Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic Funktionel MRI

Published: April 19, 2016 doi: 10.3791/53346

Introduction

Optogenetic funktionel magnetisk resonans (ofMRI) er en ny teknik, der kombinerer den rumlige opløsning af høj felt fMRI med præcision optogenetic stimulering 1-11,38, så celletype-specifik kortlægning af funktionelle neurale kredsløb og deres dynamik i hele hjerne. Optogenetics muliggør specifikke celletyper, der skal målrettes til stimulering af indførelsen af ​​lysfølsomme trans-membrankonduktans kanaler, kaldet opsiner. Specifikke elementer af neurale kredsløb er genetisk modificeret til at udtrykke disse kanaler, så millisekund-tidsskala modulation af aktivitet i den intakte hjerne 1-15. fMRI tilvejebringer en ikke-invasiv fremgangsmåde til bestemmelse af hjernens globale dynamiske respons på optogenetic stimulering af specifikke neurale kredsløb gennem måling af blod-ilt-niveau-afhængig (fed) signal 16-18, hvilket giver en indirekte måling af neuronal aktivitet.

Kombinationen af ​​disse to teknikker, betegnet optogenetic funktionel magnetisk resonans (ofMRI), er fordelagtig i forhold til andre metoder til optagelse hjernens aktivitet under stimulering såsom elektrofysiologi fordi det kan tilvejebringe en visning af hele hjernen ved relativt høj rumlig opløsning. Dette muliggør påvisning af neuronal aktivitet som respons på målrettet stimulation ved store afstande fra stedet for stimulering uden behov for implantering af invasive registreringselektroder 1-11. ofMRI er fordelagtig i forhold den mere traditionelle fremgangsmåde til udførelse af elektrisk stimulering under fMRI, som kan rekruttere forskellige celletyper nær elektroden og dermed forvirre den kausale indflydelse hver population 19. Desuden elektroderne anvendes til elektrisk stimulering og den genererede strøm kan producere artefakter under MR-billeddannelse 20. Faktisk ofMRI muliggør observation af indflydelse på den globale hjerne aktivitet fra den specifikke modulatipå af en bred række celletyper gennem brug af avancerede genetiske targeting teknikker såsom Cre-Lox-system i transgene dyr eller anvendelse af promotorer. Kombinatorisk optisk kontrol med hel-hjerne overvågning er mulig med ofMRI gennem brug af både NpHR at inhibere og CHR2 at excitere specifikke celletyper. Den optogenetic værktøjskasse til rådighed til brug i ofMRI også hurtigt bedre over tid med indførelsen af ​​opsiner med øget lysfølsomhed eller forbedrede kinetik, af stabiliserede trinfunktions opsiner (SSFOs) eller af rød-skiftet opsiner som kan ophæve kravet om implanterede fiber optik, der gør det muligt ikke-invasiv stimulation under billedbehandling 21. Disse muligheder er ikke tilgængelige med elektrisk stimulering.

Imidlertid har signalartefakter følge af opvarmning af væv på grund af lys levering i hjernen blevet rapporteret 22, hvor temperaturen induceret ændring af relaksationstider er blevet vist at producere pseugøre aktivering. Forskere udfører ofMRI bør derfor være opmærksomme på denne potentielle forvirre. Med den rette opsætning og kontrol, kan problemet løses. Yderligere kan relativt lav tidsmæssig opløsning til måling af hæmodynamiske respons i fMRI være en begrænsende faktor for visse anvendelser af denne teknik.

Denne protokol beskrives først opbygningen af de fiberoptiske implantater, der muliggør levering af specifikke lysbølgelængder dybt ind i hjernen in vivo. Protokollen beskriver derefter leveringen af ​​opsin-kodende viral vektor til en præcis hjerne region under anvendelse stereotaktisk kirurgi. Næste protokollen beskriver processen med hel-hjerne funktionel MRI ved samtidig lys stimulation. Endelig protokollen skitserer grundlæggende data analyse af de indsamlede data.

Af note, der er beskrevet her optogenetics kræver en kronisk implantat til lys levering. Men de fiberoptiske implantater er stabile og bio-kompatible, der giver mulighed for langsgående scanning og undersøgelse af neural kredsløb over en periode på måneder 23,24.

Sammenfattende den præcise stimulering og hel-hjerne overvågning evne ofMRI er afgørende faktorer ved fremstilling ofMRI et effektivt redskab til studiet af connectomics af hjernen. Desuden kan det tilvejebringe nye indsigt i mekanismerne i neurologiske sygdomme 25 når kombineret med forskellige dyremodeller. Faktisk har ofMRI blevet brugt til at belyse netværksaktivitet af distinkte hippocampus subregioner forbundet med anfald 8. Derfor vil laboratorier interesseret i at besvare systemer niveau neurovidenskab spørgsmål finder denne teknik af betydning.

Protocol

Etik Statement: her er blevet godkendt af Stanford University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) Eksperimentelle procedurer.

1. Forberedelse Patch kabler og Endetyller implantater

Bemærk: Selvom patch kabler og ferrule implantater er kommercielt tilgængelige, der producerer disse internt muliggør speciale designs og vil koste mindre.

  1. For at fremstille en fiber patch kabel til afgivelse lys fra laseren til implantatet i hjernen, første spalte den optiske fiber til den ønskede længde.
    1. Ved hjælp af en fiber spaltekniven, opsige den optiske fiber til at producere en flad ende ved afslutningen punkt. Hvis fiberen er blevet overtrukket med en kappe afisoleres kappen med en fiber-afisoleringsværktøj forhånd.
    2. Spalte den anden ende af den optiske fiber til at frembringe den ønskede længde for kablet, sikrer, at kablet er lang nok til at strække sig fra lyskilden til dyret inde i boringen iscanneren.
  2. Bland en lille mængde epoxy lim i et 1: 1 forhold på et stykke aluminiumsfolie kort før det næste trin, som epoxylim bliver for viskøs til brug 5 min efter blanding.
  3. Ved hjælp af en lille træpind, forsigtigt anvende epoxy lim til den del af fiberen, der vil blive placeret inde i konkave side af den keramiske rørring og derefter anvende en lille dråbe på overfladen af ​​den flade side af rørringen. Efter at sætte det i ferrule, sikre, at en lille længde fiber (<0,5 mm) stikker ud fra den flade side af den keramiske ferrule. Lad epoxylim til at hærde O / N for optimale resultater.
  4. På den side af det fiberoptiske patch kabel, der vil forbinde til laserlyskilden, forsigtigt anvende epoxy lim til den del af fiberen, der vil blive placeret inde i konkave side af rørringen af ​​FC / PC stik og derefter anvende en lille falde ned på overfladen af ​​den flade side af rørringen. Efter at sætte det i ferrule, sikreat en lille fiberlængde (<0,5 mm) rager frem fra den flade side af rørringen. Lad epoxylim til at hærde O / N for optimale resultater.
  5. Polere den flade ende af ferrulerne for begge sider af kablet ved hjælp af en polering disk ved hjælp af en pincet til at anvende blid nedadgående pres på rørringen samtidig med at figur-8 rotationer på aluminiumoxid lappemaskiner ark (fra 3 um til 1 um til 0,3 um grus ).
  6. Undersøg den flade ende af ferrulen med et mikroskop ved 100X forstørrelse. Sikre, at overfladen af ​​den flade ende, herunder selve den fiberoptiske overflade, er fri for enhver epoxy lim; fortsætte polering hvis epoxylim forbliver på overfladen. Sørg for, at fiberoptiske overfladen ikke har brudt eller tilhugget.
    ADVARSEL: Sørg personale træffe passende laser sikkerhed uddannelse klasser og slid laser beskyttelsesbriller før håndtering laserudstyr.
  7. Slut fiberoptiske patch kabel til laserlyskilden gennem FC / PC stik og tilpasse fIber tip til omdrejningspunktet for koblingen. Mål lyset sendeeffekt af fiberen med en power meter for at sikre tilstrækkelig lysudbytte.
    Bemærk: Følgende trin er for at forberede keramiske rørringe med fiberoptik for kronisk implantation ind i hjernen; keramiske rørringe er hule i centrum og bære fiberoptik til at levere lys fra en patch kabel til et område af interesse (ROI) i hjernen.
  8. Ved hjælp af en fiber spaltekniven, opsige den optiske fiber til at producere en flad ende ved afslutningen punkt. Hvis fiberen er blevet overtrukket med en kappe afisoleres kappen med en fiber-afisoleringsværktøj forhånd.
  9. Spalte den anden ende af den optiske fiber til at frembringe den ønskede længde til implantering i hjernen. Bestemme længden af ​​fiberen ved hjælp af en stereotaksiske atlas at målrette ROI i hjernen.
    1. For eksempel: at målrette dorsale hippocampus hos rotter, der er 3,5 mm under bregma, sikre, at længden af ​​fiberen rager ud fra ferrule er 3,5 mm + 0,25 mm, svarende til kraniet tykkelse og giver mulighed for fejlmargen. Derfor, at det endelige længde af fiber er 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (længde af rørringen) = 14.25 mm.
  10. Bland en lille mængde epoxy lim i et 1: 1 forhold på et stykke aluminiumsfolie kort før det næste trin (epoxy lim bliver for viskøs til brug 5 min efter blanding).
  11. Ved hjælp af en lille træpind, forsigtigt anvende epoxy lim til den del af fiberen, der vil blive placeret inde i konkave side af den keramiske rørring og derefter anvende en lille dråbe på overfladen af ​​den flade side af rørringen. Efter at sætte det i ferrule, sikre, at en lille længde fiber (<0,5 mm) stikker ud fra den flade side af den keramiske ferrule. Lad epoxylim til at hærde O / N for optimale resultater.
  12. Polere den flade ende af rørringen ved hjælp af en polering disk ved hjælp af en pincet til at anvende blid nedadgående pres på rørringen samtidig med at figur-8 rotations på aluminiumoxid lappemaskiner ark (fra 3 um til 1 um til 0,3 um grus).
  13. Undersøg den flade ende af ferrulen med et mikroskop ved 100X forstørrelse. Sikre, at overfladen af ​​den flade ende, herunder selve den fiberoptiske overflade, er fri for enhver epoxy lim; fortsætte polering hvis epoxylim forbliver på overfladen. Sørg for, at fiberoptiske overfladen ikke har brudt eller tilhugget.
  14. Par den polerede ferrule til en fiberoptisk patch kabel med en dupsko ærme og tilslut patchkabel til en laser lyskilde. Mål lyset sendeeffekt på spidsen af ​​fiberen med en power meter for at sikre tilstrækkelig effektivitet.
  15. Hold en log over udgangseffekten kræves fra plasteret kablets ferrule for hver ferrule implantat til output den ønskede effekt på spidsen af ​​den fiberoptiske (2,5 mW i denne protokol). Kassér rørringe med en dæmpning på over 50% og med ikke-cirkulært output mønster.

2. stereotaktisk Implantation Kirurgi og virus Injection

  1. Sørg for, at eksperimentelle procedurer, der involverer brug af dyr er godkendt af den lokale IACUC. Oprethold aseptiske forhold under overlevelse operationer ved at følge aseptiske procedurer, herunder ved hjælp af sterile handsker, sterile masker, sterile kirurgiske gardiner og steriliserede kirurgiske instrumenter.
    FORSIGTIG: Sørg for, at kirurger er iført korrekt personlige værnemidler (PPE), herunder beskyttelsesbriller, før du begynder proceduren. Følg standard biosikkerhed procedurer, når du arbejder med adenoassocieret vektor (AAV), der tager sig for at undgå stænk. Bortskaf AAV affald i en biologisk fare container.
  2. Læg en mikroliter sprøjte med nok AAV til injektion i dyret plus ekstra til at redegøre for potentielle tab Mange (alt 4 pi per dyr), at holde sprøjten på is før brug. I denne protokol, er AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP ved en titer på 4x10 12 vg / ml anvendes. Placer dyret under Isoflurane anæstesi med en induktion kammer, forbundet til en præcision isofluran fordamper sæt 3 - 4% med en oxygenholdig gaskilde.
  3. Barbere hovedet med en elektrisk barbermaskine og udføre en tredobbelt kirurgisk krat på huden med Betadine og en ethanol skylning 70%.
  4. Når dyret er i dyb anæstesi (tjek tå refleks og vejrtrækning), immobilisere dyrets kranium i et stereotaktisk apparat med intra-lydlige positionering nitter og tand bar.
    Bemærk: Hele proceduren vil tage 1 - 2 ud hr, fra anæstesi induktion til genopretning.
  5. Indstil anæstesi til et passende niveau (1 - 3% isofluran på fordamperen) og løbende overvåge dyrets vitale tegn, justere anæstesi som nødvendigt for at opretholde en vejrtrækning på ~ 40 vejrtrækninger / min. Administrere oftalmisk salve på øjnene af dyret for at forhindre tørhed mens under anæstesi.
  6. Lav en 15 - 20 mm midtlinie hovedbund snit med en skalpel og trække hovedbunden ved hjælp af kirurgiske hemostats enttached til periosteum. Henvisning lambda og bregma at placere borehovedet over koordinater for ROI.
  7. Bor et lille kraniotomi (2 - 3 mm) over ROI med en tandlægebor, pas på ikke at punktere hjernen. Sæt langsomt nål fastgjort til mikroliter sprøjten gennem kraniotomi til ROI i hjernen.
  8. Med en mikrosprøjte pumpestyring, injicere 2 pi af vektoren opløsningen i ROI. Brug en strømningshastighed på 150 nl / min for at undgå vævsbeskadigelse. Efter at injektionen er afsluttet, vente 10 minutter før fjernelse af sprøjten langsomt, med en hastighed på 0,5 mm / min.
  9. Efter injektion, tørre overfladen af ​​kraniet. Henvisning lambda og bregma at bekræfte koordinater og derefter indsætte ferrule implantat til målet dybde (for eksempel: 3,5 mm under bregma for dorsale hippocampus) med en hastighed på omkring 0,5 mm / min. Monter rørringen implantatet til kraniet ved dental cement. Efter dental cement er størknet, forsegle incisionen med suturer (size 5-0 for rotter) omkring dental cement cap.
  10. Efter operationen dyret i sit bur enkeltvis opstaldet med halvdelen af ​​buret på toppen af ​​et varmeapparat til anæstesi recovery. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Placer ikke dyret i selskab med andre dyr, indtil den er fuldt tilbagebetalt.
  11. For post-kirurgisk behandling af smerte, administrere buprenorphin subkutant hver 12 timer ved en dosis på 0,05 mg / kg i 24 timer. Administrere antibiotisk pulver dagligt over incisionssted i 3 dage.
  12. Fjern suturerne cirka to uger efter operationen for at forhindre skorpedannelse.
  13. Vent 4 - 6 uger efter virus injektion tilstrækkelig udtryk for optogenetic gener, før du udfører eksperimenter.

3. optogenetic Funktionel MRI

ADVARSEL: Vær forsigtig omkring det permanente magnetfelt af en MR-scanner. Sikker udstent, herunder funktion generator, lyskilde, ventilator, capnograph og gastanke, tilstrækkeligt langt væk (mindst ud over 5 Gauss grænse).

  1. Placer dyret under gas anæstesi med en induktion kammer, forbundet til en præcision isofluran fordamper fastsat til 5% med en oxygenholdig gaskilde.
  2. Når dyret er i dyb anæstesi (kontrol tå refleks og vejrtrækning), intubere dyret i henhold til protokollen beskrevet i Rivard et al. (2006) for at tillade overvågning af kuldioxid ved kapnografi 26. Bemærk: intubation er kritisk i at opretholde ordentlig niveauer af eksspiratorisk CO 2 under billedbehandling.
  3. Fastgør dyret i scanneren holderen.
    Bemærk: I denne protokol, blev vuggen brugerdefinerede producerede men sådanne vugger er også kommercielt tilgængelige. Rat cradle tjener til at sikre dyret inden scanneren til levering af anæstesi, opvarmet luft og for begrænsning af bevægelse.
  4. Levere en blanding af isofluran (Ranging udtaget fra 1.2 - 1,5%) i ca. 60% lattergas og 40% oxygen via en slange gennem holderen. Sørg for, at dyrets hoved er forsvarligt fastgjort for at undgå bevægelsesartefakter.
  5. Giv opvarmet luft gennem slangen i vuggen og indsætte en rektal termometer med smøremiddel til at overvåge kropstemperaturen. Administrere oftalmisk salve på øjnene af dyret for at forhindre tørhed mens under anæstesi.
  6. Slut fiberoptiske patch kabel til en laserlyskilde og måle output ved spidsen af ​​plasteret kablets rørring med en effektmåler.
  7. Juster til det relevante effektniveau (tidligere bestemt i trin 1.15) for at frembringe den ønskede udgang (2,5 mW i denne protokol) på spidsen af ​​den fiberoptiske implanteret inde i hjernen. Eftersom overdreven udgangseffekt fra den fiberoptiske potentielt kan forårsage vævsskade i hjernen eller forårsager opvarmning af væv, der frembringer signal artefakter, ikke øge udgangseffekten af ​​laserenud over den tilsigtede output.
  8. Forhindre lys lækage fra implantatet med en kegle af sort elektrisk tape og dække øjnene på dyret. Par fiberoptiske kabel til ferrulen implantatet på dyret med en rørring ærme.
  9. Placer spolen over hovedet på dyret. Sæt holderen med dyret ind i boringen i scanneren.
    Bemærk: I denne protokol, single-loop sende-modtage spole blev skik produceret og pre-tunet til at modtage den optimale radiofrekvens fra hjernevæv.
  10. Overvåg vejrtrækning og kropstemperatur hele denne proces, justere den kunstige ventilator og varmelegeme som nødvendigt for at holde fysiologiske værdier inden for grænser (sikre, at eksspiratorisk CO 2 er 3 - 4% ved at dreje grebene på ventilatoren for at justere slagtilfælde frekvens og volumen, og at temperatur er 37 ° C ved at klikke på pilene for temperatur indstilling).
  11. Vælg en positionering sekvens til billedet dyret hoved placering. Hvis Bregn er ikke i iso-center, justere hovedet placering dyr og gentag positionering scanning indtil hjernen er i iso-center. Vælg en lineær afstandsstykker sekvens, og klik belastning i udvælgelsen sekvens vinduet. Klik derefter begynde at reducere inhomogeniteter af det magnetiske felt.
    Bemærk: afstandsplader er et afgørende skridt, der vil direkte påvirke integriteten af ​​fMRI data.
  12. Vælg en T2-vægtet sekvens, og klik belastning i udvælgelsen sekvens vinduet. Klik derefter begynde at erhverve T2-vægtede høj opløsning koronale anatomiske billeder før fMRI at kontrollere, om den overordnede integritet af hjernen og at bekræfte placeringen af ​​den optiske fiber implantat.
    Bemærk: Disse billeder kan anvendes som anatomi overlays for ofMRI scanning serie.
  13. Slut BNC kabler fra udløser porten på MR scanner til funktionen generator, så at laserlyskilden drives ifølge en eksperimentel stimulering paradigme.
    Bemærk: I denne protokol, stimulering pAradigm er 30 sek af baseline efterfulgt af 20 sekunders On / 40 sek off for seks minutter.
  14. Vælg en multi-slice gradient mindede ekko (GRE) sekvens, og klik belastning i udvælgelsen sekvens vinduet. Klik derefter begynde at erhverve 35 mm x 35 mm (2D FOV) i-plane koronale skiver med 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm rumlig opløsning.
    Bemærk: Den GRE sekvens bruges her har en gentagelse tid (TR) og ekko tid (TE) af TR / TE = 750/12 msek og 30 ° flip vinkel.
  15. Ved afslutningen af ​​scanningen, skal du fjerne dyret fra scanneren og overvåge, indtil den er vækket fra anæstesi og kan opretholde brystleje.

4. ofMRI Dataanalyse

Bemærk: udføres Følgende trin i MATLAB som beskrevet i en publikation om high-throughput ofMRI 27.

  1. Efter den rå scan data er blevet overført til computeren anvendes til analyse, bruger glidende vindue genopbygning til at opdatere billedet hver TR, meden fire-interleave spiral udlæsning, til 750 ms TR og 12 ms ekko tid erhverve 23 skiver pr scan serie. I stedet for konventionel rekonstruktion, hvor nye fMRI billeder er rekonstrueret, efter at alle indfletter erhverves for hver skive, den glidende vindue genopbygning metode rekonstruerer billeder efter overtagelsen af hver indskydningspapiret 27.
  2. Behandle de rå data for to-dimensionel gridding rekonstruktion, bevægelse korrektion, og beregning af tidsserier som tidligere 27 beskrevet.
  3. Brug en tærskel sammenhæng metode til at bestemme aktiverede voxels ved at beregne procent modulation af BOLD signal af hver voxel i forhold til baseline periode indsamlet før stimulation som tidligere 27 beskrevet. Beregn sammenhæng værdier størrelsen af Fouriertransformation på hyppigheden af gentagne stimuleringscykler divideret med summen-af-kvadrater af alle frekvenskomponenter 8.
  4. Brug af tidsseriedata for hver vOxel gennemsnitlige motion-korrigerede billeder, der hører til på hinanden følgende scanninger af den samme stimulation paradigme først. Derefter justere de gennemsnitlige 4D billeder til en fælles koordinatsystem ramme med et stift legeme transformation seks graders-of-frihed plus isotrope skalering til sammenligning inden for og mellem dyr som tidligere 27 beskrevet.

Representative Results

Figur 1 og figur 2 viser repræsentative data fra 20 Hz (15 msek impulsbredde, 473 nm, 30% duty cycle) optogenetic stimulering af den motoriske hjernebark. En stimulering paradigme 30 sekunder af baseline efterfulgt af 20 sekunders On / 40 sek off for blev anvendt seks minutter. Tidligere undersøgelser har vist, at dette paradigme frembringer robuste BOLD signal fra optogenetic stimulering 1,8. Figur 1 viser aktiverede voxels detekterede både på det lokale site af stimulation (motor cortex) og i thalamus, som følge af de langtrækkende synaptiske forbindelser mellem disse regioner. Figur 2 viser, at tidsmæssig information kan udledes HRFs, som den thalamiske reaktion forsinkes (lavere initiale hældning) sammenlignet med den motoriske hjernebark respons efter optogenetic stimulering.

p_upload / 53.346 / 53346fig1.jpg "/>
Figur 1. Aktivering Kort over BOLD Signal induceret af optogenetic Stimulering af CamKIIa-udtrykkende celler i Motor Cortex. Sammenhæng værdier af aktive voxels, identificeret som dem betydeligt synkroniseret til gentagne stimulationer, vises overlejret på en T2-vægtet koronal anatomiske skive. Data, indsamlet over en seks min, 30 sek periode (indledende 30 sek baseline og seks stimulering cyklusser af 20 sek på / 40 sek off med 473 nm lys, 20 Hz, 15 msek pulsbredde) kondenseres i en aktivering kortet. Sekventielle skiver er 0,5 mm fra hinanden og placeringen af fiberoptiske implantatet er angivet ved trekanten. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Bevægelse af emnet under billedbehandling er en væsentlig kilde til artefakt, som kan føre til ødelæggelse af data. Passende sikre dyret på imaging vugge kan minimere sådanne artefakter som vil opretholde passende anæstesi niveauer. Her brugte vi isofluran men alternative bedøvelsesmidler, såsom medetomidin eller ketamin og xylazin, bør også overvejes. Niveauerne og valg af bedøvelse, kan imidlertid påvirke mange parametre i hjernen, herunder BOLD respons 28. Isofluran kan forårsage ændringer i neuronexcitabilitet 29. Andre bedøvelsesmidler kan også påvirke GABA synaptisk hæmning 30. Således er valget af anæstesi er vigtig, når der udføres ofMRI givet sin evne til at påvirke neuronal aktivitet. ofMRI i mangel af anæstesi er muligt, men kan være udfordrende med øget bevægelse fra dyret, som kan reduceres, hvis dyret er habituated; er tidligere blevet udført sådanne vågen ofMRI undersøgelser ennd ville undgå forvirrende virkninger af anæstesi på hjernen 9,10. Efterbehandling motion korrektionsalgoritmer kan anvendes til i høj grad at afbøde virkningerne af bevægelse. Flere af disse metoder findes, herunder den inverse Gauss-Newton-algoritme beskæftiget i denne protokol, der minimerer summen af ​​kvadrater omkostningerne funktion af henvisningen billede og billede under korrektion. Algoritmen er nyttigt, fordi det giver mulighed for hurtig og robust bevægelse korrektion, ved hjælp af en GPU parallel platform designet til at reducere sagsbehandlingstider 27.

For genopbygning data i denne protokol, blev skik skrevet software i en MATLAB miljø bruges til to-dimensionelle gridding rekonstruktion, hvor spiral prøver rekonstrueret i k-rummet til gitter billeder 31-33. Tidsseriedata blev genereret ved at beregne procent modulation af BOLD signal af hver voxel i forhold til baseline periode indsamlet før stimulation. Voxels hvis tidsserier blev SYNchronized til blokke af optogenetic stimulation med en sammenhæng værdi på 0,35 eller større blev defineret som aktiverede voxels; denne sammenhæng værdi svarer til en mindre end 10 -9 P-værdi 8. Sammenhæng værdier blev beregnet som størrelsen af Fouriertransformation på hyppigheden af gentagne stimuleringscykler divideret med summen-af-kvadrater af alle frekvenskomponenter højst 8,27. Familywise fejl kan kontrolleres ved hjælp af Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger. kan anvendes andre analysemetoder, herunder parametriske statistiske tests såsom de generelle lineære modeller (GLMs). Sammenhængen metode kræver mindre forudgående kendskab til det HRF sammenlignet med den konventionelle generelle lineære model. Derfor er det fordelagtigt, når udforske data ved hjælp ofMRI. Dog kan sammenhængen metode kun bruges til data med blok designs eller udvalgte event-relaterede designs med en fast interstimulus interval og må ikke anvendes i ofMRI data med andre event-relaTed konstruerer eller blandede designs. Efterfølgende kan dynamisk kausal modellering (DCM) bruges til at analysere interaktioner mellem hjerneområder er identificeret gennem ofMRI. DCM er et Bayesian statistisk teknik udviklet til analyse af funktionel konnektivitet fra systemets reaktioner på eksperimentelle indgange under fMRI 34.

Supplerende tekniske bekymringer for ofMRI diskuteres her. Implantater kan blive beskadiget eller falde, hvilket fører til fjernelse af det syge dyr fra undersøgelsen. Re-implantation operationer anbefales ikke på grund af den yderligere usikkerhed målrette samme ROI som i den oprindelige implantation kirurgi og på grund af dyrevelfærd. På grund af den betydelige mængde af tid og ressourcer investeres i hver forsøgsdyr, overvejelse af styrken af ​​materialet er en væsentlig bekymring, når du vælger en passende dental cement til brug i ofMRI undersøgelser. Den implantering er en kritisk faktor i at maksimere levetiden af ​​implant og forsøgsdyr. For eksempel sikrer, at kraniet er tør før påføring af dentalcement og placere en tilstrækkelig mængde af cement omkring keramikring implantatet kan sikre stabilitet over potentielle måneder lange tidslinje for dyret under undersøgelsen. Derudover kan alternative bur designs udforskes og diskuteres med lokale dyr pleje facilitet til at undgå bure med wire toppe holder mad og vand, der ofte stikker ind i buret og give muligheder for dyret at beskadige implantatet. Vigtigt er, skal dentalcement vælges omhyggeligt for at reducere artefakter, der påvirker billeddannelse og alternative cementer kan testes ved påføring på et fantom og billeddannelse i en scanner før anvendelse i dyreforsøg. Trial and error med forskellige dental cementer har vist, at cement, der anvendes i denne protokol giver relativt få artefakter. En anden teknisk udfordring i at udføre ofMRI er nøjagtigheden af ​​fiberoptiske placering på den påtænkte ROI, givet UdvindingEmely små afstande, der kan eksistere mellem kerner i hjernen 35. Efter at have afsluttet implantation operationer, kan T2-vægtede anatomiske scanninger anvendes til at bestemme korrekt placering ved overlejring på en hjerne atlas. Den dygtighed af kirurgen og praksis at udføre disse operationer kan forbedre korrekte placering satser. Specificiteten og udtryk for opsin på den påtænkte ROI kan verificeres ved afslutningen af ​​den undersøgelse, som perfusion dyret og fastsættelse af hjernen, ved hjælp af immunhistokemi eller endogene fluorescens af en reporter-protein mærket til opsin til visualisering. Disse reporter-proteiner kan også colocalized med andre proteiner for at sikre, at opsin udtrykkes i de ønskede neurale celletyper 1,8,15,25. Som tidligere nævnt kan artefakter opstå ved udførelse ofMRI grundet opvarmning af væv fra lys levering 22. Vævet opvarmning forårsager ændring af afslapning gange, hvilket resulterer i falsk BOLD signal. For at sikre at activationen følge af lys stimulering under ofMRI skyldes ikke denne artefakt, bør udføres opsin-negative kontroller, hvor enten saltvand injicerede dyr eller dyr injiceret med kontrol fluoroforen vektorer (såsom AAV-CamKIIa-EYFP) undergår ofMRI. Derudover bør kun velopbygget fiberoptiske implantater med god lystransmission effektivitet anvendes til at fjerne behovet for at anvende høje lasereffekter. ofMRI undersøgelser er blevet udført, hvor falsk aktivering på grund af opvarmning af væv har ikke været et problem 1,6-8,10,11.

Med hensyn til valget af vektor til at indføre de nødvendige optogenetic gener i neuroner til ekspression, er AAV'er ikke kendt for at forårsage sygdom hos mennesker og er derfor en bekvem løsning, fordi det lavere biosikkerhed niveau, der kræves for at bruge disse midler (BSL-1). Desuden et væld af vektor kerner bære AAV'er pakket med forskellige optogenetic gener i lager og med flere serotyper. Serotype AAV skal vælges based af den tilsigtede cellepopulation mål at sikre optimale ekspressionsniveauer 36,37. Lentivira kan også anvendes, men kræver en højere biosikkerhed niveau. Tidsrummet er nødvendig for tilstrækkelig udtryk for optogenetic gener er variabel afhængig af den specifikke dyremodel anvendt, af den særlige AAV anvendes, og af den specifikke eksperimentelle paradigme. I denne protokol, er Sprague Dawley rotter 11 uger gammel brugt og optogenetic undersøgelser begynder fire til seks uger efter virus injektion. Transgene mus kan også anvendes i optogenetic undersøgelser. Det er nødvendigt at udføre pilotforsøg for at bestemme den specifikke mængde tid, der kræves for tilstrækkelig udtryk for opsiner. Stimulation paradigmer kan variere afhængigt af den specifikke opsin anvendes. I denne protokol, er AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP anvendt og stimulering paradigme er 20 sek på / 40 sek fra. Hvis der anvendes en SSFO vil stimulation paradigme variere fordi SSFO kræver kun en kort puls af lys at være acveret og derefter en kort puls af lys ved en anden bølgelængde skal afsluttes.

En ekstra kritisk bekymring, når du udfører ofMRI forhindrer lys lækage fra ferrule implantat grænseflade med det fiberoptiske patch kabel under optogenetic stimulation for at forhindre en confounding hjerne signal stammer fra visuel stimulation, selv når dyret er bedøvet. Kogler af sort elektrisk tape kan anvendes til at blokere lyset fra ferulerne og dække øjnene af dyret. Vigtigt er det, skal fysiologiske værdier, herunder eksspiratorisk CO2 og kropstemperaturen af emnet være ordentligt vedligeholdt gennem hele det billeddannende. Eksspiratorisk CO 2 bør holdes mellem 3 - 4% og legemstemperatur ved 37 ° C. Desuden de lagdannelse sekvenser mindskes mest inhomogenitet som muligt i det magnetiske felt før start ofMRI scanner spænder bestemmer kvaliteten af ​​de resulterende BOLD data. Kontrol af disse faktorerer kritisk i at producere pålidelige ofMRI data. I denne protokol, der DPSS lasere bruges som lyskilde til optogenetic stimulation. Fordi laserlys er sammenhængende, mere end nok strøm let kan tilføres gennem fiberoptiske. LED-lyskilder koblet til fiberoptik er tilgængelige fra kommercielle leverandører, men har den ulempe, nedsat effekt af lystransmission. Laseren lyskilde kræver tilpasning til hver enkelt fiberoptiske patch kabel, men med praksis, kan tilpasningen ske inden for sekunder til minutter.

Fremtidige anvendelser af ofMRI indbefatter anvendelsen af ​​næste generation opsiner såsom rødforskudt opsiner at muliggøre ikke-invasiv stimulation under billedbehandling. Derudover kunne implantation af MR-kompatible EEG eller lignende optagelse elektroder sammen med fiberoptiske implantat give mulighed for erhvervelse af høje data tidsmæssige opløsning ud over de højopløselige data fra MRI rumlige. ofMRI med electrophysiological optagelse kunne give omfattende oplysninger om den funktionelle konnektivitet af hjernen. Sammenfattende magt ofMRI at overvåge hele hjernen som reaktion på stimulering af specifikke cellepopulationer defineret af genetiske eller anatomisk identitet gør ofMRI et kritisk værktøj til brug i studiet af neurologiske sygdomme og af connectomics af sund hjerne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 Tesla scanner Agilent Technologies Discovery MR901 System
Sprague Dawley rats Charles River Crl:SD 11 weeks old
fiber cleaver Fujikura CT-05
multimode optical fiber Thor Labs AFS105/125Y
fiber stripper   Thor Labs T08S13
ceramic split sleeve Precision Fiber Products SM-CS1140S
epoxy glue Thor Labs G14250
cotton-tipped applicators Stoelting Co. 50975
multimode ceramic zirconia ferrules Precision Fiber Products MM-FER2002
FC/PC multimode connector Thor Labs 30128C3
fiber optic polishing disk Precision Fiber Products M1-80754
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm Thor Labs LFG03P
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm Thor Labs LFG1P
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm Thor Labs LFG3P
binocular biological microscope 40X-1,000X Amscope B100
laser safety glasses Kentek KXL-62W01
473 nm DPSS laser Laserglow LRS-0473
594 nm DPSS laser Laserglow LRS-0594
Allen hex wrench set 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser
power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm Thor Labs PM121D
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033
isoflurane vaporizer with induction chamber VetEquip 901806
NanoFil 100 µl syringe World Precision Instruments NANOFIL-100
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-1
function generator A.M.P.I.  Master-8
small animal stereotax David Kopf Instruments Model 940 
Model 683 small animal ventilator  Harvard Apparatus 550000
Type 340 capnograph  Harvard Apparatus 733809
dental drill (rotary micromotor kit) Foredom Electric Co. K.1070
ophthalmic ointment (Artificial Tears) Rugby 00536-6550-91
instrument sterilizer CellPoint Scientific Germinator 500 glass bead sterilizer
antibiotic powder Pfizer NEO-PREDEF neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride
buprenorphine painkiller Hospira NDC:0409-2012 schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. H., et al. Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring. Nature. 465 (7299), 788-792 (2010).
  2. Weitz, A. J., Lee, J. H. Progress with optogenetic functional MRI and its translational implications. Future Neurol. 8 (6), 691-700 (2013).
  3. Lee, J. H. Informing brain connectivity with optogenetic functional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 62 (4), 2244-2249 (2012).
  4. Lee, J. H. Tracing Activity Across the Whole Brain Neural Network with Optogenetic Functional Magnetic Resonance Imaging. Front. Neuroinform. 5 (October), 1-7 (2011).
  5. Kahn, I., et al. Characterization of the Functional MRI Response Temporal Linearity via Optical Control of Neocortical Pyramidal Neurons. J. Neurosci. 31 (42), 15086-15091 (2011).
  6. Takata, N., et al. Optogenetic Activation of CA1 Pyramidal Neurons at the Dorsal and Ventral Hippocampus Evokes Distinct Brain-Wide Responses Revealed by Mouse fMRI. PLoS ONE. 10 (3), e0121417 (2015).
  7. Iordanova, B., Vazquez, A. L., Poplawsky, A. J., Fukuda, M., Kim, S. -G. Neural and hemodynamic responses to optogenetic and sensory stimulation in the rat somatosensory cortex. J. Cereb. Blood Flow Metab. 35 (6), 922-932 (2015).
  8. Weitz, A. J., et al. Optogenetic fMRI reveals distinct, frequency-dependent networks recruited by dorsal and intermediate hippocampus stimulations. NeuroImage. 107, 229-241 (2015).
  9. Desai, M., et al. Mapping brain networks in awake mice using combined optical neural control and fMRI. J. Neurophysiol. 105 (December 2010), 1393-1405 (2011).
  10. Liang, Z., Watson, G. D. R., Alloway, K. D., Lee, G., Neuberger, T., Zhang, N. Mapping the functional network of medial prefrontal cortex by combining optogenetics and fMRI in awake rats. NeuroImage. 117 (0), 114-123 (2015).
  11. Byers, B., et al. Direct in vivo assessment of human stem cell graft-host neural circuits. NeuroImage. 114 (0), 328-337 (2015).
  12. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  13. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat. Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
  14. Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3 (10), 785-792 (2006).
  15. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  16. Ogawa, S., Lee, T. M., Kay, A. R., Tank, D. W. Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24), 9868-9872 (1990).
  17. Ogawa, S., et al. Intrinsic signal changes accompanying sensory stimulation: functional brain mapping with magnetic resonance imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5951-5955 (1992).
  18. Kwong, K. K., Belliveau, J. W., et al. Dynamic magnetic resonance imaging of human brain activity during primary sensory stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5675-5679 (1992).
  19. Canals, S., Beyerlein, M., Murayama, Y., Logothetis, N. K. Electric stimulation fMRI of the perforant pathway to the rat hippocampus. Magn. Reson. Imaging. 26, 978-986 (2008).
  20. Antal, A., et al. Imaging artifacts induced by electrical stimulation during conventional fMRI of the brain. NeuroImage. 85 (3), (2014).
  21. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nat. Neurosci. 16 (10), 1499-1508 (2013).
  22. Christie, I. N., et al. FMRI response to blue light delivery in the naïve brain: Implications for combined optogenetic fMRI studies. NeuroImage. 66, 634-641 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J. Neural Eng. 4, S143-S156 (2007).
  24. Pashaie, R., et al. Optogenetic brain interfaces. IEEE Rev. Biomed. Eng. 7, 3-30 (2014).
  25. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
  26. Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19, 267-274 (2006).
  27. Fang, Z., Lee, J. H. High-throughput optogenetic functional magnetic resonance imaging with parallel computations. J. Neurosci. Meth. 218 (2), 184-195 (2013).
  28. Da Silva, F. L. EEG: Origin and measurement. EEG - fMRI: Physiological Basis, Technique, and Applications. , 19-38 (2010).
  29. Becker, K., et al. Low dose isoflurane exerts opposing effects on neuronal network excitability in neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 7 (6), 3-9 (2012).
  30. Nishikawa, K., Maciver, M. B. Agent-selective Effects of Volatile Anesthetics on GABA A Receptor - mediated Synaptic Inhibition in Hippocampal Interneurons. Anesthesiology. 94 (2), 340-347 (2001).
  31. Jackson, J. I., Meyer, C. H., Nishimura, D. G., Macovski, A. Selection of a convolution function for Fourier inversion using gridding. IEEE Trans. Med. Imag. 10 (3), 473-478 (1991).
  32. Glover, G. H., Lee, A. T. Motion artifacts in fMRI: comparison of 2DFT with PR and spiral scan methods. Magn. Reson. Med. 33 (20), 624-635 (1995).
  33. Kim, D. H., Adalsteinsson, E., Spielman, D. M. Simple analytic variable density spiral design. Magn. Reson. Med. 50, 214-219 (2003).
  34. Friston, K. J., Harrison, L., Penny, W. Dynamic causal modeling. Neuroimage. 19, 1273-1302 (2003).
  35. Alkire, M. T., McReynolds, J. R., Hahn, E. L., Trivedi, A. N. Thalamic microinjection of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat. Anesthesiology. 107 (2), 264-272 (2007).
  36. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol. Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  37. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS ONE. 8 (9), 1-16 (2013).
  38. Liu, J., et al. Frequency-selective control of cortical and subcortical networks by central thalamus. eLife. 4, e09215 (2015).

Tags

Neuroscience optogenetics funktionel magnetisk resonans (fMRI) optogenetic fMRI (ofMRI) neurovidenskab hjerne dyb brain stimulation (DBS)
Optogenetic Funktionel MRI
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, P., Fang, Z., Liu, J., Lee, J.More

Lin, P., Fang, Z., Liu, J., Lee, J. H. Optogenetic Functional MRI. J. Vis. Exp. (110), e53346, doi:10.3791/53346 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter