordenador. Una imagen muestra xy del GNSS con la alineación correcta se muestra en la Figura 2B.
- Ligeramente cambiar la altura de la etapa de la muestra para comprobar la concentricidad del foco. Si no es concéntrico, ajustar la viga con los dos espejos en frente del escáner hasta el centro de la GNS se mantiene en la misma posición mientras se cambia la altura de la etapa de la muestra. Asegúrese de que la imagen xz del PSF es similar a la figura 2Cpara asegurar la alineación del haz correcta. Procesar estas dos imágenes con paso bajo y filtros suaves de Gauss.
3. Caracterización de la dispersión de no linealidad
- A baja intensidad de excitación (menos de 10 4 W / cm2), adquirir una imagen de nanopartículas de oro, siguiendo el protocolo 2.6.
- Abre la imagen en ImageJ (o de cualquier otro software de análisis de imágenes). Dibuja una línea a través de uno de los GNSS en la imagen (ver Figura 2B), y el uso de Análisis -> perfil Parcela de las herramientas ImageJ para recuperar el perfil de intensidad de dispersión. Montar el perfil del PSF elegido por una función de Gauss:
donde Y es el valor de lectura PMT, y 0 es el valor de fondo (si lo hay), A es la amplitud de pico, w es la anchura, x es la coordenada espacial, y x c es el centro de coordinate de la función de Gauss. La FWHM del PSF correspondiente es (½ln2) w. Sobre la base de la apertura numérica (NA) del objetivo, la FWHM teórico del PSF confocal se puede estimar en aproximadamente 0.43l / NA, donde l es la longitud de onda de excitación. Compare estos dos números para comprobar la alineación del sistema de imagen. - Aumentar la intensidad de excitación cambiando manualmente el filtro de densidad neutra (ND) en la figura 2A, y registrar las imágenes de retrodispersión en cada nivel de intensidad. Tome el valor de la señal de dispersión desde el centro de cada uno GNS a diferentes intensidades de excitación, y trazar la curva de dispersión de las señales contra intensidades de excitación. Comprobar la linealidad de los primeros puntos, que debe exhibir una relación lineal cuando la intensidad de excitación es adecuadamente baja. Dibuja una línea sobre la base de ajuste lineal de los primeros puntos. Si la intensidad de dispersión de los puntos posteriores caen por debajo de la tendencia lineal, saturation se ha producido.
- Después de observar la dispersión saturable, disminuir gradualmente la intensidad por debajo del umbral de saturación, y la imagen de la misma GNSS de nuevo para garantizar la reversibilidad de los comportamientos no lineales.
4. Medición de un Dispersión del Espectro de un Oro Nanosphere Individual
- Para medir el espectro de retrodispersión de una sola GNS, utilizar el láser super-continuo como la fuente de láser. La longitud de onda inicial del láser varía de 450 nm a 1750 nm. Para eliminar el exceso de energía infrarroja que podrían causar daños a la muestra y los componentes ópticos, coloque uno o dos espejos justo después de que el láser súper-continuo para reflejar la luz visible, y el uso del haz vertederos para recoger el exceso de luz infrarroja.
- Siga los procedimientos de alineación de la Sección 2 para dirigir el láser súper continuo en el microscopio láser confocal de barrido. Use una banda ancha 50/50 BS para asegurar una cobertura espectral a través de todo el rango visible.
- Adquirir unaimagen de los GNSS en vidrio. Localiza una sola GNS en la imagen, y fijar el foco de la luz de banda ancha incidente sobre la partícula.
- Use un espejo flipping en frente de la PMT para dirigir la señal de retrodispersión hacia el espectrómetro, que está equipado con un dispositivo de acoplamiento de carga, y luego tomar un espectro de los GNS individuales seleccionados. Tenga cuidado de que el espectro aquí es una mezcla de GNS y dispersión de fondo debido a reflexiones de otras superficies.
- Cambie de nuevo al detector PMT, y tomar otra imagen para confirmar que la posición de la partícula no ha cambiado. A continuación, cambiar el enfoque a un punto en el cual ninguna partícula está presente. Cambie de nuevo al espectrómetro, y tomar uno de espectro más, lo que representa el fondo.
- Restar el espectro de fondo de la etapa 4.5 a partir del espectro de la etapa 4.4 para obtener un espectro de retrodispersión clara de una sola GNS.
5. Alineación de SAX Microscopio
- Vea la Figura 3para el esquema del microscopio SAX, donde se obtiene una modulación temporal sinusoidal ideales de la frecuencia de batido entre dos moduladores acústico-óptica (AOMs). En primer lugar, ajustar el tamaño del haz del láser para cumplir el requisito de los AOMs posteriores. Dividir la luz láser de 532 nm en dos haces mediante un divisor de haz 50/50.
- Guía a los dos haces a través de los dos AOMs, con un solo haz de cruce a través de cada OMA. Las frecuencias de modulación de las dos AOMs deben ser diferentes. Por ejemplo, uno puede ser en 40,000 MHz y la otra a 40,010 MHz, dando una diferencia de frecuencia de 10 kHz. Esta frecuencia diferencia será la frecuencia de modulación fundamental f m para las señales de SAX.
- Tome el primer orden haces difractados de ambos AOMs, y combinar los dos haces con cualquier otro divisor de haz 50/50. Ajuste los espejos después de los AOMs para colimar los dos haces.
- Añadir un fotodetector que está conectado a un osciloscopio para controlar la modulatio temporalnorte. Dividir una pequeña porción del láser con un portaobjetos de vidrio, y enviarlo al fotodetector, como se muestra en la Figura 3. Con correcta de modulación y la superposición del haz, observar modulación de intensidad sinusoidal a la frecuencia principal f m, similar a la de la forma de onda mostrada en la Figura 4.
Nota: El fondo de la modulación debe ser lo más bajo posible para lograr la máxima profundidad de modulación. Además, utilice la función de análisis de Fourier del osciloscopio para comprobar que la distorsión armónica de la modulación está disminuyendo. Para lograr la implementación SAX éxito, asegurar una modulación de la intensidad de excitación sinusoidal perfecta con no linealidad inicial minimizado. - Desconecte la salida eléctrica del fotodetector del osciloscopio y conectarse a la entrada de referencia de un amplificador lock-in.
- Como se muestra en la Figura 3, alinear el haz de láser en el sistema confocal siguiendo los protocolos anteriores. MARIDOere, conecte la salida eléctrica de la PMT al amplificador lock-in como la entrada de señal.
- Utilice una cubierta de vidrio en blanco como la muestra, y comprobar la linealidad del sistema de detección eléctrica aumentando gradualmente la potencia de excitación ,, como se muestra en la Figura 5, en el que el detector es lineal por debajo de un valor de lectura de 1-V. En todas las mediciones posteriores, tenga cuidado para restringir la lectura por debajo de este valor.
- Ajuste la salida del amplificador lock-in para exportar la magnitud absoluta de la señal de tensión. Al cambiar el ajuste en el canal de referencia componente armónico, obtener las amplitudes de las señales de Sax, A 1, A 2, y así sucesivamente.
- Exportar la señales lineales y no lineales del amplificador lock-in a una tarjeta de adquisición de datos, que también recibe las señales de voltaje de conducción de los espejos galvano de exploración de trama. Con la ayuda de un programa Labview personalizado, sincronizar las señales del amplificador y el lock-ingalvano espejos para formar una imagen.
- Para optimizar la relación señal-ruido en las imágenes, seleccionar adecuadamente la adquisición de píxeles y tiempos de integración del amplificador lock-in. Por ejemplo, cuando la frecuencia de modulación f m principal de la excitación es de 10 kHz, es decir, cuando el período es de 100 microsegundos, establecer el tiempo de integración del amplificador lock-in que ser al menos tres veces más largo que el período. Añadiendo el tiempo del movimiento del espejo galvano, la velocidad de adquisición se fija en 1.500 píxeles por segundo en el modo de imagen SAX.
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Representative Results
La Figura 6 muestra el espectro medido desde un 80 GNS nm. Una curva calculada sobre la base de la teoría de Mie se da en la misma parcela, mostrando excelente acuerdo. El pico LSPR es de alrededor de 580 nm. En el siguiente experimento, la longitud de onda del láser era 532 nm, que fue elegido ya que se encuentra dentro de la banda plasmónica para mejorar la dispersión óptica con efecto plasmónica y permitir la dispersión de saturación 21.
La Figura 7 presenta dispersión imágenes de un solo nanopartícula de oro a diferentes intensidades de excitación, y la fila inferior proporciona el perfil de la línea de cada partícula para resaltar la no linealidad. El tamaño de la imagen es de 600 nm x 600 nm, y el tamaño de píxel es de 13,8 nm. La velocidad de adquisición fue de 234.000 píxeles por segundo en el modo de imagen xy normal. Cada imagen se promedió más de cinco adquisiciones para mejorar la relación señal a ruido.
Cuando la intensidad de excitación es menor que1,5 × 10 6 W / cm 2, la dispersión es linealmente dependiente de la intensidad de excitación, por lo que la imagen resultante de un solo nanopartícula se asemeja a la PSF del haz de excitación, con un perfil Gaussiano estándar. Sin embargo, cuando se observa la intensidad de excitación se incrementa a 1,7 × 10 6 W / cm 2, no sólo aplanamiento claro en la parte superior de la PSF, sino también ensanchamiento de la FWHM, lo que indica la saturación. Muy interesantemente, ligeramente intensidades más altas, la intensidad central se convierte en menor que el periférica, resultando en una PSF en forma de rosquilla. Entonces, como la intensidad de excitación continúa aumentando, la intensidad de dispersión aumenta de nuevo, revelando de saturación inversa y que resulta en un nuevo pico en el centro de la PSF.
Representando las intensidades centrales de los PSFs a diferentes intensidades de excitación, se obtiene la dependencia de intensidad de dispersión, como se muestra por los puntos en la Figura 8. Esta curva clearly revela las tendencias de saturación y comportamientos de saturación inversa. Como era de esperar, se ve muy similar a la dependencia de la intensidad de 15-17 absorción no lineal. Siguiendo el método típico de analizar la absorción no lineal, una función polinómica se utilizó para ajustar el resultado de dispersión no lineal. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los estudios de absorción no lineales, en los que la no linealidad de tercer orden es suficiente para modelar los resultados, aquí quinto orden no linealidad se requería para ajustarse mejor a la curva de dispersión.
Como se ha mencionado en la sección 5, los componentes de frecuencia de armónicos pueden ser experimentalmente extraídos por un amplificador lock-in, y los resultados se dan en la Figura 9A. Por otro lado, los componentes armónicos se pueden calcular a partir de la Figura 8. En primer lugar, utilizar una función polinómica, donde I es la intensidad de excitación, para adaptarse a la Figura 8, por lo que tenemos los parámetros de ajuste α, β, γ .... Podemos a continuación, expresar los intens excitacióndad como una función temporalmente modulada I (t) = I 0 (1 + cos (2 πf m t)) / 2, donde t es el tiempo, m f es la frecuencia de modulación, y I 0 es la intensidad máxima de excitación. Sustituyendo I (t) en S (I), y hacer una transformación de Fourier para convertir la resultante S (I (t)) en el dominio de frecuencia, tenemos la siguiente ecuación compuesta de múltiples funciones delta (delta):
El coeficiente de cada función delta (A 0, A 1, A 2, etc.) representa la amplitud de la señal de SAX a la frecuencia armónica correspondiente. Estos coeficientes, que corresponden a los signa SAXl fortalezas en diferentes armónicos, se pueden escribir como funciones de los parámetros de ajuste, ß, γ ...:
Los resultados del cálculo se muestran en la Figura 9B. Las parcelas experimentales y de cálculo coinciden estrechamente, sobre todo en los dos aspectos siguientes.
En primer lugar, las curvas de 2 f my 3 m f no son suaves, mostrando caídas a intensidades específicas a lo largo de las curvas. En ambas figuras, hay tres caídas en los 2 f m curvas, mientras que dos caídas se ven en los 3 f m curvas. En segundo lugar, las pistas son diferentes, con diferentes intensidades de excitación. Cuando la intensidad de excitación no es alta, las laderas de 1 f m, 2 f m, y 3 f m son 1, 2 y 3, respectivamente. Sin embargo, después de cada inmersión, las laderas de las correspondientes curvas no lineales se hacen más grandes.
Con las salsas y las variaciones de pendiente, PSF no convencionales se anticipan si los componentes no lineales se extraen a través de la técnica de SAX, cuando la intensidad de excitación aumenta a través de las salsas. Figura 10A muestra los ejemplos de imagen SAX del 1 f m, 2 f m, y 3 componentes de frecuencia f m en diferentes intensidades de excitación. En la primera fila, la intensidad de excitación es de 0,7 MW / cm 2, que es suficiente para inducir los componentes no lineales, pero la amplitud es relativamente débil. En este nivel de intensidad, la pendiente de la señal de 2 m f es 2, y es 3 para la señal de 3 m f, como se muestra en la Figura 9A. Si la intensidad de excitación aumenta con el nivel de la primera inmersión de la señal de 2 m f, las imágenes de la SAX 2señal f m convertirse en forma de donut, como se muestra en la segunda fila en la Figura 10A. Tanto los 1 f m y 3 m f imágenes siguen siendo sólidos, mientras que el FWHM del PSF 3 f m es significativamente menor que la de la señal de 1 m f, que se manifiesta mejora de la resolución notable. Desde el perfil de señal en el panel más a la derecha de la misma fila, la FWHM del anillo m rosquilla 2 f es de aproximadamente 110 nm. Por otro lado, la tercera fila de la Figura 10A muestra que cuando la intensidad de excitación aumenta a la primera inclinación de la señal de 3 m f, sólo la imagen 3 m f se convierte en forma de rosquilla, con una anchura de anillo de 65 nm. En esta intensidad, mejora de la resolución extraordinaria se encuentra al comparar la señal m 2 f para el 1 f m una.
Figuras 10B y 10C muestran la PS calculadaFs de las m señales 2 f m y 3 f, respectivamente, en las intensidades correspondientes que dan lugar a las formas de donut. Los cálculos se basan en el ajuste de la curva polinómica en la Figura 9B. Las curvas calculadas así se reproducen los rasgos de las PSFs experimentales en los paneles más a la derecha en la figura 10A, confirmando de nuevo la idoneidad de un ajuste polinómico de quinto orden para la dispersión no lineal.
Figura 1. Imagen SEM del GNSS. Mediante la realización de los procesos de preparación descritos en la primera parte del protocolo, suficientemente separados se observó GNSS. Con más de 100 nm entre GNSS, sus efectos LSPR no están acoplados entre sí. Barra de escala:. 100 nm Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.
Figura 2. (A) Configuración de fabricación casera microscopio confocal 24. (B) Imagen xy con GNSS en el foco. 2 (c):. Xz imagen de fibras discontinuas de poliéster con la alineación correcta Hay dos fuentes de láser para este sistema. Uno es una nm láser de onda continua 532, y el otro es un láser super-continuo pulsado. Al medir las señales de dispersión, un 532 nm láser de onda continua se utiliza como la fuente y un PMT como el detector (con un filtro de línea de láser insertada). Para medir el espectro, se adoptó un láser super-continuo como la fuente láser y un espectrómetro como el detector. El láser seleccionado se envía a través de un conjunto de filtros de densidad neutra para controlar la intensidad de excitación. Un divisor de haz 50/50 guía el láser en el microscopio de exploración y permite medio de las señales de dispersión hacia atrás en elPM T o el espectrómetro, que es seleccionado por un espejo flipping. En el sistema de exploración, hay dos espejos de galvano que forman exploración de trama vertical y horizontal en el plano focal de un objetivo. La dispersión hacia atrás es recogida por el mismo objetivo y convertida en señales eléctricas por los detectores. Las señales se sincronizan con el sistema confocal de barrido para formar imágenes. La etapa de PI se utilizó para adquirir la imagen xz moviendo el GNSS axial. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Configuración de la microscopía SAX. La mayoría de los componentes son los mismos que los obtenidos a partir de un microscopio confocal (rectángulo rojo), pero la modulación sinusoidal se añadió al haz de láser de excitación. Azul rectángulo muestra modulconfiguración ator. Primero, el láser de excitación se dividió en dos haces y se envía por separado a través de dos AOMs para producir modulaciones de alta frecuencia con frecuencias ligeramente diferentes. Entonces, los dos haces modulados se combinaron para producir la modulación sinusoidal a la frecuencia de batido entre los dos AOMs. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La modulación de haces combinados después de AOMs medidos por osciloscopio. Y1 e Y2 indican valores de intensidad de modulación máximo (52,1 mW) y mínimo (1,2 mW), respectivamente. Y2 debe ser cero para lograr la modulación perfecto. Frecuencia de modulación actual era de 10 kHz. Haga clic aquí para ver una granr Versión de esta figura.
Figura 5. Prueba de linealidad del sistema de detección. Mediante la colocación de una cubierta de vidrio en el plano focal, se utilizó el reflejo del láser de excitación desde la interfaz vidrio / aire para comprobar la linealidad del sistema de detección. La salida de la señal frente a la intensidad de excitación muestra linealidad por debajo de un valor de lectura de 1-V. Por otra parte, el nivel de ruido es muy por debajo de 10 -4 V, por lo que el sistema proporciona un rango dinámico de al menos 10 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Dispersión de espectro de 80 GNS nm. Los puntos rojos indican experimmediciones entales, y la línea de negro representa el cálculo de la teoría de Mie. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. imágenes dispersión de GNS de lineal para revertir la saturación. Fila superior muestra imágenes de retrodispersión, y la fila inferior da perfiles de señal de nanopartículas seleccionada en varias intensidades de excitación. La transición de la linealidad de saturación para revertir la saturación se observa claramente. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura intensidad 8. Dispersiónfrente a la intensidad de excitación del GNS individuales. Los puntos azules corresponden a la dispersión intensidades en el centro del PSF en diferentes intensidades de excitación, que muestran respuestas muy lineales, incluyendo la saturación y la saturación inversa. Curva de color rojo indica la curva de ajuste basado en función polinómica de quinto orden. (Imágenes reproducidas de la Ref. 25). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. dependencias intensidad de las señales SAX según (A) experimento y (B) cálculo. (A) señales SAX fueron extraídos por amplificador lock-in, y cada punto de datos experimentales se promediaron más de cuatro 80 nm GNSS. Las líneas de puntos indican las pendientes de las señales SAX 25. (B) Siguiendo el protocolo 5, si SAXertas señales se calcularon sobre la base de quinto orden ajuste polinómico en la Figura 8. (Imágenes reproducidas de la Ref. 25) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. Imágenes de Sax en diferentes intensidades de excitación. (A) experimentalmente observado 1 f m, 2 f m, y 3 f imágenes m Sax en diferentes intensidades de excitación. Tamaño de píxel es de 20 nm, y cada tamaño de la imagen es de 750 nm × 750 nm. Perfiles de intensidad de donas en 2 f my 3 m f se representan en paneles de más a la derecha. (B) Imagen de perfil Calculado m 2 imagen f de al 0,75 MW / cm2. (C) Calculado perfil de imagen de 3 f </ em> m imagen al 1,1 MW / cm2. (Imágenes reproducidas de la Ref. 25). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En el protocolo, hay varios pasos críticos. En primer lugar, en la preparación de las muestras, la densidad de las nanopartículas no debería ser demasiado alta, para evitar el acoplamiento entre partículas plasmónica. Si dos o más partículas son muy cerca uno del otro, los resultados de acoplamiento en la longitud de onda LSPR cambiando hacia longitudes de onda más largas, reduciendo así significativamente la no linealidad. Sin embargo, esta técnica de imagen en realidad los mapas de la distribución de los modos plasmónicas, en lugar de las propias partículas. Por lo tanto, se espera que con una longitud de onda de excitación apropiada, los modos acoplados plasmónicas también pueden mostrar una fuerte no linealidad de dispersión y se pueden obtener imágenes con una resolución mejorada. En segundo lugar, es muy importante para producir modulación sinusoidal pura dentro del haz de excitación, motivando así la utilización de batido entre los dos AOMs. Desde mejora de la resolución se basa en la extracción de partes no lineales (componentes de frecuencia de armónicos) de la modulación de señal de dispersión, si no linealdistorsión está presente en la modulación de excitación, a continuación, la extracción será más difícil. Además, en el esquema actual, una configuración de interferómetro se utiliza para producir la modulación de latir, por lo que la alineación de las dos vigas en el interferómetro es también crítica para lograr tan grande de una profundidad de modulación como sea posible. En tercer lugar, es muy importante asegurarse de que la no linealidad de la señal no se plantea desde el sistema de detección (que incluye el detector, un amplificador, un convertidor A / D, y el ordenador I / O). Por lo tanto, es necesaria una atención especial para garantizar que el sistema de detección está funcionando dentro del rango dinámico. El rango dinámico se define como la región de linealidad sistema de detección, es decir, desde el nivel de ruido a la saturación del detector. En el caso actual, la señal de voltaje detectado es lineal por debajo de 1 V, y el nivel de ruido está por debajo de 10 V. -4 Por lo tanto, el sistema proporciona un rango dinámico de al menos 10 4. Para asegurar que la no linealidad de la señal se origina a partirla propia nanopartícula de oro, no desde el sistema de detección, es necesario para mantener el valor de lectura dentro de la gama dinámica. El cuarto factor crítico es la estabilidad mecánica de la muestra. Durante la caracterización no linealidad, es esencial que las nanopartículas permanecen en el mismo plano focal. Axial deriva de la nanopartícula o la etapa de la muestra podría afectar gravemente la exactitud de la evaluación no linealidad. Por lo tanto, cuando se trabaja con nanopartículas, es importante encontrar partículas que no se mueven con facilidad por bajo excitación luz. Por otro lado, también es posible trabajar con muestras obtenidas de la litografía. En este caso, la estabilidad etapa microscópica es el principal factor limitante. Hay etapas con control de realimentación de posición que pueden mejorar en gran medida la estabilidad. Alternativamente, ya que el movimiento etapa es típicamente muy lenta (por ejemplo, 1 m en 10 min), es útil para adquirir una xyz pila de imágenes en 3D, tales como 10 imágenes con 100 nm axial separation entre las imágenes adyacentes, en cada valor de intensidad diferente. Luego, durante la etapa de análisis, la imagen más brillante de cada pila debe ser elegida como la imagen representativa en esa intensidad.
En principio, la resolución de las técnicas basadas en la saturación, que incluyen SAX y saturado microscopía de iluminación estructurada (SSIM) 26, no presenta límite inferior, siempre y cuando no linealidad de orden superior (componentes de alta frecuencia armónico) se puede lograr. Sin embargo, en la práctica, la resolución está limitada por la relación señal a ruido (SNR), especialmente cuando la extracción de componentes de demodulación de armónicos de orden superior. Hay algunas estrategias que pueden mejorar la SNR. Por ejemplo, se ha demostrado que la frecuencia de modulación afecta severamente la SNR 27. También es posible mejorar la SNR mediante el cálculo de la diferencia de intensidad entre señales no saturados y saturados para extraer sólo la señal saturada (manuscrito en preparación).
28-30, opor la saturación de la emisión de fluorescencia 22,26,31. Sin embargo, la fluorescencia presenta un problema intrínseco de la foto-blanqueo, especialmente bajo una fuerte iluminación de luz. Este estudio demostró que la dispersión saturable del GNSS es un método prometedor de super-resolución microscopía ya que no hay problema de blanqueo 21. En comparación con estudios previos de la microscopía de fluorescencia utilizando SAX, la mejora de la resolución con la dispersión saturable fue mucho mayor en esta investigación, posiblemente debido a la no linealidad de orden superior 22. Además, otra que la microscopía SAX, hay otra técnica de super-resolución basada en la saturación: 26 SSIM. SSIM explota modulación espacial de franjas para extraer las señales no lineales, mientras que la microscopía SAX utiliza modulación temporal. Con la propiedad de saturación de esta dispersión no blanqueado, ello, se espera que este descubrimiento se puede combinar con SSIM para mejorar la resolución espacial bajo de campo amplio enfermoumination.
En futuras aplicaciones, esta técnica SAX plasmónica será útil no sólo para resolver las distribuciones de modo de resonancia y la dinámica en los circuitos plasmónicas, sino también para mejorar la resolución de imágenes de tejidos biológicos. Mejora de la resolución similar se ha demostrado con otros materiales plasmónicas tales como plata (no publicado), así como materiales no plasmónicas, tales como el silicio 32. En el campo de la imagen de super-resolución, microscopía SAX tiene ventajas en varios aspectos. En comparación con la microscopía óptica estocástico reconstrucción (Storm) y foto-activado microscopía de localización (LA PALMA), microscopía SAX tiene una velocidad de escaneo rápido de sólo unos pocos segundos por imagen. En comparación con el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía, sólo se requiere un láser para microscopía SAX, reduciendo significativamente la complejidad óptica. En comparación con SSIM, la resolución de SAX se mejora simultáneamente en ambas direcciones laterales y axiales. Además dealcanzar una profundidad suficiente de formación de imágenes, dispersión aleatoria a lo largo de la trayectoria del haz de excitación o la colección es crítica. Para las técnicas de campo amplio como TORMENTA, PALM, y SSIM, las imágenes son capturadas con una cámara, que es altamente susceptible a la dispersión aleatoria de fotones fluorescencia emitida en los tejidos. Para las técnicas de punto de escaneo como STED y SAX, las señales de fluorescencia son recogidos por un detector de punto, por lo que son más robustos frente a la dispersión de los tejidos. Sin embargo, STED requiere una placa de fase para crear un perfil de la viga de rosquilla en el foco, y la información de fase se puede deteriorar durante la propagación del haz en los tejidos. Por lo tanto, la microscopía SAX debe ser el mejor entre estas modalidades de tejido profundo de imagen super-resolución.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
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