Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic कार्यात्मक एमआरआई

Published: April 19, 2016 doi: 10.3791/53346
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Neurology and Neurological Sciences, Stanford University, 2Electrical Engineering, Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Introduction

Optogenetic कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (ofMRI) एक उपन्यास तकनीक का उच्च क्षेत्र fMRI स्थानिक संकल्प optogenetic उत्तेजना 1-11,38 की परिशुद्धता के साथ जोड़ती है कि, पूरी भर कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट के सेल प्रकार विशिष्ट मानचित्रण और उनकी गतिशीलता को सक्षम करने के लिए है दिमाग। Optogenetics के लिए विशेष प्रकार की कोशिकाओं के प्रकाश के प्रति संवेदनशील पार झिल्ली प्रवाहकत्त्व चैनल, कहा जाता opsins के लागू होने से उत्तेजना के लिए निशाना बनाया जा सकता है। तंत्रिका सर्किट के विशिष्ट तत्वों आनुवंशिक रूप से इन चैनलों को व्यक्त करने के लिए, अक्षत मस्तिष्क 1-15 में गतिविधि का मिलीसेकंड-timescale मॉडुलन सक्षम करने के लिए संशोधित कर रहे हैं। fMRI रक्त ऑक्सीजन के स्तर पर निर्भर (बोल्ड) संकेत 16-18, जो neuronal गतिविधि का एक अप्रत्यक्ष माप प्रदान की माप के माध्यम से विशिष्ट तंत्रिका सर्किट के optogenetic उत्तेजना मस्तिष्क के वैश्विक गतिशील प्रतिक्रिया का निर्धारण करने के लिए एक गैर-आक्रामक तरीका प्रदान करता है।

इन दो तकनीकों के संयोजन, करार दिया optogenetic कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (ofMRI), क्योंकि यह अपेक्षाकृत उच्च स्थानिक संकल्प पर पूरे दिमाग के एक दृश्य प्रदान कर सकते हैं जैसे कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में उत्तेजना के दौरान रिकॉर्डिंग मस्तिष्क गतिविधि के अन्य तरीकों पर फायदेमंद है। यह आक्रामक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड 1-11 के आरोपण के लिए आवश्यकता के बिना उत्तेजना की साइट से काफी दूरी पर लक्षित उत्तेजना के जवाब में neuronal गतिविधि का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है। ofMRI fMRI के दौरान बिजली की उत्तेजना के प्रदर्शन का अधिक परंपरागत विधि, इलेक्ट्रोड के पास विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की भर्ती कर सकते हैं जो और इस प्रकार प्रत्येक जनसंख्या 19 के कारण प्रभाव उलझाना से ज्यादा फायदेमंद है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड बिजली की उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया और उत्पन्न वर्तमान एमआर इमेजिंग 20 के दौरान कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं। दरअसल, ofMRI विशिष्ट modulati से वैश्विक मस्तिष्क की गतिविधियों पर प्रभाव के अवलोकन के लिए सक्षम बनाताऐसे ट्रांसजेनिक जानवरों में Cre पर Lox प्रणाली या प्रमोटरों के उपयोग के रूप में उन्नत आनुवंशिक लक्ष्यीकरण तकनीकों के उपयोग के माध्यम से सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के पर। पूरे मस्तिष्क की निगरानी के साथ मिश्रित ऑप्टिकल नियंत्रण विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए दोनों NpHR के उपयोग को रोकना और ChR2 के माध्यम से ofMRI साथ संभव है। optogenetic टूलकिट ofMRI में उपयोग के लिए उपलब्ध भी तेजी से वृद्धि हुई प्रकाश संवेदनशीलता या सुधार कैनेटीक्स, स्थिर कदम समारोह opsins (SSFOs) या लाल स्थानांतरित opsins के साथ opsins का परिचय है कि प्रत्यारोपित फाइबर के लिए आवश्यकता नकारना सकता है के साथ समय के साथ सुधार हो रहा है प्रकाशिकी, इमेजिंग 21 के दौरान गैर-आक्रामक उत्तेजना सक्षम करने से। इन संभावनाओं बिजली की उत्तेजना के साथ उपलब्ध नहीं हैं।

हालांकि, संकेत ऊतक हीटिंग से उत्पन्न कलाकृतियों मस्तिष्क में प्रकाश वितरण के कारण 22, जहां छूट बार के तापमान को प्रेरित संशोधन pseu उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है सूचित किया गया हैसक्रियण से करते हैं। ofMRI प्रदर्शन शोधकर्ताओं इसलिए इस संभावित उलझाना के बारे में पता होना चाहिए। उचित स्थापना और नियंत्रण के साथ, इस मुद्दे को संबोधित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, fMRI में रक्तसंचारप्रकरण प्रतिक्रिया को मापने की अपेक्षाकृत कम अस्थायी समाधान इस तकनीक के कुछ अनुप्रयोगों के लिए एक सीमित कारक हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल पहली फाइबर ऑप्टिक प्रत्यारोपण कि विवो में मस्तिष्क में गहरी प्रकाश के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य का वितरण सक्षम के निर्माण का वर्णन है। प्रोटोकॉल तो स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी का उपयोग कर एक सटीक मस्तिष्क क्षेत्र को opsin एन्कोडिंग वायरल वेक्टर के वितरण का वर्णन है। प्रोटोकॉल अगले एक साथ प्रकाश उत्तेजना के दौरान पूरे मस्तिष्क कार्यात्मक एमआरआई की प्रक्रिया का वर्णन है। अंत में, प्रोटोकॉल का अधिग्रहण डेटा के बुनियादी डेटा विश्लेषण की रूपरेखा।

ध्यान से, optogenetics यहाँ वर्णित प्रकाश वितरण के लिए एक पुरानी प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है। हालांकि, फाइबर ऑप्टिक प्रत्यारोपण स्थिर और जैव हैंसंगत, अनुदैर्ध्य स्कैनिंग और महीनों की अवधि में 23,24 तंत्रिका circuitry की जांच के लिए अनुमति देता है।

सारांश में, सटीक उत्तेजना और पूरे मस्तिष्क निगरानी ofMRI की क्षमता ofMRI मस्तिष्क के connectomics के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाने में महत्वपूर्ण कारक हैं। इसके अलावा, यह मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 25 के तंत्र जब विभिन्न पशु मॉडलों के साथ मिलकर में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। दरअसल, ofMRI अलग हिप्पोकैम्पस बरामदगी 8 के साथ जुड़े उपक्षेत्र के नेटवर्क गतिविधि को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसलिए, सिस्टम स्तर के तंत्रिका विज्ञान के सवालों का जवाब देने में रुचि प्रयोगशालाओं महत्व की इस तकनीक को मिलेगा।

Protocol

आचार कथन: प्रायोगिक प्रक्रिया यहाँ स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. तैयारी पैच केबल्स और सामी समाविष्ट

नोट: हालांकि पैच केबल और सामी प्रत्यारोपण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, उत्पादन में इन-हाउस डिजाइन विशेषता सक्षम बनाता है और कम खर्च होंगे।

  1. मस्तिष्क में समाविष्ट करने के लिए लेजर से प्रकाश देने के लिए एक फाइबर केबल पैच तैयार करने के लिए, पहली इच्छित लंबाई करने के लिए ऑप्टिकल फाइबर फोड़ना।
    1. एक फाइबर क्लीवर का उपयोग करना, समापन बिंदु पर एक फ्लैट अंत का उत्पादन करने के लिए ऑप्टिकल फाइबर समाप्त। फाइबर एक जैकेट के साथ लेपित किया गया है, तो जैकेट एक फाइबर अलग करना उपकरण पहले से साथ बंद पट्टी।
    2. ऑप्टिकल फाइबर केबल के लिए इच्छित लंबाई का उत्पादन करने के दूसरे छोर फोड़ना, यह सुनिश्चित करना है कि केबल लंबे समय पर्याप्त है के बोर के अंदर जानवर को प्रकाश स्रोत से विस्तार करने के लिएस्कैनर।
  2. एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर 1 के अनुपात में शीघ्र ही अगले कदम से पहले, के रूप में epoxy गोंद मिश्रण के बाद के लिए उपयोग 5 मिनट भी चिपचिपा हो जाता है: एक 1 में epoxy गोंद की एक छोटी राशि मिक्स।
  3. एक छोटे से लकड़ी की छड़ी का प्रयोग, धीरे फाइबर है कि सिरेमिक सामी के अवतल पक्ष के अंदर रखा जाएगा और उसके बाद सामी के फ्लैट की ओर की सतह पर एक छोटी सी बूंद लागू के हिस्से को epoxy गोंद लागू होते हैं। सामी में डालने के बाद, यह सुनिश्चित करें कि फाइबर (<0.5 मिमी) की एक छोटी लंबाई सिरेमिक सामी के फ्लैट की ओर से protrudes। epoxy गोंद इष्टतम परिणामों के लिए हे / एन कड़ा करने की अनुमति दें।
  4. फाइबर ऑप्टिक पैच केबल के पक्ष यह है कि लेजर प्रकाश स्रोत से कनेक्ट करेगा, पर धीरे फाइबर है कि एफसी / पीसी कनेक्टर के सामी के अवतल पक्ष के अंदर रखा जाएगा हिस्सा करने के लिए epoxy गोंद लागू करते हैं और फिर एक छोटे से लागू सामी के फ्लैट की ओर की सतह पर छोड़ देते हैं। सामी में डालने के बाद, यह सुनिश्चित करेंकि फाइबर (<0.5 मिमी) की एक छोटी लंबाई सामी के फ्लैट की ओर से protrudes। epoxy गोंद इष्टतम परिणामों के लिए हे / एन कड़ा करने की अनुमति दें।
  5. सामी पर कोमल नीचे दबाव लागू करने के लिए चिमटी का उपयोग करके एक चमकाने डिस्क का उपयोग केबल के दोनों पक्षों के लिए ferrules के फ्लैट अंत पॉलिश, जबकि 3 माइक्रोन के लिए 1 माइक्रोन से 0.3 माइक्रोन धैर्य से एल्यूमीनियम ऑक्साइड lapping शीट (पर आंकड़ा -8 घुमाव बनाने )।
  6. 100X बढ़ाई पर एक माइक्रोस्कोप के साथ सामी के फ्लैट अंत जांच करते हैं। सुनिश्चित करें कि फाइबर ऑप्टिक सतह ही सहित फ्लैट अंत की सतह, किसी भी epoxy गोंद से मुक्त है; यदि epoxy गोंद सतह पर रहता है चमकाने जारी है। सुनिश्चित करें कि फाइबर ऑप्टिक सतह टूट गया है या chipped नहीं किया है।
    चेतावनी: सुनिश्चित कर्मियों उचित लेजर सुरक्षा प्रशिक्षण कक्षाएं लेते हैं और लेजर उपकरण को संभालने से पहले लेजर सुरक्षा चश्मे पहनते हैं।
  7. एफसी / पीसी कनेक्टर के माध्यम से लेजर प्रकाश स्रोत के लिए फाइबर ऑप्टिक पैच केबल कनेक्ट और च संरेखितयुग्मक का केन्द्र बिन्दु को iber टिप। एक बिजली मीटर के साथ फाइबर के प्रकाश संचरण शक्ति को मापने के लिए पर्याप्त प्रकाश उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए।
    नोट: निम्न चरणों के दिमाग में पुरानी आरोपण के लिए फाइबर ऑप्टिक्स के साथ चीनी मिट्टी ferrules तैयार करने के लिए कर रहे हैं; सिरेमिक ferrules केंद्र में खोखला कर रहे हैं और फाइबर ऑप्टिक्स ले प्रकाश मस्तिष्क के भीतर ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र के लिए एक पैच केबल से वितरित करने के लिए।
  8. एक फाइबर क्लीवर का उपयोग करना, समापन बिंदु पर एक फ्लैट अंत का उत्पादन करने के लिए ऑप्टिकल फाइबर समाप्त। फाइबर एक जैकेट के साथ लेपित किया गया है, तो जैकेट एक फाइबर अलग करना उपकरण पहले से साथ बंद पट्टी।
  9. ऑप्टिकल फाइबर के दूसरे छोर फोड़ना मस्तिष्क में आरोपण के लिए इच्छित लंबाई का उत्पादन। मस्तिष्क के भीतर रॉय निशाना बनाने के लिए एक stereotaxic एटलस का उपयोग कर फाइबर की लंबाई निर्धारित करते हैं।
    1. उदाहरण के लिए: चूहे जो पर्वबिन्दु नीचे 3.5 मिमी है में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस निशाना बनाने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि फाइबर की लंबाई ferrul से फैला हुआई 3.5 मिमी + 0.25 मिमी, मोटाई खोपड़ी के लिए लेखांकन और त्रुटि के मार्जिन के लिए अनुमति देता है। इसलिए, जाँच करें कि फाइबर के अंतिम लंबाई 3.5 मिमी + 0.25 मिमी + 10.5 मिमी (सामी की लंबाई) = 14.25 मिमी है।
  10. एक 1 में epoxy गोंद की एक छोटी राशि मिक्स: एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर 1 के अनुपात में शीघ्र ही अगले कदम से पहले (epoxy गोंद मिश्रण के बाद के लिए उपयोग 5 मिनट भी चिपचिपा हो जाता है)।
  11. एक छोटे से लकड़ी की छड़ी का प्रयोग, धीरे फाइबर है कि सिरेमिक सामी के अवतल पक्ष के अंदर रखा जाएगा और उसके बाद सामी के फ्लैट की ओर की सतह पर एक छोटी सी बूंद लागू के हिस्से को epoxy गोंद लागू होते हैं। सामी में डालने के बाद, यह सुनिश्चित करें कि फाइबर (<0.5 मिमी) की एक छोटी लंबाई सिरेमिक सामी के फ्लैट की ओर से protrudes। epoxy गोंद इष्टतम परिणामों के लिए हे / एन कड़ा करने की अनुमति दें।
  12. सामी पर कोमल नीचे दबाव लागू करने के लिए चिमटी का उपयोग करके एक चमकाने डिस्क का उपयोग करते समय आंकड़ा -8 रोटेशन बनाने सामी के फ्लैट अंत पॉलिशएल्यूमीनियम ऑक्साइड lapping शीट पर एस (3 माइक्रोन 1 माइक्रोन से 0.3 माइक्रोन धैर्य से)।
  13. 100X बढ़ाई पर एक माइक्रोस्कोप के साथ सामी के फ्लैट अंत जांच करते हैं। सुनिश्चित करें कि फाइबर ऑप्टिक सतह ही सहित फ्लैट अंत की सतह, किसी भी epoxy गोंद से मुक्त है; यदि epoxy गोंद सतह पर रहता है चमकाने जारी है। सुनिश्चित करें कि फाइबर ऑप्टिक सतह टूट गया है या chipped नहीं किया है।
  14. युगल एक सामी आस्तीन के साथ एक फाइबर ऑप्टिक पैच केबल के लिए पॉलिश सामी और एक लेजर प्रकाश स्रोत के लिए पैच केबल को जोड़ने। एक बिजली मीटर के साथ फाइबर की नोक पर प्रकाश संचरण शक्ति को मापने के लिए पर्याप्त दक्षता सुनिश्चित करने के लिए।
  15. बिजली उत्पादन के उत्पादन के लिए प्रत्येक सामी प्रत्यारोपण फाइबर ऑप्टिक (इस प्रोटोकॉल में 2.5 मेगावाट) की नोक पर वांछित सत्ता के स्तर के लिए पैच केबल के सामी से आवश्यक का एक लॉग रखें। 50% से अधिक की एक क्षीणन दर के साथ और गैर परिपत्र उत्पादन पैटर्न के साथ ferrules त्यागें।

2. Stereotaxic छोटा सा भूतlantation सर्जरी और वायरस इंजेक्शन

  1. सुनिश्चित करें कि किसी भी प्रायोगिक पशुओं के उपयोग से जुड़े प्रक्रियाओं स्थानीय IACUC द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं। सड़न रोकनेवाला प्रक्रियाओं के बाद, बाँझ दस्ताने, मास्क बाँझ, बाँझ शल्य पर्दे और निष्फल सर्जिकल उपकरणों का उपयोग कर शामिल करके अस्तित्व सर्जरी के दौरान मम्मियाँ की स्थिति को बनाए रखें।
    चेतावनी: यह सुनिश्चित करें कि सर्जन उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) प्रक्रिया शुरू करने से पहले सुरक्षा चश्मे सहित पहने हुए हैं। जब एडिनो से जुड़े वेक्टर (एएवी) के साथ काम कर रहा है, देखभाल करने के splashing से बचने के लिए मानक जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें। एक biohazard कंटेनर में एएवी कचरे के निपटान।
  2. जानवर में इंजेक्शन के लिए पर्याप्त एएवी के साथ एक microliter सिरिंज लोड प्लस संभावित मात्रा घाटा (पशु प्रति 4 μl की कुल) के लिए खाते में करने के लिए अतिरिक्त, उपयोग करने से पहले बर्फ पर सिरिंज रखे हुए हैं। इस प्रोटोकॉल में, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) 4x10 12 वी.जी. / एमएल के एक अनुमापांक पर -EYFP प्रयोग किया जाता है। आइसोफ्लुरेन के तहत पशु रखेंएक प्रेरण कक्ष के साथ ई संज्ञाहरण, 3 पर एक सटीक isoflurane vaporizer सेट से जुड़ा - एक ऑक्सीजन गैस के स्रोत के साथ 4%।
  3. एक बिजली के रेजर के साथ सिर दाढ़ी और betadine और एक 70% इथेनॉल कुल्ला का उपयोग कर त्वचा पर एक ट्रिपल शल्य साफ़ करते हैं।
  4. एक बार जानवर गहरी संज्ञाहरण (पैर की अंगुली पलटा और साँस लेने की दर की जाँच) में है, इंट्रा-कर्ण स्थिति स्टड और दांत के साथ एक बार stereotaxic तंत्र में पशु की खोपड़ी स्थिर करना।
    नोट: इस पूरी प्रक्रिया में 1 ले जाएगा - संज्ञाहरण प्रेरण से वसूली करने के लिए 2 घंटा,।
  5. (- Vaporizer पर 3% isoflurane 1) और लगातार जानवर के महत्वपूर्ण संकेत निगरानी, ​​आवश्यक के रूप में संज्ञाहरण का समायोजन ~ 40 साँस / मिनट एक साँस लेने की दर बनाए रखने के लिए एक उचित स्तर पर संज्ञाहरण सेट करें। जानवर की आंखों पर नेत्र मरहम जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए प्रशासन।
  6. एक छुरी के साथ 20 मिमी midline खोपड़ी चीरा और शल्य चिकित्सा hemostats का उपयोग कर खोपड़ी वापस लेना एक - एक 15 बनाओperiosteum को ttached। संदर्भ लैम्ब्डा और शीर्षस्थान रॉय के लिए निर्देशांक के ऊपर ड्रिल बिट की स्थिति है।
  7. एक छोटे से craniotomy ड्रिल - एक दंत ड्रिल के साथ रॉय के ऊपर (2 से 3 मिमी), देखभाल करने के मस्तिष्क पंचर करने के लिए नहीं। धीरे धीरे मस्तिष्क में रॉय को craniotomy के माध्यम से microliter सिरिंज से जुड़ी सुई डालें।
  8. एक microsyringe पंप नियंत्रक के साथ, आरओआई में वेक्टर समाधान के 2 μl इंजेक्षन। 150 nl / मिनट की एक प्रवाह की दर का प्रयोग ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए। इंजेक्शन के बाद पूरा हो, सिरिंज धीरे-धीरे हटाने, 0.5 मिमी / मिनट की दर से पहले 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  9. इंजेक्शन के बाद, खोपड़ी की सतह सूखी। संदर्भ लैम्ब्डा और शीर्षस्थान निर्देशांक की पुष्टि करें और फिर लक्ष्य की गहराई (उदाहरण के लिए: पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के लिए शीर्षस्थान नीचे 3.5 मिमी) को सामी प्रत्यारोपण डालने के लिए लगभग 0.5 मिमी / मिनट की दर से। खोपड़ी दंत सीमेंट का उपयोग करने सामी प्रत्यारोपण माउंट। बाद दंत सीमेंट जम गया है, टांके के साथ चीरा सील (एसआईचूहों के लिए ज़ी 5-0) दंत सीमेंट टोपी के आसपास।
  10. सर्जरी के बाद, अपने पिंजरे अकेले संज्ञाहरण वसूली के लिए एक हीटर के शीर्ष पर पिंजरे के आधे के साथ रखे में जानवरों की जगह। एक जानवर की पहुंच से बाहर छोड़ जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। अन्य जानवरों की कंपनी में जानवरों की जगह जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो गया है मत करो।
  11. दर्द की शल्य चिकित्सा के बाद प्रबंधन, प्रशासन buprenorphine subcutaneously हर 12 से 24 घंटे के लिए 0.05 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक पर घंटे के लिए। 3 दिन के लिए चीरा साइट पर दैनिक एंटीबायोटिक पाउडर प्रशासन।
  12. गद्दारी को रोकने के लिए लगभग दो सप्ताह सर्जरी के बाद टांके निकालें।
  13. प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले optogenetic जीनों की अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त वायरस इंजेक्शन के बाद 6 सप्ताह - 4 रुको।

3. optogenetic कार्यात्मक एमआरआई

चेतावनी: एक एमआरआई स्कैनर के स्थायी चुंबकीय क्षेत्र के आसपास व्यायाम सावधानी। सुरक्षित equipmईएनटी, समारोह जनरेटर, प्रकाश स्रोत, वेंटीलेटर, capnograph और गैस टैंक सहित पर्याप्त दूर दूर (कम से कम 5 गॉस की सीमा से परे)।

  1. गैस संज्ञाहरण के तहत पशु एक प्रेरण कक्ष, एक ऑक्सीजन गैस के स्रोत के साथ 5% से कम एक सटीक isoflurane vaporizer सेट से जुड़ा के साथ रखें।
  2. एक बार जानवर गहरी संज्ञाहरण (चेक पैर की अंगुली पलटा और साँस लेने की दर) में है, प्रोटोकॉल Rivard एट अल में विस्तृत के अनुसार पशु intubate। (2006) Capnography 26 से कार्बन डाइऑक्साइड की निगरानी की अनुमति है। नोट: इंटुबैषेण इमेजिंग के दौरान निःश्वास सीओ 2 के उचित स्तर को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है।
  3. स्कैनर पालने में पशु सुरक्षित।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, पालने कस्टम उत्पादन किया गया था, लेकिन इस तरह पालने भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। चूहे पालने कार्यों संज्ञाहरण, गर्म हवा के वितरण के लिए और गति के प्रतिबंध के लिए स्कैनर के भीतर पशु सुरक्षित करने के लिए।
  4. (Isoflurane की एक मिश्रण rangin उद्धारपालने के माध्यम से ट्यूबिंग के माध्यम से लगभग 60% नाइट्रस ऑक्साइड और 40% ऑक्सीजन में 1.5%) - 1.2 से छ। सुनिश्चित करें कि पशु के सिर को सुरक्षित आदेश गति कलाकृतियों से बचने के लिए तय हो गई है।
  5. पालने में ट्यूबिंग के माध्यम से गर्म हवा प्रदान करते हैं और स्नेहक के साथ एक गुदा थर्मामीटर डालने के शरीर के तापमान पर नजर रखने के लिए। जानवर की आंखों पर नेत्र मरहम जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए प्रशासन।
  6. एक लेजर प्रकाश स्रोत के लिए फाइबर ऑप्टिक पैच केबल कनेक्ट और एक बिजली मीटर के साथ पैच केबल के सामी की नोक पर उत्पादन को मापने।
  7. उचित शक्ति स्तर (कदम 1.15 में पहले से निर्धारित) को समायोजित फाइबर ऑप्टिक दिमाग के अंदर प्रत्यारोपित की नोक पर वांछित उत्पादन (इस प्रोटोकॉल में 2.5 मेगावाट) का उत्पादन करने के लिए। चूंकि फाइबर ऑप्टिक से अत्यधिक बिजली उत्पादन के संभावित मस्तिष्क के अंदर ऊतकों को नुकसान के कारण या ऊतक हीटिंग कि संकेत कलाकृतियों का उत्पादन होगा पैदा कर सकता है, काफी लेजर की बिजली उत्पादन में वृद्धि नहीं करतेइरादा उत्पादन से परे है।
  8. काले बिजली के टेप की एक शंकु के साथ प्रत्यारोपण से प्रकाश रिसाव को रोकने और जानवर की आँखों को कवर किया। युगल एक सामी आस्तीन के साथ पशु पर सामी प्रत्यारोपण के लिए फाइबर ऑप्टिक केबल।
  9. पशु के सिर पर कुंडली रखें। स्कैनर के बोर में जानवर के साथ पालने डालें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एकल पाश संचारित-प्राप्त कुंडल कस्टम उत्पादन किया गया था और मस्तिष्क के ऊतकों से इष्टतम रेडियो आवृत्ति प्राप्त करने के लिए पूर्व देखते।
  10. वेंटीलेटर पर knobs घूर्णन स्ट्रोक आवृत्ति और मात्रा को समायोजित करने के लिए और कहा कि 4% - साँस लेने की दर और शरीर का तापमान इस प्रक्रिया के दौरान, कृत्रिम जीवन रक्षक प्रणाली और हीटर की सीमा के भीतर शारीरिक मूल्यों रखने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित करने के मॉनिटर (सुनिश्चित करें कि निःश्वास सीओ 2 3 है तापमान तापमान की स्थापना के लिए तीर) पर क्लिक करके 37 डिग्री सेल्सियस है।
  11. छवि के लिए एक स्थिति अनुक्रम पशु सिर स्थान का चयन करें। यदि खबारिश, आईएसओ केंद्र में नहीं है पशु सिर स्थान को समायोजित करने और स्थिति को स्कैन दोहराएँ जब तक मस्तिष्क आईएसओ केंद्र में है। एक रेखीय shimming अनुक्रम का चयन करें और अनुक्रम चयन विंडो में लोड क्लिक करें। अगले, चुंबकीय क्षेत्र के inhomogeneities को कम करने के लिए शुरू क्लिक करें।
    नोट: shimming एक महत्वपूर्ण कदम है कि सीधे fMRI डेटा की अखंडता को प्रभावित करेगा।
  12. एक टी 2 भारित अनुक्रम का चयन करें और अनुक्रम चयन विंडो में लोड क्लिक करें। अगले, मस्तिष्क के समग्र अखंडता पर जांच करने के लिए और ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपण के स्थान की पुष्टि करने के लिए टी 2 भारित उच्च संकल्प राज्याभिषेक संरचनात्मक छवियों को प्राप्त करने से पहले fMRI के लिए शुरू क्लिक करें।
    नोट: इन छवियों ofMRI स्कैन श्रृंखला के लिए शरीर रचना विज्ञान ओवरले के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  13. इतना है कि लेजर प्रकाश स्रोत एक प्रयोगात्मक उत्तेजना प्रतिमान के अनुसार संचालित है समारोह जनरेटर के लिए एमआरआई स्कैनर के ट्रिगर बंदरगाह से BNC केबल कनेक्ट करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, उत्तेजना पीaradigm आधारभूत का 30 सेकंड के छह मिनट के लिए / 40 सेकंड के आधार पर 20 सेकंड के बाद है।
  14. एक बहु-टुकड़ा ढाल की चर्चा की गूंज (जीआरई) के अनुक्रम का चयन करें और अनुक्रम चयन विंडो में लोड क्लिक करें। इसके बाद, 35 मिमी x 35 में विमान मिमी (2 डी FOV) के साथ 0.5 मिमी x 0.5 मिमी x 0.5 मिमी स्थानिक संकल्प राज्याभिषेक स्लाइस के अधिग्रहण के लिए क्लिक करें प्रारंभ करें।
    नोट: यहां इस्तेमाल जीआरई अनुक्रम टी.आर. / ते की पुनरावृत्ति समय (टीआर) और गूंज समय (ते) है = 750/12 मिसे और एक 30 डिग्री के कोण फ्लिप।
  15. स्कैन के समापन पर, स्कैनर से पशु हटा दें और जब तक यह संज्ञाहरण से जाग गया है और स्टर्नल लेटना बनाए रख सकते हैं की निगरानी।

4. ofMRI डेटा विश्लेषण

नोट: निम्न चरणों में MATLAB में प्रदर्शन कर रहे हैं उच्च throughput पर एक प्रकाशन ofMRI 27 में वर्णित है।

  1. बाद कच्चे स्कैन डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कंप्यूटर को हस्तांतरित कर दिया गया है, छवि हर टी.आर. अद्यतन करने के लिए खिड़की पुनर्निर्माण रपट उपयोग के साथएक चार बिछा सर्पिल readout, 750 मिसे टी.आर. और 12 मिसे गूंज समय श्रृंखला स्कैन प्रति 23 स्लाइस प्राप्त करने के लिए। पारंपरिक पुनर्निर्माण जहां नई fMRI छवियों को खंगाला कर रहे हैं के बाद ही सभी interleaves प्रत्येक टुकड़ा के लिए अधिग्रहण कर रहे हैं के बजाय, रपट खिड़की पुनर्निर्माण विधि फालतू 27 प्रत्येक के अधिग्रहण के बाद छवियों reconstructs।
  2. के रूप में पहले 27 में वर्णित दो आयामी gridding पुनर्निर्माण, गति सुधार, और समय की श्रृंखला की गणना के लिए कच्चे डेटा की प्रक्रिया।
  3. के रूप में पहले 27 में वर्णित उत्तेजना से पहले एकत्र आधारभूत अवधि के लिए प्रत्येक voxel रिश्तेदार के बोल्ड संकेत के प्रतिशत की गणना के मॉडुलन से सक्रिय voxels निर्धारित करने के लिए एक सीमा से जुटना विधि का प्रयोग करें। जुटना मूल्यों की गणना के रूप में फूरियर की भयावहता सभी आवृत्ति घटकों 8 की सम-ऑफ-चौराहों से विभाजित दोहराया उत्तेजना चक्र की आवृत्ति पर बदलना।
  4. प्रत्येक V के लिए समय श्रृंखला डेटा का उपयोगoxel, औसत गति को सही छवियों पहले ही उत्तेजना प्रतिमान की लगातार स्कैन करने के लिए संबंधित है। के रूप में पहले 27 में वर्णित फिर एक छह डिग्री के-स्वतंत्रता कठोर शारीरिक परिवर्तन प्लस के भीतर और पशुओं के बीच तुलना के लिए isotropic स्केलिंग के साथ एक आम समन्वय के फ्रेम करने के लिए औसत 4D छवियों को संरेखित।

Representative Results

चित्रा 1 और चित्रा 2 20 हर्ट्ज (15 मिसे पल्स चौड़ाई, 473 एनएम, 30% कर्तव्य चक्र) मोटर प्रांतस्था के optogenetic उत्तेजना से उत्पन्न प्रतिनिधि डेटा दिखाने के लिए। आधारभूत का 30 सेकंड का एक उत्तेजना प्रतिमान बंद पर / 40 सेकंड 20 सेकंड के द्वारा पीछा के लिए छह मिनट का इस्तेमाल किया गया था। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इस प्रतिमान optogenetic उत्तेजना 1,8 से मजबूत बोल्ड संकेत पैदा करता है। 1 से पता चलता सक्रिय voxels उत्तेजना (मोटर प्रांतस्था) के स्थानीय स्थल पर दोनों का पता चला और चेतक में चित्रा, लंबी दूरी की synaptic कनेक्शन का एक परिणाम के रूप में इन क्षेत्रों के बीच। चित्रा 2 से पता चलता है कि अस्थायी जानकारी, HRFs से बटोरा जा सकता है के रूप thalamic प्रतिक्रिया देरी हो रही है (कम प्रारंभिक ढलान) optogenetic उत्तेजना के बाद मोटर प्रांतस्था प्रतिक्रिया की तुलना में।

p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg "/>
चित्रा 1. एक्टिवेशन बोल्ड संकेत के मानचित्र मोटर प्रांतस्था में कोशिकाओं CaMKIIa व्यक्त की optogenetic उत्तेजना से प्रेरित। सक्रिय voxels, काफी दोहराया stimulations के लिए सिंक्रनाइज़ उन के रूप में पहचान का जुटना मूल्यों, एक टी 2 भारित राज्याभिषेक संरचनात्मक टुकड़ा पर मढ़ा दिखाए जाते हैं। डेटा एक सक्रियण नक्शे में संघनित कर रहे हैं (/ 40 473 एनएम प्रकाश, 20 हर्ट्ज, 15 मिसे नाड़ी चौड़ाई के साथ सेकंड बंद पर 20 सेकंड के प्रारंभिक 30 सेकंड के आधारभूत और छह उत्तेजना चक्र) एक छह मिनट, 30 सेकंड की अवधि में एकत्र। अनुक्रमिक स्लाइस 0.5 मिमी अलग कर रहे हैं और फाइबर ऑप्टिक प्रत्यारोपण के स्थान त्रिकोण से चिह्नित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इमेजिंग के दौरान इस विषय की गति विरूपण साक्ष्य है कि डेटा भ्रष्टाचार को जन्म दे सकता का एक महत्वपूर्ण स्रोत है। उचित इमेजिंग पालने पर पशु हासिल ऐसी कलाकृतियों को कम कर सकते हैं उचित संज्ञाहरण स्तर को बनाए रखने के रूप में होगा। यहाँ, हम isoflurane लेकिन इस तरह के medetomidine या ketamine और xylazine के रूप में वैकल्पिक anesthetics, इस्तेमाल किया, यह भी विचार किया जाना चाहिए। हालांकि, स्तर और संवेदनाहारी की पसंद मस्तिष्क में कई मापदंडों को प्रभावित कर सकते हैं, बोल्ड प्रतिक्रिया 28 भी शामिल है। Isoflurane neuronal excitability 29 में परिवर्तन हो सकता है। अन्य anesthetics भी गाबा synaptic निषेध 30 प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, संज्ञाहरण के चुनाव महत्वपूर्ण जब प्रदर्शन ofMRI neuronal गतिविधि को प्रभावित करने की क्षमता दी है। संज्ञाहरण के अभाव में ofMRI संभव है, लेकिन पशु, अगर पशु आदत है कम किया जा सकता है, जो से बढ़ाकर गति के साथ चुनौतीपूर्ण हो सकता है; इस तरह जाग ofMRI अध्ययनों से पहले प्रदर्शन किया गया है एकएन डी मस्तिष्क 9,10 पर संज्ञाहरण के confounding प्रभाव से बचना होगा। बाद के प्रसंस्करण गति सुधार एल्गोरिदम बहुत गति के प्रभाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल है, जो सुधार के तहत संदर्भ छवि के वर्गों लागत समारोह और छवि का योग कम से कम में कार्यरत उलटा गॉस-न्यूटन एल्गोरिथ्म सहित इन तरीकों में से कई मौजूद हैं। क्योंकि यह तेजी से और मजबूत गति सुधार सक्षम बनाता है, एक GPU समानांतर मंच डिजाइन का उपयोग कर प्रसंस्करण बार 27 कम करने के लिए एल्गोरिथ्म उपयोगी है।

इस प्रोटोकॉल में डेटा पुनर्निर्माण के लिए, एक MATLAB वातावरण में कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर दो आयामी gridding पुनर्निर्माण, जहां सर्पिल नमूने gridded छवियों 31-33 में कश्मीर अंतरिक्ष में खंगाला रहे हैं के लिए इस्तेमाल किया गया था। समय श्रृंखला डेटा उत्तेजना से पहले एकत्र आधारभूत अवधि के लिए प्रत्येक voxel रिश्तेदार के बोल्ड संकेत का प्रतिशत मॉडुलन की गणना के द्वारा उत्पन्न किया गया। Voxels जिसका समय श्रृंखला syn थे0.35 या अधिक की एक जुटना मूल्य सक्रिय voxels के रूप में परिभाषित किया गया साथ optogenetic उत्तेजना के ब्लॉक करने के लिए chronized; इस जुटना मूल्य कम से कम एक 10 -9 पी मूल्य 8 से मेल खाती है। के रूप में फूरियर की भयावहता सभी आवृत्ति घटकों 8,27 के सम-ऑफ-चौराहों से विभाजित दोहराया उत्तेजना चक्र की आवृत्ति पर बदलना जुटना मूल्यों की गणना की गई। कई तुलना के लिए Bonferroni सुधार का उपयोग Familywise त्रुटि को नियंत्रित किया जा सकता है। विश्लेषण के वैकल्पिक तरीकों जैसे सामान्य रेखीय मॉडल (GLMs) के रूप में पैरामीट्रिक सांख्यिकीय परीक्षण सहित इस्तेमाल किया जा सकता है। जुटना विधि पारंपरिक सामान्य रेखीय मॉडल की तुलना में HRF से कम पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है। इसलिए, यह लाभप्रद जब ofMRI का उपयोग कर डेटा तलाश रही है। हालांकि, जुटना विधि केवल ब्लॉक डिजाइन के साथ डेटा के लिए चयनित एक अंतराल interstimulus तय की और अन्य घटना-असली के साथ ofMRI डेटा में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है के साथ प्रयोग किया जा सकता है या घटना से संबंधित डिजाइनटेड डिजाइन या मिश्रित डिजाइन। बाद में, गतिशील कारण मॉडलिंग (डीसीएम) ofMRI के माध्यम से पहचान मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। डीसीएम एक Bayesian सांख्यिकीय fMRI 34 के दौरान प्रायोगिक आदानों के लिए प्रणाली प्रतिक्रियाओं से कार्यात्मक कनेक्टिविटी के विश्लेषण के लिए विकसित तकनीक है।

ofMRI के लिए अतिरिक्त तकनीकी चिंताओं यहां चर्चा कर रहे हैं। समाविष्ट क्षतिग्रस्त या गिर, अध्ययन से प्रभावित जानवर को हटाने के लिए अग्रणी हो सकता है। पुन आरोपण सर्जरी मूल आरोपण सर्जरी के रूप में और पशुओं के कल्याण के मुद्दों के कारण ही रॉय को निशाना बनाने का अतिरिक्त अनिश्चितता की वजह से सिफारिश नहीं कर रहे हैं। प्रत्येक जानवर के विषय में निवेश का समय और संसाधनों की महत्वपूर्ण राशि की वजह से, माल की ताकत पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय है जब ofMRI अध्ययन में इस्तेमाल के लिए एक उपयुक्त दंत सीमेंट चुनने है। आरोपण सर्जरी implan की दीर्घायु को अधिकतम करने में एक महत्वपूर्ण कारक हैटी और पशु विषय। उदाहरण के लिए, यह सुनिश्चित करना है कि खोपड़ी सिरेमिक सामी प्रत्यारोपण के आसपास दंत सीमेंट लागू करने और सीमेंट की एक पर्याप्त राशि रखने के अध्ययन के दौरान पशु की क्षमता महीने के लंबे समय से अधिक स्थिरता सुनिश्चित कर सकते हैं पहले सूखा है। इसके अतिरिक्त, वैकल्पिक पिंजरे डिजाइन का पता लगाया और तार में सबसे ऊपर खाद्य पकड़ रहा है और पानी के साथ पिंजरों है कि अक्सर पिंजरे में बहर से बचने और पशु प्रत्यारोपण को नुकसान करने के लिए अवसर प्रदान करने के लिए स्थानीय पशु की देखभाल की सुविधा के साथ विचार-विमर्श किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, दंत सीमेंट ध्यान से कलाकृतियों को प्रभावित इमेजिंग और वैकल्पिक सीमेंट्स पशु प्रयोगों में उपयोग करने से पहले एक स्कैनर में एक प्रेत और इमेजिंग पर आवेदन के द्वारा परीक्षण किया जा सकता कम करने के लिए चुना जाना चाहिए। ट्रायल और विभिन्न दंत सीमेंट्स के साथ त्रुटि से पता चला है कि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सीमेंट अपेक्षाकृत कुछ कलाकृतियों देता है। ofMRI प्रदर्शन में एक और तकनीकी चुनौती है, इरादा रॉय पर फाइबर ऑप्टिक नियुक्ति की सटीकता है extr दियाकि मस्तिष्क 35 में नाभिक के बीच मौजूद कर सकते हैं Emely छोटी दूरी। आरोपण सर्जरी पूरा करने के बाद, टी 2 भारित शारीरिक स्कैन एक मस्तिष्क एटलस पर overlaying द्वारा सही स्थान निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सर्जन और अभ्यास इन सर्जरी प्रदर्शन करने में कौशल सही प्लेसमेंट दर में सुधार कर सकते हैं। इरादा रॉय पर विशिष्टता और opsin की अभिव्यक्ति पशु perfusing और मस्तिष्क फिक्सिंग, immunohistochemistry या एक संवाददाता प्रोटीन दृश्य के लिए opsin के लिए टैग की अंतर्जात प्रतिदीप्ति का उपयोग करके अध्ययन के समापन पर सत्यापित किया जा सकता। ये रिपोर्टर प्रोटीन भी अन्य प्रोटीन के साथ colocalized जा सकती है कि यह सुनिश्चित करने opsin वांछित तंत्रिका कोशिका प्रकार 1,8,15,25 में व्यक्त किया जाता है। जैसा कि पहले उल्लेख, कलाकृतियों जब प्रकाश वितरण 22 से ऊतक हीटिंग की वजह से ofMRI प्रदर्शन पैदा कर सकते हैं। ऊतक हीटिंग झूठी बोल्ड संकेत में जिसके परिणामस्वरूप, विश्राम बार के संशोधन का कारण बनता है। कि एसी सुनिश्चित करने के लिएofMRI दौरान प्रकाश उत्तेजना से उत्पन्न tivation इस विरूपण साक्ष्य के कारण नहीं है, opsin-नकारात्मक नियंत्रण किया जाना चाहिए, जिसमें या तो खारा इंजेक्शन पशुओं या जानवरों नियंत्रण fluorophore वैक्टर (जैसे एएवी-CaMKIIa-EYFP के रूप में) के साथ इंजेक्शन ofMRI गुज़रना पड़ता है। इसके अतिरिक्त, अच्छा प्रकाश संचरण क्षमता के साथ ही अच्छी तरह का निर्माण फाइबर ऑप्टिक प्रत्यारोपण उच्च लेजर शक्तियों का उपयोग करने की आवश्यकता को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ofMRI पढ़ाई के ऊतक हीटिंग की वजह से जो गलत सक्रियण में प्रदर्शन किया गया है एक मुद्दा 1,6-8,10,11 नहीं किया गया है।

वेक्टर अभिव्यक्ति के लिए न्यूरॉन्स में आवश्यक optogenetic जीनों को पेश करने के विकल्प के बारे में, AAVS मनुष्यों में रोग का कारण ज्ञात नहीं हैं और इसलिए एक सुविधाजनक विकल्प हैं, इन एजेंटों (बीएसएल -1) का उपयोग करने के लिए आवश्यक कम जैव सुरक्षा के स्तर को देखते हुए। इसके अलावा, वेक्टर कोर की एक भीड़ के स्टॉक में है और कई सीरमप्रकारों के साथ विभिन्न optogenetic जीन के साथ पैक किया AAVS ले। एएवी की सीरोटाइप ख चुना जाना चाहिएइरादा सेल की आबादी लक्ष्य पर ased इष्टतम अभिव्यक्ति के स्तर 36,37 सुनिश्चित करने के लिए। Lentiviruses भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक उच्च जैव सुरक्षा स्तर की आवश्यकता होती है। समय अवधि optogenetic जीन की पर्याप्त अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है, का इस्तेमाल किया विशेष इस्तेमाल किया एएवी पर और विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रतिमान पर विशिष्ट पशु मॉडल के आधार पर चर रहा है। इस प्रोटोकॉल में, 11 सप्ताह की उम्र में Sprague Dawley चूहों का इस्तेमाल किया जाता है और optogenetic पढ़ाई के वायरस इंजेक्शन के बाद चार से छह सप्ताह शुरू करते हैं। ट्रांसजेनिक चूहों भी optogenetic अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह opsins की पर्याप्त अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक समय की विशेष राशि निर्धारित करने के लिए पायलट प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। उत्तेजना मानदंड विशिष्ट इस्तेमाल किया opsin के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP प्रयोग किया जाता है और उत्तेजना प्रतिमान / 40 सेकंड बंद पर 20 सेकंड है। एक SSFO का उपयोग करते हैं, उत्तेजना प्रतिमान अलग अलग होंगे क्योंकि SSFO एसी होने के लिए केवल प्रकाश की एक संक्षिप्त नाड़ी की आवश्यकता हैtivated और फिर एक और तरंग दैर्ध्य में प्रकाश की एक संक्षिप्त पल्स समाप्त किया जा सके।

एक अतिरिक्त गंभीर चिंता का विषय है, जब ofMRI एक confounding मस्तिष्क संकेत दृश्य उत्तेजना से होने को रोकने के लिए optogenetic उत्तेजना के दौरान फाइबर ऑप्टिक पैच केबल के साथ सामी प्रत्यारोपण इंटरफ़ेस से प्रकाश रिसाव को रोक रहा है, तब भी जब पशु anesthetized है प्रदर्शन। काले बिजली के टेप के शंकु ferrules से प्रकाश ब्लॉक करने के लिए और जानवर की आंखों को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, निःश्वास सीओ 2 और शरीर के तापमान को विषय सहित शारीरिक मूल्यों ठीक से इमेजिंग की अवधि के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4% और शरीर का तापमान - निःश्वास सीओ 2 से 3 के बीच रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, shimming दृश्यों चुंबकीय क्षेत्र में जितना संभव हो उतना inhomogeneity कम करने के लिए बहुत ofMRI को स्कैन करता है जिसके परिणामस्वरूप बोल्ड डेटा की गुणवत्ता निर्धारित शुरू करने से पहले। इन कारकों का नियंत्रणविश्वसनीय ofMRI डेटा के उत्पादन में महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, DPSS लेज़रों optogenetic उत्तेजना के लिए प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। क्योंकि लेजर प्रकाश सुसंगत है, पर्याप्त शक्ति से अधिक आसानी से फाइबर ऑप्टिक के माध्यम से आपूर्ति की जा सकती। एलईडी प्रकाश स्रोतों फाइबर ऑप्टिक्स के लिए युग्मित वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध हैं, लेकिन प्रकाश संचरण के कम बिजली का नुकसान है। लेजर प्रकाश स्रोत एक विशेष फाइबर ऑप्टिक पैच केबल के लिए संरेखण की आवश्यकता होती है, लेकिन अभ्यास के साथ, संरेखण मिनट के लिए सेकंड के भीतर पूरा किया जा सकता है।

ofMRI का भविष्य अनुप्रयोगों जैसे इमेजिंग के दौरान गैर-आक्रामक उत्तेजना सक्षम करने के लिए लाल स्थानांतरित opsins रूप में अगली पीढ़ी opsins का उपयोग शामिल है। इसके अतिरिक्त, एमआरआई-संगत ईईजी या फाइबर ऑप्टिक प्रत्यारोपण के साथ इसी तरह की रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का आरोपण एमआरआई के उच्च स्थानिक संकल्प आंकड़ों के अलावा उच्च अस्थायी समाधान डेटा के अधिग्रहण के लिए अनुमति दे सकता है। ofMRI साथ electrophysiological रिकॉर्डिंग मस्तिष्क के कार्यात्मक कनेक्टिविटी पर विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकता है। सारांश में, ofMRI की शक्ति आनुवंशिक या शारीरिक पहचान द्वारा परिभाषित विशेष सेल आबादी की उत्तेजना के जवाब में पूरे मस्तिष्क की निगरानी के लिए ofMRI मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन में और स्वस्थ मस्तिष्क के connectomics का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 Tesla scanner Agilent Technologies Discovery MR901 System
Sprague Dawley rats Charles River Crl:SD 11 weeks old
fiber cleaver Fujikura CT-05
multimode optical fiber Thor Labs AFS105/125Y
fiber stripper   Thor Labs T08S13
ceramic split sleeve Precision Fiber Products SM-CS1140S
epoxy glue Thor Labs G14250
cotton-tipped applicators Stoelting Co. 50975
multimode ceramic zirconia ferrules Precision Fiber Products MM-FER2002
FC/PC multimode connector Thor Labs 30128C3
fiber optic polishing disk Precision Fiber Products M1-80754
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm Thor Labs LFG03P
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm Thor Labs LFG1P
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm Thor Labs LFG3P
binocular biological microscope 40X-1,000X Amscope B100
laser safety glasses Kentek KXL-62W01
473 nm DPSS laser Laserglow LRS-0473
594 nm DPSS laser Laserglow LRS-0594
Allen hex wrench set 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser
power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm Thor Labs PM121D
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033
isoflurane vaporizer with induction chamber VetEquip 901806
NanoFil 100 µl syringe World Precision Instruments NANOFIL-100
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-1
function generator A.M.P.I.  Master-8
small animal stereotax David Kopf Instruments Model 940 
Model 683 small animal ventilator  Harvard Apparatus 550000
Type 340 capnograph  Harvard Apparatus 733809
dental drill (rotary micromotor kit) Foredom Electric Co. K.1070
ophthalmic ointment (Artificial Tears) Rugby 00536-6550-91
instrument sterilizer CellPoint Scientific Germinator 500 glass bead sterilizer
antibiotic powder Pfizer NEO-PREDEF neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride
buprenorphine painkiller Hospira NDC:0409-2012 schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. H., et al. Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring. Nature. 465 (7299), 788-792 (2010).
  2. Weitz, A. J., Lee, J. H. Progress with optogenetic functional MRI and its translational implications. Future Neurol. 8 (6), 691-700 (2013).
  3. Lee, J. H. Informing brain connectivity with optogenetic functional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 62 (4), 2244-2249 (2012).
  4. Lee, J. H. Tracing Activity Across the Whole Brain Neural Network with Optogenetic Functional Magnetic Resonance Imaging. Front. Neuroinform. 5 (October), 1-7 (2011).
  5. Kahn, I., et al. Characterization of the Functional MRI Response Temporal Linearity via Optical Control of Neocortical Pyramidal Neurons. J. Neurosci. 31 (42), 15086-15091 (2011).
  6. Takata, N., et al. Optogenetic Activation of CA1 Pyramidal Neurons at the Dorsal and Ventral Hippocampus Evokes Distinct Brain-Wide Responses Revealed by Mouse fMRI. PLoS ONE. 10 (3), e0121417 (2015).
  7. Iordanova, B., Vazquez, A. L., Poplawsky, A. J., Fukuda, M., Kim, S. -G. Neural and hemodynamic responses to optogenetic and sensory stimulation in the rat somatosensory cortex. J. Cereb. Blood Flow Metab. 35 (6), 922-932 (2015).
  8. Weitz, A. J., et al. Optogenetic fMRI reveals distinct, frequency-dependent networks recruited by dorsal and intermediate hippocampus stimulations. NeuroImage. 107, 229-241 (2015).
  9. Desai, M., et al. Mapping brain networks in awake mice using combined optical neural control and fMRI. J. Neurophysiol. 105 (December 2010), 1393-1405 (2011).
  10. Liang, Z., Watson, G. D. R., Alloway, K. D., Lee, G., Neuberger, T., Zhang, N. Mapping the functional network of medial prefrontal cortex by combining optogenetics and fMRI in awake rats. NeuroImage. 117 (0), 114-123 (2015).
  11. Byers, B., et al. Direct in vivo assessment of human stem cell graft-host neural circuits. NeuroImage. 114 (0), 328-337 (2015).
  12. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  13. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat. Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
  14. Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3 (10), 785-792 (2006).
  15. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  16. Ogawa, S., Lee, T. M., Kay, A. R., Tank, D. W. Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24), 9868-9872 (1990).
  17. Ogawa, S., et al. Intrinsic signal changes accompanying sensory stimulation: functional brain mapping with magnetic resonance imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5951-5955 (1992).
  18. Kwong, K. K., Belliveau, J. W., et al. Dynamic magnetic resonance imaging of human brain activity during primary sensory stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5675-5679 (1992).
  19. Canals, S., Beyerlein, M., Murayama, Y., Logothetis, N. K. Electric stimulation fMRI of the perforant pathway to the rat hippocampus. Magn. Reson. Imaging. 26, 978-986 (2008).
  20. Antal, A., et al. Imaging artifacts induced by electrical stimulation during conventional fMRI of the brain. NeuroImage. 85 (3), (2014).
  21. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nat. Neurosci. 16 (10), 1499-1508 (2013).
  22. Christie, I. N., et al. FMRI response to blue light delivery in the naïve brain: Implications for combined optogenetic fMRI studies. NeuroImage. 66, 634-641 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J. Neural Eng. 4, S143-S156 (2007).
  24. Pashaie, R., et al. Optogenetic brain interfaces. IEEE Rev. Biomed. Eng. 7, 3-30 (2014).
  25. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
  26. Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19, 267-274 (2006).
  27. Fang, Z., Lee, J. H. High-throughput optogenetic functional magnetic resonance imaging with parallel computations. J. Neurosci. Meth. 218 (2), 184-195 (2013).
  28. Da Silva, F. L. EEG: Origin and measurement. EEG - fMRI: Physiological Basis, Technique, and Applications. , 19-38 (2010).
  29. Becker, K., et al. Low dose isoflurane exerts opposing effects on neuronal network excitability in neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 7 (6), 3-9 (2012).
  30. Nishikawa, K., Maciver, M. B. Agent-selective Effects of Volatile Anesthetics on GABA A Receptor - mediated Synaptic Inhibition in Hippocampal Interneurons. Anesthesiology. 94 (2), 340-347 (2001).
  31. Jackson, J. I., Meyer, C. H., Nishimura, D. G., Macovski, A. Selection of a convolution function for Fourier inversion using gridding. IEEE Trans. Med. Imag. 10 (3), 473-478 (1991).
  32. Glover, G. H., Lee, A. T. Motion artifacts in fMRI: comparison of 2DFT with PR and spiral scan methods. Magn. Reson. Med. 33 (20), 624-635 (1995).
  33. Kim, D. H., Adalsteinsson, E., Spielman, D. M. Simple analytic variable density spiral design. Magn. Reson. Med. 50, 214-219 (2003).
  34. Friston, K. J., Harrison, L., Penny, W. Dynamic causal modeling. Neuroimage. 19, 1273-1302 (2003).
  35. Alkire, M. T., McReynolds, J. R., Hahn, E. L., Trivedi, A. N. Thalamic microinjection of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat. Anesthesiology. 107 (2), 264-272 (2007).
  36. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol. Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  37. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS ONE. 8 (9), 1-16 (2013).
  38. Liu, J., et al. Frequency-selective control of cortical and subcortical networks by central thalamus. eLife. 4, e09215 (2015).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 110 optogenetics कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (fMRI) optogenetic fMRI (ofMRI) तंत्रिका विज्ञान मस्तिष्क गहरी मस्तिष्क उत्तेजना (डीबीएस)
Optogenetic कार्यात्मक एमआरआई
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, P., Fang, Z., Liu, J., Lee, J.… More

Lin, P., Fang, Z., Liu, J., Lee, J. H. Optogenetic Functional MRI. J. Vis. Exp. (110), e53346, doi:10.3791/53346 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter