הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Abstract

שימוש בעוברי עוף אפשר לבדוק ישירות את ההשפעות של שני גורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות על ביטוי גנים והפעלה של מסלולי העברת אותות. טכניקה זו מאפשרת המשלוח של מולקולות איתות בשלבי התפתחות מוגדרות במדויק לזמנים מסוימים. לאחר ניתן לקצור זו עוברים וביטוי גנים בדקו, למשל, על ידי הכלאה באתר, או הפעלה של מסלולי העברת אותות נצפו עם immunostaining.

בחרוזים זה וידאו הפרין הספוג בFGF18 או חרוזים 1-X2 AG הספוג בU0126, מעכב MEK, הם מורכבים לניצן האיבר באוב. זה מראה כי FGF18 גורם ביטוי של Myod וזירחון ERK וביטוי Myod שני אנדוגני וFGF18 המושרה הוא מעוכב על ידי U0126. חרוזים הספוגים באנטגוניסט חומצה רטינואית יכולים להגביר אינדוקציה Myod מוקדמת על ידי FGF18.

גישה זו יכולה להיות לנואד עם מגוון רחב של גורמים שונים צמיחה ומעכבים ומותאם בקלות לרקמות אחרות בעובר המתפתח.

Introduction

עוברי עופות סיפקו כלי רב עוצמה ללימוד פיתוח במשך שנים רבות ^1. אחד מהמאפיינים השימושיים ביותר שלהם הוא שהם קלים יחסית לתמרן. פיתוח חיצוני מאפשר לפתוח את הביצה כדי לגשת לעובר ולבצע micromanipulations השונים, כולל דוגמאות, כגון מערכת הכימרה שליו-חומוס הקלאסית ללימוד תא גורל ^2,3, ההזרקה של רטרווירוסים לביטוי יתר ברקמות ספציפיות במהלך פיתוח ^4,5 ותרבות explant לזהות מקורות איתות התפתחותית ^6. לאחרונה מפלצות שנוצרו בין מארחים ללא תווית עם שתלים מקו עוף מהונדס להביע GFP הראה כי שילוב של השתלה קלסית ושינוי גנטי יכול לספק תובנות חשובות פיתוח ^7,8.

הקלות שבה ניתן להשפיע עובר העופות הפכה אותו מודל מצוין לחקר איברפיתוח ^9. היישום של גורמי גדילה ספציפיים לאיברי פיתוח in vivo כבר סייע בזיהוי גורמים המשנים דפוסי איבר ^10,11 וממשיך לספק תובנות תהליך זה ^12. גישה זו שימשה גם כדי ללמוד את הגורמים המווסתים את התפתחות שרירים וחשפה תפקידים למספר רבים של אותות כגון ¹³ Wnts, ¹⁴ ו ^-15 BMPs HGF.

לאחרונה טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לחקור את אותות שליטה ביטוי גני myogenic בניצן האיבר והראתה כי אינטראקציות בין FGF18 וחומצה רטינואית יכולות לשלוט על העיתוי של ביטוי Myod ^16. באמצעות שילוב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות שניתן לטעון על חרוזים ולאחר מכן השתילו ישירות לתוך רקמות ספציפיות בשלבי התפתחות מוגדרים נותנת ההזדמנות להתערב כמעט בכל זמן ובאזור במהלך פיתוח. זה נעשה שימוש כדי Investigate תהליכים רבים, כולל דפוסי somite ^17,18, מפרט עצבי ^19, הגירה עצבית פסגת ²⁰ והארכת ציר ^21.

כאן אנו מתארים שיטה להשתלת חרוזים ספוגים באו גורמי גדילה או מעכבים לפיתוח גפיים עוף. זה נעשה שימוש כדי לקבוע את ההשפעות של אותות אלה על ידי ניתוח myogenesis ביטוי שריר גן ספציפי עם הכלאה באתר. אנו מתארים שתלים או באמצעות חרוזים הפרין ספוגים, המשמשים לגורמי גדילה, או חרוזים 1-X2 AG למולקולות קטנות הידרופובי כגון חומצה רטינואית או מעכבי מולקולה קטנים של מסלולי איתות ספציפיים. עם זאת חרוזים אחרים זמינים גם אשר היו בשימוש כדי לספק את שני ²² FGFs ושש ^23.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל הניסויים האלה לעקוב אחרי הטיפול בבעלי החיים וקווים מנחים אתיים של אוניברסיטת נוטינגהם.

1. הכנת חרוזים הפרין להארכה

1. לשטוף חרוזים הפרין ביסודיות בPBS לפני השימוש. הערה: ניתן לאחסן חרוזים על 4 מעלות צלזיוס כתרחיף בPBS.
   1. בחר חרוזים להשתלה על ידי הוצאתם מהמנייה עם טפטפת 20 μl לירידת 1 מיליליטר של PBS. לאחר מכן להשתמש micropipette מוגדר 2 μl להעביר חרוזים לירידה של 20 μl של PBS בצלחת פטרי 3 סנטימטר. בחר חרוזים מבוססים על גודל ו, באמצעות סטריאו מיקרוסקופ לנתח, להעביר חרוזים נבחרו עם קצה פיפטה P2; הסובבים 100 מיקרומטר הקוטר הוא אידיאליים.
2. הסר את PBS מהחרוזים. להסיר את רוב הנוזל עם טפטפת μl 20 ואת הנוזל שיורית על ידי פעולת נימים עם מלקחיים שענים בסדר. שים לב: חשוב להסיר כמה שיותר כך צמיחת פקטוr אינו מדולל כאשר הוא הוסיף לחרוזים.
3. פיפטה גורם הגדילה ישירות על חרוזים. לFGF18 להוסיף 0.5 μl של FGF18 רקומביננטי מחדש ברמה של 0.5 מ"ג / מיליליטר בBSA 0.1% ב PBS. מניחים כמה טיפות של מים בקצוות של המנה, כדי למנוע את הנוזל מתאדה מ.
4. דגירה חרוזים עבור שעה 1 ב RT. הסר את טיפות מים מהצלחת עם פיפטה פסטר ומניח על קרח מוכן להשתלה.
5. אם נדרש העברה (לחרוזים שקופים) 4-5 חרוזים 2% פנול אדומים לפני השתלה כדי לעזור לחזות אותם. יש לשטוף בPBS לפני העברה לעובר.

2. הכנת חרוזים 1-X2 AG להארכה

1. לפני שימוש derivatize חרוזים עם 0.2 חומצה פורמית N.
   1. כדי לעשות שימוש זה מרית להעביר חרוזים לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 1ml של 0.2 חומצה פורמית N ולשטוף על פלטפורמה רועדת עבור שעה 1.
   2. ואז להסיר את החומצה פורמית עם טפטפת P1000 ולהחליף עם 1מיליליטר של מים. לשטוף עבור שעה 1 ולחזור על שש פעמים כדי להסיר נותר חומצה פורמית.
   3. הסר נוזל שנותר עם טפטפת P1000 ולאחסן את החרוזים על 4 מעלות צלזיוס. הערה: אין צורך להסיר את כל שאריות המים בשלב זה.
2. הסר גלולה קטנה של חרוזים של כ 5-10 μl נפח מהמניות בעזרת מרית קטנה לצלחת פטרי 3 סנטימטר ולהוסיף 1 מיליליטר של DMSO (או לפי ממס התרופה מומסת ב). הערה: זה אמור לספק כמה מאה חרוזים שממנו ניתן לבחור את הגודל הנכון.
3. לאחר מכן להשתמש פיפטה P2 מוגדרת 2 μl להעביר חרוזים של כ -100 מיקרומטר קוטר לירידה של 20 μl של ממס בצלחת פטרי עוד 3 סנטימטר.
4. הסר ממס עם טפטפת μl 20 וכל ממס שייר עם טפטפת 2 μl. החלף עם 20 μl של התרופה שיש להחיל.
   הערה: לעקביות לפזר את התרופה בריכוז של 100 מיקרומטר בDMSO (או שאי פעם ממס משמש),aliquot לתוך 20 μl ולאחסן ב -80 ° C כמו כמה מעכבי מולקולה קטנים אינם יציבים ועדיף להימנע מהקפאה-הפשרה חוזרת ונשנית. אם יש צורך אז לדלל את התרופה לריכוז הרצוי לפני השרייה חרוזים. ריכוזים יעילים ייתכן שיהיו הצורך לקבוע באופן אמפירי לכל תרופה.
5. דגירה עבור שעה 1. להגן מפני אור רב של מולקולות אלה הם רגישים לאור.
6. לפני השתלת העברה 4-5 חרוזים עם טפטפת P2 מוגדר 2 μl לμl 20 של 2% פנול אדומים מומס במים. לבצע שלב זה באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו לדמיין את החרוזים. הסר חרוז אחד עם מלקחיים שענים קנס או לולאת חוט ולשטוף בPBS לפני העברה לעובר. אל תשאירו חרוזים ב 2% פנול אדומים ליותר מ -15 דקות לפני השימוש כמו זה יכול לגרום לאובדן של פעילות.

3. הכנת מחטי טונגסטן

1. חותך חוט טונגסטן קנס ל3-4 סנטימטר אורך. הכנס חתיכת חוט אחד לסוףפיפטה פסטר זכוכית ולהמס במבער בונזן לתקן בעמדה. הכן עד 10 מחטים על מנת להבטיח כי יש חלקי חילוף אם הם ניזוקו במהלך שימוש.
2. הנח את קצה החוט לתוך להבת מבער ולהחזיק אותו שם עד טונגסטן זוהר לבן והקצה חד (כ 2-3 דקות). הערה: במהלך שימוש המחט ניתן לנקות ו- חידד מחדש במבער בהתאם לצורך.
   הערה: גם מחטים אלה יכולים לשמש כדי להפוך את הלולאות להעברת חרוזים. לגעת בעדינות את המחט לספסל וזה יהיה לכופף כדי ליצור לולאה.

4. עוברים הכנה לתל חרוז

1. דגירה ביצים עם סופו של הדבר הבוטה עד שהם מגיעים לשלב הרצוי (3-5 ימים עבור רוב מניפולציות ניצן האיבר). שימוש בברז מלקחיים בוטה על הקצה הקהה לשבור את הקליפה ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי להסיר את הקליפה ולחשוף את העובר. ודא קרום קליפת הביצה הוא גם הוסר.
   הערה: ניתן להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS עם פיפטה פסטר לסייע בזה אם הקרום נדבק לחלמון. בעדינות פיפטה PBS על פני השטח של החלמון, לתפוס את הקרום עם המלקחיים, נזהר שלא לפגוע בחלמון, ומשוכים בעדינות מהביצה.
2. הסר עד 5 מיליליטר של חלבון מן הביצה עם מזרק 10 מיליליטר ומחט 19 G. קח רק את מה שנחוץ כדי להבטיח את העובר לא ליצור קשר עם הקלטת משמשת לאטום את הביצה כהסרה של נפחים גדולים יותר יכול להפחית את שיעורי הישרדות עובר.
3. כדי להמחיש את העובר להוסיף 5-6 טיפות של דיו הודו אמנים עד 15 מיליליטר של PBS המכיל 100 פניצילין U ו 0.1 מ"ג סטרפטומיצין / מיליליטר. להזריק 0.5-1 מ"ל ישירות תחת העובר עם מזרק 1 מיליליטר ומחט 25 G.
4. להוסיף 2-3 מיליליטר של PBS עם 1% בסרום עוברי עגל ופניצילין 100 U ו 0.1 מ"ג סטרפטומיצין / מיליליטר לתוך הביצה על מנת להבטיח את העובר אינו מייבשים. בעזרת מלקחיים שענים חידדו להסיר את קרום vitelline ולפתוח את amnion מעל ניצני איבר הפיתוח. להבטיח את העובר לא להתייבש ו, במידת הצורך, להוסיף עוד PBS / FCS.
   הערה: ניצני האיבר ניתן לראות צמחים לזווג בכנף של העובר באופן ברור. בשלבים אלה העובר יהפוך הלוואי כגון הנכון הוא בדרך כלל עליון. כתוצאה מכך היא בדרך כלל קלה יותר להרכיב חרוזים לגפיים תקין ולהשתמש באלה עזבו כפקדים נגדי.
5. השתמש בחוט טונגסטן חידד לעשות חתך לניצן האיבר שבו חרוז יהיה מושתל. הימנע חיתוך לאורך כל הדרך ניצן האיבר שבו אפשרי אם כי בשלבים צעירים זה קשה.
   הערה: בעוברים גדולים יותר (שלב HH 22 ומעלה) ניתן לבחור אזורים ספציפיים של ניצן האיבר להשתלה, אך בשלבים צעירים זה קשה יותר כאיבר הניצן עצמו הוא קטן. כמו כן, חשוב לזכור כי ניצן האיבר יגדל עבר חרוז המורכבים כל כך, במיוחד בשלבים צעירים, חרוז יישאר בגפה הפרוקסימלית.
6. להרים חרוז משני גורם הגדילה או תרופה או באמצעות wa קנס נוסףמלקחיים tchmakers או לולאה עשויה ממחט טונגסטן. אם חרוז כבר ספוג באו DMSO או פנול אדום, לשטוף בPBS לפני היישום לעובר. העבר את חרוז לעובר עם המלקחיים / לולאת חוט. לאחר מכן השתמשתי בחוט טונגסטן חידד להכניס את חרוז לתוך החתך.
7. להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS / FCS לביצה להבטיח כי העובר נשמר התייבשות, אך להימנע יישום ישירות על העובר עצמו כמו זה יכול לגרום נזק לעוברים ולגרום חרוז שחלץ. לאטום את הביצה עם קלטת ולחזור לחממה.

Representative Results

בשלב HH 21 Myod לא בא לידי ביטוי בפיתוח myoblasts איבר למרות הכתמה ניתן לראות בmyotome של somites הפיתוח (איור 1 א). איור 1 מציג הכלאה באתר לMyod 6 שעות הבאות שתל חרוז FGF18. Myod מושרה בmyoblasts הקרוב לחרוז בעוד אין ביטוי באיבר הנגדי. שיתוף השתלת חרוז הספוג בU0126, מעכב ספציפי של MEK, האינדוקציה FGF18 לוקים של Myod (איור 1 ג). כמו כן השתלת חרוז U0126 בשלב HH 21 ומחפש ביטוי Myod לאחר 24 שעות מפחיתה את הביטוי אנדוגני של Myod לעומת האיבר הנגדי שלא טופל (איור 1D, ה).

בניצני איבר בFGF18 HH שלב 19 לא לגרום Myod (איור 1F). עם זאת שיתוף השתלה של חרוזים ספוגים בFGF18 ואנטגוניסט החומצה רטינואית BMS493 יכול להתגבר על זה וMyod חוץ רחמי מזוהה (Figuמחדש 1G)

כדי לאשר FGF18 שפועל באמצעות עוברי MEK נקצרו שעה 1 לאחר שתל חרוז וimmunostained לERK פוספורילציה, היעד של MEK. איור 1H מראה תמונת brightfield של שעות חרוז FGF18 1 לאחר השתלה תוך איור 1 ט מראה כי FGF18 גורם זירחון המהיר של ERK סביב חרוז המורכבים. איור 1J מציג כיסוי של תמונות אלה. חרוזים בקרה ספוגים בBSA 0.1% לא לגרום זירחון ERK (איור 1 יא, L, M)

ביטוי 1. Myod איור בגפיים מוסדר על ידי FGF18 וחומצה רטינואית באמצעות זירחון ERK. גפיים שליטת Unmanipulated בשלב HH 21 לא להביע Myod () אבל ביטוי מוקדם מזוהה 6 שעות לאחר השתלת חרוז FGF18 (B). בלוקים חרוזים FGF18 וU0126 השתלה-שיתוף אינדוקציה זה (C). ביטוי Myod אנדוגני נראה בשלב HH 21 (ד) אבל זה חסום על ידי השתלת חרוזים הספוגים בU0126 (E). בניצני איבר מוקדם ביטוי Myod המוקדם אינו נגרם על ידי FGF18 (F) אך הנגרם על ידי חרוזים השתלה-שיתוף הספוג בFGF18 ואנטגוניסט החומצה רטינואית BMS493 (G). חרוזים FGF18 המורכבים לגפי HH21 לגרום זירחון ERK אחרי שעה 1: brightfield (H), ניאון (אני) והתמזגו תמונות (J) של איבר HH21 immunostained לאנטי-phosphoERK. חרוזים בקרה ספוגים בBSA לא לגרום זירחון ERK:, ניאון (L) (K) והתמזגו תמונות (M) של איבר HH21 immunostained לאנטי-phosphoERK. נתון זה שונה ממוק et al, 2014 ^16. כוכביות שחורות: חרוזים הפרין; ASTE הלבןסיכונים: AG חרוזים 1-X2; חיצים מראים ביטוי Myod חוץ רחמי בניצני גפיים. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

השימוש בשתלי חרוז מיושמים ישירות לפיתוח רקמות באובו הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח את התפקיד של איתות גורם גדילה במהלך הפיתוח נותן שליטה ללא תחרות על השלב ההתפתחותי שבו הם מיושמים ומשך חשיפה.

הבחירה של החרוזים לכל סוג של מולקולה חשובה. מולקולות קטנות הידרופובי, כגון המעכבים המתוארים כאן וחומצה רטינואית, בדרך כלל נקשרות גם לחרוזי 1-X2 AG derivatized למרות שיש צורך לבדוק את האפקטיביות של כל מעכב בחרוזים אלה באופן אמפירי. באופן דומה, לגורמי גדילה ייתכן שיהיה צורך לבחון את הסוגים שונים של חרוז. חרוזים חלקם שקופים ולכן יכול להיות קשה לדמיין במהלך המניפולציות אבל טיפול קצר עם פנול אדום ואחרי שטיפה בPBS יהיה לתייג אותם למספיק זמן כדי לבצע את השתל.

בעת הכנת חרוזים, במיוחד אלה שכבר ספוגים במעכבים, חשוב להגן עליהם מפני אור ככל האפשר. במהלך הטיפול הראשוני שלהם ובמהלך המניפולציה שהם צריכים להיות מכוסים ורק כאשר הוסרו חרוזים מועברים. עדיף להשתמש aliquots מופשר טרי כחלק מריאגנטים אלה אינם יציבים ויכול לתת תוצאות שליליות מטעות אם לא מאוחסן כראוי. כמו כן, חשוב לא להשאיר אותם השרייה בפנול אדום לזמן רב מדי לפני השתלה כמו זה יכול להפחית את היעילות של חרוז.

הריכוזים המשמשים לשתלי חרוז הבאים, של שני גורמי הגדילה ותרופות, הם לעתים קרובות גבוהים מאוד; חרוזים FGF18 הם ספוגים בריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר וחרוזים למעכבי מולקולה קטנים לעתים קרובות הם ספוגים בריכוז של 100 מיקרומטר. למרות שזה גבוה בהרבה מהריכוזים משמשים בדרך כלל לטיפול בתאים בפתרון זה הוא צורך הכמויות של גורמי גדילה ותרופות נקלטו על ידי חרוזים ולאחר מכן שוחררו קשה למדוד ישירות, אך ככל הנראה generate רמות נמוכות מזה in vivo. כתוצאה מכך מגוון של ריכוזים חייב להיבדק לכל מולקולה המשמשת לקביעת מינון אפקטיבי.

טכניקה זו היא גם ישימה למגוון רחב של רקמות אחרות, כגון somites ^24, במהלך פיתוח וניתן להשתמש בעוברים באובו או בתרבויות, כגון תרבות EC ^25. כמו כן ניתן לגדל תאים בתרבית שמפרישים גורמי גדילה ספציפיים כמו כדורים שלאחר מכן יכול להיות מורכבים לעוברי המתפתחים באותה הדרך ^26.

השילוב של נגישות, הנוחות של מניפולציה ועלות נמוכה הופכת את עוברי עוף מודל מצוין של פיתוח. ⁷ ושליו ²⁷ טכנולוגיות מהונדסים מיושמות יותר ויותר מיני עופות וקווים מהונדסים גנטי של שני התרנגולות הופכים לזמינים השילוב של עובר קלאסי השתלת טכניקות עם ציפורים שונה אלה כבר מספקים תובנות רומן לדהvelopment ^8,28.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30 ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS