Introduction
Studiet av plasmonik har rönt stort intresse på grund av dess tillämpningar inom många olika områden 1-4. En av de mest undersökta fälten i plasmonik är ytan plasmonik, i vilka den kollektiva svängning ledningselektroner par med en extern elektromagnetisk våg vid en gränsyta mellan en metall och dielektrikum. Surface plasmonik har undersökts för sina potentiella tillämpningar inom subwavelength optik, biofotonik och mikroskopi 5,6. Den starka fältet förbättringen i den ultra liten volym av metalliska nanopartiklar på grund av lokal ytplasmonresonans (LSPR) har rönt stor uppmärksamhet, inte bara på grund av sin exceptionella känslighet för partikelstorlekar, partikelformer och de dielektriska egenskaperna hos det omgivande mediet 7 -10, men också på grund av dess förmåga att öka sin natur svaga icke-linjära optiska effekter 11. Den exceptionella känslighet LSPR är värdefullt för bio-sensorer och nära field avbildningstekniker 12,13. Å andra sidan, kan den förbättrade olinjäritet plasmoniska strukturer utnyttjas i fotoniska integrerade kretsar i tillämpningar såsom optisk omkoppling och heloptisk signalbehandling 14,15. Det är väl känt att plasmoniska absorptionen är linjärt proportionell mot exciteringsintensiteten vid låga intensitetsnivåer. När excitation är stark nog, absorptionen når mättnad. Intriguingly vid högre intensiteter, ökar absorptionen igen. Dessa ickelinjära effekter kallas mätt absorption (SA) 15-17 och omvända mätt absorption (RSA) 18, respektive.
Det är känt att på grund av LSPR, är särskilt stark i plasmoniska strukturer spridning. Baserat på grundläggande elektromagnetism, bör svaret från spridning kontra infallande intensitet vara linjär. Men i nanopartiklar, spridning och absorption är nära kopplade via Mie teori, och båda kan vara expressed i termer av verkliga och imaginära delarna av den dielektriska konstanten. Under antagandet att en enda GNS uppför sig som en dipol under ljusbelysning, kan spridningskoefficienten (Q SCA) och absorptionskoefficienten (Q abs) från en enda plasmoniska nanopartikel enligt Mie teorin uttryckas som 19
där x är 2 πa / λ, är en radie av sfären, och m 2 är ε m / ε d. Här, ε m och ε d motsvarar de dielektriska konstanterna hos metallen och av de omgivande dielektrika, respektive. Eftersom formen av spridningskoefficienten är liknande den i: tee absorptionskoefficient är det därför förväntas följa mättningsbar spridning i en enda plasmoniska nanopartiklar 20.
Nyligen var olinjära mättnadsbar spridning i en isolerad plasmoniska partikel demonstreras för första gången 21. Det är anmärkningsvärt att i djup mättnad, spridningsintensiteten i själva verket minskade något när excitationsintensiteten ökat. Ännu mer anmärkningsvärt, när exciteringsintensiteten fortsatte öka efter spridningen blev mättad, spridningsintensiteten steg igen, som visar effekten av omvänd mättningsbar scattering 20. Wavelength- och storleksberoende studier har visat ett starkt samband mellan LSPR och olinjära spridning 21. Intensiteten och våglängds beroenden av plasmoniska spridning är mycket liknar absorption, vilket tyder på en gemensam mekanism bakom dessa icke-linjära beteenden.
När det gäller tillämpningar, är det väl known att olinjäritet bidrar till att förbättra optisk mikroskopi upplösning. År 2007, mättad excitation (SAX) mikroskopi föreslogs, vilket kan öka upplösningen genom att extrahera den mättade signal via en tidssinusformad modulering av excitationsstrålen 22. SAX mikroskopi är baserad på konceptet att, för en laser fokalpunkt är intensiteten starkare vid centrum än vid periferin. Om signalen (antingen fluorescens eller spridning) uppvisar mättnadsbeteende måste mättnads starta från mitten, medan den linjära responsen förblir vid periferin. Därför, om det finns en metod för att extrahera endast den mättade delen, kommer det att lämna endast den centrala delen medan den avvisar den perifera delen, vilket effektivt förbättrar den rumsliga upplösningen. I princip finns det ingen lägre upplösningsgränsen i SAX-mikroskopi, så länge som djup mättnad uppnås och det finns inget prov skada på grund av intensiv belysning.
Det har visats att Upplösning in av fluorescens avbildning kan förbättras avsevärt genom att använda SAX-tekniken. Lider emellertid fluorescensen från fotoblekning effekten. Kombinera upptäckten av spridnings olinjäritet och begreppet SAX, kan super-resolution mikroskopi baserad på spridning realiseras 21. Jämfört med konventionella superupplösnings microscopies tillhandahåller spridningsbaserade tekniken en ny icke-blekkontrastmetod. I detta dokument är en steg-för-steg-beskrivning som ges för att beskriva de förfaranden som krävs för att erhålla och extrahera olinjäritet plasmoniska spridning. Metoder för att identifiera spridnings olinjäriteter som infördes genom att ändra den infallande intensitet beskrivs. Mer information kommer att ges att reda ut hur dessa olinjäriteter påverkar bilder av enskilda nanopartiklar och hur spatial upplösning kan förbättras i enlighet med SAX-tekniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. GNS Provberedning
- Innan du förbereder provet Sonikera 1 ml GNS kolloid lösning under minst 15 minuter vid ca 40 kHz för att förhindra partikelaggregation, vilket kan leda till att LSPR toppen att flytta.
- Drop 100-200 il GNS kolloid på ett objektglas med kommersiell magnesiumaluminiumsilikat (MAS) beläggning för att fixera GNSS.
- Efter minst en minut, ta bort den extra kolloiden genom spolning med destillerat vatten. Väntetiden beror på den erforderliga täthetsfördelningen av GNSS. Typiskt 1-3 min resulterar i en lämplig densitet som gör att partiklarna lätt identifieras eftersom de flesta av dem är isolerade från varandra. Betydande aggregation kan uppstå om väntetiden är för lång.
- Torka provet genom spolning med kvävgas.
- (Tillval) För att kartlägga GNSS på glaset med hög upplösning, utföra svepelektronmikroskop (SEM) i detta skede 23. Ett exempel bild ges i Figure 1, som visar den karakteristiska tätheten av GNSS. Använd en fältemissions SEM att hämta bilden. När oljan tillsätts på provet (nästa steg), kommer det att bli svårt att ta bort olja och observera provet med SEM.
- Tillsätt en droppe av olja med samma brytningsindex på provet för att täcka GNSS och att eliminera den starka reflektionen från glassubstratet.
- Placera ett täckglas över provet och försegla den med nagellack.
- Vänta minst 5 minuter tills nagellack torkar. Provet är klar nu.
2. Anpassning av hembyggda konfokalmikroskop
- Se figur 2 för systemet för installationen. Rikta den vita ljus belysning väg mikroskopkroppen själv. Slå på halogen ljuskälla av mikroskopet och följ mikroskop tillverkarens manual för att uppnå Köhler belysnings skick. Kontrollera att de vita halogen ljusstrålarna är nästan parallellt på baksidan avöppning av målet, delvis reflekteras av den 50/50 stråluppdelaren, och sedan fortplantar sig mot lasern.
- Slå på galvano speglar för att se till att de förblir på rätt utgångsläge, det vill säga i mitten av scanningsområdet.
- Placera minst två mål, som gjorts av ett tunt pappersark med koncentriska ringar på den, längs halogenljus vägen, och anpassa dem med halogen trålen.
- För att utföra avbildning, välj 532 nm laser. För att utföra spektroskopi mätningar väljer super-kontinuum laser. Under inriktningen bör kraften i lasrar vara mindre än 10 ^ W på baksidan öppning av målet att undvika olinjäritet. Sedan, kolli den infallande laserstrålen motsatt utgående halogen strålen med hjälp av de två målen. När processen är slutförd, har grovinriktning av laserstrålen har uppnåtts.
- Rikta laserstrålen genom mitten av den bakre öppningen av objektivlinsen. Normalt använder en oil-immersionsobjektiv. Tillsätt en droppe av olja mellan oljeimmersionsobjektiv linsen och GNS provet. Använd ett fotomultiplikatorrör (PMT) som detektorn för att samla spridningssignalerna från GNSS.
- Placera ett litet hål 20-um-diameter framför PMT att blockera ut-fokus scattering signaler. Slå på galvano speglar och PMT (via hembyggda programvara), justera hål position och höjd av provet scenen för att maximera bakåtspridning signalerna från GNSS, och sedan följa en individ GNS på en datorskärm. Ett prov xy bild av GNSS med korrekt inriktning visas i figur 2B.
- Något ändra höjden av provet scenen för att kontrollera koncentriciteten av fokus. Om det inte är koncentriskt, justera strålen med de två speglarna framför skannern tills mitten av GNS förblir i samma position medan höjden av provsteget ändras. Kontrollera att xz bilden av PSF liknar fig 2Cför att säkerställa korrekt ljushöjden. Behandla dessa två bilder med låg-pass och Gaussiska släta filter.
3. Karakterisering av Scattering Nonlinearity
- Vid låg excitationsintensiteten (mindre än 10 4 W / cm 2), få en bild av guldnanopartiklar genom att följa protokoll 2.6.
- Öppna bilden i ImageJ (eller någon annan mjukvara för bildanalys). Rita en linje tvärs över en av GNSS i bilden (se figur 2B), och använd analys -> Plot profil ImageJ verktyg för att hämta spridningsintensitetsprofilen. Passar profilen av den valda PSF enligt en Gauss-funktion:
där y är PMT utlästa värdet, y är 0 bakgrundsvärdet (om någon), A är toppamplituden, w är bredden, x är den rumsliga koordinaten, och Xc är centrum coordinate hos den Gaussiska funktionen. FWHM av motsvarande PSF är (½ln2) w. Baserat på den numeriska bländaröppningen (NA) i målet, kan det teoretiska FWHM av konfokala PSF uppskattas vara ungefär 0.43l / NA, där l är excitationsvåglängden. Jämför dessa två nummer för att kontrollera inriktningen av avbildningssystemet. - Öka excitationsintensiteten genom att manuellt ändra neutral densitet (ND) filter i figur 2A, och spela in bakåtspridning bilder på varje intensitetsnivå. Ta värdet av spridningssignalen från centrum av vardera GNS vid olika exciterings intensiteter, och plotta kurvan för spridningssignaler kontra exciteringsintensitet. Kontrollera linjäritet de första punkterna, som bör uppvisa ett linjärt förhållande när excitationsintensiteten är adekvat låg. Rita en linje baserat på linjär montering av de första punkterna. Om spridningsintensiteterna för de efterföljande punkter ner under denna linjär trend, saturation har inträffat.
- Efter att ha konstaterat mätt spridning, gradvis minska intensiteten under tröskel mättnad och bild samma GNSS igen för att säkerställa reversibilitet olinjära beteenden.
4. Mätning av en Scattering spektrum av ett gemensamt Gold Nanosphere
- För att mäta bakåtspridning spektrumet från en enda GNS använder super-kontinuum laser laserkällan. Den inledande våglängden för laser varierar från 450 nm till 1750 nm. För att ta bort överskottet av infraröda kraft som kan orsaka skada på provet och de optiska komponenterna, placera en eller två speglar direkt efter super-kontinuum laser för att reflektera synligt ljus, och använder balk tippar att samla överskottet infrarött ljus.
- Följ inriktningsförfarandena i avsnitt 2 att rikta super kontinuum laser i laserskanning konfokalmikroskop. Använd en bredbands 50/50 BS för att säkerställa spektral täckning över hela synliga området.
- Förvärvabild av GNSS på glas. Leta en enda GNS i bilden, och låsa fokus av det infallande bredbands ljuset på partikeln.
- Använd en vändning spegel framför PMT att rikta bakåtspridning signalen mot spektrometern, som är utrustad med en laddningskopplad enhet, och sedan ta ett spektrum av de utvalda enskilda GNS. Var försiktig så att spektrumet här är en blandning av GNS spridning och bakgrunden på grund av reflektioner från andra ytor.
- Växla tillbaka till PMT detektor, och ta en annan bild för att bekräfta att partikel läget inte har ändrats. Sedan, flytta fokus till en punkt vid vilken ingen partikel är närvarande. Växla tillbaka till spektrometern och ta en mer spektrum, som representerar bakgrunden.
- Subtrahera bakgrunds spektrumet från steg 4,5 från spektrumet från steg 4,4 för att erhålla en tydlig bakåtspridning spektrum av en enda GNS.
5. Anpassning av SAX Mikroskop
- Se Figur 3för systemet i SAX mikroskop, där en perfekt sinusformad tidsmodulering erhålls från svävningsfrekvensen mellan två akustooptiska modulatorer (AOMs). Först justera strålen storleken på laser för att uppfylla kravet på efterföljande AOMs. Split 532 nm laserljus i två strålar med hjälp av en 50/50 stråldelare.
- Guide de två strålarna genom de två AOMs, med en stråle som passerar genom varje AOM. De modulerande frekvenserna för de två AOMs måste vara olika. Exempelvis kan en vara vid 40,000 MHz och den andra vid 40,010 MHz, vilket ger en frekvensskillnad av 10 kHz. Denna skillnad frekvens vara den grundläggande moduleringsfrekvensen fm för SAX signalerna.
- Ta den första ordningens diffrakterade strålarna från båda AOMs, och kombinera de två strålarna genom att använda en annan 50/50 stråldelare. Justera speglarna efter AOMs att kollimera de två strålarna.
- Lägg till en fotodetektor som är ansluten till ett oscilloskop för att övervaka den tidsmässiga modulation. Dela upp en liten del av lasern med ett objektglas, och skicka den till fotodetektorn, såsom visas i fig 3. Med korrekt modulering och balk överlappning, observera sinusformig intensitetsmodulering vid huvudfrekvensen f m, liknande den hos den vågform som visas i fig 4.
Obs: Bakgrunden av moduler måste vara så låg som möjligt för att uppnå den maximala moduleringsdjupet. Dessutom använder Fourier analysfunktion av oscilloskopet att kontrollera att harmonisk distorsion av moduleringen minskar. För att uppnå ett framgångsrikt genomförande SAX, säkerställa en perfekt sinusformad exciterings intensitetsmodulation med minimerad initial olinjäritet. - Koppla den elektriska utsignalen från fotodetektorn av oscilloskopet och ansluta till referensingången på en synkroniseringsförstärkare.
- Såsom visas i fig 3, rikta laserstrålen i det konfokala systemet efter de föregående protokollen. Here ansluter elektriska utsignalen från PMT till lock-in förstärkare som signalingång.
- Använd en tom täckglas som prov, och kontrollera linjäritet hos den elektriska detektionssystemet genom att gradvis öka exciteringsström ,, såsom visas i fig 5, där detektorn är linjär under en utläsning värde på 1-V. I alla efterföljande mätningar, vara noga med att hålla avläsningen till under detta värde.
- Ställ utsignalen från lock-in-förstärkare för att exportera den absoluta storleken hos spänningssignalen. Genom att ändra den harmoniska komponenten inställningen på referenskanalen, erhålla amplituder i SAX signaler, A 1, A 2, och så vidare.
- Exportera de linjära och icke-linjära signaler från synkroniseringsförstärkare till ett datainsamlingskort, som även mottar de drivande spänningssignalerna hos rasteravsöknings Galvano speglar. Med hjälp av en anpassad Labview program, synkronisera signalerna från lock-in förstärkare ochGalvano speglar att bilda en bild.
- För att optimera signal-brusförhållande på bilderna, välj ett lämpligt pixel förvärv och integrationstider av lock-in förstärkare. Till exempel, när huvudmoduleringsfrekvensen fm av excitation är 10 kHz, det vill säga när den perioden är 100 ^ sek, ställa in integrationstiden för inlåsningsförstärkare vara minst tre gånger längre än den period. Lägga tiden för galvano spegelrörelse, är förvärvshastigheten inställd på 1500 pixlar per sekund i SAX bildläget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 visar det uppmätta spektrat från en 80 nm GNS. En beräknad kurva baserad på Mie teorin ges i samma tomt, visar utmärkt överensstämmelse. Den LSPR toppen är cirka 580 nm. I följande experiment, laservåglängden var 532 nm, som valdes eftersom det ligger inne i plasmoniska bandet för att öka optisk spridning med plasmoniska effekt och möjliggöra spridning mättnad 21.
Figur 7 presenterar spridnings bilder av en enda guldnanopartiklar på olika exciteringsnivåer, och den nedersta raden ger linjeprofilen för varje partikel för att markera olinjäritet. Bildstorleken är 600 nm × 600 nm, och pixelstorleken är 13,8 nm. Förvärvshastigheten var 234.000 bildpunkter per sekund i den normala xy bildläget. Varje bild var i genomsnitt över fem förvärv för att förbättra signal-brusförhållandet.
När exciteringsintensiteten är lägre än1,5 x 10 6 W / cm 2, är spridnings linjärt beroende av exciteringsintensitet, så den resulterande bilden av en enda nanopartikel liknar PSF av excitationsstrålen, har en normal Gaussisk profil. När emellertid excitationsintensitet ökar till 1,7 x 10 6 W / cm 2, inte bara tydligt plattning på toppen av PSF: observeras, men också breddning av FWHM, indikerande mättnad. Mycket intressant, vid något högre intensiteter, blir den centrala intensitet lägre än den perifera, vilket resulterar i en donut-formad polyesterstapelfibrer. Sedan, när excitationsintensitet fortsätter att öka, ökar spridningsintensiteten igen, avslöjar omvända mättnad och resulterar i en ny topp i mitten av PSF.
Genom att avsätta de centrala intensiteter mellan vävda vid olika exciterings intensiteter, är spridningsintensiteten beroende erhölls, såsom visas av prickarna i figur 8. Denna kurva clearly avslöjar trender mättnad och omvända mättnads beteenden. Som väntat, ser det mycket lik den intensitet beroende av olinjära absorption 15-17. Efter den typiska metod för att analysera icke-linjär absorption framställdes en polynom funktion som används för att passa den icke-linjära spridningsresultatet. Men, till skillnad från de flesta icke-linjära absorption studier, där tredje ordningens olinjäritet är tillräckligt för att modellera resultaten här femte ordningens olinjäritet krävdes för att bättre passa spridningskurvan.
Som nämns i avsnitt 5, kan de harmoniska frekvenskomponenter experimentellt heras genom en lock-in-förstärkare, och resultaten ges i Figur 9A. Å andra sidan kan de harmoniska komponenterna beräknas från figur 8. Använd först en polynomfunktion, där jag är excitationsintensiteten, för att passa figur 8, så vi har monterings parametrarna α, β, γ .... Vi kan sedan uttrycka excitation intenshet som en tidsmässigt modulerad funktion I (t) = I 0 (1 + cos (2 πf m t)) / 2, där t är tiden, f är m modulationsfrekvensen, och jag 0 är den maximala exciteringsintensitet. Genom att ersätta I (t) till S (I), och göra en Fourier-transform för att omvandla det resulterande S (I (t)) i frekvensdomänen, har vi följande ekvation består av flera deltafunktioner (ö):
Koefficienten för varje deltafunktion (A 0, A 1, A 2, etc) representerar amplituden av SAX signalen vid den motsvarande övertonsfrekvens. Dessa koefficienter, som motsvarar SAX signal styrkor vid olika övertoner, kan skrivas som funktioner av de passande parametrar a, p, γ ...:
Beräkningsresultaten visas i figur 9B. De experimentella och beräknings tomter överens noga, särskilt i de följande två aspekter.
Först kurvorna av 2 fm och 3 fm är ojämna, visar dips vid specifika intensiteter längs kurvorna. I båda figurerna, finns det tre nedgångar i de två f m kurvor, medan två dips ses i 3 f m kurvor. För det andra, i backen är olika med olika exciteringsnivåer. När excitationsintensiteten är inte hög, sluttningarna av en fm, 2 fm och 3 fm är 1, 2 och 3, respektive. Men efter varje dopp, sluttningarna av motsvarande olinjära kurvor blir större.
Med dips och lutningsvariationer, är okonventionella vävda förväntas om olinjära komponenter extraheras via SAX tekniken, när excitationsintensitet ökar över dips. Figur 10A visar SAX bild exempel på en fm, 2 fm och 3 f m frekvenskomponenter vid olika exciterings intensiteter. I den första raden, är exciteringsintensiteten 0,7 mW / cm 2, vilket är tillräckligt för att inducera de olinjära komponenter, men amplituden är relativt svag. Vid denna intensitetsnivå, är lutningen hos den 2 fm signalen 2, och det är 3 för 3 fm-signal, såsom visas i fig 9A. Om exciteringsintensitet ökar till nivån för den första dip av 2 fm-signalen, de SAX bilder av tvåfm-signalen blir munk formad, såsom visas i den andra raden i figur 10A. Både 1 f m och 3 f m bilder förblir fast, medan FWHM av de 3 fm PSF är betydligt mindre än den 1 fm signal, manifesterar anmärkningsvärd upplösning förbättring. Från signalprofilen vid den högra panelen i samma rad, FWHM av 2 fm munkring är ca 110 nm. Å andra sidan, den tredje raden i Figur 10A visar att när excitationsintensiteten ökar till den första dopp i 3 fm signal, blir bara 3 fm bild donut formad, med en 65 nm årsring. Vid denna intensitet, är anmärkningsvärt upplösningsförbättring hittades när man jämför 2 fm signal till en fm ett.
Figurerna 10B och 10C visar beräknade PSFs av de 2 f m och 3 f m signaler, respektive, vid motsvarande intensiteter som resulterar i munk former. Beräkningarna baserades på polynomet passande kurvan i figur 9B. De beräknade kurvorna väl reproducera egenskaperna hos de experimentella vävda i längst till höger paneler i figur 10A, bekräftar återigen lämpligheten av ett femte ordningens polynomanpassning för olinjära spridning.
Figur 1. SEM-bild av GNSS. Genom att utföra framställningsprocesser som beskrivs i den första delen av protokollet, tillräckligt separerade GNSS iakttas. Med mer än 100 nm mellan GNSS, deras LSPR effekter som inte kopplade till varandra. Skala bar:. 100 nm Klicka här för att seen större version av denna figur.
Figur 2. (A) Inställning av hembyggda konfokalmikroskop 24. (B) xy bild med GNSS på fokus. 2 (c). Xz bild av PSF med korrekt inriktning Det finns två laserkällor för detta system. Den ena är en 532 nm kontinuerligt-vågor arbetande laser, och den andra är en pulsad super kontinuum laser. Vid mätning av spridningssignaler, var ett 532 nm kontinuerlig-våg laser som används som källa och en PMT såsom detektor (med en laserlinjefilter isatt). För att mäta spektrumet, var en super-kontinuum laser antas som laserkälla och en spektrometer som detektorn. Den valda lasern sänds genom en uppsättning av neutrala densitetsfilter för att styra exciteringsintensitet. En 50/50 stråldelare styr lasern i svepmikroskop och möjliggör hälften av bakåtspridningssignaler iPM T eller spektrometer, som väljs av en vändning spegel. I skanningssystemet, finns två Galvano speglar som bildar vertikala och horisontella rasterskanning i fokalplanet av ett mål. Den bakåtspridning samlas in av samma mål och omvandlas till elektriska signaler av detektorerna. Signalerna är synkroniserade med det konfokala avsökningssystem för att bilda bilder. PI stadiet användes för att förvärva xz bilden genom att flytta GNSS axiellt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Inställning av SAX mikroskopi. De flesta komponenter är desamma som de som erhållits från en konfokalmikroskop (röd rektangel), men sinusformad modulering sattes till excitation laserstrålen. Blå rektangel visar modultören setup. Först var excitation laser uppdelad i två strålar och för sig skickas via två AOMs att producera högfrekventa moduleringar med lite olika frekvenser. Därefter har de två modulerade strålarna kombineras för att producera sinusformad modulation vid svävningsfrekvensen mellan de två AOMs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Modulering av kombinerade strålar efter AOMs mätt med oscilloskop. Y1 och Y2 anger maximal (52,1 mW) och minimum (1,2 mW) värden för moduleringsintensitet, respektive. Y2 bör vara noll för att uppnå perfekt modulering. Aktuell modulationsfrekvensen var 10 kHz. Klicka här för att se en storr version av denna siffra.
Figur 5. Linjäritet test av detektionssystem. Genom att placera ett täckglas på fokalplanet, var en återspegling av excitation laser från glas / luftgränssnittet används för att kontrollera linearitet detektionssystemet. Utsignalen kontra excitationsintensiteten visar linjäritet under en avläsning värdet 1-V. Dessutom är ljudnivån väl under 10 -4 V, så att systemet ger en dynamisk räckvidd på minst 10 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Scattering spektrum av 80 nm GNS. Röda prickarna visar experimental mätningar och svarta linjen representerar beräkning från Mie teori. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Scattering bilder av GNS från linjära att vända mättnad. Översta raden visar återspridningen bilder, och nedersta raden ger signalprofiler av utvalda nanoparticle vid olika exciteringsintensitet. Övergång från linjäritet till mättnad att vända mättnad tydligt observeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Spridningsintensitetenkontra excitationsintensiteten från enstaka GNS. Blå prickar motsvarar spridningsnivåer i mitten av PSF på olika exciteringsnivåer, visar mycket olinjära svar, inklusive mättnad och omvänd mättnad. Röd kurva visar passnings kurva baserad på femte ordningens polynomfunktion. (Bilder reproduceras från Ref. 25). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Intensitet beroenden av SAX signaler enligt (A) experiment och (B) beräkning. (A) SAX signaler extraherades genom lock-förstärkare, och varje försöksdatapunkt var i genomsnitt över fyra 80 nm GNSS. Prickade linjer indikerar sluttningarna av SAX signaler 25. (B) Efter protokoll 5, SAX signals beräknades baserat på femte ordningens polynomanpassning i figur 8. (Bilder reproduceras från Ref. 25) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. SAX bilder på olika exciteringsnivåer. (A) Experimentellt observerade en fm, 2 fm och 3 f m SAX bilder på olika exciteringsnivåer. Pixelstorlek är 20 nm, och varje bildstorlek är 750 nm × 750 nm. Intensitetsprofiler av munkar på 2 fm och 3 fm plottas i längst till höger paneler. (B) Beräknad bild profil 2 fm bild på 0,75 MW / cm2. (C) Beräknad bild profil 3 f </ em> m bild på 1,1 MW / cm2. (Bilder reproduceras från Ref. 25). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollet finns det flera viktiga steg. Först när framställning av proverna, tätheten av nanopartiklar bör inte vara för hög, för att undvika plasmoniska koppling mellan partiklar. Om två eller flera partiklar är mycket nära varandra, kopplingsresulterar i LSPR våglängden skiftar mot längre våglängder, vilket avsevärt minskar olinjäritet. Men denna avbildningsteknik faktiskt kartor fördelningen av plasmoniska lägen, i stället för själva partiklarna. Därför förväntas det att med en lämplig excitationsvåglängd, kan de kopplade plasmoniska lägen också visa stark spridnings olinjäritet och kan avbildas med förbättrad upplösning. För det andra är det mycket viktigt för framställning av ren sinusformad modulering i exciteringsstrålen, därigenom motivera användningen av slå mellan de två AOMs. Eftersom upplösningsförbättring bygger på att utvinna icke-linjära delar (harmoniska frekvenskomponenter) av spridningssignalmodulering, om icke-linjärförvrängning är närvarande i exciteringsmodulering, sedan extraktion kommer att bli svårare. Dessutom i det nuvarande systemet är en interferometer inställning används för att framställa misshandeln modulation, så anpassningen av de två strålarna i interferometern är också avgörande för att nå så stor av en moduleringsdjup som möjligt. För det tredje är det mycket viktigt att se till att signal olinjäritet inte uppkommer från detekteringssystemet (som innefattar detektorn, förstärkare, A / D-omvandlare, och dator-I / O). Därför är det nödvändigt särskild uppmärksamhet för att garantera att detekteringssystemet arbetar inom det dynamiska området. Det dynamiska området definieras som den region i detekteringssystemet linjäritet, det vill säga från brusnivån till detektor mättnad. I det aktuella fallet är den detekterade spänningssignalen linjär under 1 V, och ljudnivån är lägre än 10 -4 V. Därför ger systemet en dynamisk räckvidd på minst 10 4. För att säkerställa att signalen olinjäritet härrör frånguldnanopartiklar i sig, inte från detektionssystemet, är det nödvändigt att bibehålla det utlästa värdet inom det dynamiska området. Den fjärde kritiska faktorn är den mekaniska stabiliteten av provet. Under olinjäritet karakterisering, är det väsentligt att nanopartiklarna förblir i samma fokalplan. Axiell driften av nanopartiklar eller provstadiet skulle allvarligt påverka noggrannheten av olinjäritet bedömning. Därför när man arbetar med nanopartiklar, är det viktigt att hitta partiklar som inte lätt röra sig under lätt excitation. Å andra sidan är det också möjligt att arbeta med prover som odlas från litografi. I detta fall är mikroskopisk skede stabilitet huvud begränsande faktor. Det finns steg med positionen återkopplingsstyrning som kraftigt kan öka stabiliteten. Alternativt, eftersom scenen rörelse är vanligtvis mycket långsam (t.ex. en mikrometer i 10 min), är det bra att få en xyz 3D-bild stack, såsom 10 bilder med 100 nm axial separation mellan angränsande bilder, vid varje olika intensitetsvärde. Sedan under analysstadiet, bör den ljusaste bilden av varje stapel väljas som den representativa bilden på den intensitet.
I princip, resolutionen av mättnadsbaserade tekniker, som omfattar SAX och mättad strukturerad-belysning mikroskopi (SSIM) 26, uppvisar ingen undre gräns så länge kan uppnås högre ordning olinjäritet (högt övertonsfrekvenskomponenter). Men i praktiken är upplösningen begränsad av signal-till-brusförhållande (SNR), speciellt vid extrahering högre ordningens harmoniska demodulering komponenter. Det finns några strategier som kan förbättra SNR. Exempelvis har det visat sig att modulationsfrekvensen påverkar allvarligt SNR 27. Det är också möjligt att förbättra SNR genom att beräkna intensitetsskillnad mellan icke-mättade och mättade signaler till extraktion av enbart den mättade signalen (manuskript under utarbetande).
28-30, ellergenom mättnad av fluorescensemission 22,26,31. Men uppvisar fluorescens en inneboende problem med fotoblekning, särskilt under starkt ljus belysning. Denna studie visade att mätt spridning av GNSS är en lovande metod för super-resolution mikroskopi, eftersom det inte finns någon blekning fråga 21. Jämfört med tidigare studier av SAX mikroskopi utnyttjar fluorescens, upplösningen förbättring med mätt spridning var mycket högre i denna undersökning, möjligen på grund av den högre ordningens olinjäritet 22. Dessutom, det finns andra än SAX mikroskopi annan super-resolution teknik baserad på mättnad: SSIM 26. SSIM utnyttjar rumslig modulering av fransar att extrahera icke-linjära signaler, medan SAX mikroskopi utnyttjar tidsmodulering. Med mättnads egenskap av denna icke-blekspridning, är det därför troligt att denna upptäckt kan kombineras med SSIM att förbättra den rumsliga upplösningen i brett fält sjukumination.
I framtida tillämpningar, kommer detta plasmoniska SAX tekniken vara till nytta inte bara för att lösa resonans-mode distributioner och dynamik i plasmoniska kretsar, men också att förstärka upplösningen av biologisk vävnad avbildning. Liknande upplösningsförbättring har visats med andra plasmoniska material såsom silver (opublicerad), samt icke-plasmoniska material, såsom kisel 32. I super-upplösning bildfältet, har SAX mikroskopi fördelar i flera avseenden. Jämfört med stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM) och fotoaktiverad lokaliserings mikroskopi (PALM), har SAX mikroskopi en snabbare avsökningshastighet av endast ett fåtal sekunder per bild. Jämfört med stimulerad utarmning emission (STED) mikroskopi är bara en laser som krävs för SAX mikroskopi, vilket avsevärt minskar den optiska komplexitet. Jämfört med SSIM, upplösningen av SAX samtidigt förbättrats både sido och axiella riktningarna. Förutomuppnå en tillräcklig bilddjupet, är slumpmässig spridning längs strålgång excitation eller insamling kritisk. För brett fält tekniker som STORM, PALM, och SSIM är bilder tagna med en kamera, som är mycket känslig för slumpmässiga spridningen av utsända fluorescensfotoner i vävnader. För punkt-scan tekniker som STED och SAX, är fluorescenssignalerna samlas in av en punkt detektor, så att de är mer robusta mot vävnadsspridning. Ändå kräver STED en fasplatta att skapa en donut strålprofil i fokus, och informationsfasen kan försämrats under balk utbredning i vävnader. Därför bör SAX mikroskopi vara bäst bland dessa villkor för superupplösning djupa vävnaden avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope body | Olympus, Japan | BX-51 | |
| objective lens | Olympus, Japan | UPlanSapo, 100X, NA 1.4 | |
| 80-nm gold colloid | BBI Solutions, UK | EM.GC80 | |
| supercontinuum laser | Fianium, United Kingdom | SC400-2-PP | |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, USA | BB1-E02 | |
| field emission SEM | JEOL, Japan | JSM-6330F | optional |
| spectrometer | Andor Technology, UK | Shamrock 163 | |
| charge-coupled device | Andor Technology, UK | iDus DV420A-OE | |
| acousto-optic modulators | IntraAction Corp., USA | AOM-402AF1 | |
| lock-in amplifier | Stanford Research Systems, USA | SR-830 | |
| MAS-coated slide glass | Matsunami Glass, Japan, | S9215 |
References
- Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. Sub-diffraction-limited optical imaging with a silver superlens. Science. 308 (5721), 534-537 (2005).
- Lee, B., Kim, S., Kim, H., Lim, Y. The use of plasmonics in light beaming and focusing. 34 (2), 47-87 (2010).
- Lal, S., Link, S., Halas, N. J. Nano-optics from sensing to waveguiding. Nature Photon. 1 (11), 641-648 (2007).
- Kawata, S., Inouye, Y., Verma, P. Plasmonics for near-field nano-imaging and superlensing. Nature Photon. 3 (7), 388-394 (2009).
- Homola, J., Yee, S. S., Gauglitz, G. Surface plasmon resonance sensors: review. Sensor. Actuat. B-Chem. 54 ((1-2)), 3-15 (1999).
- Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
- Hache, F., Ricard, D., Flytzanis, C. Optical nonlinearities of small metal particles - surface-mediated resonance and quantum size effects. J. Opt. Soc. Am. B. 3 (12), 1647-1655 (1986).
- Balamurugan, B., Maruyama, T. Evidence of an enhanced interband absorption in Au nanoparticles: Size-dependent electronic structure and optical properties. Applied Physics Letters. 87 (14), 143105 (2005).
- Link, S., El-Sayed, M. A. Size and temperature dependence of the plasmon absorption of colloidal gold nanoparticles. J. Phys. Chem. B. 103 (21), 4212-4217 (1999).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Kauranen, M., Zayats, A. V. Nonlinear plasmonics. Nature Photon. 6 (11), 737-748 (2012).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Au nanoparticles target cancer. Nano Today. 2 (1), 18-29 (2007).
- Wada, O. Femtosecond all-optical devices for ultrafast communication and signal processing. New J. Phys. 6 (183), Forthcoming.
- Elim, H. I., Yang, J., Lee, J. Y., Mi, J., Ji, W. Observation of saturable and reverse-saturable absorption at longitudinal surface plasmon resonance in gold nanorods. Appl. Phys. Lett. 88 (8), 083107 (2006).
- Ros, I., Schiavuta, P., Bello, V., Mattei, G., Bozio, R. Femtosecond nonlinear absorption of gold nanoshells at surface plasmon resonance. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (41), 13692-13698 (2010).
- De Boni, L., Wood, E. L., Toro, C., Hernandez, F. E. Optical Saturable Absorption in Gold Nanoparticles. Plasmonics. 3 (4), 171-176 (2008).
- Gurudas, U., et al. Saturable and reverse saturable absorption in silver nanodots at 532 nm using picosecond laser pulses. J. Appl. Phys. 104 (7), 073107 (2008).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and scattering of light by small particles. , John Wiley & Sons Inc. (1983).
- Chu, S. W., et al. Saturation and reverse saturation of scattering in a single plasmonic nanoparticle. ACS Photon. 1 (1), 32-37 (2014).
- Chu, S. W., et al. Measurement of a saturated emission of optical radiation from gold nanoparticles: application to an ultrahigh resolution microscope. Phys. Rev. Lett. 112 (1), 017402 (2014).
- Fujita, K., Kobayashi, M., Kawano, S., Yamanaka, M., Kawata, S. High-resolution confocal microscopy by saturated excitation of fluorescence. Phys. Rev. Lett. 99 (22), 228105 (2007).
- Smith, K. C. A., Oatley, C. W. The scanning electron microscope and its fields of application. Brit. J.Appl. Phys. 6 (11), (1955).
- Yu, J. Y., et al. A diffraction-limited scanning system providing broad spectral range for laser scanning microscopy. Rev. Sci. Instru. 80 (11), 113704 (2009).
- Lee, H., et al. Point spread function analysis with saturable and reverse saturable scattering. Opt. Express. 22 (21), 26016-26022 (2014).
- Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Yonemaru, Y., Yamanaka, M., Smith, N. I., Kawata, S., Fujita, K. Saturated Excitation Microscopy with Optimized Excitation Modulation. ChemPhysChem. 15 (4), 743-749 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Heintzmann, R., Jovin, T. M., Cremer, C. Saturated patterned excitation microscopy - a concept for optical resolution improvement. J. Opt. Soc. Am. A. 19 (8), 1599-1609 (2002).
- Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity. Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).
