Abstract
Ved hjelp av kyllingembryoer er det mulig å teste direkte effektene av enten vekstfaktorer eller spesifikke inhibitorer av signalveier på genekspresjon og aktivering av signaloverføringsreaksjonsveier. Denne teknikken gjør at levering av signalmolekyler på presist definerte utviklingsstadier for bestemte tider. Etter dette embryo kan høstes og genekspresjon undersøkes, for eksempel ved in situ hybridisering, eller aktivering av signaltransduksjonsveiene observert med immunfarging.
I videoen heparin perler dynket i FGF18 eller AG 1-X2 perler dynket i U0126, en MEK inhibitor, er podet inn i lem knopp i ovo. Dette viser at FGF18 induserer uttrykk for myod og ERK-fosforylering og både endogene og FGF18 indusert myod uttrykk hemmes av U0126. Perler dynket i en retinsyre antagonist kan potensere tidlig myod induksjon av FGF18.
Denne tilnærmingen kan være ossed med et bredt spekter av forskjellige vekstfaktorer og inhibitorer og kan lett tilpasses andre vev i utvikling av embryo.
Introduction
Avian embryo har gitt et kraftig verktøy for å studere utvikling i mange år 1. En av de mest nyttige egenskaper er at de er forholdsvis lette å manipulere. Ekstern utvikling gjør det mulig å åpne egget å få tilgang til embryoet og utføre forskjellige micromanipulations inkludert eksempler som klassiske vaktel-chick kimær system for å studere celle skjebne 2,3, injeksjon av retrovirus for overekspresjon i bestemte vev under utvikling 4,5 og eksplantering kultur for å identifisere utviklingssignalkilder 6. Flere nylig kimeras generert mellom umerkede vertene med grafts fra en transgen kylling linje som uttrykker GFP har vist at kombinasjonen av klassisk pode og genmodifisering kan gi viktig innsikt i utviklingen 7,8.
Den enkle som avian embryo kan manipuleres har gjort det en utmerket modell for å studere lemutvikling 9. Bruk av spesifikke vekstfaktorer for å utvikle lemmer in vivo har vært medvirkende i å identifisere faktorer som endrer lem mønster 10,11 og fortsetter å gi innsikt i denne prosessen 12. Denne fremgangsmåten har også blitt brukt til å studere de faktorer som regulerer muskelutvikling og har avdekket roller for en rekke signaler som Wnts 13, BMP 14 og 15 HGF.
Nylig denne teknikken har blitt brukt til å undersøke de signalene som styrer myogenic genuttrykk i lem knopp og har vist at interaksjoner mellom FGF18 og retinsyre kan kontrollere tidspunktet for myod uttrykk 16. Ved hjelp av en kombinasjon av vekstfaktorer og små molekyler som kan legges på perler og deretter podet direkte inn i bestemte vev på definerte utviklingsstadier gir mulighet til å gripe inn på nesten enhver tid og region under utvikling. Dette har blitt brukt til å investigate mange prosesser inkludert somitt mønster 17,18, nevrale spesifikasjon 19, neural crest migrasjon 20 og aksen forlengelse 21.
Her beskriver vi en metode for pode perler dynket i enten vekstfaktorer eller hemmere til å utvikle kylling lemmer. Dette har blitt benyttet for å bestemme effekten av disse signaler på myogenese ved å analysere muskel spesifikk genekspresjon med in situ-hybridisering. Vi beskriver grafts ved å bruke enten heparin fuktet perler, som brukes for vekstfaktorer, eller AG 1-X2-perler for små hydrofobe molekyler, slik som retinsyre eller lavmolekylære inhibitorer av spesifikke signalveier. Men andre perler er også tilgjengelige som har blitt brukt til å levere både FGF 22 og Shh 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle disse eksperimentene følger dyr omsorg og etiske retningslinjer ved Universitetet i Nottingham.
1. Utarbeidelse av Heparin Perler for Negl
- Vask heparin perler grundig i PBS før bruk. Merk: Perler kan lagres ved 4 ° C som en oppslemming i PBS.
- Velg perler for pode ved å fjerne dem fra lager med en 20 mL pipette inn i en 1 ml dråpe PBS. Deretter bruker en mikropipette satt til 2 mL å overføre perlene inn i en 20 ul dråpe av PBS i et 3 cm petriskål. Velg perler basert på størrelse og med en stereo dissekere mikroskop, overføre utvalgte perler med en P2 pipette tips; de rundt 100 mikrometer i diameter er ideelle.
- Fjern PBS fra kulene. Fjern mesteparten av væsken med en 20 ul pipette, og den resterende væske ved kapillarvirkning med fine urmakere tang. Merk: Det er viktig å fjerne så mye som mulig, slik at veksten factor er ikke utvannet når det blir lagt til perlene.
- Pipetter vekstfaktor direkte på kulene. For FGF18 tilsett 0,5 mL av rekombinant FGF18 rekonstituert til 0,5 mg / ml i 0,1% BSA i PBS. Plassere flere dråper vann rundt kantene på fatet, slik at væsken fordamper.
- Inkubering av kulene i 1 time ved RT. Fjerne vanndråper fra fatet med en Pasteur pipette og legg på is klar for pode.
- Hvis det er nødvendig (for gjennomsiktige perler) transfer 4-5 perler til 2% fenolrød før pode å hjelpe visualisere dem. Skyll i PBS før de overføres til fosteret.
2. Utarbeidelse av AG 1-X2 Perler for Negl
- Før bruk derivatisere perler med 0,2 N maursyre.
- For å gjøre dette, bruk en slikkepott til å overføre perler til en 1,5 ml mikro tube. Legg 1 ml 0,2 N maursyre og vaske på en risteplattform i 1 time.
- Deretter fjerner maursyre med en P1000 pipette og erstatte med enml vann. Vask i 1 time og gjenta seks ganger for å fjerne gjenværende maursyre.
- Fjerne gjenværende væske med en P1000 pipette og lagre perlene ved 4 ° C. Merk: Det er ikke nødvendig å fjerne alt resterende vann på dette stadiet.
- Fjerne en liten pellet av kuler av ca. 5-10 ul volum fra lager ved hjelp av en liten spatel inn i en 3 cm petriskål og tilsett 1 ml DMSO (eller hvilken som helst løsningsmiddel medikamentet oppløses i). Merk: Dette bør gi flere hundre perler for å velge de av riktig størrelse.
- Deretter bruker en P2 pipette satt til 2 mL å overføre perlene på omtrent 100 mikrometer i diameter til en 20 ul dråpe av løsningsmiddel i en annen 3 cm petriskål.
- Fjern løsningsmiddel med et 20 ul pipette og eventuelt resterende oppløsningsmiddel med en 2 ul pipette. Bytt ut med 20 mL av stoffet for å bli brukt.
NB: For konsistens oppløse medikamentet i en konsentrasjon på 100 uM i DMSO (eller som stadig løsningsmiddel),delmengde i 20 ul, og oppbevar ved -80 ° C i noen lavmolekylære inhibitorer er ustabile, og det er best å unngå gjentatte fryse-tining. Om nødvendig så fortynne stoffet til ønsket konsentrasjon før soaking perler. Effektive konsentrasjoner kan må bestemmes empirisk for hvert medikament. - Inkuber i 1 time. Beskytt mot lys så mange av disse molekylene er lysfølsom.
- Før podning overføring 4-5 perler med en p2 pipette satt til 2 pl til 20 pl av 2% fenolrødt oppløst i vann. Utfør dette trinnet bruker en stereo disseksjonsmikroskop å visualisere perlene. Fjern en enkelt perle med fine urmakere pinsett eller en wire loop og skyll i PBS før de overføres til fosteret. Ikke la perler i 2% fenolrød i mer enn 15 minutter før bruk, da dette kan føre til tap av aktivitet.
3. Klartungsten Needles
- Skjær fine Tungsten ledning inn 3-4 cm lengder. Sett den ene del av ledningen inn i enden avet glass Pasteur pipette og smelte i en Bunsen-brenner til å feste i stilling. Forbered opp til 10 nåler for å sikre at det er deler hvis de blir skadet under bruk.
- Plasser enden av ledningen inn i en blåselampe flamme og hold den der til wolfram lyser hvitt og spissen er skarp (rundt 2-3 min). Merk: Under bruk nålen kan rengjøres og re-skjerpet i blåselampe som trengs.
MERK: Disse nålene kan også brukes til å lage løkker for overføring av perler. Forsiktig berøre nålen til benken, og det vil bøye for å danne en løkke.
4. Forbereder Embryoet for Perler Grafts
- Ruge egg med den butte enden opp til de når ønsket scene (3-5 dager for de fleste lem bud manipulasjoner). Bruke sløv tang trykk på den butte enden å bryte skallet og deretter bruke pinsett for å fjerne skallet og utsetter fosteret. Sikre eggeskallet membran er også fjernet.
MERK: 1-2 ml PBS kan legges med en Pasteur pipette for å bistå meddette hvis membranen holder seg til eggeplomme. Forsiktig pipette PBS på overflaten av eggeplomme, ta tak i membranen med pinsett, tar seg ikke å skade plomme, og dra det forsiktig bort fra egg. - Fjerne opp til 5 ml av albumin fra egg med en 10 ml sprøyte og en 19 G nål. Ta bare så mye som nødvendig for å sikre at fosteret ikke får kontakt med tape brukes til å forsegle egg som fjerning av større mengder kan redusere embryo overlevelse.
- For å visualisere embryoet tilsett 5-6 dråper kunstnere India blekk til 15 ml PBS inneholdende 100 enheter penicillin og 0,1 mg streptomycin / ml. Injiser 0,5-1 ml direkte under embryoet med en 1 ml sprøyte og en 25 G nål.
- Tilsett 2-3 ml PBS med 1% føtalt kalveserum og 100 enheter penicillin og 0,1 mg streptomycin / ml inn i egget for å sikre at embryo ikke dehydrere. Bruke skjerpet urmakere tang fjerne vitelline membranen og åpne amnion over utviklings lem knopper. Sørg for at embryoet ikke tørker ut ogOm nødvendig, legge til mer PBS / FCS.
MERK: lem knopper kan tydelig ses som sammenkoblede utvekster på flanken av embryo. På disse stadiene embryoet vil snu slik at høyre side er normalt øverst. Som et resultat er det normalt lettere å pode perler inn de rette lemmer og bruke venstre etter de som kontralaterale kontroller. - Bruk en skjerpet wolfram wire å lage et snitt i lem knopp der perlen vil bli implantert. Unngå å kutte hele veien gjennom greinen knoppen der det er mulig selv om yngre stadier dette er vanskelig.
MERK: I eldre embryoer (HH stadium 22 og over) er det mulig å velge spesifikke regioner av lem bud for pode men mot yngre stadier dette er mer vanskelig som lem bud er liten. Det er også viktig å huske på at den lem knoppen vil vokse forbi den podede vulsten slik, spesielt ved yngre fase, vil vulsten forbli i den proksimale lem. - Plukk opp en perle fra enten vekstfaktor eller narkotika ved hjelp av enten ekstra fin watchmakers tang eller en sløyfe fremstilt av et wolfram nål. Hvis kulen har blitt dynket i enten DMSO eller fenolrød, skyll i PBS før du bruker på embryo. Overfør vulsten til embryoet med tang / wire loop. Bruke så skjerpet wolfram wire for å sette perlen i snittet.
- Legg 1-2 ml PBS / FCS for å egget slik at embryoet holdes hydrert, men unngå påføring direkte på embryoet seg, da dette kan skade embryoene, og føre til at vulsten som skal forskyves. Tett egg med tape og gå tilbake til inkubatoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På HH trinn 21 myod ikke uttrykkes i å utvikle lem myoblaster selv om farging kan sees i myotome av utviklings somites (figur 1A). Figur 1B viser in situ hybridisering for myod 6 timer etter en FGF18 vulst transplantat. Myod blir indusert i myoblaster nær vulsten mens det er ingen ekspresjon i det kontralaterale lem. Ko-poding av en vulst fuktet i U0126, en spesifikk inhibitor av MEK, blokker FGF18 induksjon av myod (figur 1C). Tilsvar pode en U0126 perle ved HH scene 21 og leter etter myod uttrykk etter 24 timers reduserer endogene uttrykk for myod sammenlignet med ubehandlet kontralaterale lem (figur 1D, E).
I lem knopper på HH stadium 19 FGF18 induserer ikke myod (figur 1F). Men co-poding av perler dynket i FGF18 og retinsyre antagonist BMS493 kan overvinne dette, og ektopisk myod oppdages (Figure 1G)
For å bekrefte at FGF18 er konstituert gjennom MEK embryoene ble høstet en time etter perle pode og immunostained for fosforylert ERK, målet for MEK. Figur 1 H viser en lysfelt bilde av en FGF18 perle 1 time etter pode mens figur 1I viser at FGF18 induserer rask fosforylering av ERK rundt podet perle. Figur 1J viser en overlapping av disse bildene. Kontroll perler dynket i 0,1% BSA må ikke brekning ERK-fosforylering (figur 1K, L, M)
Figur 1. myod uttrykk i lemmene er regulert av FGF18 og retinsyre gjennom ERK-fosforylering. Umanipulerte kontroll lemmer på HH stadium 21 uttrykker ikke myod (A), men for tidlig uttrykk blir oppdaget seks timer etter poding en FGF18 perle (B). Co-pode FGF18 og U0126 perler blokkerer denne induksjon (C). Endogen myod ekspresjon sees ved HH trinn 21 (D), men denne blir blokkert av pode kulene fuktet i U0126 (E). I tidligere lem knopper prematur myod uttrykk ikke er indusert av FGF18 (F), men induseres ved ko-poding perler dynket i FGF18 og retinsyre antagonist BMS493 (G). FGF18 perler podet inn HH21 lemmer indusere ERK-fosforylering etter 1 time: lysfelt (H), fluorescerende (I) og fusjonert (J) bilder av en HH21 lem immunofarget for anti-phosphoERK. Kontroll perler dynket i BSA må ikke brekning ERK-fosforylering: (K), fluorescerende (L) og fusjonert (M) bilder av en HH21 lem immunofarget for anti-phosphoERK. Dette tallet har blitt forandret fra Mok et al 2014 16. Sorte stjernene: heparin perler; hvit asterisikoer: AG 1-X2 perler; Pilene viser ektopisk myod uttrykk i lem knopper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av perle grafts brukes direkte til å utvikle vev i ovo er et kraftig verktøy for å dissekere rollen som vekstfaktor signale under utvikling som gir enestående kontroll over utviklingsstadiet hvor de brukes og varigheten av eksponeringen.
Valget av vulsten for hver type molekyl er viktig. Små hydrofobe molekyler, slik som de inhibitorene som beskrives her og retinsyre, vanligvis bindes godt til derivatisert AG 1-X2-perler, selv om det er nødvendig å teste effektiviteten av hver inhibitor på disse perlene empirisk. Tilsvarende for vekstfaktorer kan det være nødvendig å teste forskjellige typer av vulsten. Noen perler er transparente og så kan være vanskelig å visualisere de manipulasjoner, men en kort behandling med fenolrød etterfulgt av en skylling i PBS vil merke dem lenge nok til å utføre pode.
Når du forbereder perler, spesielt de som har blitt dynket med inhibitors, er det viktig å beskytte dem mot lys så langt som mulig. Under den første behandling, og i løpet av manipulering bør de være tildekket og bare fjernes når perlene blir overført. Det er best å bruke fersk tinte porsjoner som noen av disse reagenser er ustabil og kan gi misvisende negative resultater hvis ikke lagret på riktig måte. Det er også viktig ikke å la dem soaking i fenolrødt for lenge før poding, da dette kan redusere effektiviteten av perlen.
Konsentrasjonene anvendt for disse kuletransplantater, av både vekstfaktorer og medikamenter, er ofte meget høy; FGF18 perler er fuktet i en konsentrasjon på 0,5 mg / ml og perler for lavmolekylære inhibitorer er ofte fuktet i en konsentrasjon på 100 uM. Selv om dette er mye høyere enn de konsentrasjoner som vanligvis brukes for å behandle celler i løsning dette er nødvendig, fordi mengden av vekstfaktorer og medikamenter absorberes av kulene, og deretter slippes ut er vanskelig å måle direkte, men formodentlig generate lavere nivåer enn dette in vivo. Som et resultat av en rekke konsentrasjoner må testes for hvert molekyl anvendt for å bestemme en effektiv dose.
Denne teknikken kan også anvendes på et bredt spekter av andre vev, så som somites 24, under utvikling og kan brukes på befruktede egg i ovo eller i kulturer, såsom EC kultur 25. Det er også mulig å dyrke dyrkede celler som utskiller spesifikke vekstfaktorer som pellets som så kan podes inn i utvikling av embryo på samme måte 26.
Kombinasjonen av tilgjengelighet, enkel manipulasjon og lav pris gjør kylling embryoer en utmerket modell for utvikling. Som transgene teknologier er i økende grad brukt til fuglearter og genmodifiserte linjer med både kyllinger 7 og vaktler 27 blir tilgjengelige kombinasjonen av klassisk embryo pode teknikker med disse modifiserte fuglene er allerede gir ny innsikt i deling 8,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
| AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
| U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
| Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30 ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
| Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |
References
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Bell, E., Brickell, P. Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo. Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).
- Abu-Elmagd, M., et al. Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis. Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).
- Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. Development. 121, 651-660 (1995).
- McGrew, M. J., et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).
- Valasek, P., et al. Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle. Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Rosello-Diez, A., Torres, M. Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells. Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).
- Anakwe, K., et al. Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing. Development. 130, 3503-3514 (2003).
- Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. The importance of timing differentiation during limb muscle development. Current Biology. 8, 642-652 (1998).
- Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo. Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).
- Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts. Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).
- Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5. Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).
- Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals. Development. 127, 4105-4113 (2000).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Martinez-Morales, P. L., et al. FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk. Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).
- Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension. Development. 134, 2125-2135 (2007).
- Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity. Development. 125, 2825-2835 (1998).
- Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes. Development. 125, 777-790 (1998).
- Sweetman, D., et al. FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos. Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).
- Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals. BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).
- Scott, B. B., Lois, C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).
- Seidl, A. H., et al. Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).
