Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Оптогенетика Функциональная МРТ

Published: April 19, 2016 doi: 10.3791/53346
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Neurology and Neurological Sciences, Stanford University, 2Electrical Engineering, Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Introduction

Оптогенетика функциональная магнитно - резонансная томография (ofMRI) представляет собой метод романа , который сочетает пространственное разрешение высокого поля фМРТ с точностью оптогенетика стимуляции 1-11,38, что позволяет клеточный типоспецифической отображение функциональных нейронных цепей и их динамику по всей головной мозг. Оптогенетика позволяет специфические типы клеток, которые будут направлены на стимулирование путем введения светочувствительных трансмембранной проводимости каналов, называемых опсинов. Конкретные элементы нейронных цепей являются генетически модифицированными , чтобы выразить эти каналы, что позволяет миллисекунду-временной шкалы модуляции активности в интактном мозге 1-15. ФМРТ обеспечивает неинвазивный метод определения глобальной динамической реакции мозга на оптогенетика стимуляции специфических нейронных цепей путем измерения крови кислородом зависимой от уровня (полужирный) сигнала 16-18, который обеспечивает косвенное измерение активности нейронов.

Сочетание этих двух методов, называемых оптогенетика функциональной магнитно-резонансной томографии (ofMRI), является преимуществом по сравнению с другими методами записи активности мозга во время стимуляции, таких как электрофизиологии, потому что он может обеспечить представление всей мозга при относительно высоким пространственным разрешением. Это позволяет обнаруживать активности нейронов в ответ на целевой стимуляции на больших расстояниях от места стимуляции без необходимости имплантации инвазивных регистрирующих электродов 1-11. ofMRI имеет преимущество по сравнению с более традиционным способом выполнения электрической стимуляции во время фМРТ, которые могут рекрутировать различные типы клеток вблизи электрода и тем самым посрамить причинное влияние каждого населения 19. Кроме того, электроды , используемые для электрической стимуляции и генерируемый ток может производить артефакты во время МР - томографии 20. Действительно, ofMRI позволяет наблюдать влияние на глобальной активности мозга от конкретного modulatiна из самых разнообразных типов клеток за счет использования современных методов генетической нацеливания, таких как система Cre-LOX у трансгенных животных или использование промоторов. Комбинаторные оптический контроль с мониторингом всего головного мозга возможно с ofMRI путем использования обоих NpHR ингибировать и ChR2 возбуждать специфические типы клеток. Оптогенетика инструментарий доступен для использования в ofMRI также быстро улучшается с течением времени с введением опсинов с повышенной светочувствительности или улучшенной кинетики, стабилизированных ступенчатой ​​функции опсинов (SSFOs) или красным смещением опсинов, что может свести на нет потребность в имплантированным волокна оптика, что позволяет неинвазивной стимуляции во время съемки 21. Эти возможности недоступны при использовании электрической стимуляции.

Тем не менее, сигнальные артефакты , возникающие в результате нагревания ткани вследствие легкой доставки в головном мозге было зарегистрировано 22, где температура индуцированное изменение времен релаксации было показано , чтобы произвести pseuсделать активацию. Поэтому исследователи, осуществляющие ofMRI должны знать об этой потенциальной запутать. При правильной настройке и управления, проблема может быть решена. Кроме того, относительно низкое временное разрешение измерения отклика гемодинамические в фМРТ может быть ограничивающим фактором для некоторых применений этой техники.

Этот протокол первый описывает строительство волоконно - оптических имплантатов , которые позволяют доставку определенных длин волн света глубоко в мозг в естественных условиях. Затем протокол описывает доставку опсина-кодирующий вирусный вектор для точной области мозга с помощью стереотаксической хирургии. Следующий протокол описывает процесс целого мозга функциональной МРТ при одновременной световой стимуляции. И, наконец, протокол описывает базовый анализ данных полученных данных.

Следует отметить, что описанный здесь оптогенетика требуют хронического имплантат для легкой доставки. Тем не менее, волоконно-оптические имплантаты являются стабильными и биосовместимый, что позволяет для продольного сканирования и исследования нейронной схемы в течение периода месяцев 23,24.

Таким образом, точное и стимуляция всего головного мозга способность контроля ofMRI являются решающими факторами при принятии ofMRI мощный инструмент для изучения connectomics головного мозга. Кроме того, она может обеспечить новое понимание механизмов неврологических заболеваний , 25 в сочетании с различными моделями животных. Действительно, ofMRI был использован для выяснения сетевой активности различных гиппокампа субрегионов , связанных с приступами 8. Поэтому, лаборатории, заинтересованные в ответах на вопросы неврологии системного уровня найдут эту технику значение.

Protocol

Заявление по этике: Экспериментальные процедуры здесь были утверждены Институциональный уходу и использованию животных комитета Стэнфордского университета (IACUC) путем.

1. Подготовка кабелей патч и наконечнику Имплантаты

Примечание: Хотя патч кабели и наконечнику имплантаты являются коммерчески доступными, производя их в доме позволяет специальности дизайн и будет стоить меньше.

  1. Чтобы подготовить кабель волоконно патч для подачи света от лазера к имплантату в головном мозге, сначала расщепить оптическое волокно до желаемой длины.
    1. Использование волокна скалыватель, прекратить оптическое волокно для получения плоской конец в точке подключения. Если волокно имеет покрытие с рубашкой, обнажать куртку с волокном инструмент для зачистки заранее.
    2. Сколите другой конец оптического волокна для получения желаемой длины для кабеля, при этом кабель должен достаточно долго, чтобы проходить от источника света к животному внутри отверстиясканер.
  2. Смешайте небольшое количество эпоксидного клея в соотношении 1: 1 на лист алюминиевой фольги, незадолго до того, на следующей стадии, как эпоксидный клей становится слишком вязким для использования 5 мин после смешивания.
  3. С помощью небольшой деревянной палочкой, осторожно применять эпоксидный клей на части волокна, которые будут размещены внутри вогнутой части керамического наконечника, а затем применить небольшую каплю на поверхность плоской стороне наконечника. После того, как вставить его в манжете, убедитесь, что небольшая длина волокна (<0,5 мм) выступает из плоской стороной керамического наконечника. Дайте эпоксидный клей затвердеет O / N для достижения оптимального результата.
  4. На стороне соединительного кабеля волоконно-оптической, который будет подключаться к источнику лазерного света, осторожно применять эпоксидный клей на части волокна, которые будут размещены внутри вогнутой стороне наконечника разъема FC / PC, а затем применить небольшое падение на поверхность плоской стороне наконечника. После введения его в манжете, обеспечитьчто небольшая длина волокна (<0,5 мм) выступает из плоской стороны наконечника. Дайте эпоксидный клей затвердеет O / N для достижения оптимального результата.
  5. Польский плоский конец манжет для обеих сторон кабеля с помощью полировального диска с помощью пинцета, чтобы применить мягкое давление на манжете, делая фигуре 8 ротаций на окиси алюминия притирки листов (от 3 мкм до 1 мкм до 0,3 мкм зернистость ).
  6. Изучить плоский конец наконечника с микроскопом при 100-кратном увеличении. Убедитесь, что поверхность плоского конца, в том числе самого волоконно-оптической поверхности, свободна от любого эпоксидного клея; продолжать полировать, если эпоксидный клей остается на поверхности. Убедитесь, что поверхность оптоволоконный не сломаны или сколы.
    ВНИМАНИЕ: Обеспечить персонал принимать соответствующие учебные классы лазерной безопасности и носить очки лазерной безопасности перед началом работы лазерного оборудования.
  7. Подключите кабель волоконно-оптический патч к источнику лазерного излучения через разъем FC / PC и совместите пИбер наконечник координатору соединителя. Измерьте световой мощности передачи волокна с помощью измерителя мощности, чтобы обеспечить адекватную светоотдачу.
    Примечание: Следующие шаги для получения керамических наконечников с волоконной оптикой для хронической имплантации в мозг; керамические наконечники полые в центре и нести волоконной оптики поставить свет от соединительного кабеля к интересующей области (ROI) в головном мозге.
  8. Использование волокна скалыватель, прекратить оптическое волокно для получения плоской конец в точке подключения. Если волокно имеет покрытие с рубашкой, обнажать куртку с волокном инструмент для зачистки заранее.
  9. Сколите другой конец оптического волокна для получения желаемой длины для имплантации в головной мозг. Определить длину волокна с помощью стереотаксической атлас для целевой ROI в головном мозге.
    1. Например: нацеливать дорсального гиппокампа у крыс, которая в 3,5 мм ниже темени, убедитесь, что длина волокна, выступающую от ferrulе составляет 3,5 мм + 0,25 мм, что составляет толщину черепа и учитывая погрешности. Поэтому убедитесь, что окончательная длина волокна составляет 3,5 мм + 0,25 мм + 10.5 мм (длина манжеты) = 14,25 мм.
  10. Смешайте небольшое количество эпоксидного клея в соотношении 1: 1 на лист алюминиевой фольги, незадолго до следующей стадии (эпоксидный клей становится слишком вязким для использования 5 мин после смешивания).
  11. С помощью небольшой деревянной палочкой, осторожно применять эпоксидный клей на части волокна, которые будут размещены внутри вогнутой части керамического наконечника, а затем применить небольшую каплю на поверхность плоской стороне наконечника. После того, как вставить его в манжете, убедитесь, что небольшая длина волокна (<0,5 мм) выступает из плоской стороной керамического наконечника. Дайте эпоксидный клей затвердеет O / N для достижения оптимального результата.
  12. Польский плоский конец наконечника с помощью полировального диска с помощью пинцета, чтобы применить мягкое давление на манжете, делая фигуру-8 вращениеs на оксид алюминия притирки листов (от 3 мкм до 1 мкм до 0,3 мкм грит).
  13. Изучить плоский конец наконечника с микроскопом при 100-кратном увеличении. Убедитесь, что поверхность плоского конца, в том числе самого волоконно-оптической поверхности, свободна от любого эпоксидного клея; продолжать полировать, если эпоксидный клей остается на поверхности. Убедитесь, что поверхность оптоволоконный не сломаны или сколы.
  14. Пара полированная обойма к патч-кабеля волоконно-оптический с гильзой втулки и подключите соединительный кабель к источнику лазерного излучения. Измерения света, мощность передачи на конце световода с помощью измерителя мощности, чтобы обеспечить адекватную эффективность.
  15. Храните журнал выходной мощности, требуемой от обоймы Пластырь кабеля для каждого ободка имплантата на выходе желаемый уровень мощности на конце оптического волокна (2,5 мВт в данном протоколе). Откажитесь наконечниками с частотой затухания более чем на 50% и с некруглой выходным рисунком.

2. Стереотаксическая Implantation хирургии и Вирус Инъекции

  1. Убедитесь в том, что любые экспериментальные процедуры, включающие использование животных одобрено местным IACUC. Поддержание асептических условий во время операций выживания следуя асептических процедур, в том числе с использованием стерильных перчаток, стерильные маски, стерильные хирургические простыни и стерилизуют хирургические инструменты.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь в том, что хирурги носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая защитные очки перед началом процедуры. при работе с аденоассоциированного вектором (AAV), следя за тем, чтобы избежать разбрызгивания следовать стандартным процедурам биологической безопасности. Утилизировать AAV отходов в контейнер для биологически опасных.
  2. Загрузите микролитре шприц с достаточным количеством AAV для инъекции в организм животного плюс дополнительный, чтобы учесть возможные потери объема (всего 4 мкл на одно животное), держа шприц на льду перед использованием. В этом протоколе, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP в титре 4x10 12 Vg / мл используется. Поместите животное под Изофлуране анестезия с индукционной камеры, соединенной с точностью изофлурановым набора испарителем на 3 - 4%, с источником кислорода газа.
  3. Бритье головы с электрической бритвы и выполнить тройной хирургический скраб на кожу с помощью бетадин и полоскание этанол 70%.
  4. После того, как животное находится в глубокой анестезии (схождение проверить рефлекс и частоту дыхания), иммобилизации череп животного в стереотаксического аппарата с внутриушной позиционирования шпильки и зубов бар.
    Примечание: Вся процедура займет 1 - 2 ч, от анестезии индукции к восстановлению.
  5. Установите анестезию до соответствующего уровня (1 - 3% изофлуран на испарителем) и постоянно контролировать жизненно важные признаки животного, регулируя анестезии по мере необходимости для поддержания частоты дыхания от ~ 40 вдохов / мин. Администрируйте глазной мази на глазах животного, чтобы предотвратить сухость в то время как под анестезией.
  6. Сделайте 15 A - 20 мм по средней линии скальпа разрез скальпелем и убрать кожу головы с помощью хирургических кровоостанавливающихttached к надкостнице. Ссылка лямбда и брегма позиционировать сверло по координатам для ROI.
  7. Дрель небольшой краниотомия (2 - 3 мм) по сравнению с ROI с бормашины, следя за тем, чтобы не проколоть мозг. Медленно вставить иглу, прикрепленную к микролитров шприца через Краниотомия к ROI в головном мозге.
  8. С помощью контроллера микрошприц насоса, вводят по 2 мкл вектора раствора в ROI. Использование скорости потока 150 л / мин, чтобы избежать повреждения тканей. После инъекции завершается, подождите 10 мин перед извлечением шприца медленно, со скоростью 0,5 мм / мин.
  9. После инъекции, сухой поверхности черепа. Ссылка лямбда и брегма подтвердить координаты, а затем вставить металлический наконечник имплантата до целевой глубины (например, 3,5 мм ниже темени для дорсального гиппокампа) со скоростью около 0,5 мм / мин. Установите обоймы имплантата к черепу при помощи стоматологического цемента. После того, как зубной цемент затвердеет, запечатать разрез с швами (сиZE 5-0 для крыс) вокруг зубного цемента крышкой.
  10. После операции, поместите животное в своей клетке по одному размещалась с половиной клетки на верхней части нагревателя для выхода из наркоза. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не оставляйте животное в компании других животных, пока он не полностью восстановилась.
  11. Для послеоперационного лечения боли, администрировать бупренорфин подкожно каждые 12 ч в дозе 0,05 мг / кг в течение 24 ч. Администрируйте порошок антибиотика ежедневно в течение месте разреза в течение 3-х дней.
  12. Удалить швы примерно через две недели после операции, чтобы предотвратить струпьев.
  13. Подождите 4 - 6 недель после инъекции вируса в течение достаточного экспрессии генов оптогенетика перед выполнением экспериментов.

3. оптогенетика Функциональная МРТ

ВНИМАНИЕ: Соблюдайте осторожность вокруг постоянного магнитного поля магнитно-резонансной томографии. Secure оборудовлор, в том числе функции генератора, источника света, вентилятор, капнографом и газовых резервуаров, достаточно далеко (по крайней мере за 5 предела Гаусс).

  1. Место животное под газовой анестезией с индукционной камеры, соединенной с точностью изофлурановым набора испарителем на 5% с источником кислорода газа.
  2. После того , как животное находится в глубокой анестезии (проверка схождения рефлекса и частоты дыхания), интубация животное в соответствии с протоколом , детально описанной в Rivard и др. (2006) , что позволяет контролировать двуокиси углерода капнографией 26. Примечание: интубация имеет решающее значение для поддержания надлежащего уровня выдыхаемого СО 2 во время съемки.
  3. Зафиксируйте животное в колыбели сканера.
    Примечание: В этом протоколе, колыбель был обычай производства, но такие люльки также имеются в продаже. Функции крысы колыбели, чтобы обеспечить животное внутри сканера для доставки анестезии, нагретого воздуха и для ограничения движения.
  4. Deliver смесь изофлуран (Рангинуг с 1,2 - 1,5%) в приблизительно 60% закиси азота и 40% кислорода с помощью трубки через базовую станцию. Убедитесь, что голова животного надежно фиксируется, чтобы избежать артефактов движения.
  5. Обеспечить нагретого воздуха через трубу в люльке и вставьте ректального термометра смазкой для контроля температуры тела. Администрируйте глазной мази на глазах животного, чтобы предотвратить сухость в то время как под анестезией.
  6. Подключите кабель волоконно-оптический патч к источнику лазерного излучения и измерить выход на конце наконечника кабель заплаты с помощью измерителя мощности.
  7. Отрегулировать до соответствующего уровня мощности (ранее определенной на этапе 1.15), для получения требуемого выходного сигнала (2.5 мВт в данном протоколе) на конце оптического волокна имплантированного в мозг. Так как чрезмерный выходной мощности от волоконно-оптических может потенциально привести к повреждению тканей внутри мозга или вызывать нагрев ткани, которая будет производить сигнальные артефакты, не значительно увеличить выходную мощность лазераза предполагаемого выхода.
  8. Предотвращение утечки света из имплантата с конусом черной изоленты и закрывала глаза животного. Пара волоконно-оптический кабель с металлическим наконечником имплантата на животное с гильзой втулкой.
  9. Поместите катушку над головой животного. Вставьте держатель с животным в отверстие сканера.
    Примечание: В этом протоколе, однопетлевое приема-передачи катушка была специально изготовлены и предварительно настроенная получить оптимальную частоту радиосигнала от ткани мозга.
  10. Монитор скорости и температуры тела дыхания на протяжении всего этого процесса, регулируя искусственный вентилятор и нагреватель по мере необходимости , чтобы сохранить физиологические значения в пределах (убедитесь , что на выдохе СО 2 составляет 3 - 4%, вращая ручки на искусственной вентиляции легких для регулировки частоты хода и громкость и что температура 37 ° C, нажимая на стрелки для установки температуры).
  11. Выберите последовательность позиционирования изображения на местоположении головы животного. Если бдождь не в изо-центре, отрегулируйте положение головы животного и повторить сканирование позиционирования, пока мозг не находится в изо-центре. Выберите последовательность шиммирования линейную и нажмите нагрузку в окне выбора последовательности. Далее, нажмите кнопку Пуск, чтобы уменьшить неоднородности магнитного поля.
    Примечание: Шиммирование является важным шагом, который будет непосредственно влиять на целостность данных МРТ.
  12. Выберите последовательность T2-взвешенных и нажмите нагрузки в окне выбора последовательности. Далее, нажмите кнопку Пуск, чтобы приобрести T2-взвешенных с высокой разрешающей способностью корональные анатомических изображений до фМРТ для проверки общей целостности головного мозга и подтвердить расположение оптического волокна имплантата.
    Примечание: Эти изображения могут быть использованы как анатомия накладками для серии сканирования ofMRI.
  13. Подключение кабелей BNC от инициирующего порту сканера MRI к функции генератора таким образом, чтобы лазерный источник света приводится в движение в соответствии с экспериментальной парадигмы стимуляции.
    Примечание: В этом протоколе стимуляция рaradigm составляет 30 с базовой линии с последующим 20 сек вкл / выкл 40 сек в течение шести минут.
  14. Выберите мульти-срез градиент отозван эхо последовательности (GRE) и нажмите нагрузки в окне выбора последовательности. Затем нажмите кнопку Пуск, чтобы приобрести 35 мм х 35 мм (2D FOV) в плоскости корональные срезы 0,5 мм х 0,5 мм х 0,5 мм пространственное разрешение.
    Примечание: Последовательность GRE, используемый здесь, имеет время повторения (TR) и эхо времени (TE) из TR / TE = 750/12 мс и угол флип 30 °.
  15. По завершении сканирования, удалите животное со сканера и монитора, пока она не очнулась от наркоза и может поддерживать грудины лежачее.

4. Анализ данных ofMRI

Примечание: Следующие шаги выполняются в среде MATLAB , как описано в публикации на высокой пропускной способностью ofMRI 27.

  1. После того, как необработанные данные сканирования были переданы на компьютер, используемый для анализа, использование скользящего окна реконструкции для обновления изображения каждый TR, счетыре перемежать спираль считывания, 750 мс TR и 12 мс эхо время для приобретения 23 ломтиков в серии сканирования. Вместо обычной реконструкции , где новые образы фМРТ реконструируются только после того, как все перемежает приобретаются для каждого среза, скользящий метод реконструкции окна реконструирует изображения после приобретения каждого Interleaf 27.
  2. Процесс исходные данные для двумерной гридинга реконструкции, коррекции движения, и расчет временных рядов , как описано выше 27.
  3. С помощью метода порога когерентности для определения активированные вокселей путем расчета процента модуляции BOLD сигнала каждого воксела относительно базового периода , собранные до стимуляции , как описано выше 27. Вычислить значения когерентности , как величина преобразования Фурье на частоте повторных циклов стимуляции , разделенное на квадраты суммы чисел всех частотных составляющих 8.
  4. Использование данных временных рядов для каждого Voxel, среднее движение скорректированного изображения, которые принадлежат последовательных сканирований той же парадигмы стимуляции в первую очередь. Затем выровнять средние 4D изображений в общей системе координат с преобразованием твердого тела с шестью степенями свободы плюс изотропного масштабирования для сравнения внутри и между животными , как описано выше 27.

Representative Results

На рисунке 1 и 2 показаны репрезентативные данные полученные от 20 Гц (15 мс длительность импульса, 473 нм, 30% рабочий цикл) оптогенетика стимуляции моторной коры. Стимуляция парадигма 30 секунд базового уровня с последующим 20 сек вкл / выкл 40 секунд для использовали шесть мин. Предыдущие исследования показали , что эта парадигма создает надежный BOLD сигнал от оптогенетика стимуляции 1,8. На рисунке 1 показано , активированных вокселей , обнаруженные как на локальном участке стимуляции (моторной коры) и в таламус, в результате синаптических связей дальнего радиуса действия между этими областями. Рисунок 2 показывает , что временная информация можно почерпнуть из HRFs, как таламическая ответ задерживается (нижний начальный наклон) по сравнению с ответом моторной коры после стимуляции оптогенетика.

p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Активация Карта BOLD сигнала индуцированные оптогенетика стимуляции CaMKIIa-экспрессирующих клеток в моторной коре. Значения когерентность активных вокселов, идентифицированных как те , значительно синхронизирована с повторными раздражениями, показаны наложены на корональной анатомического среза T2-взвешенный. Данные, собранные в течение шести мин, 30 сек Период (начальный 30 с базовой линии и шести циклов стимуляции 20 сек на / 40 с выкл с 473 нм света, 20 Гц, 15 мс) ширины импульса конденсируются в одну карту активации. Последовательные ломтики 0,5 мм друг от друга и расположение волоконно - оптического имплантата обозначается треугольником. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Движение предмета во время формирования изображения является существенным источником артефакт, который может привести к повреждению данных. Надлежащим обеспечение животное на люльке визуализации может свести к минимуму такие артефакты, как будет поддерживать соответствующие уровни анестезии. Здесь мы использовали изофлуран но альтернативные анестетики, такие как медетомидина или кетамином и ксилазином, также следует учитывать. Тем не менее, уровни и выбор анестетика может влиять на многие параметры в головном мозге, в том числе Смелый ответ 28. Isoflurane может вызвать изменения в возбудимости нейронов 29. Другие анестетики могут также влиять на ГАМК синаптическую ингибирование 30. Таким образом, выбор анестезии важно при выполнении ofMRI учитывая его способность влиять на нейронную активность. ofMRI в отсутствие анестезии возможно, но может быть сложной задачей с увеличением движения от животного, которое может быть уменьшено, если животное приученный; такие просыпаются исследования ofMRI ранее выполнилий позволит избежать эффекта сбивающий анестезии на мозг 9,10. Алгоритмы коррекции движения постобработка может быть использован для значительного уменьшения эффектов движения. Некоторые из этих методов, существуют, в том числе обратной Гаусса-Ньютона алгоритма, используемого в данном протоколе, который сводит к минимуму сумму квадратов функции стоимости опорного изображения, и изображение, при коррекции. Алгоритм полезен , поскольку он позволяет быстро и надежную коррекцию движения, с использованием графического дизайна параллельной платформы для сокращения времени обработки 27.

Для восстановления данных в этом протоколе, пользовательские написано программное обеспечение в среде MATLAB была использована для двумерной гридинга реконструкции, где образцы спиральных реконструируются в к-пространстве в привязке к сетке изображений 31-33. Данные временных рядов были получены путем расчета процента модуляции BOLD сигнала каждого воксела относительно базового периода, собранные до стимуляции. Воксели которого временные ряды синchronized к блокам оптогенетика стимуляции со значением когерентности 0,35 или выше, были определены как активированных вокселей; это значение когерентности соответствует менее чем 10 -9 значения P 8. Значения Согласованность рассчитывались как величина преобразования Фурье на частоте повторных циклов стимуляции , разделенное на квадраты суммы чисел всех частотных составляющих 8,27. Ошибка Familywise можно управлять с помощью коррекции Бонферрони для множественных сравнений. могут быть использованы альтернативные методы анализа, включая параметрические статистические тесты, такие как общие линейные модели (GLMS). Метод когерентности требует меньше предварительных знаний о HRF по сравнению с обычной общей линейной модели. Таким образом, предпочтительно, при изучении данных с использованием ofMRI. Тем не менее, метод когерентности может быть использован только для данных с блок-схем или выбранных конструкций событий, связанных с фиксированным интервалом межстимульный и не могут быть использованы в данных ofMRI с другими ивент-отношеTed конструкции или смешанные конструкции. Впоследствии, динамическое моделирование причинной (DCM) может быть использована для анализа взаимодействий между областями мозга, выявленных в ходе ofMRI. DCM является байесовский статистический метод , разработанный для анализа функциональной связности из системы ответов на экспериментальных входов во время фМРТ 34.

Дополнительные технические проблемы для ofMRI обсуждаются здесь. Имплантаты могут быть повреждены или упасть, что приводит к удалению пораженного животного из исследования. Re-имплантацией операции не рекомендуется из-за дополнительной неопределенности ориентации тот же ROI, как и в оригинальной имплантации хирургии и из-за проблем защиты животных. Из-за значительного количества времени и ресурсов, вложенных в каждый предмет животных, рассмотрение прочности материала является важным фактором при выборе подходящего стоматологического цемента для использования в исследованиях ofMRI. Операция имплантации является решающим фактором в максимизации долговечности implanт и при условии животных. Например, обеспечение того, чтобы череп сухим перед нанесением стоматологического цемента и размещение достаточного количества цемента вокруг керамического наконечника имплантата может обеспечить стабильность в течение потенциального многомесячную сроки животного во время исследования. Кроме того, альтернативные конструкции клетки могут быть изучены и обсуждены с местным средства по уходу за животными, чтобы избежать клетки с проволочными верхушек держащих пищи и воды, которые часто выступают в клетку и обеспечить возможности для животного повредить имплантат. Важно отметить, что стоматологический цемент должен быть выбраны тщательно, чтобы уменьшить артефакты, которые влияют на отображение и альтернативные цементы могут быть протестированы с помощью нанесения на фантоме и получения изображений в сканер перед использованием в экспериментах на животных. Метод проб и ошибок с различными зубных цементов показал, что цемент, используемый в данном протоколе дает относительно небольшое число артефактов. Еще одна техническая проблема при выполнении ofMRI является точность размещения волоконно-оптических в планируемом ROI, учитывая ОтбораEmely малые расстояния , которые могут существовать между ядрами в мозге 35. После завершения имплантации хирургических операций, Т2-взвешенных анатомических сканирование может быть использовано для определения правильного размещения, накладывая на Атласа мозга. Мастерство хирурга и практики, выполняющего эти операции могут улучшить правильные цены размещения. Специфичность и экспрессия опсином на намеченное ROI может быть проверена при завершении исследования путем перфузии животного и фиксации мозг, с помощью иммуногистохимии или эндогенное флуоресценции репортерного белка, привязанную к опсином для визуализации. Эти репортерные белки также могут быть локализуется с другими белками , чтобы гарантировать , что опсина выражается в желаемых нейронных типов клеток 1,8,15,25. Как упоминалось ранее, артефакты могут возникнуть при выполнении ofMRI из - за нагревания ткани из легкого доставки 22. Нагрева ткани вызывает изменение времен релаксации, что приводит к ложным BOLD сигнала. Чтобы гарантировать, что асактиваций в результате световой стимуляции во время ofMRI не из-за этого артефакта, Opsin-отрицательный контроль должен быть выполнен, в которых либо физиологический раствор вводили животным или животным, которым вводили контроль флуорофором векторами (например, AAV-CaMKIIa-EYFP) подвергаются ofMRI. Кроме того, только хорошо построены волоконно-оптические имплантаты с хорошей светоотдачей передачи следует использовать для удаления необходимость использования высоких мощности лазера. Исследования ofMRI были выполнены в каком ложной активации из - за нагрева ткани не было проблемой 1,6-8,10,11.

Что касается выбора вектора для введения необходимых оптогенетика генов в нейроны для экспрессии, AAVs не известно, вызывают заболевания у людей и, следовательно, представляют собой удобный вариант, учитывая более низкую уровня биологической безопасности, необходимые для использования этих агентов (BSL-1). Кроме того, множество векторных ядер несут AAVs упакованные с различными оптогенетика генов в наличии и с множественными серотипов. Серотип AAV должны быть выбраны бAsed на намеченной цели клеточной популяции , чтобы обеспечить оптимальные уровни экспрессии 36,37. Лентивирусов также могут быть использованы, но требуют более высокого уровня биологической безопасности. Период времени, необходимый для достаточного экспрессии генов оптогенетика варьирует в зависимости от конкретной модели животного, используемого на конкретном AAV, используемой и на конкретной экспериментальной парадигмы. В этом протоколе, Спрэг Dawley крыс на 11 недель используются и оптогенетика исследования начинаются от четырех до шести недель после инъекции вируса. Трансгенные мыши, также могут быть использованы в оптогенетика исследованиях. Необходимо проводить пилотные эксперименты с целью определения конкретного количества времени, необходимого для достаточного экспрессии опсинов. Стимулирующие парадигм может изменяться в зависимости от конкретного используемого опсином. В этом протоколе, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP используется и парадигма стимуляции 20 сек вкл / выкл 40 сек. При использовании SSFO, парадигма стимуляции будет меняться, потому что SSFO требует лишь краткий импульс света, чтобы быть переменного токаа затем, усиленное акцией короткий импульс света на другую длину волны, чтобы быть прекращено.

Дополнительным критическим фактором при выполнении ofMRI является предотвращение утечки света от интерфейса имплантата ободка с помощью кабеля волоконно-оптический патч во время оптогенетика стимуляции, чтобы предотвратить Поразительным сигнал мозга, исходящий от визуальной стимуляции, даже когда наркозом животное. Конусы черной изоленты можно использовать, чтобы блокировать свет от манжет и покрыть глаза животного. Важно отметить, что физиологические значения , включая выдохе СО 2 и температуру тела субъекта должны быть надлежащим образом в течение всего периода формирования изображения. Выдыхаемого СО 2 должен составлять от 3 ​​- 4% и температуру тела при 37 ° С. Кроме того, Шиммирование последовательности, чтобы уменьшить, насколько это возможно, как неоднородность в магнитном поле перед началом ofMRI значительно сканирует определяет качество получаемых BOLD данных. Контроль этих факторовимеет решающее значение для получения достоверных данных ofMRI. В этом протоколе, DPSS лазеры используются в качестве источника света для оптогенетика стимуляции. Поскольку лазерный свет является когерентным, более чем достаточно мощности может быть легко подается через волоконно-оптические. Светодиодные источники света в сочетании с волоконной оптикой доступны от коммерческих поставщиков, но имеют тот недостаток, уменьшенной мощности передачи света. Источник лазерного луча требует выравнивания для каждого конкретного соединительного кабеля волоконно-оптического, но с практикой, выравнивание может быть достигнуто в течение нескольких секунд до нескольких минут.

Будущие приложения ofMRI включают в себя использование опсинов следующего поколения, таких как красным смещением опсинов чтобы позволить неинвазивной стимуляции во время визуализации. Кроме того, внедрение МРТ-совместимый ЭЭГ или аналогичной записи электродов наряду с оптоволоконным имплантата может позволить для получения данных высоким временным разрешением в дополнение к высоким данным пространственным разрешением МРТ. ofMRI с electrophysiological записи может предоставить обширную информацию о функциональной связности мозга. Таким образом, мощность ofMRI контролировать весь мозг в ответ на стимуляцию специфических клеточных популяций, определяемых генетической или анатомической идентичности делает ofMRI критический инструмент для использования при изучении неврологических заболеваний и из connectomics здорового мозга.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 Tesla scanner Agilent Technologies Discovery MR901 System
Sprague Dawley rats Charles River Crl:SD 11 weeks old
fiber cleaver Fujikura CT-05
multimode optical fiber Thor Labs AFS105/125Y
fiber stripper   Thor Labs T08S13
ceramic split sleeve Precision Fiber Products SM-CS1140S
epoxy glue Thor Labs G14250
cotton-tipped applicators Stoelting Co. 50975
multimode ceramic zirconia ferrules Precision Fiber Products MM-FER2002
FC/PC multimode connector Thor Labs 30128C3
fiber optic polishing disk Precision Fiber Products M1-80754
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm Thor Labs LFG03P
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm Thor Labs LFG1P
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm Thor Labs LFG3P
binocular biological microscope 40X-1,000X Amscope B100
laser safety glasses Kentek KXL-62W01
473 nm DPSS laser Laserglow LRS-0473
594 nm DPSS laser Laserglow LRS-0594
Allen hex wrench set 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser
power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm Thor Labs PM121D
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033
isoflurane vaporizer with induction chamber VetEquip 901806
NanoFil 100 µl syringe World Precision Instruments NANOFIL-100
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-1
function generator A.M.P.I.  Master-8
small animal stereotax David Kopf Instruments Model 940 
Model 683 small animal ventilator  Harvard Apparatus 550000
Type 340 capnograph  Harvard Apparatus 733809
dental drill (rotary micromotor kit) Foredom Electric Co. K.1070
ophthalmic ointment (Artificial Tears) Rugby 00536-6550-91
instrument sterilizer CellPoint Scientific Germinator 500 glass bead sterilizer
antibiotic powder Pfizer NEO-PREDEF neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride
buprenorphine painkiller Hospira NDC:0409-2012 schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. H., et al. Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring. Nature. 465 (7299), 788-792 (2010).
  2. Weitz, A. J., Lee, J. H. Progress with optogenetic functional MRI and its translational implications. Future Neurol. 8 (6), 691-700 (2013).
  3. Lee, J. H. Informing brain connectivity with optogenetic functional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 62 (4), 2244-2249 (2012).
  4. Lee, J. H. Tracing Activity Across the Whole Brain Neural Network with Optogenetic Functional Magnetic Resonance Imaging. Front. Neuroinform. 5 (October), 1-7 (2011).
  5. Kahn, I., et al. Characterization of the Functional MRI Response Temporal Linearity via Optical Control of Neocortical Pyramidal Neurons. J. Neurosci. 31 (42), 15086-15091 (2011).
  6. Takata, N., et al. Optogenetic Activation of CA1 Pyramidal Neurons at the Dorsal and Ventral Hippocampus Evokes Distinct Brain-Wide Responses Revealed by Mouse fMRI. PLoS ONE. 10 (3), e0121417 (2015).
  7. Iordanova, B., Vazquez, A. L., Poplawsky, A. J., Fukuda, M., Kim, S. -G. Neural and hemodynamic responses to optogenetic and sensory stimulation in the rat somatosensory cortex. J. Cereb. Blood Flow Metab. 35 (6), 922-932 (2015).
  8. Weitz, A. J., et al. Optogenetic fMRI reveals distinct, frequency-dependent networks recruited by dorsal and intermediate hippocampus stimulations. NeuroImage. 107, 229-241 (2015).
  9. Desai, M., et al. Mapping brain networks in awake mice using combined optical neural control and fMRI. J. Neurophysiol. 105 (December 2010), 1393-1405 (2011).
  10. Liang, Z., Watson, G. D. R., Alloway, K. D., Lee, G., Neuberger, T., Zhang, N. Mapping the functional network of medial prefrontal cortex by combining optogenetics and fMRI in awake rats. NeuroImage. 117 (0), 114-123 (2015).
  11. Byers, B., et al. Direct in vivo assessment of human stem cell graft-host neural circuits. NeuroImage. 114 (0), 328-337 (2015).
  12. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  13. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat. Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
  14. Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3 (10), 785-792 (2006).
  15. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  16. Ogawa, S., Lee, T. M., Kay, A. R., Tank, D. W. Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24), 9868-9872 (1990).
  17. Ogawa, S., et al. Intrinsic signal changes accompanying sensory stimulation: functional brain mapping with magnetic resonance imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5951-5955 (1992).
  18. Kwong, K. K., Belliveau, J. W., et al. Dynamic magnetic resonance imaging of human brain activity during primary sensory stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5675-5679 (1992).
  19. Canals, S., Beyerlein, M., Murayama, Y., Logothetis, N. K. Electric stimulation fMRI of the perforant pathway to the rat hippocampus. Magn. Reson. Imaging. 26, 978-986 (2008).
  20. Antal, A., et al. Imaging artifacts induced by electrical stimulation during conventional fMRI of the brain. NeuroImage. 85 (3), (2014).
  21. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nat. Neurosci. 16 (10), 1499-1508 (2013).
  22. Christie, I. N., et al. FMRI response to blue light delivery in the naïve brain: Implications for combined optogenetic fMRI studies. NeuroImage. 66, 634-641 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J. Neural Eng. 4, S143-S156 (2007).
  24. Pashaie, R., et al. Optogenetic brain interfaces. IEEE Rev. Biomed. Eng. 7, 3-30 (2014).
  25. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
  26. Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19, 267-274 (2006).
  27. Fang, Z., Lee, J. H. High-throughput optogenetic functional magnetic resonance imaging with parallel computations. J. Neurosci. Meth. 218 (2), 184-195 (2013).
  28. Da Silva, F. L. EEG: Origin and measurement. EEG - fMRI: Physiological Basis, Technique, and Applications. , 19-38 (2010).
  29. Becker, K., et al. Low dose isoflurane exerts opposing effects on neuronal network excitability in neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 7 (6), 3-9 (2012).
  30. Nishikawa, K., Maciver, M. B. Agent-selective Effects of Volatile Anesthetics on GABA A Receptor - mediated Synaptic Inhibition in Hippocampal Interneurons. Anesthesiology. 94 (2), 340-347 (2001).
  31. Jackson, J. I., Meyer, C. H., Nishimura, D. G., Macovski, A. Selection of a convolution function for Fourier inversion using gridding. IEEE Trans. Med. Imag. 10 (3), 473-478 (1991).
  32. Glover, G. H., Lee, A. T. Motion artifacts in fMRI: comparison of 2DFT with PR and spiral scan methods. Magn. Reson. Med. 33 (20), 624-635 (1995).
  33. Kim, D. H., Adalsteinsson, E., Spielman, D. M. Simple analytic variable density spiral design. Magn. Reson. Med. 50, 214-219 (2003).
  34. Friston, K. J., Harrison, L., Penny, W. Dynamic causal modeling. Neuroimage. 19, 1273-1302 (2003).
  35. Alkire, M. T., McReynolds, J. R., Hahn, E. L., Trivedi, A. N. Thalamic microinjection of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat. Anesthesiology. 107 (2), 264-272 (2007).
  36. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol. Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  37. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS ONE. 8 (9), 1-16 (2013).
  38. Liu, J., et al. Frequency-selective control of cortical and subcortical networks by central thalamus. eLife. 4, e09215 (2015).

Tags

Neuroscience выпуск 110 оптогенетика функциональная магнитно-резонансная томография (МРТ) оптогенетика ФМРТ (ofMRI) нейробиология мозг глубокая стимуляция мозга (DBS)
Оптогенетика Функциональная МРТ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, P., Fang, Z., Liu, J., Lee, J.… More

Lin, P., Fang, Z., Liu, J., Lee, J. H. Optogenetic Functional MRI. J. Vis. Exp. (110), e53346, doi:10.3791/53346 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter