Abstract
Использование куриных эмбрионов можно проверить непосредственно эффектами или факторы роста или специфических ингибиторов пути на экспрессию генов и активацией пути передачи сигналов сигнализации. Этот метод позволяет доставку сигнальных молекул на четко определенных этапах развития для конкретных времен. После этого эмбрионы могут быть собраны и изучены экспрессия гена, например, путем гибридизация, или активации путей передачи сигнала с использованием иммунной наблюдаемых.
В этом видео гепарин бисера, пропитанных FGF18 или AG 1-X2 бисера, пропитанных U0126, ингибитора MEK, привиты в зачатках конечностей в яйце. Это показывает, что FGF18 индуцирует экспрессию MyoD и ЭРК фосфорилирования и как эндогенного и FGF18 индуцированной экспрессии MyoD подавляется U0126. Бусы, пропитанные антагониста ретиноевой кислоты может потенцировать индукцию преждевременное MyoD по FGF18.
Этот подход может быть намиред с широким спектром различных факторов роста и ингибиторов и легко адаптировать для других тканей в развивающегося эмбриона.
Introduction
Эмбрионов птиц обеспечили мощный инструмент для изучения развития в течение многих лет 1. Один из их самых полезных характеристик является то, что они относительно легко манипулировать. Внешний разработка позволяет открыть яйцо открыть зародыш и выполнять различные микроманипуляций в том числе такие примеры, как классического перепела-цыпленок химера системы для изучения клеток судьбу 2,3, инъекции ретровирусов для избыточной экспрессии в определенных тканях в ходе развития 4,5 и эксплантов культуры, чтобы определить источники развития сигнализации 6. Совсем недавно химер возникает между немеченых хозяев с трансплантатами из трансгенной линии, экспрессирующей куриного GFP показал, что сочетание классической прививки и генетической модификации может обеспечить важную информацию в развитие 7,8.
Легкость, с которой птичий эмбрион можно манипулировать сделал его отличным модель для изучения конечностьразвитие 9. Применение специфических факторов роста для развивающихся конечностей в естественных условиях играет важную роль в выявлении факторов, которые изменяют паттерна конечностей 10,11 и продолжает оказывать понимание этого процесса 12. Этот подход был также использован для изучения факторов, которые регулируют развитие мышц и обнаружили роли для многочисленных сигналов, таких как Wnts 13 БМП и 14 HGF 15.
В последнее время эта техника была использована для исследования сигналов, контролирующих экспрессию генов в миогенную почки конечности и показал, что взаимодействие между FGF18 и ретиноевой кислоты может контролировать сроки MyoD выражения 16. Используя комбинацию факторов роста и малых молекул, которые могут быть загружены на бусы, а затем непосредственно в привитых определенных тканях в определенных стадиях развития дает возможность вмешаться в практически в любое время и регион в процессе развития. Это была использована для INVEstigate многие процессы, включая сомитов паттерна 17,18, нервной спецификации 19 нервного гребня миграции 20 и расширение 21 оси.
Здесь мы опишем метод пересадки шарики, смоченные в либо факторов роста или ингибиторов в развитии куриные конечности. Это было использовано, чтобы определить влияние этих сигналов на миогенеза путем анализа экспрессии конкретного гена мышечной с в гибридизация. Опишем трансплантатов с использованием либо гепарином, пропитанной шарики, которые используются для факторов роста, или AG 1-Х2, бусы для малых гидрофобных молекул, таких как ретиноевая кислота или низкомолекулярные ингибиторы специфических сигнальных путей. Однако другие шарики, также доступны, которые были использованы для доставки как FGFs 22 и 23 Shh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
О себе Этика: Все эти эксперименты следовать уход за животными и этических принципов в Университете Ноттингема.
1. Подготовка гепарина шариков для прививки
- Вымойте тщательно гепарин шарики в PBS перед использованием. Примечание: бисер можно хранить при температуре 4 ° С в виде суспензии в PBS.
- Выберите шарики для прививки, удалив их из запаса с 20 мкл пипетки в капле 1 мл PBS. Затем с помощью микропипетки установлен в 2 мкл передать шарики в каплю 20 мкл PBS в 3 см чашки Петри. Выберите шарики, основанные на размере и, используя стерео микроскоп рассекает, передать выбранные бусы с наконечником пипетки Р2; те, около 100 мкм диаметр идеально.
- Снимите PBS из бисера. Удалить большую часть жидкости с 20 мкл пипетки и остаточной жидкости под действием капиллярных сил с тонкой часовщиков щипцы. Примечание: Важно, чтобы удалить как можно больше, чтобы рост фактоR не разбавляют при добавлении к гранулам.
- Внесите фактор роста непосредственно на шарики. Для добавления FGF18 0,5 мкл рекомбинантного FGF18 восстановленного в 0,5 мг / мл в 0,1% БСА в PBS. Место несколько капель воды вокруг краев тарелки, чтобы предотвратить испарение жидкости.
- Инкубируйте бусины в течение 1 часа при комнатной температуре. Удалить капли воды из сосуда с помощью пипетки Пастера и поместите на лед готов для пересадки.
- При необходимости (для прозрачных бусин) передача 4-5 бусы до 2% фенола красного, прежде чем прививки, чтобы помочь визуализировать их. Полоскание в PBS до передачи эмбриона.
2. Подготовка AG 1-X2 шариков для прививки
- Перед использованием дериватизации шарики 0,2 н муравьиной кислотой.
- Для этого используйте лопаточку, чтобы передать бисером 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 1 мл 0,2 N муравьиной кислоты и мыть на качалке платформы в течение 1 часа.
- Затем снимите муравьиной кислоты с P1000 пипетки и заменить 1мл воды. Промыть в течение 1 ч и повторить шесть раз, чтобы удалить остатки муравьиной кислоты.
- Удалить оставшуюся жидкость с P1000 пипетки и хранить шарики при 4 ° С. Примечание: Это не нужно, чтобы удалить все остатки воды на этом этапе.
- Удалить небольшой шарик шариков примерно 5-10 мкл объем со склада с помощью небольшого шпателя в 3 см чашки Петри и добавить 1 мл ДМСО (в зависимости от того или растворитель препарата растворяют в). Примечание: Это должно обеспечить несколько сотен шарики, из которых, чтобы выбрать те, нужного размера.
- Затем используйте P2 пипетки набор 2 мкл передать шарики примерно 100 мкм диаметром до капли 20 мкл растворителя в другой 3 см чашке Петри.
- Растворитель удаляют с 20 мкл пипетки и любой остаточный растворитель с 2 мкл пипетки. Замените 20 мкл препарата следует применять.
Примечание: для последовательности растворения лекарственного средства в концентрации 100 мкМ в ДМСО (или которые используют либо растворителем),аликвоту в 20 мкл и хранить при температуре -80 ° С в некоторых низкомолекулярные ингибиторы являются неустойчивыми, и это лучше, чтобы избежать повторного замораживания-оттаивания. При необходимости затем разбавить препарат до желаемой концентрации перед замачивания шарики. Эффективные концентрации могут должны быть определены эмпирически для каждого препарата. - Инкубировать в течение 1 часа. Защищать от света, как многие из этих молекул чувствительна к свету.
- Перед прививкой трансфер 4-5 бусы с p2 пипетки, установленным в 2 мкл в 20 мкл 2% фенола красного, растворенных в воде. Выполните этот шаг, используя стерео микроскоп рассекает визуализировать бисером. Удалить один шарик с тонкой часовщиков щипцы или проволочную петлю и промыть в PBS до передачи эмбриона. Не оставляйте шарики в 2% фенола красного для более чем на 15 мин перед использованием, так как это может привести к потере активности.
3. Подготовка вольфрама Иглы
- Нарезать мелкими вольфрамовой проволоки в 3-4 см длины. Вставьте один кусок проволоки в концестакан пипетки Пастера и расплавить в горелку, чтобы исправить на месте. Подготовка до 10 игл для того, чтобы есть запасные, если они повреждены во время использования.
- Поместите конец провода в паяльную лампу пламени и удерживайте ее там, пока не вольфрама светится белым, а кончик острый (около 2-3 мин). Примечание: При использовании иглы можно очищать и повторно заточены в паяльной лампы по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти иглы также может быть использован, чтобы сделать петли для передачи бусы. Осторожно коснитесь иглу на скамейку, и он будет сгибаться, образуя петлю.
4. Подготовка эмбрионов для бисера трансплантатов
- Выдержите яйца с тупого конца, пока они не достигнут желаемого этап (3-5 дней для большинства почки конечности манипуляций). Использование тупой щипцы кран на тупом конце, чтобы разбить скорлупу, а затем использовать пинцет, чтобы удалить оболочку и подвергать эмбрион. Убедитесь, что мембрана яичной скорлупы удаляется также.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1-2 мл PBS могут быть добавлены с пипетки Пастера, чтобы помочь сэто, если мембрана прилипает к желтка. Аккуратно пипетки PBS на поверхности желтка, понять мембрану с пинцетом, стараясь не повредить желток, и аккуратно выньте ее от яйца. - Удалить до 5 мл белка из яйца с 10 мл шприца и иглы 19 G. Возьмите столько, сколько нужно, чтобы обеспечить эмбрион не вступать в контакт с лентой, используемой для герметизации яйцо как удаление больших объемов может уменьшить выживаемость эмбрионов.
- Для визуализации эмбрион добавить 5-6 капель художников тушь 15 мл PBS, содержащим 100 Е пенициллина и 0,1 мг стрептомицина / мл. Вводят 0.5-1 мл непосредственно под эмбриона с 1 мл шприца и иглы 25 G.
- Добавьте 2-3 мл PBS с 1% фетальной телячьей сыворотки и 100 ед пенициллина и стрептомицина 0,1 мг / мл в яйцо, чтобы обеспечить эмбрион не дегидратации. Использование заточенные часовщиков щипцы удалить желточный мембрану и открыть амнион над развивающихся зачатках конечностей. Убедитесь, что эмбрион не высыхают иПри необходимости, добавить еще PBS / FCS.
ПРИМЕЧАНИЕ: почки конечностей может быть хорошо видно, как парных выростов на фланге эмбриона. На этих стадиях эмбрион превратится такие правая обычно верхний. В результате, как правило, легче привить шарики в правых конечностях и использовать левые контралатеральную управления. - Используйте заостренный вольфрамовой проволоки, чтобы сделать разрез в зачатках конечностей, где шарик будет имплантирован. Избегайте резки всю дорогу через почки конечности, где возможно, хотя у младших стадиях это трудно.
Примечание: В старых эмбрионов (HH стадии 22 и выше) можно выбрать определенные участки почки конечности для прививки, но в более раннем этапе, это труднее, поскольку почки конечности сама мала. Важно также помнить, что почки конечности вырастет мимо валика привитого, так, особенно в младших стадий, шарик будет оставаться в проксимальной конечности. - Возьмите шарик из любой фактор роста или лекарства, используя либо дополнительный штраф ваtchmakers щипцы или петля изготовлена из вольфрамовой иглы. Если шарик, смоченной в любом ДМСО или фенола красного, промыть в PBS до обращения в зародыше. Передача шарик эмбриона с щипцов / проволочной петлей. Затем используйте заостренный вольфрамовой проволоки, чтобы вставить шарик в разрез.
- Добавить 1-2 мл PBS / FCS в яйце гарантируя, что эмбрион хранится увлажненной, но избежать применения непосредственно на самой эмбриона, так как это может привести к повреждению эмбрионов и вызвать шарик быть смещены. Печать яйцо с лентой и вернуться в инкубатор.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В HH стадии 21 MyoD не выражается в развитии конечностей миобластов хотя окрашивание можно увидеть в миотом развивающихся сомитов (рис 1а). Рисунок 1B показывает в гибридизация для MyoD 6 ч после проведения FGF18 борта трансплантата. MyoD индуцируется в миобластов, близких к борта, а нет выражение в контралатеральной конечности. Со прививки шарик, пропитанный в U0126, специфический ингибитор МЕК, блоки FGF18 индукции MyoD (рис 1С). Аналогично привитой U0126 шарик на этапе HH 21 и ищет выражения MyoD после 24 ч уменьшает эндогенную экспрессию MyoD сравнению с необработанным контралатеральной конечности (рис 1D, E).
В зачатках конечностей в стадии HH 19 FGF18 не вызывает MyoD (рис 1F). Однако совместное прививка бисером замачивают в FGF18 и антагонист ретиноевой кислоты BMS493 может преодолеть это и внематочная MyoD обнаружено (FIGUповторно 1G)
Чтобы подтвердить, что FGF18 действует через MEK эмбрионов собирали 1 ч после борта трансплантата и иммунологически для фосфорилированного ERK, цель МЕК. Рис 1H показывает светлое изображение на FGF18 борта 1 ч после прививки в то время как рис 1I показывает, что FGF18 вызывает быстрое фосфорилирование Эрк вокруг привитого шарик. рис 1J показывает наложение этих изображений. Бусины управления замачивают в 0,1% BSA не вызывать ERK фосфорилирования (рис 1K, L, M)
Рисунок 1. MyoD выражение в конечностях регулируется FGF18 и ретиноевой кислоты через ERK фосфорилирования. Unmanipulated конечности контроля на стадии HH 21 не выражают MyoD (A), но преждевременная выражение обнаружено 6 ч после прививки FGF18 шарик (Б). Co-прививки FGF18 и U0126 бисер блоки эта индукция (С). Эндогенную экспрессию MyoD видно на стадии HH 21 (D), но это блокируется путем прививки шарики, пропитанные U0126 (E). В более ранних почек конечностей выражение преждевременно MyoD не индуцируется FGF18 (F), но индуцируется совместно прививки бисера пропитанные FGF18 и антагониста ретиноевой кислоты BMS493 (G). FGF18 шарики привитые в HH21 конечностей вызывают ERK фосфорилирования после 1 часа: светлого (H), флуоресцентный (I) и объединены (J) изображения с HH21 конечности иммуноокрашиванию для анти-phosphoERK. Бисер управления, пропитанные BSA не вызывать ERK фосфорилирования: (K), флуоресцентный (L) и объединены (M) изображения с HH21 конечности иммуноокрашиванию для анти-phosphoERK. Эта цифра была изменена с Мок и др 2014 16. Черные звездочки: гепарин шарики; белый астеРиски: AG 1-X2 шарики; Стрелки показывают внематочной выражение MyoD в зачатках конечностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование бортовых трансплантатов, применяемых непосредственно к разработке тканей в яйце является мощным инструментом для анализировать роль сигнализации фактора роста во время развития дает беспрецедентный контроль над стадии развития, на которой они применяются и продолжительности воздействия.
Выбор валика для каждого типа молекулы важно. Небольшие гидрофобные молекулы, такие как ингибиторы, описанные здесь и ретиноевой кислоты, как правило, связывают с дериватизированный хорошо AG 1-X2 бисером, хотя это необходимо для проверки эффективности каждого ингибитора на этих шариков эмпирически. Аналогично, для факторов роста может быть необходимо, чтобы проверить различные типы шарика. Некоторые шарики являются прозрачными и поэтому может быть трудно визуализировать во время манипуляций, но короткий лечения фенола красного с последующим ополаскиванием в PBS в маркируют их достаточно долго, чтобы выполнить трансплантат.
При подготовке шарики, особенно те, которые были пропитаны ингибиторомс, важно, чтобы защитить их от света, насколько это возможно. Во время начального лечения и в течение манипуляций они должны быть покрыты и удаляется только при бисер передаются. Лучше всего использовать свежий талой аликвоты, как некоторые из этих реагентов являются нестабильными и могут дать вводящие в заблуждение результаты, если негативные не сохраняются должным образом. Важно также, чтобы не оставить их замачивания в фенолового красного слишком долго, прежде чем прививки, поскольку это может привести к снижению эффективности борта.
Концентрации, используемые для этих бортов трансплантатов, из обоих факторов роста и препаратов, часто очень высока; FGF18 шарики замачивают в концентрации 0,5 мг / мл и бисером для низкомолекулярные ингибиторы часто смоченной в концентрации 100 мкМ. Хотя это значительно выше, чем концентрации, как правило, используются для лечения клеток в растворе это необходимо, как количеств факторов роста и препаратов, поглощаемых бисера, а затем освобождены трудно непосредственно измерять но предположительно родовте более низкие уровни, чем это в естественных условиях. В результате диапазон концентраций должны быть проверены на каждую молекулу, используемой для определения эффективной дозы.
Этот метод также применим к широкому кругу других тканей, таких как сомитов 24, во время разработки и могут быть использованы на эмбрионах в яйце или в культурах, таких как культура EC 25. Кроме того, можно выращивать культуры клеток, секретирующих специфические факторы роста, как гранулы, которые затем могут быть привиты к развивающихся эмбрионов таким же образом 26.
Сочетание доступности, легкости манипуляции и низкой стоимости делает куриных эмбрионов отличная модель развития. Как трансгенные технологии все чаще применяются для видов птиц и генетически модифицированных линий обеих кур и перепелов 7 27 стали доступны сочетание классической эмбриона прививки методы с этих модифицированных птиц уже оказывает новые идеи в девития 8,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
