Introduction
Optogenetic ressonância magnética (ofMRI) é um nova técnica que combina a resolução espacial de alta-campo IRMf com a precisão de estimulação optogenetic 1-11,38, permitindo mapeamento de tipo específico de células de circuitos neuronais funcionais e suas dinâmica em todo o território cérebro. Optogenetics permite a tipos específicos de células a ser orientada para a estimulação pela introdução de canais de condutância trans-membrana, chamada opsinas sensíveis à luz. Elementos específicos de circuitos neurais são geneticamente modificadas para expressar esses canais, permitindo a modulação milissegundo-calendário de atividade no cérebro intacto 1-15. fMRI fornece um método não-invasivo de determinação da resposta dinâmica mundial do cérebro à estimulação optogenética dos circuitos neurais específicos através da medição do sinal de sangue oxigênio-dependente de nível (BOLD) 16-18, que fornece uma medida indireta da atividade neuronal.
A combinação destas duas técnicas, denominado optogenetic ressonância magnética (ofMRI), é vantajosa em relação a outros métodos de gravação durante a actividade cerebral, tais como a estimulação electrofisiologia, pois pode proporcionar uma vista de todo o cérebro em relativamente elevada resolução espacial. Isto permite a detecção da actividade neuronal em resposta a estimulação dirigida a grandes distâncias do local da estimulação, sem a necessidade para implantação de eléctrodos de registo invasivos 1-11. ofMRI é vantajoso sobre o método mais tradicional de realizar a estimulação elétrica durante fMRI, que pode recrutar diferentes tipos de células perto do eléctrodo e, portanto, confundir a influência causal de cada população 19. Além disso, os eléctrodos utilizados para a estimulação eléctrica e da corrente gerada podem produzir artefactos durante a RM 20. Com efeito, ofMRI permite a observação da influência sobre a actividade cerebral global a partir do modulati específicana de uma ampla variedade de tipos de células, através da utilização de técnicas avançadas de segmentação genética, tais como o sistema Cre-Lox em animais transgénicos ou a utilização de promotores. controlo óptico combinatória com monitorização de todo o cérebro é possível com ofMRI através da utilização de ambos NpHR para inibir e ChR2 para excitar tipos de células específicos. O kit de ferramentas optogenetic disponíveis para uso em ofMRI também está melhorando rapidamente ao longo do tempo com a introdução de opsins com o aumento da sensibilidade à luz ou cinética melhoradas, de opsins função etapa estabilizadas (SSFOs) ou de opsins vermelho-deslocado que pode anular a exigência de fibra implantado ópticas, permitindo a estimulação não-invasiva durante o exame 21. Estas possibilidades não estão disponíveis com estimulação elétrica.
No entanto, os artefactos sinal resultante de um aquecimento do tecido devido a um fornecimento de luz no cérebro têm sido relatados 22, onde foi mostrado modificação induzida pela temperatura de tempos de relaxação para produzir pseufazer a ativação. Pesquisadores do espectáculo ofMRI deve, portanto, estar ciente desta confundem potencial. Com a configuração e controlo adequado, a questão pode ser abordada. Além disso, relativamente baixa resolução temporal de medir a resposta hemodinâmica em fMRI pode ser um fator limitante para certas aplicações desta técnica.
Este protocolo descreve em primeiro lugar a construção dos implantes de fibra óptica que permitem uma entrega de comprimentos de onda específicos da luz profundamente no cérebro in vivo. O protocolo em seguida, descreve a entrega do vector viral que codifica para uma região opsina precisa cérebro utilizando cirurgia estereotáxica. Em seguida, o protocolo descreve o processo de ressonância magnética funcional do cérebro inteiro durante a estimulação de luz simultânea. Finalmente, o protocolo descreve a análise dos dados adquiridos dados de base.
De nota, a optogenética descrito aqui requerem um implante crônica para a entrega de luz. No entanto, os implantes de fibra óptica são estáveis e bio-compatível, permitindo varrimento longitudinal e investigação de circuito neural ao longo de um período de meses 23,24.
Em resumo, a estimulação precisa e capacidade de monitorização de todo o cérebro de ofMRI são factores cruciais para tornar ofMRI uma ferramenta poderosa para o estudo dos conectonomia do cérebro. Além disso, pode proporcionar um novo discernimento sobre os mecanismos das doenças neurológicas 25 quando acoplado com diferentes modelos animais. Com efeito, ofMRI foi usado para elucidar a actividade de sub-regiões do hipocampo de rede distintas associadas a convulsões 8. Portanto, laboratórios interessados em responder a perguntas de neurociência de nível de sistemas vai encontrar esta técnica de importância.
Protocol
Declaração de Ética: Os procedimentos experimentais aqui foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade de Stanford (IACUC).
1. Preparar Cabos e ponteira Implants
Nota: Embora cabos de correção e implantes virola estão disponíveis comercialmente, produzindo estes in-house permite que projetos de especialidade e vai custar menos.
- Para preparar um cabo de fibra para a entrega de luz proveniente do laser ao implante no cérebro, primeiro clivar a fibra óptica ao comprimento desejado.
- Usando um cutelo de fibra, terminar a fibra óptica para produzir uma extremidade plana no ponto de ligação. Se a fibra tenha sido revestido com um revestimento, o revestimento tira fora com uma ferramenta de remoção de fibras de antemão.
- Clivar a outra extremidade da fibra óptica para produzir o tamanho desejado para o cabo, assegurando que o cabo é longo o suficiente para estender-se desde a fonte de luz para o animal dentro do furo deo scanner.
- Misturar uma pequena quantidade de cola epóxi numa proporção de 1: 1 sobre um pedaço de folha de alumínio, pouco antes do passo seguinte, tal como a cola epoxi se torna demasiado viscosa para utilização 5 minutos após a mistura.
- Utilizando uma pequena vara de madeira, aplicar suavemente cola epoxi para a parte da fibra que vai ser colocada no interior do lado côncavo do casquilho cerâmico e, em seguida, aplicar uma pequena gota sobre a superfície do lado plano da virola. Após a inseri-lo no interior da ponteira, assegurar que um pequeno comprimento de fibra (<0,5 mm) sobressai a partir do lado plano da virola cerâmica. Permitir que a cola epóxi para endurecer O / N para melhores resultados.
- No lado do cabo de fibra óptica que vai ligar à fonte de luz laser, aplicar suavemente cola epoxi para a parte da fibra que vai ser colocada no interior do lado côncavo da ponteira do conector de FC / PC e, em seguida, aplicar uma pequena cair sobre a superfície do lado plano da virola. Depois de o introduzir na ponteira, garantirque um pequeno comprimento de fibra (<0,5 mm) sobressai a partir do lado plano da virola. Permitir que a cola epóxi para endurecer O / N para melhores resultados.
- Polir a extremidade plana das virolas para ambos os lados do cabo usando um disco de polimento, utilizando uma pinça para aplicar pressão descendente suave na virola ao fazer rotações Figura-8 em folhas de lapidação óxido de alumínio (a partir de 3 micrómetros a 1 uM a 0,3 uM grit ).
- Examinar a extremidade plana da virola com um microscópio uma ampliação de 100X. Certifique-se de que a superfície da extremidade plana, incluindo a própria superfície de fibra óptica, é livre de qualquer cola epoxi; continuar polimento se cola epóxi permanece sobre a superfície. Certifique-se de que a superfície de fibra óptica não tenha quebrado ou lascado.
CUIDADO: Certifique-se de pessoal ter aulas de treinamento de segurança do laser adequados e usar óculos de segurança a laser antes de manusear equipamentos laser. - Conecte o cabo de fibra óptica para a fonte de luz laser através do conector FC / PC e alinhe a fponta Iber ao ponto focal do acoplador. Medir a potência de transmissão de luz da fibra com um medidor de energia para garantir a produção de luz adequada.
Nota: Os passos seguintes são para a preparação de anéis de cerâmica com fibra ótica para implantação crônica no cérebro; virolas cerâmicas são ocos no centro e levar a fibra óptica para fornecer a luz de um cabo de rede para uma região de interesse (ROI) dentro do cérebro. - Usando um cutelo de fibra, terminar a fibra óptica para produzir uma extremidade plana no ponto de ligação. Se a fibra tenha sido revestido com um revestimento, o revestimento tira fora com uma ferramenta de remoção de fibras de antemão.
- Clivar a outra extremidade da fibra óptica para produzir o desejado comprimento para implantação no cérebro. Determinar o comprimento da fibra utilizando um atlas estereotáxicas para alvejar a ROI dentro do cérebro.
- Por exemplo: para segmentar hipocampo dorsal de rato em que é de 3,5 mm abaixo da bregma, garantir que o comprimento da fibra protuberante a partir do ferrule é de 3,5 mm + 0,25 mm, correspondendo a espessura do crânio e permitindo a margem de erro. Portanto, verifique se o comprimento final da fibra é de 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (comprimento da ponteira) = 14,25 mm.
- Misturar uma pequena quantidade de cola epóxi numa proporção de 1: 1 sobre um pedaço de folha de alumínio, pouco antes do próximo passo (a cola epoxi se torna demasiado viscosa para utilização 5 minutos após a mistura).
- Utilizando uma pequena vara de madeira, aplicar suavemente cola epoxi para a parte da fibra que vai ser colocada no interior do lado côncavo do casquilho cerâmico e, em seguida, aplicar uma pequena gota sobre a superfície do lado plano da virola. Após a inseri-lo no interior da ponteira, assegurar que um pequeno comprimento de fibra (<0,5 mm) sobressai a partir do lado plano da virola cerâmica. Permitir que a cola epóxi para endurecer O / N para melhores resultados.
- Polir a extremidade plana da virola usando um disco de polir, usando uma pinça para aplicar pressão descendente suave na ponteira ao fazer figura-8 rotaçãos em folhas de lapidação óxido de alumínio (a partir de 3 micrómetros a 1 uM a 0,3 uM grit).
- Examinar a extremidade plana da virola com um microscópio uma ampliação de 100X. Certifique-se de que a superfície da extremidade plana, incluindo a própria superfície de fibra óptica, é livre de qualquer cola epoxi; continuar polimento se cola epóxi permanece sobre a superfície. Certifique-se de que a superfície de fibra óptica não tenha quebrado ou lascado.
- Casal da ponteira polido para um cabo de fibra óptica com uma manga de ferrolho e conectar o cabo de rede a uma fonte de luz laser. Medir a potência de transmissão de luz na extremidade da fibra com um medidor de energia para garantir a eficiência adequada.
- Manter um registo da potência necessária da virola do cabo de remendo para cada implante ponteira de saída para o nível de potência pretendido na ponta da fibra óptica (2,5 mW neste protocolo). Descarte ponteiras com uma taxa de atenuação de mais de 50% e com padrão de produção não circular.
2. estereotáxica ImpCirurgia lantation e injeção de vírus
- Assegurar que quaisquer procedimentos experimentais envolvendo o uso de animais são aprovados pelo IACUC local. Manter condições assépticas durante cirurgias de sobrevivência, seguindo procedimentos assépticos, incluindo o uso de luvas estéreis, máscaras estéreis, campos cirúrgicos estéreis e instrumentos cirúrgicos esterilizados.
CUIDADO: Certifique-se de que os cirurgiões estão usando equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo óculos de segurança antes de iniciar o procedimento. Siga os procedimentos de biossegurança padrão quando se trabalha com vetor adeno-associado (AAV), tomando cuidado para evitar respingos. Descarte de resíduos AAV em um recipiente de risco biológico. - Carregar uma seringa de microlitro com AAV suficiente para a injecção no animal mais extra para compensar perdas de volume potencial (total de 4 mL por animal), mantendo a seringa em gelo antes da utilização. Neste protocolo, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP a um título de 4x10 12 vg / ml é utilizada. Colocar o animal sob isofluranoe anestesia com uma câmara de indução, ligado a uma precisão isoflurano conjunto vaporizador a 3 - 4% com uma fonte de gás oxigênio.
- Raspar a cabeça com um barbeador elétrico e executar um matagal cirúrgica triplo na pele usando betadine e uma lavagem de etanol a 70%.
- Uma vez que o animal está em anestesia profunda (confira reflex dedo do pé e taxa de respiração), imobilizar o crânio do animal em um aparelho estereotáxico com tachas de posicionamento intra-aural e bar dente.
Nota: Todo o processo vai demorar 1-2 horas, desde a indução da anestesia para a recuperação. - Defina a anestesia para um nível adequado (1-3% de isoflurano no vaporizador) e continuamente monitorar os sinais vitais do animal, ajustando a anestesia como necessário para manter a taxa de respiração de ~ 40 respirações / min. Administrar pomada oftálmica sobre os olhos do animal para evitar a secura e sob anestesia.
- Faça a 15 - 20 mm incisão na linha média do couro cabeludo com um bisturi e retrair o couro cabeludo usando hemostats cirúrgicos umttached ao periósteo. lambda Referência e bregma para posicionar a broca sobre as coordenadas para o ROI.
- Perfurar uma pequena craniotomia (2-3 mm) sobre o ROI com uma broca dental, tomando cuidado para não perfurar o cérebro. Lentamente, inserir a agulha ligada à seringa microlitro através da craniotomia para o ROI no cérebro.
- Com uma bomba de micro-controlador, injectar 2 ul da solução de vetor para a ROI. Usar uma taxa de fluxo de 150 nl / min para evitar danos nos tecidos. Após a injecção está completa, esperar 10 minutos antes de remover a seringa, lentamente, a uma velocidade de 0,5 mm / min.
- Após a injecção, secar a superfície do crânio. lambda Referência e bregma para confirmar coordenadas e, em seguida, inserir o implante virola para a profundidade de destino (por exemplo: 3,5 mm abaixo da bregma para hipocampo dorsal) a uma taxa de cerca de 0,5 mm / min. Monte o implante ponteira ao crânio com cimento dental. Depois que o cimento dental tem solidificado, selar a incisão com suturas (size 5-0 para ratos) em volta da tampa de cimento dental.
- Após a cirurgia, colocar o animal na sua gaiola alojados individualmente com metade da gaiola em cima de um aquecedor para a recuperação da anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não coloque o animal na companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.
- Para a gestão pós-cirúrgica da dor, administrar buprenorfina por via subcutânea a cada 12 horas a uma dosagem de 0,05 mg / kg durante 24 h. Administrar pó antibiótico diário ao longo do local da incisão durante 3 dias.
- Retirar as suturas de aproximadamente duas semanas após a cirurgia, para evitar formação de crostas.
- Espera 4 - 6 semanas após a injecção de vírus para a expressão de genes suficiente optogenetic antes de realizar as experiências.
3. RM Funcional optogenética
CUIDADO: Tenha cuidado ao redor do campo magnético permanente de um scanner de ressonância magnética. seguro equipmotorrinolaringológico, incluindo o gerador de funções, fonte de luz, ventilador, tanques capnógrafo e gás, suficientemente longe (pelo menos para além do limite de 5 Gauss).
- Colocar o animal sob anestesia de gás com uma câmara de indução, ligado a uma precisão isoflurano conjunto vaporizador em 5% com uma fonte de gás oxigênio.
- Uma vez que o animal está em anestesia profunda (reflexo de verificação do dedo do pé e freqüência respiratória), entubar o animal de acordo com o protocolo detalhado no Rivard et al. (2006) para permitir o monitoramento de dióxido de carbono por capnografia 26. Nota: intubação é fundamental na manutenção de níveis adequados de CO 2 expiratório durante o exame.
- Garantir o animal no berço scanner.
Nota: Neste protocolo, o berço foi personalizado produzido, mas tais berços também estão disponíveis comercialmente. As funções berço rato para proteger o animal dentro do scanner para entrega da anestesia, ar aquecido e para a restrição de movimento. - Entregar uma mistura de isoflurano (Ranging 1,2-1,5%) em óxido nitroso a 60% e aproximadamente 40% de oxigénio através de uma tubagem através do berço. Certifique-se de que a cabeça do animal é firmemente fixado para evitar artefatos de movimento.
- Fornecer ar aquecido através de tubos no berço e inserir um termômetro retal com lubrificante para monitorar a temperatura do corpo. Administrar pomada oftálmica sobre os olhos do animal para evitar a secura e sob anestesia.
- Conecte o cabo de fibra óptica a uma fonte de luz laser e medir a saída na ponta da ponteira do cabo de rede com um medidor de energia.
- Ajuste até ao nível de energia apropriado (determinado anteriormente no passo 1.15) para produzir o resultado desejado (2,5 mW neste protocolo) na ponta da fibra óptica implantado no interior do cérebro. Uma vez que a saída de energia excessivo a partir da fibra óptica pode potencialmente causar danos nos tecidos no interior do cérebro ou provocar o aquecimento de tecidos que irá produzir artefactos de sinal, não aumentam significativamente a potência de saída do laseralém do resultado pretendido.
- Prevenir a fuga de luz a partir do implante com um cone de fita isolante preta e cobrir os olhos do animal. Acoplar o cabo de fibra óptica para o implante virola sobre o animal com uma manga de ferrolho.
- Coloque a bobina na cabeça do animal. Insira o suporte com animais para dentro do furo do scanner.
Nota: Neste protocolo, o de circuito único transmissor-receptor de bobina personalizado foi produzido e pré-ajustado para receber a frequência de rádio ideal do tecido cerebral. - Monitor de freqüência e temperatura corporal respiração durante todo este processo, ajustando o ventilador artificial e aquecedor como necessário para manter valores fisiológicos dentro dos limites (garantir que CO expiratória 2 é 3 - 4%, girando os botões no ventilador para ajustar a frequência do curso e do volume e que a temperatura é de 37 ° C, clicando nas setas para ajuste de temperatura).
- Seleccione uma sequência de posicionamento para a imagem da localização cabeça animal. Se a bchuva não está em iso-centro, ajustar a cabeça de localização de animais e repetir a verificação de posicionamento até que o cérebro está em iso-centro. Seleccione uma sequência shimming linear e clique de carga na janela de seleção sequência. Em seguida, clique em começar a reduzir heterogeneidades do campo magnético.
Nota: calço é um passo crítico que irá influenciar diretamente a integridade dos dados de fMRI. - Seleccione uma sequência ponderada em T2 e clique de carga na janela de seleção sequência. Em seguida, clique em Iniciar para adquirir imagens de alta resolução anatômicas coronais ponderadas em T2 antes da fMRI para verificar a integridade global do cérebro e para confirmar a localização do implante de fibra óptica.
Nota: Estas imagens podem ser usadas como sobreposições de anatomia para a série de digitalização ofMRI. - Ligar cabos BNC a partir da porta de disparo do scanner de IRM para o gerador de função de modo a que a fonte de luz laser é conduzido de acordo com um paradigma experimental estimulação.
Nota: Neste protocolo, a estimulação pAradigm é 30 segundos da linha de base seguido por 20 seg on / 40 seg off para seis min. - Selecione um multi-slice gradiente lembrou sequência de eco (GRE) e clique de carga na janela de seleção sequência. Em seguida, clique em Iniciar para adquirir 35 mm x 35 mm (2D FOV) no plano coronal com 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm Resolução espacial.
Nota: A sequência GRE usada aqui tem um tempo de repetição (TR) e tempo de eco (TE) da TR / TE = 750/12 ms e um ângulo de 30 ° aleta. - Na conclusão da digitalização, remover o animal do scanner e monitor até que tenha despertado da anestesia e pode manter decúbito esternal.
4. Análise de Dados ofMRI
Nota: Os passos seguintes são realizados em MATLAB, conforme descrito em uma publicação on-alto rendimento ofMRI 27.
- Depois que os dados de varredura em bruto foi transferido para o computador utilizado para análise, utilizar o deslizar reconstrução janela para atualizar a imagem a cada TR, comuma leitura espiral de quatro intercalam, 750 TR ms e 12 ms tempo de eco para adquirir 23 fatias por série de digitalização. Em vez de reconstrução convencional, onde novas imagens de fMRI são reconstruídos apenas após todos os intercala são adquiridos para cada fatia, o método de reconstrução janela deslizante reconstrói imagens após a aquisição de cada interleaf 27.
- Processar os dados brutos para a reconstrução bidimensional gridding, correção de movimento, eo cálculo das séries temporais, como descrito anteriormente 27.
- Usar um método para determinar a coerência limiar voxels activados através do cálculo da modulação por cento do sinal NEGRITO de cada voxel em relação ao período da linha de base recolhido antes da estimulação, tal como descrito anteriormente 27. Calcular valores de coerência como a magnitude da transformada de Fourier com a frequência dos ciclos de estimulação repetida dividido pela soma dos quadrados de-de todos os componentes de frequência 8.
- Usando os dados de séries temporais para cada vOxel, imagens médias corrigidas-motion que pertencem a varreduras consecutivas do mesmo paradigma de estimulação primeiros. Em seguida, alinhar as imagens médias 4D para um quadro de coordenadas comum com uma transformação de seis graus de liberdade do corpo rígido, mais isotrópico dimensionamento para comparação dentro e entre os animais, como descrito anteriormente 27.
Representative Results
A Figura 1 e a Figura 2 mostram os dados representativos resultantes de 20 Hz (15 mseg de largura de impulso, 473 nm, 30% de ciclo de trabalho) optogenetic estimulação do córtex motor. Um paradigma de estimulação de 30 segundos de linha de base seguido por 20 seg on / 40 seg off para foi usada seis min. Estudos anteriores mostraram que este paradigma produz sinal NEGRITO robusta a partir de 1,8 optogenetic estimulação. A Figura 1 mostra os voxels activados detectados tanto no próprio local da estimulação (córtex motor) e no tálamo, como um resultado das conexões sinápticas de longo alcance entre essas regiões. a Figura 2 mostra que a informação temporal pode ser adquirida a partir de HRFs, como a resposta do tálamo é retardada (declive inicial inferior) comparada com a resposta após estimulação do córtex motor optogenetic.
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Figura 1. Mapa A ativação do sinal BOLD induzida por optogenética Estimulação da CaMKIIa-expressando células em Motor Cortex. Valores coerência dos voxels ativos, identificados como aqueles significativamente sincronizados a estímulos repetidos, são mostradas sobrepostas em uma fatia anatômico coronal ponderada em T2. Os dados recolhidos ao longo de um período de seis min, 30 seg período (inicial da linha de base de 30 segundos e seis de estimulação ciclos de 20 seg on / 40 seg off com 473 nm de luz, 20 Hz, 15 ms de largura de pulso) são condensados em um mapa de ativação. Fatias sequenciais são 0,5 mm de distância ea localização do implante de fibra óptica é indicada pelo triângulo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Movimento do assunto durante a imagem é uma fonte significativa de artefato que pode levar à corrupção de dados. Apropriadamente garantir o animal no suporte de imagem pode minimizar tais artefactos como irá manter níveis adequados de anestesia. Aqui, utilizou-se isoflurano mas anestésicos alternativos, tais como medetomidina ou cetamina e xilazina, deve também ser considerado. No entanto, os níveis e escolha do anestésico pode influenciar muitos parâmetros no cérebro, incluindo a resposta BOLD 28. Isoflurano pode causar alterações na excitabilidade neuronal 29. Outros anestésicos também pode afetar GABA inibição sináptica 30. Assim, a escolha da anestesia é importante quando se realiza ofMRI dada a sua capacidade de afetar a atividade neuronal. ofMRI na ausência de anestesia é possível, mas pode ser um desafio com o aumento do movimento do animal, o que pode ser reduzido se o animal está habituado; tais estudos ofMRI acordado previamente realizada umand evitaria o efeito de confusão da anestesia no cérebro 9,10. De pós-processamento de algoritmos de correcção de movimento pode ser usado para atenuar grandemente os efeitos de movimento. Vários desses métodos existem, incluindo o inverso algoritmo de Gauss-Newton empregada neste protocolo, o que minimiza a soma dos quadrados função custo da imagem de referência e imagem sob a correção. O algoritmo é útil porque permite a correção de movimento rápido e robusto, usando um design da plataforma paralela GPU para reduzir os tempos de processamento 27.
Para a reconstrução dos dados neste protocolo, software personalizado escrito em um ambiente MATLAB foi utilizado para reconstrução gridding bidimensional, onde as amostras em espiral são reconstruídos em k-espaço em imagens em grade 31-33. dados de séries de tempo foram gerados através do cálculo da modulação por cento do sinal NEGRITO de cada voxel em relação ao período da linha de base recolhido antes da estimulação. Voxels cuja séries temporais foram synchronized aos blocos de estimulação optogenética com um valor de coerência de 0,35 ou superior foram definidos como voxels activados; este valor coerência corresponde a um menor que 10 -9 valor P 8. Valores de coerência foram calculados como a magnitude da transformada de Fourier com a frequência dos ciclos de estimulação repetida dividido pela soma dos quadrados de-de todos os componentes de frequcia de 8,27. erro Familywise pode ser controlada usando a correção de Bonferroni para comparações múltiplas. métodos alternativos de análise pode ser utilizado, incluindo testes estatísticos paramétricos, tais como os modelos lineares gerais (MLG). O método requer o conhecimento de coerência menos antes da HRF em comparação com o modelo linear geral convencional. Portanto, é vantajoso quando está a explorar os dados usando ofMRI. No entanto, o método de coerência só pode ser usado para dados com desenhos ou bloco seleccionado modelos de eventos relacionados com um intervalo fixo interstimulus e não pode ser utilizado nos dados ofMRI com outro evento-RELAted desenhos ou modelos mistos. Subsequentemente, modelagem causal dinâmica (DCM) pode ser utilizada para analisar interacções entre regiões cerebrais identificados através ofMRI. DCM é uma técnica estatística Bayesian desenvolvido para análise da conectividade funcional de respostas do sistema para entradas experimentais durante fMRI 34.
preocupações técnicas adicionais para ofMRI são discutidos aqui. Os implantes podem ser danificados ou cair, levando à remoção do animal afectado do estudo. cirurgias de re-implantação não são recomendados devido à incerteza adicional de segmentação o mesmo ROI como na cirurgia de implante original e devido a questões de bem-estar animal. Por causa da quantidade significativa de tempo e recursos investir em cada sujeito animal, a apreciação da resistência do material é uma preocupação significativa na escolha de um cimento dentário adequado para utilização em estudos ofMRI. A cirurgia de implantação é um fator crítico para maximizar a longevidade do IMPLANt e sujeito animal. Por exemplo, assegurando que o crânio é seca antes de se aplicar o cimento dental e colocando uma quantidade adequada de cimento em torno do implante virola cerâmica pode garantir a estabilidade ao longo da linha do tempo potencial do animal meses de duração, durante o estudo. Além disso, modelos alternativos de gaiola pode ser explorado e discutido com a facilidade de cuidado animal local para evitar gaiolas com tops de arame, segurando a comida e água, que muitas vezes se projetam para dentro da jaula e oferecer oportunidades para que o animal danificar o implante. Importantemente, o cimento dental deve ser escolhido cuidadosamente para reduzir os artefactos que afectam imagiologia e cimentos alternativos pode ser testada por aplicação sobre um fantasma e imagens em um scanner antes do uso em experimentos com animais. Tentativa e erro com vários cimentos dentários mostrou que o cimento utilizado neste protocolo dá relativamente poucos artefactos. Outro desafio técnico na realização ofMRI é a precisão da colocação de fibra óptica no ROI pretendido, dada a extremely pequenas distâncias que podem existir entre os núcleos no cérebro 35. Depois de concluir as cirurgias de implantação, scans anatômicas ponderadas em T2 pode ser usada para determinar a colocação correta sobrepondo em um atlas do cérebro. A habilidade do cirurgião e da prática realizar estas cirurgias pode melhorar as taxas de colocação corretos. A especificidade e expressão da opsina na ROI pretendido pode ser verificado na conclusão do estudo de perfusão do animal e que fixa o cérebro, usando imuno-histoquímica ou a fluorescência endógena de um repórter em proteínas marcado para a opsina para visualização. Estas proteínas repórter pode ser também co-localizada com outras proteínas para assegurar que o opsina é expresso nos tipos de células neurais 1,8,15,25 desejados. Como mencionado anteriormente, os artefactos podem surgir quando se realiza ofMRI devido ao aquecimento do tecido a partir da entrega de luz 22. O aquecimento dos tecidos provoca a modificação de tempos de relaxação, resultando em sinal BOLD falsa. Para assegurar que a corrente alternadavação resultante da estimulação luz durante ofMRI não é devido a este artefacto, controlos opsina-negativa deve ser realizada em solução salina que injectada animais ou animais injectados com vectores de controlo fluoróforo (tal como o AAV-CaMKIIa-EYFP) sofrem ofMRI. Além disso, apenas fibras bem construídos implantes com uma boa eficiência óptica de transmissão de luz deve ser usado para remover a necessidade de utilização de altas potências de laser. estudos ofMRI foram realizados em que a falsa activação devido ao aquecimento dos tecidos não foi um problema 1,6-8,10,11.
No que respeita à escolha do vector para introduzir os genes necessários optogenetic em neurónios para a expressão, os AAV não são conhecidos por provocar doenças nos seres humanos e são, por conseguinte, uma opção conveniente, tendo em conta o nível de segurança biológica inferior necessário para usar estes agentes (BSL-1). Além disso, um grande número de núcleos vetor realizar AAV embalados com vários genes optogenética em estoque e com vários sorotipos. O serotipo de AAV deve ser escolhido based no alvo população de células destinadas a assegurar os níveis de expressão óptimos 36,37. Os lentivírus podem também ser usados, mas requerem um maior nível de segurança biológica. O período de tempo necessário para a expressão dos genes suficientes optogenetic é variável, dependendo do modelo animal específico utilizado, no AAV particular utilizada e no paradigma experimental específica. Neste protocolo, ratos Sprague Dawley às 11 semanas de idade são usados e estudos optogenetic começar quatro a seis semanas após a injecção do vírus. Os ratinhos transgénicos podem também ser utilizados em estudos optogenetic. É necessária a realização de experiências-piloto para determinar a quantidade específica de tempo necessário para a expressão suficiente dos opsins. paradigmas estimulação pode variar dependendo da opsina específico utilizado. Neste protocolo, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP é usado eo paradigma de estimulação é 20 seg on / off 40 seg. Se usando um SSFO, o paradigma da estimulação irá variar porque o SSFO requer apenas um breve pulso de luz seja ACvado e depois de um breve pulso de luz em outro comprimento de onda a ser finalizado.
Uma preocupação crítica adicional ao executar ofMRI está a impedir o vazamento de luz a partir da interface implante ponteira com o cabo de fibra óptica durante a estimulação optogenética para evitar um sinal cerebral de confusão proveniente de estimulação visual, mesmo quando o animal é anestesiado. Cones de fita isolante preta pode ser utilizada para bloquear a luz a partir das virolas e para cobrir os olhos do animal. Importante, valores fisiológicos, incluindo expiratório CO 2 e temperatura corporal do sujeito deve ser adequadamente mantida durante toda a duração da imagiologia. CO Expiratório 2 deve ser mantido entre 3-4% e a temperatura do corpo a 37 ° C. Além disso, as sequências shimming a reduzir tanto quanto possível falta de homogeneidade do campo magnético antes de se iniciar ofMRI verifica determina em grande parte a qualidade dos dados em negrito resultantes. O controlo destes factoresé crítico na produção de dados ofMRI fiáveis. Neste protocolo, DPSS lasers são usados como fonte de luz para a estimulação optogenética. Porque a luz laser é coerente, mais energia suficiente pode ser facilmente fornecido através da fibra óptica. fontes de luz LED acoplado a fibra óptica estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais, mas têm a desvantagem de poder diminuído de transmissão de luz. A fonte de luz laser exige alinhamento para cada cabo especial de correção de fibra óptica, mas com a prática, o alinhamento pode ser realizado dentro de segundos a minutos.
As aplicações futuras de ofMRI incluem o uso de opsins de próxima geração, tais como opsins vermelho-deslocou-se para permitir a estimulação não-invasiva durante o exame. Além disso, o implante de ressonância magnética compatível com EEG ou eléctrodos de registo semelhantes, juntamente com o implante de fibra óptica poderia permitir a aquisição de dados de alta resolução temporal, para além dos dados de alta resolução espacial de ressonância magnética. ofMRI com Electrophysiolgravação ogical poderia fornecer ampla informação sobre a conectividade funcional do cérebro. Em resumo, o poder de ofMRI para acompanhar todo o cérebro em resposta à estimulação de populações de células específicas definidas pela identidade genética ou anatómica faz ofMRI uma ferramenta essencial para utilizar no estudo de doenças neurológicas e dos conectonomia do cérebro saudável.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
| Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
| fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
| multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
| fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
| ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
| epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
| cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
| multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
| FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
| fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
| aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
| aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
| aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
| binocular biological microscope 40X-1,000X | Amscope | B100 | |
| laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
| 473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
| 594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
| Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
| power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm | Thor Labs | PM121D | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
| isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
| NanoFil 100 µl syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
| Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
| dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
| instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
| antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
| buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock |
References
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