Abstract
Usando embrioni di pollo è possibile testare direttamente gli effetti delle due fattori di crescita o inibitori specifici di vie di segnalazione di espressione genica e attivazione di vie di trasduzione del segnale. Questa tecnica permette la consegna di molecole di segnalazione in stadi di sviluppo ben definiti per i tempi specifici. Dopo questo embrioni possono essere raccolte e l'espressione genica esaminati, ad esempio in situ ibridazione, o l'attivazione di vie di trasduzione del segnale osservato con immunocolorazione.
In questo video di eparina perline imbevuti di FGF18 o AG perline 1-X2 imbevute di U0126, un inibitore di MEK, si innestano nel bocciolo arto in ovo. Questo dimostra che FGF18 induce l'espressione di MyoD e ERK fosforilazione e espressione MyoD sia endogena e FGF18 indotta è inibito dalla U0126. Perline imbevuto di un antagonista dell'acido retinoico possono potenziare l'induzione prematura MyoD da FGF18.
Questo approccio può essere noied una vasta gamma di fattori di crescita e inibitori e si adatta facilmente ad altri tessuti embrioni.
Introduction
Embrioni aviaria hanno fornito un potente strumento per lo studio di sviluppo per molti anni 1. Una delle loro caratteristiche più utili è che sono relativamente facili da manipolare. Sviluppo esterno consente di aprire l'uovo per accedere l'embrione ed eseguire varie micromanipolazioni con esempi come il sistema chimera quaglia-chick classico per lo studio il destino della cellula 2,3, l'iniezione di retrovirus per sovraespressione in tessuti specifici durante lo sviluppo 4,5 e la cultura espianto di identificare le fonti di segnalazione di sviluppo 6. Più recentemente chimere generato tra gli host non etichettati con innesti da una linea pollo transgenici che esprimono GFP ha dimostrato che la combinazione di innesto classica e la modificazione genetica in grado di fornire importanti intuizioni sviluppo 7,8.
La facilità con cui l'embrione aviaria può essere manipolato ha reso un ottimo modello per lo studio degli artisviluppo 9. L'applicazione di fattori di crescita specifici per gli arti in via di sviluppo in vivo è stato fondamentale per identificare i fattori che alterano arto patterning 10,11 e continua a fornire intuizioni in questo processo 12. Questo approccio è stato utilizzato anche per studiare i fattori che regolano lo sviluppo muscolare e ha scoperto ruoli per numerosi segnali, come Wnts 13, BMP 14 e HGF 15.
Recentemente questa tecnica è stata utilizzata per studiare i segnali che controllano l'espressione genica myogenic sul nascere degli arti e ha dimostrato che le interazioni tra FGF18 e acido retinoico può controllare i tempi di espressione MyoD 16. Usando una combinazione di fattori di crescita e piccole molecole che possono essere caricati su perline e poi innestate direttamente nei tessuti specifici a stadi di sviluppo definiti dà la possibilità di intervenire in quasi ogni momento e regione durante lo sviluppo. Questo è stato usato per investigate molti processi tra cui somite patterning 17,18, specificazione neurale 19, neural crest migrazione 20 e l'estensione dell'asse 21.
Qui si descrive un metodo per perline imbevute di entrambi i fattori di crescita o inibitori nello sviluppo di arti di pollo innesto. Questo è stato utilizzato per determinare gli effetti di questi segnali su miogenesi analizzando muscolo espressione genica specifica con ibridazione in situ. Descriviamo innesti utilizzando eparina imbevuto perline, che sono utilizzati per fattori di crescita, o perline AG 1-X2 per piccole molecole idrofobe quali acido retinoico o piccole molecole inibitrici di vie di segnalazione specifici. Tuttavia altre perle sono disponibili che sono stati utilizzati per fornire sia FGFs 22 e 23 anche Shh.
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Protocol
Etica Dichiarazione: Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e le linee guida etiche del l'Università di Nottingham.
1. Preparazione di Beads eparina per innesto
- Lavare accuratamente perle di eparina in PBS prima dell'uso. Nota: Beads possono essere conservati a 4 ° C come una sospensione in PBS.
- Selezionare perline per innesto rimuovendoli dal magazzino con una pipetta 20 microlitri in una goccia 1 ml di PBS. Quindi utilizzare una micropipetta set a 2 ml di trasferire perle in un calo del 20 microlitri di PBS in una capsula di Petri 3 centimetri. Scegli perline in base alle dimensioni e, utilizzando un impianto stereo dissezione microscopio, trasferire perline selezionati con la punta della pipetta P2; quelli intorno a 100 micron di diametro sono l'ideale.
- Rimuovere la PBS dalle perline. Rimuovere la maggior parte del liquido con una pipetta 20 microlitri e il liquido residuo per azione capillare con orologeria pinza sottile. Nota: È importante rimuovere il più possibile così la crescita factor non è diluito quando viene aggiunto ai talloni.
- Pipettare il fattore di crescita direttamente sulle perline. Per FGF18 aggiungere 0,5 ml di FGF18 ricombinante ricostituito a 0,5 mg / ml in 0,1% di BSA in PBS. Mettere alcune gocce di acqua intorno ai bordi del piatto per evitare che il liquido da evaporare.
- Incubare le perline per 1 ora a RT. Rimuovere le gocce d'acqua dal piatto con una pipetta Pasteur e disporli sul ghiaccio pronta per l'innesto.
- In caso di necessità (per perle trasparenti) trasferimento 4-5 perle al 2% rosso fenolo prima di innesto per aiutarli a visualizzare. Risciacquare in PBS prima del trasferimento per l'embrione.
2. Preparazione di AG Beads 1-X2 per innesto
- Prima dell'uso derivatize perline con 0,2 N di acido formico.
- Per fare questo uso una spatola per trasferire perline in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml di 0,2 N di acido formico e lavare su una piattaforma di agitazione per 1 ora.
- Quindi rimuovere l'acido formico con una pipetta p1000 e sostituirlo con 1ml di acqua. Lavare per 1 ora e ripetere sei volte per rimuovere residuo acido formico.
- Rimuovere il liquido residuo con una pipetta p1000 e conservare le perline a 4 ° C. Nota: Non è necessario rimuovere tutta l'acqua residua in questa fase.
- Rimuovere una piccola pallina di perle di circa il 5-10 volumi microlitri dal magazzino con una piccola spatola in una capsula di Petri 3 centimetri e aggiungere 1 ml di DMSO (o qualsiasi solvente il farmaco è dissolto in). Nota: Questo dovrebbe fornire diverse centinaia di perline da cui selezionare quelli della giusta misura.
- Quindi utilizzare una pipetta P2 impostata su 2 microlitri di trasferire perle di circa 100 micron di diametro per un calo del 20 ml di solvente in un altro piatto di Petri 3 centimetri.
- Rimuovere il solvente con una pipetta 20 microlitri e qualsiasi solvente residuo con una pipetta 2 microlitri. Sostituire con 20 ml di farmaco da applicare.
NOTA: Per coerenza sciogliere il farmaco ad una concentrazione di 100 mM in DMSO (o che mai è utilizzato solvente),un'aliquota in 20 microlitri e conservare a -80 ° C, come alcuni piccoli inibitori molecolari sono instabili ed è meglio evitare ripetuti di congelamento-scongelamento. Se necessario diluire il farmaco alla concentrazione desiderata prima di ammollo perline. Concentrazioni efficaci possono avere bisogno di essere determinati empiricamente per ogni farmaco. - Incubare per 1 ora. Proteggere dalla luce come molti di queste molecole sono sensibile alla luce.
- Prima innesto trasferimento 4-5 perle con una pipetta p2 impostato 2 microlitri in 20 ml di 2% di rosso fenolo disciolti in acqua. Eseguire questo passaggio usando un microscopio da dissezione stereo per visualizzare le perline. Rimuovere una singola goccia di orologiai pinza sottile o un cappio e risciacquare in PBS prima del trasferimento per l'embrione. Non lasciare perline in 2% rosso fenolo per più di 15 minuti prima dell'uso come questo può causare la perdita di attività.
3. Preparazione tungsteno aghi
- Tagliare multa filo di tungsteno in 3-4 cm di lunghezza. Inserire un pezzo di filo al fine diuna pipetta Pasteur di vetro e si fondono in un becco Bunsen per fissare in posizione. Preparare fino a 10 aghi per assicurare che non vi siano parti di ricambio se danneggiati durante l'uso.
- Posizionare l'estremità del filo in una fiamma ossidrica e tenerla lì fino a quando il tungsteno diventa bianco e la punta è affilata (circa 2-3 minuti). Nota: Durante l'uso l'ago può essere pulito e ri-affilata nella fiamma ossidrica, se necessario.
NOTA: Questi aghi possono essere utilizzati anche per creare dei cicli per il trasferimento di perline. Toccare delicatamente l'ago per la panchina e si piega a formare un anello.
4. Gli embrioni Preparazione per Bead innesti
- Incubare le uova con l'estremità smussata fino a quando non raggiungono lo stadio desiderato (3-5 giorni per la maggior parte le manipolazioni gemma arto). Utilizzando pinze smussato toccare la punta smussata per rompere il guscio e quindi utilizzare le pinze per rimuovere il guscio ed esporre l'embrione. Assicurarsi che la membrana guscio d'uovo viene rimosso anche.
NOTA: 1-2 ml di soluzione salina può essere aggiunto con una pipetta Pasteur per assistere conquesto se la membrana aderisce al tuorlo. Pipetta delicatamente la PBS sulla superficie del tuorlo, afferrare la membrana con le pinze, facendo attenzione a non danneggiare il tuorlo, e tirare delicatamente via dall'uovo. - Rimuovere fino a 5 ml di albume dall'uovo con una siringa da 10 ml e un ago 19 G. Prendere solo quanto necessario per garantire l'embrione non entrare in contatto con il nastro utilizzato per sigillare l'uovo come rimozione di volumi più grandi in grado di ridurre i tassi di sopravvivenza degli embrioni.
- Per visualizzare l'embrione aggiungere un 5-6 gocce di artisti china a 15 ml di PBS contenente 100 U penicillina e 0,1 mg di streptomicina / ml. Iniettare 0,5-1 ml direttamente sotto l'embrione con una siringa da 1 ml e un ago 25 G.
- Aggiungere 2-3 ml di PBS 1% con siero fetale bovino e 100 U di penicillina e 0,1 mg di streptomicina / ml nell'uovo di garantire l'embrione non disidratarsi. Utilizzando affilate orologiai pinze rimuovere la membrana vitellina e aprire il sacco amniotico sulle gemme degli arti in via di sviluppo. Assicurarsi che l'embrione non si secchi e, Se necessario, aggiungere altro PBS / FCS.
NOTA: Le gemme degli arti può essere visto chiaramente come escrescenze appaiati sul fianco dell 'embrione. A queste fasi dell'embrione girerà come il lato destro è normalmente superiore. Il risultato è normalmente più facile innestare perle nelle arti di destra e utilizzare quelli lasciati come controlli controlaterale. - Utilizzare un filo di tungsteno affilato per fare un'incisione nella gemma arto dove sarà impiantato il tallone. Evitare di tagliare tutto il percorso attraverso la gemma arto, se possibile, anche se a fasi più giovani questo è difficile.
NOTA: in embrioni più anziani (HH stadio 22 e sopra) è possibile selezionare specifiche regioni del bocciolo arto per l'innesto, ma nelle fasi più giovani questo è più difficile come l'arto gemma in sé è piccolo. E 'anche importante ricordare che la gemma arto crescerà oltre il tallone innestato così, soprattutto nelle fasi più giovani, il tallone rimarrà nell'arto prossimale. - Prendete una perlina sia dal fattore di crescita o di droga utilizzando wa extra finetchmakers forcipe o un ciclo fatto da un ago di tungsteno. Se il cordone è stato immerso in uno DMSO o rosso fenolo, lavare in PBS prima di applicare per l'embrione. Trasferire il tallone per l'embrione con la pinza / cappio. Quindi utilizzare il filo di tungsteno affilato per inserire il tallone nell'incisione.
- Aggiungere 1-2 ml di PBS / FCS all'uovo assicurare che l'embrione è mantenuta idratata ma evitare di applicare direttamente sulla dell'embrione stesso come questo può danneggiare gli embrioni e causare il tallone da sloggiato. Sigillare l'uovo con nastro e tornare alla incubatrice.
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Representative Results
Nella fase HH 21 MyoD non è espresso in mioblasti sviluppo arto sebbene colorazione può essere visto in myotome dei somiti sviluppo (Figura 1A). Figura 1B mostra ibridazione in situ per MyoD 6 ore dopo un innesto FGF18 tallone. MyoD è indotta in mioblasti vicino al tallone, mentre non vi è alcuna espressione nell'arto controlaterale. Co-innestando un branello imbevuto U0126, un inibitore specifico di MEK, induzione blocchi FGF18 di MyoD (Figura 1C). Allo stesso modo l'innesto una perlina U0126 in fase HH 21 anni e cerco espressione MyoD dopo 24 ore riduce l'espressione endogena di MyoD confronto con l'arto controlaterale non trattata (figura 1D, E).
In gemme degli arti a HH fase 19 FGF18 non induce MyoD (Figura 1F). Tuttavia co-innesto di perline imbevuto di FGF18 e l'antagonista acido retinoico BMS493 in grado di superare questo e viene rilevato MyoD ectopica (Figuri 1G)
Per confermare che FGF18 si agisce attraverso gli embrioni del MEK sono state raccolte 1 ora dopo perlina trapianto e immunostained per ERK fosforilata, l'obiettivo di MEK. Figura 1H mostra un'immagine campo chiaro di una FGF18 cordone di 1 ora dopo l'innesto mentre la Figura 1I mostra che FGF18 induce una rapida fosforilazione di ERK intorno al tallone innestato. La figura 1J mostra una sovrapposizione di queste immagini. Perline di controllo immersi in 0,1% di BSA non provocare ERK fosforilazione (Figura 1 K, L, M)
Figura 1. MyoD espressione negli arti è regolato da FGF18 e acido retinoico attraverso la fosforilazione di ERK. Membra di controllo non manipolata in HH fase 21 non esprimono MyoD (A), ma l'espressione prematura viene rilevata 6 ore dopo l'innesto di un cordone di FGF18 (B). Co-innesto di FGF18 e U0126 perline blocchi questa induzione (C). Espressione MyoD endogena è visto in fase HH 21 (D), ma questa è bloccata da perline imbevute di U0126 (E) l'innesto. In gemme degli arti anteriori espressione MyoD precoce non è indotta da FGF18 (F), ma è indotta dalla co-innesto perline imbevute di FGF18 e l'antagonista dell'acido retinoico BMS493 (G). Perline FGF18 innestate in arti HH21 inducono fosforilazione ERK dopo 1 ora: campo chiaro (H), fluorescenti (I) e uniti (J) immagini di un arto HH21 immunostained per l'anti-phosphoERK. Perline di controllo imbevuti di BSA non provocare ERK fosforilazione: (K), fluorescente (L) e uniti (M) immagini di un arto HH21 immunostained per l'anti-phosphoERK. Questa cifra è stata modificata da Mok et al, 2014 16. Nero asterischi: perle di eparina; aste biancorischi: AG perle 1-X2; frecce mostrano espressione MyoD ectopica in gemme degli arti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'utilizzo di innesti tallone applicati direttamente allo sviluppo di tessuti in ovo è un potente strumento per analizzare il ruolo del fattore di crescita di segnalazione durante lo sviluppo dando il controllo senza precedenti sopra lo stadio di sviluppo in cui vengono applicate e la durata dell'esposizione.
La scelta del cordone per ogni tipo di molecola è importante. Piccole molecole idrofobe, come gli inibitori qui descritte ed acido retinoico, di solito si legano bene al derivatizzato AG 1-X2 perline sebbene sia necessario verificare l'efficacia di ciascun inibitore su queste perle empiricamente. Analogamente, per i fattori di crescita può essere necessario testare diversi tipi di tallone. Alcune perle sono trasparenti e quindi può essere difficile da visualizzare durante le manipolazioni ma un breve trattamento con rosso fenolo, seguito da un risciacquo in PBS li etichetta per un tempo sufficiente per eseguire l'innesto.
Nel preparare perle, in particolare quelli che sono stati impregnati con inibitores, è importante proteggere dalla luce, per quanto possibile. Durante il trattamento iniziale e durante la manipolazione devono essere coperti e solo rimossi quando perline vengono trasferiti. E 'meglio usare aliquote appena scongelati come alcuni di questi reagenti sono instabili e possono dare risultati negativi fuorvianti se non conservato correttamente. E 'anche importante non lasciarli ammollo in rosso fenolo per troppo tempo prima dell'innesto come questo può ridurre l'efficacia del tallone.
Le concentrazioni utilizzate per questi innesti tallone, di entrambi i fattori di crescita e farmaci, sono spesso molto elevata; Perline FGF18 sono immersi in una concentrazione di 0,5 mg / ml e perline per piccole molecole inibitrici sono spesso imbevuto ad una concentrazione di 100 mM. Anche se questo è molto più elevata rispetto alle concentrazioni tipicamente utilizzati per il trattamento di cellule in soluzione è necessario in quanto la quantità di fattori di crescita e farmaci assorbiti da perline e poi rilasciati sono difficili da misurare direttamente ma presumibilmente generite livelli inferiori a questo in vivo. Come risultato un intervallo di concentrazioni deve essere testato per ciascuna molecola utilizzata per determinare una dose efficace.
Questa tecnica è anche applicabile ad una vasta gamma di altri tessuti, come la 24 somiti, durante lo sviluppo e può essere utilizzato su embrioni in ovo o in culture, come la cultura EC 25. È anche possibile coltivare cellule in coltura che secernono fattori di crescita specifici i pellet che possono poi essere innestati in embrioni di sviluppo nello stesso modo 26.
La combinazione di accessibilità, facilità di manipolazione e di basso costo rende embrioni di pollo un ottimo modello di sviluppo. Poiché le tecnologie transgeniche sono sempre più applicate a specie avicole e linee geneticamente modificate sia polli 7 e quaglie 27 diventano disponibili la combinazione di embrione classica tecniche con questi uccelli modificati innesto è già fornendo nuove intuizioni deluppo 8,28.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
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