Nem og præcis mekanisk-profilering på Micropost Arrays

Introduction

Mekanisk-sensitive cellebaserede assays tillader undersøge vedhængende celler, med en bred vifte af applikationer, der afspejler den centrale rolle, som mekanikere kan spille i cellebiologi. Disse applikationer fokuserer ofte på de underliggende mekanismer, der driver subcellulære processer eller hel-celle adfærd. På den ene side kan eksterne miljøfaktorer såsom ekstra cellulær matrix sammensætning eller matrix stivhed dramatisk påvirke mekanisk og biologisk respons i en celle. ¹ Det samme kan iagttages efter anvendelse af mange klasser af farmaceutisk aktive forbindelser, hvis virkninger er ofte karakteriseret ved anvendelse cellekulturmodeller. ² På den anden side genotypiske egenskaber, såsom dem, der forårsages af spontane eller eksperimentelt induceret genetiske mutationer, kan inducere markante ændringer i cellefænotype, der er forbundet med ændringer i cytoskelettet struktur og funktion. ³ Disse eksempler er blot nogle få af de mange muligeemner for hvilke mekaniske fænotypebestemmelse af celler er relevant, og alle disse er blevet fordel undersøgt med micropost arrays.

På tidspunktet for dette skrives, har ca. 200 artikler er blevet offentliggjort som beskriver celle-micropost interaktion. Disse værker diskuterer teoretiske aspekter af micropost afbøjning principper samt praktiske instruktioner om deres fremstilling. Den første artikel, der beskriver samspillet mellem celler og fleksible micropost arrays blev udgivet af Tan og kolleger i 2003. ⁴ I modsætning til klassiske trækkraft mikroskopi (TFM), hvor der anvendes kontinuerlig bløde underlag at estimere nanonewton skala celle kontraktilitet, Tan et al. der beskrevet en fremgangsmåde ved hjælp af flere tætliggende lodrette bjælker fremstillet af silikoneelastomer. De vigtigste fordele ved denne teknik frem fra to vigtigste funktioner. Først for at ændre celle-substrat tilsyneladende stivhed man behøver blot at ændre micropost dimensioner, samtidig med atsubstratet sammensætningen ellers konstant og således undgå forskelle i overfladen topologi og kemi. Anden microposts opfører sig som individuelle fjedre, der kan diskret analyseret med kraft og rumlige beslutninger om rækkefølgen af ​​de enkelte fokale sammenvoksninger og kan reducere de analytiske udfordringer, der er forbundet til en tilsvarende undersøgelse af standard TFM.

I dag rækken af ​​applikationer til micropost arrays langt overstiger bare kortlægning af kræfter i et par enkelte celler. For eksempel, Akiyama rapporterer anvendelsen af et isoleret dorsal fartøj væv fra et møl larve som en aktuator til en micropost array, med henblik på at udvikle et insekt muskel-drevne autonome mikro-robot. ⁵

Imidlertid har de fleste offentliggjorte anvendelser af microposts fokuseret på studier af medicinske tilstande som infektion eller cancer. For eksempel har micropost arrays blevet brugt til at studere den kraft generation af bundtet type IV pili af Neisseria gonorrhOEA kolonier, der er forbundet med signal kaskader øge infektion. ⁶ Andre har anvendt microposts at studere brystkræftceller behandlet med farmaceutiske forbindelser målrettet cytoskelettet. ⁷

Afbøjning af en micropost beskrives ofte ved hjælp af klassisk stråle teori for en cantilever med en belastning ende antager cellen lægger kun til den meget spids af micropost. Her den påførte kraft F, der forårsager en deformation δ afhænger af micropost s "bøjningsstivhed" k og beregnes ved formlen:

(1)

med E, I og L er den Youngs modul, område inertimoment og stråle længde hhv. Men resultaterne fra denne ligning kun give en generel tilnærmelse af de kræfter på arbejde, da strålen klipning og bøjning samt ikke tages i ac substrat vridningtælle. Betragtning af, at microposts typisk er lavet af bløde materialer som polydimethylsiloxan (PDMS) -baseret silikonegummi disse faktorer skal medtages. . Schoen et al viste, at der er sådan en korrektionsfaktor baseret på billedformatet af micropost (L / D) og den tilsvarende polymer er Poisson-forhold v ⁸ Det er givet ved.:

(2)

Med T _tilt (v) er en vippe koefficient, der omfatter montering parameter a = 1,3, som kan findes i samme artikel:

(3)

Det betyder en micropost korrigerede stivhed k _corr er produktet af den rene bøjningsstivhed k = k _{bøjes og} korrektionsfaktoren corrgivet ved:

(4)

Derfor bør celle kraft beregninger udføres ved hjælp af mere raffineret variant af ligning (1) nu læser:

(5)

Virkningen af ​​korrektionen bliver mere tydelig, så snart typiske værdier for micropost dimensioner anvendes. For eksempel, en 15-mikron lange micropost med et cirkulært tværsnit og en diameter på 5 um lavet af PDMS-baserede silikonegummi fører til en korrektionsfaktor på 0,77 og dermed en ukorrigeret beregning ville overvurdere de udøves celle kræfter med 23%. Dette bliver endnu mere alvorlig for microposts med mindre størrelsesforhold.

Traditionelt har micropost billedanalyse også været baseret på idealiserede stråle bøjning teori. I 2005 den gruppe, der pioner brugen af ​​MICRopost arrays offentliggjort et billede analyse software velegnet til micropost analyse ⁹ Softwaren kræver en softwarelicens, og brugeren skal tage tre billeder for hver position.; én fra hver af micropost top og bund fly i transmissionstilstand og en anden i fluorescens mode med den farvede celle. Efter at have sammenlignet den øverste og nederste positioner for hver micropost softwaren bestemmer en kraft vektor felt og beregner relaterede parametre såsom kraft pr indlæg. Der findes andre softwarepakker, og deres analyse principper er kort omtalt i de tilsvarende artikler, der beskriver dem, men disse analytiske softwarepakker er generelt ikke offentligt tilgængelige. ^10,11

De micropost arrays designet til kortlægning celle kræfter kan klassificeres som enten værende i en ortogonal micropost layout eller en sekskantet en, hvor sidstnævnte har den fordel, ækvidistante huller mellem alle nabo microposts. Typiske microposts have et cirkulært tværsnit og deres dimensioner i området fra 1,0 um til 10 um i diameter og 2 til 50 um i længden. ⁴ dog microposts med elliptisk eller kvadratisk tværsnit er også blevet rapporteret. ^12,13

Anvendelsen af ​​PDMS-baserede siliconeblandinger som micropost materiale giver mulighed for at tilføje nanopartikler i blandingen. For eksempel tilføje kobolt nano-stænger giver en magnetisk aktivering af micropost og dermed giver en anden grad af frihed til potentielle forsøgsdesign. ¹⁴ De fleste grupper producere deres micropost arrays på flade stive substrater som dækglas eller inde i en petriskål. Men Mann og medarbejdere for nylig rapporteret en micropost matrix dannet på et strækbart membran. ^15. Dette tillader anvendelsen af celle strækker kræfter til adhærente celler, mens de studerer levende celle subcellulære dynamiske respons i form af celle kontraktilitet.

Den bredt anvendte og mest Estabnedsat fremgangsmåde til fremstilling micropost arrays er baseret på blødt litografi som beskrevet i de indsigtsfulde protokoller Sniadecki og kolleger. ^16-18 i korte standard renrum fremgangsmåder anvendes til at generere de mikrostrukturer oven på en siliciumskive ved anvendelse af SU8 fotoresist. Dette efterfølges af en kopiering hvor silicone-gummi er støbt i de strukturer, overføre dem i forme. I et andet trin disse forme anvendes til at gengive den oprindelige mikrostruktur under anvendelse af siliconegummi på toppen af ​​en valgt substrat. Men på trods af den store og voksende antal publikationer i forbindelse med deres ansøgning, om oprettelse af en fremstillingsproces for microposts tager megen tid, selv for mikro-engineering eksperter; der er mange procestrin, der kræver optimering og tilpasning til den specifikke lab miljø og micropost layout til at give et acceptabelt kvalitetsniveau.

Kommercielle micropost arrays er nu tilgængelige i en færdig to-brug ("off-the-shelf") format med en ensartet høj kvalitet. Som sådan er de et alternativ til den komplekse og langvarige fremstillingsproces der kræves til produktion på stedet. I dette papir en kommercielt tilgængelig micropost matrix blev anvendt til kortlægning cellulære kræfter ved hjælp af en enkelt lysfeltsbillede mikroskopi billede. Endnu vigtigere denne artikel beskriver og dokumenterer en fuldt funktionel open source-software ved navn MechProfiler, som kan hentes som supplerende materiale til dette manuskript. En aktivt vedligeholdt version af softwaren kan også findes på http://www.orthobiomech.ethz.ch.

Kombinationen af ​​en "off-the-shelf" assay og et kompatibelt open source analyse software sænker markant posten hurdle for at opnå nøjagtige TFM eksperimenter. Forskere uden adgang til enten rene rum faciliteter eller softwareudvikling ekspertise kan analysere cellulære kræfter med succes. Det gør det muligt for en bruger at fokusere på de mechanosensitivity assay output snarere end selve teknologien, og gør trækkraft målinger til rådighed for et bredere samfund. Desuden er dette er et vigtigt skridt til at bane vejen for fuldautomatisk screening af micropost arrays.

Den MechProfiler analyse software behandler billeder i filformatet tiff, png, bmp og jpg. Billederne kan tages ved hjælp af fluorescens, fasekontrast eller lysfeltsbillede lysmikroskopi. Den enkeltstående program løber sammen med den frie Matlab Compiler Runtime (findes på: figur 12) og underliggende algoritmer giver mulighed for strømlinet billedbehandling, der giver brugeren mulighed for at behandle billeder med enkelte eller flere celler i omkring 1 min. Endvidere kan disse celler enten levende eller "faste".

Den MechProfiler software er i stand til i høj grad at øge dataanalyse gennemløb ved at stole på reproducerbarhed af kvalitet kommerciel micropost arrays, mere specifikt, standard & #8220, ikke-afbøjet "position for hver stilling i array kan formodes mod en ideel gitter (fremstillingsvariationer til nettet i arrays anvendes til denne undersøgelse var mindre end 100 nm).

Kort sagt man åbner et udvalg af billedfiler til analyse, beskærer dem til regionen af ​​interesse, definerer stillinger omfattet af celler, eller som har brug for at blive kasseret, bestemmer indlæg positioner, beregner omlægninger / kræfter mod den ideelle nettet, og endelig gemmer alle celle-specifikke data med mulighed for eksport, herunder til en standard kontor regneark.

Protocol

1. dyrkning af celler på Micropost Arrays

Bemærk: Alle trin skal udføres i et biosikkerhed kabinet for at sikre sterilitet. De her givne mængder er for T25 celledyrkningskolber. Celledyrkningsmediet opskrift og cellepodning densitet er optimeret til knoglekræft cellelinier HuO9 og M132.

1. Forbered en cellekultur til såning på et micropost array.
   1. Inspicere cellekultur kvalitet ved at placere kulturen kolben på en standard lysmikroskop. Sikre, at cellerne viser en typisk vækst og morfologi ved at estimere, hvor meget af dyrkningskolben bunden er dækket. En dækning på 70% -80% afspejler en sund vækst. Vær opmærksom på mængden af ​​flydende celler som de repræsenterer døde celler og / eller en forvokset kultur.
   2. Trypsinisér cellerne ved at fjerne mediet og vask med 4 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS) buffer. Tilføj 0,8 ml 1x trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og inkuberes ved stuetemperatur, indtil cellens høste, som tager ca. 2-4 min. Tjek processen med mikroskopet og lejlighedsvis trykke kolben forsigtigt for at understøtte løsner.
   3. Tilsæt 5 ml celledyrkningsmedium (Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) / F12 med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptavidin (Pen / Strep)) for at stoppe reaktionen, og at vaske restceller der stadig sidde på kolbens bund. Derefter afpipetteres denne suspension op og ned flere gange for at opnå en homogen blanding. Sørg for at pipettere alle løsninger på tværs den oprindelige vækstområde af kolben for at få en effektiv løsner.
   4. Overfør cellesuspensionen på en 15 ml rør og centrifugeres den ved hjælp af en bordcentrifuge ved 0,5 xg i 3 min.
   5. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml medium ved pipettering op og ned 5 gange. Sørg for at undgå dannelsen af ​​bobler, mens du gør det.
   6. Bestem celletæthed ved hjælp af en celletælling kammer og en let microscope. Kontroller cellesuspensionen i celletælling kammer til celleaggregater og sikrer kun at have enkelte celler til efterfølgende forsøg. Pipette igen op og ned flere gange, hvis cellerne har tendens til at danne aggregater til at adskille dem.
   7. Cellesuspensionen med tilstrækkelig medium Fortynd at få en celle opløsning af 25.000 celler / ml. Bland det godt ved at vende det lukkede rør flere gange.
2. Forbered en micropost array til celle såning.
   Kritisk Bemærk: Du må ikke pipette på micropost vifte direkte som denne potentielt kunne skade microposts, især når der indføres uønskede bobler. Desuden skal du sørge for, at micropost vifte aldrig tørrer ud som forekommende kapillarkræfter fører til kollaps af microposts.
   1. Placer glassubstratet med micropost matrix står i en brønd på en plade med 12 brønde ved anvendelse af en pincet og våde det ved tilsætning af 1 ml ethanol (99%). Inkuber ved stuetemperatur i 20-30 sek.
   2. Ethanolen fortyndestrinvis ved at tilsætte ca. 1 ml sterilt deioniseret vand (DI vand) på brønden side og udsugning af ca. 1 ml under anvendelse af en overførsel pipette eller aspiration enhed. Gentag dette trin mindst 3 gange.
   3. Erstatte DI-vand med PBS-puffer på samme måde ved at tilføje og udsugning af tilnærmelsesvis 1 ml. Gentag dette trin 3 gange.
   4. Erstatte PBS-puffer med medium ved tilsætning og udsugning af tilnærmelsesvis 1 ml medium. Gentag dette trin 3 gange.
3. Pipette 1 ml celle-opløsning (25.000 celler) på toppen af ​​hver forberedt micropost array. Tæt multi-brønds plade og overføre den til en inkubator (CO ₂ 5%, 37 ° C). Lad cellerne klæber og vokse på toppen af ​​microposts for 6 -7 timer.
4. Undersøg vedhæftning processen lejlighedsvis ved hjælp af en lys et mikroskop. Kontroller, at de fleste af cellerne synes spredt ud over flere microposts.

2. Fastsættelse & farvning af celler

Bemærk: Alle trin ogmængder givet her, er for en enkelt brønd i en plade med 12 brønde. Det anbefales at behandle højst fire af de tolv brønde ad gangen for at undgå udtørring af brøndene efter opsugning af væsker, hvilket vil resultere i et sammenbrud af microposts.

1. Aspirer medium fra brønden og vaske cellerne 2 gange med 1 ml PBS-buffer. Sørg for at anvende en blid kraft mens vask med PBS for at fjerne cellerester, der akkumuleret på micropost vifte under inkubation og at løsrive døde celler.
2. Fikseres cellerne med 0,5 ml 3,7% pufret formaldehydopløsning i 5 minutter.
3. Erstatte formaldehydopløsning ved vask af micropost array-2x med 1 ml sterilt destilleret vand.
4. Farv cellerne med farvestof (0,05% Coomassie Brilliant Blue i 50% vand, 40% ethanol og 10% eddikesyre) i ca. 90 sek. Vask overskydende farvningsopløsning off 2x med 1 ml sterilt destilleret vand. Tilsæt 1 ml DI-vand at micropost array.
5. Check farvning resultat med et lysmikroskop. Gentag than farvning trin, hvis celle krop er for svag til at blive visualiseret.
6. Store micropost arrays med de farvede celler på toppen i køleskab ved 4 ° C. Sørg for at holde dem under vand på alle tidspunkter.

3. Cell Imaging

Bemærk: Trin 4 gælder kun for mikroskoper uden uendeligt korrigeret optik.

1. Tilsæt 2 ml DI-vand til en petriskål med en tynd glasbund for høj opløsning billeddannelse.
2. Overfør micropost array ved hjælp en pincet til billedbehandling fad med microposts opad.
3. Placer imaging petriskål på en bevægelig fase af et lysmikroskop.
4. Drej kompensation ring af linsen anvendes til billeddannelse indtil tallet på skalaen repræsenterer den samlede tykkelse af alle materialer langs den optiske bane for at kompensere for den manglende overensstemmelse i brydningsindekser af glassubstratet, silikoneelastomeren og væske på toppen. Dette bør føre til et lyst udseende af micropostskerner.
5. Luk iris på belysningen nedad til 50% og fjern eventuelle fase kontrast ringe fra den optiske bane muliggør en almindelig lyse-field-tilstand.
6. Juster micropost vifte at microposts danner en vandret linie gennem observation marken. Definer et startpunkt (f.eks øverst til venstre) og flyt petriskålen trinvis over scenen scanne micropost vifte, mens du tager mange billeder.
7. Tag alle billeder med den højeste indstilling opløsning til kameraet ved hjælp af en 20X eller 40X mål. Målet er at have en enkelt celle i midten af ​​billedet.
8. Fej langs z-aksen gennem underlaget, indtil micropost tip er i fokus. Brug finjustering fokus hjul af mikroskopet, og drej den mod at fokusere på micropost bunden for omkring 2-3 pm.
9. Etablere en standard billedbehandling procedure ved at tage serie af test billeder af en række afsnit fejer gennem de billeddannende parametre en ad gangen (f.eks eksponeringstid,iris indstilling lampe indstillinger osv.) Analyser billeder med MechProfiler og bestemme en egnet parametersæt for en hurtig og pålidelig analyse.

4. billedanalyse med Open Source Software "MechProfiler"

Bemærk: Alle software-funktioner kan aktiveres med et pegeredskab med venstre museknap. Dog vil en uddannet operatør bruge de dokumenterede genvejstaster designet til at være på den venstre halvdel af tastaturet for at muliggøre en effektiv to-hånds billedbehandling.

1. Start billedanalyse software MechProfiler og åbne en række billeder, der skal analyseres, ved at klikke på "Åbn".
2. Sæt alle parametre i afsnittet "Indstillinger" givet af software udvikler. Fastlægge de parametre, der skal brugerdefinerede konfigureret (dvs. kontur tærskel og minimal afstand) i overensstemmelse med procedurerne beskrevet i detaljer af softwaren manual.
3. Analyser billedes én efter én ved at beskære dem til området af interesse ved hjælp af "Crop" (klik og træk med museknappen trykket ned). Dobbeltklik inde trukket rektangel for at afslutte denne handling.
4. Mærkning hver synlige celle skitsere en efter en ved at klikke på "Draw celle skitserer" og bruge trådkorset markøren til tegning herunder alle microposts cellen er knyttet til.
5. Kassér eventuelle uønskede microposts ved at klikke på "Kassér indlæg" og bruge trådkorset markøren til at tegne. Vedlægge alle microposts, der hører til en celle uden for billedsektionen eller afbøjes af en anden grund, men ikke af cellen af ​​interesse.
6. Start softwaren subrutine "Find centroids" af museklik. Juster filteret indstilling lige ved siden af ​​"Find centroids" knappen, indtil alle microposts registreres, som er synlig med et rødt kryds i deres center. Hvis filteret indstillingen er for lav microposts vil blive ignoreret, hvis den er for høj multiple positioner vil blive markeret for en enkelt micropost. Hold filterindstilling konstant under en analyse session.
7. Brug den manuelle redigering funktionen "Manuel Edit" for centroids med flere eller ubesvarede micropost positioner. Brug musen trådkorset til at vælge det micropost pågældende ved at klikke og trække det på tværs. Dobbeltklik inde i rektanglet og placere den manglende røde markør i det forstørrede billede sektion, der automatisk lukker. Kassér sådan micropost, hvis det er uden for den trukket celle omrids (se trin 4.5), inden du fortsætter.
8. Find den ideelle micropost gitteret ved at aktivere "Generer Grid" funktion med et museklik. Sørg positionen svarer til den sande micropost hovedet, vist med en blå ring, inden i tegnet celle omrids.
9. Ret eventuelle malplacerede gitter maker inde i cellen, hvor behov ved hjælp af den tilsvarende "Manuel Edit" funktion med et museklik. Brug trådkorset til at vælge det micropost i qupågældende udstyr ved at klikke og trække det på tværs. Dobbeltklik inde i vises rektangel og placere den manglende blå markør i det forstørrede billede sektion, der automatisk lukker.
10. Brug knappen "Beregn Nedbøjninger" ved klik med musen for at få et histogram af de beregnede afbøjning værdier baseret på forskellen mellem en micropost position inde billedet afsnittet, og den genererede ideelle nettet.
11. Gem komplet analyse, herunder tabellerne i værdier med et museklik på "Gem".
12. Fortsæt billedanalyse enten ved at klikke på "Reset View" og analysere et andet billede sektion eller museklik på "Næste billede", som bekvemt kan gøres ved hjælp af rigtige tastatur curser tast.

5. Dataanalyse - Mechanoprofiling

1. Åbn filen "results.xls" med et kontor regnearksprogram fra mappen med de analyserede billeder. Den indeholder data med all beregnede værdier, herunder alle micropost omlægninger og standard afledte foranstaltninger såsom arbejde (dvs. substrat deformationsenergien) ved analyserede celle.

Representative Results

Den største fordel ved den beskrevne teknik ligger i dens enkelhed og potentiale for hurtig og effektiv integration i rutinemæssig lab arbejde. Kombinationen af høj kvalitet kommercielle sensor arrays parret med open source-software indeholder oplysninger om mekanisk-følsomhed, der ellers ville kræver adgang til renrumsfaciliteter og dybdegående kendskab til billedanalyse og softwareudvikling. Figur 1 illustrerer arbejdsgangen i den præsenterede metode. Det starter med at forberede og såning celler på micropost array. Efter fiksering og farvning af cellerne de micropost arrays er klar til billeddannelse. Den centrale del af teknikken er billedanalyse under anvendelse af MechProfiler software. En bruger kan starte analyszng billeder umiddelbart efter indtastning alle relevante parametre i "Indstillinger" i GUI. Den tilsvarende pixel størrelse er den længde, der er repræsenteret ved en enkelt pixel og afhænger af brugerens opsætning. Det har brug forskal etableres separat for hver anvendt forstørrelse ved at tage billeder af objekter med kendt størrelse. Et eksempel er givet i den supplerende figur 9.

Billedkvaliteten er en nøglefaktor, da det har stor indflydelse analyseprocessen. For at opnå den højeste kvalitet bør man sørge for at have en stabil og rutinemæssigt serviceret imaging platform som vist i figur 2. I særdeleshed tilpasningen af lyskilden er vigtigt, da forkert justering vil forårsage uønskede skygger, der kan være problematisk, når man analyserer billeder. Endvidere placere lysmikroskop oven på en anti-vibration bord eller plade er gavnligt i de fleste laboratorier, da det giver yderligere stabilitet under billedbehandling.

Fordelene ved at bruge en tynd glasbund petriskål til billeddannelse omfatter højere effektive numeriske blændeværdier, der oversætter til lysere billeder med øget opløsning.

Når taking billederne i lyse-felt funktion anbefales en 50% lukkede iris, som fokuserer på de microposts tip lettes på grund af de omkredse optræder som en sprød mørk ring. Desuden, i tilfælde af det anvendte mål har en kompensation ring, er det vigtigt at indstille den korrekt til opnå nøjagtige aflæsninger kraft. Virkningen af denne funktion kan ses ved at sammenligne Figur 3A og 3B. Billeder, der hurtigt kan analyseres opnås ved at kombinere den korrekte indstilling af kompensationen ring sammen med optimal belysning, som vist i figur 3C. Stærk kontrast mellem en micropost og dens omgivende reducerer analysetiden som det fremskynder den søgende algoritme. Brugerne vil finde, at kun minimal erfaring er nødvendig for at opnå billeder, der kan analyseres med lethed.

Vigtigt er det, protokollerne ovenfor overvinde en kritisk og fælles hindring for hurtig og effektiv integration af micropost arrays i rutinelab arbejde. Denne hindring stammer fra behovet for at kontrollere vifte kvalitet - en efterspørgsel, der kun kan opfyldes gennem en grundig og detaljeret eksperimentel karakterisering af sensorens reproducerbarhed, følsomhed og præcision. Men ved at dreje til kommercielt tilgængelige micropost arrays denne betydelige hurdle er helt undgås. 4A og 4B illustrerer nøjagtigheden af en sådan micropost array. Afvigelsen af ​​microposts position er godt i 200 nm og som sådan kan sammenlignes med en "pixel fejl", der følger med kameraet / objektiv kombination, der resulterede i en pixel størrelse på 82 nm for den anvendte opsætning. Analysen af billeder med celler afbøje microposts viser, at værdierne for en celle pålagt deformation er væsentligt højere end 200 nm (som vist i figur 4C og 4D), der fører til en komfortabel signal støjforhold.

Figur 5 illustrates de forskellige typer af kampe for microposts i et billede afhængigt af, om den er afbøjet eller ej. Som nævnt ovenfor ikke-afbøjet microposts har en lys cirkulært udseende med en mørk ring omkring dem. Deres position kan bestemmes ved hjælp af en Hough transformation, som er en feature extraction teknik til digital billedanalyse.

Det viser endvidere, at afrettet microposts på et omvendt mikroskop viser to vender mørke halvmåneformede former (se figur 5A). I en opretstående mikroskop kanten af ​​micropost spids og en mørk halvmåne form er korrekt synlige mens den anden bliver svært at opdage. Disse egenskaber er grundlaget for beregning af positioner af lyse felt mikroskop billeder af tips fra afbøjes microposts, som er blevet udviklet til denne protokol, og blev udnævnt til "Kontur tilkørsel".

Figur 5B er et eksempel på en HuO9 knoglekræftcelle microposts afbildes på et inverteret mikroskop (øverst). Det analyserede version af billedet viser resultaterne fra den påførte kontur tilgang (nederst). Figur 5C blev taget under anvendelse af samme micropost array med en opretstående mikroskop (øverst). Igen den analyserede udgave viser resultaterne fra anvendelse af konturen tilgang.

Hver billedanalyse session starter med en bruger verifikation af parametrene i "Indstillinger" i MechProfiler. Nogle er givet af micropost producent som micropost array-dimensioner og fjederkonstant. Andre er defineret af brugeren, såsom værdierne for tærsklen kontur og en minimal nedbøjning tærskel i henhold til procedurer, der er beskrevet i softwaren manual. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, bør vælges disse værdier omhyggeligt og skal være konstant for alle billeder i en indbyrdes sæt billeder at sikre sammenlignelighed. Hvorimod de præ-behandlingstrin for billedet analysis, ligesom beskæring, er selvforklarende de underliggende strategier for software funktioner som "Finding centroids", "Generer Grid" og "Kontur tilkørsel" brug for mere detaljerede forklaringer.

Algoritmisk påvisning af misligholdelse micropost stilling (som leveret af producenten) begynder ved at bruge "Finde centroids" software funktion. Algoritmen starter i øverste venstre hjørne af et billede, der søger efter den første micropost. Efterfølgende alle andre microposts findes baseret på koordinaterne for den første micropost plus værdierne for størrelsen nettet og micropost angives af fabrikanten efter sekskantet geometri. Det geometriske tyngdepunkt for hver fundet micropost beregnes ved hjælp af en Hough transformation. Filteret skyderen ved siden af ​​kommandoen knap på GUI tillader justering af følsomheden af ​​denne transformation. Alle fundne microposts er markeret med et rødt kryds og deres positioner kendt for subsequent processer.

Dernæst funktionen "Generer Grid" fører til koordinaterne for alle microposts tips. De er resultatet fra en multi-trins proces. Først en optimering funktion er løst, herunder de første positioner fra den tidligere henrettet "Find centroids" algoritme til at etablere den ideelle nettet. Andet positionerne af microposts inde i cellen område beregnes. Microposts med mindre afbøjning end defineret i indstillingen parameteren "Minimum afbøjning tærskel" i forhold til den ideelle gitter bearbejdes med en Hugh transformation. Alle andre micropost tip positioner beregnes ved hjælp af den ovenfor beskrevne kontur tilgang til afbøjet microposts. Her softwaren begynder at søge fra den indledende tyngdepunkt væk fra cellen center for en cirkulær kant (lys til mørk) inden for en vinkel på 15 ° (se figur 5A). Når denne kant er fundet en cirkel med den givne micropost diameter er monteret på that kanten med konturen tærskelværdien fra indstillingerne i GUI. Denne parameter bestemmer, hvilke pixel gråværdi anvendes til tilpasningsprocessen. Jo højere denne værdi er den mere montering læner mod lysere micropost centret den nederste, der sætter pris på mere det passer, at cirklen til mørkere micropost omrids. Når valgt, at værdien skal være konstant for alle billedet analyser inden for en given undersøgelse for at undgå at tilføje kunstig afbøjning eller ringer udbøjninger for konservativt.

For eksempel, figur 6 illustrerer vigtigheden af at beslutte sig for en passende kontur tærskelværdi. Softwaren tillader brugeren at vælge en lang række (0,1 til 0,9) til at omfatte alle mulige belysning fysisk situationer. Oversættelsen af optisk information til nedbøjning hedsafstande for begge ekstremer og en mere praktisk værdi i midten er angivet i figur 6B. Men trænede brugere af software ofte lav spe til meget lignende kontur tærskelværdier, der fører til sammenlignelige resultater som det kan ses i figur 6C. Desuden ved hjælp af standardiserede procedurer for cellefarvning og billedbehandling minimerer risikoen for ugyldige kontur tærskelværdier, som generelt bør forblive konstant inden for indbyrdes forbundne sæt af billeder.

For at demonstrere robustheden af metoden er opsummeret et udvalg af mekanisk-profilering resultater i figur 7. I figur 7A to resultater fra knogle kræftceller HuO9 og to fra M132 sammenlignes. Alle fire arrays er fra samme parti, og derfor har identiske mekaniske egenskaber. Analysen blev udført med et fast sæt af parametre for minimal deformation (0,25 um), og at tærsklen kontur (0,125). Desuden blev to identiske sæt af billeder fra SaOS 2 knoglekræft givet til to analytikere uden yderligere oplysninger om parameterindstillinger (se figur 7B). Indflydelsen af ​​farvningen på analysen blev testet ved at tage billeder af knoglekræft celler farvet med Coomassie Blue R. Efterfølgende farvestoffet blev fjernet. Efter re-farvning med Coomassie Blue G et andet sæt af billeder blev taget. Figur 7C illustrerer resultaterne fra begge serier, som blev analyseret ved den samme bruger med identiske værdier for den minimale deformation (0,25 um) og tærsklen kontur (0,25) .

Et typisk eksempel på anvendt mekanisk-profilering er præsenteret i figur 8A, hvor kompileret data præsenteres for knoglekræft cellelinjer HuO9 og M132 efter at have analyseret 151 celler puljede fra hver af fire arrays. I denne oversigt alle indikatorværdier er højere for HuO9 end for M132 allerede indikerer, at HuO9 celler anvende mere kraft end M132. , Data fra billedanalysen indeholder imidlertid en stor mængde yderligere oplysninger single-celle, der kan udvindes til bedre at forstå phenotypic cellelinie adfærd og celle-til-celle variation inden for en given linje. Ved at præsentere resultaterne for den kraft pr micropost i en kasse plot finder man, at på trods af lignende minima og maksima er dataværdier forskelligt fordelt og faktisk lave metastatisk cellelinie HuO9 celler tendens til at anvende mere kraft end den yderst metastatiske M132 linie (se figur 8B). Endvidere ved at kategorisere kraftværdierne i forhold til celleområdet finder man, at den gennemsnitlige kraft per celle ikke kun er forhøjet til HuO9 celler sammenlignet med M132, men også, at den gennemsnitlige kraft pr micropost stiger, cellerne spredes, indtil gennemsnitlige kraft pr post-strækninger en mere stabil værdi (som det kan ses i figur 8C). Desuden for celler dækker syv microposts værdierne er næsten identiske, hvilket sandsynligvis skyldes det faktum, at de typisk forekommer i sekskantet form med en central ikke-afbøjet micropost uafhængigt af deres cellelinie. Bortset fra differences i kontraktilitet, kan morfologiske forskelle kvantificeres med interessant resultat. For eksempel i modsætning til de meget metastatiske celler M132 der var meget få HuO9 celler, der dækkede kun tre microposts. Kan der foretages andre morfologiske sammenligninger mellem cellelinierne, herunder fordelingen af celleområde repræsenteret ved antallet af microposts dækket. Figur 8D viser, at de to cellelinier adskiller sig også i dynamisk spredning adfærd, når de vokser oven på microposts. Kort sagt, mechanoprofile for parental cellelinje HuO9 afslører, at de typisk dækker mere areal og anvende lidt mere kraft til at microposts hvorimod metastatisk cellelinie M132, en aggressiv celle, der stammer fra HuO9, karakteristisk dækker færre microposts og anvender mindre kraft pr micropost . Disse resultater viser potentialet i en TFM tilgang til diskriminerende applikationer.

Figur 1. Eksperiment Workflow. (A) Den overordnede procedure indeholder fem på hinanden følgende store skridt fra såning celler på en micropost array til profilering deres mekaniske egenskaber. (B) Billedet analyse udføres med den beskrevne MechProfiler softwaren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Billedbehandling Opsætning. Er en standard inverteret mikroskop bruges til billeddannelse af cellerne på micropost arrays. Opsætningen indeholder også et mikroskop kamera og dets controller, som også kan give datalagring funktioner. Den store skærm er vist, er ikke afgørende, men alligevel er bekvemt for udvidet billedbehandlingsessioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Guideline for micropost billeddannelse. (A) Billede af farvede celler på en micropost vifte taget med et 40X linse i lyse-field-tilstand. Ikke-afbøjes microposts vises som mørke ringe, når afbildet. Afrettet indlæg antager en elliptisk form med både mørkere og lysere sub regioner. Farvede celler, der dækker microposts gør dem synes endnu mørkere til det punkt, at der ikke er kontrasten mellem micropost og celle. (B) Identiske billeder taget efter justering af linsen kompensation ring og re-fokusering. Her kernerne af microposts bliver væsentligt lysere og giver mere kontrast. (C) den samme position afbildet igen efter adjusTing alle belysning parametre med kameraet controller. De frit stående microposts vises som lyse cirkler med en mørk ring. Afrettet microposts viser en tydelig halvmåne "skygge" omkring bugt kerne langs trække akse. Klik her for at se en større version af dette tal.>

Figur 4. MechProfiler skærmbilleder af analyserede microposts. (A) Et typisk eksempel på en tom micropost array kan ses i dette skærmbillede. De microposts er anbragt i en konstant sekskantet mønster. (B) Histogrammet med nedbøjninger for disse microposts viser, at alle værdier er under 200 nm. (C) Typisk eksempel på en HuO9 knoglekræft celle dækkerog trække på flere microposts. Det kan ses, at mængden af ​​trække er heterogent. (D) Histogrammet med deformation værdier for HuO9 celle viser det brede spektrum af udbøjninger, der opstår fra cellernes interaktion med micropost substrat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Micropost optrædener i lysfeltbelysning og strategier for beregning deres position i et billede. (A) ikke-afbøjet microposts fremstår som et lyst cirkulært område med en mørk ydre ring. Centroid beregnes ved en Hough transformation. Afbøjet microposts viser mørke halvmåneformede figurer. Afhængig af mikroskop setup hvis microposts står over ligh t kilde (fx omvendt mikroskop) er der to godt synlige halvmåneformede figurer. Hvis microposts står linsen (f.eks opretstående mikroskop) kun den ene halvdel Månen er godt synlige, men også selve kanten af spidsen. I begge tilfælde bør der anvendes konturen tilgang til at beregne micropost spids. (B) Et originalbillede (top) ved anvendelse af et omvendt mikroskop fra en HuO9 knoglekræft cellen og dens analyseret version (bund) ved hjælp af konturen tilgang. (C) Original billede fra den samme micropost array (top) ved anvendelse af en opretstående mikroskop og den analyserede udgave, igen anvender konturen tilgang (nederst), men med en meget lavere kontur tærskelværdi mere egnet til at kalde den mørke ringformede kant. Zoom klik her for at se en større version af dette tal.

upload / 53350 / 53350fig6.jpg "/>
Figur 6. Kontur tilkørsel og vælge den relevante tærskelværdi. (A) De tre skærmbilleder illustrerer de samme analyserede microposts hjælp af tre forskellige kontur tærskelværdier. Hvis værdien er indstillet enten for lav (venstre) eller for høj (højre) end software passer den blå ring, der repræsenterer micropost hovedet forkert. Det undervurderer eller skyder den virkelige position af micropost hovedet. En korrekt valgt tærskelværdi gør det muligt for software til at passe, at blå ring til den halvmåneformede mørke område inde i micropost der danner gennem afbøjning. (B) Grafen viser den gennemsnitlige mængde afbøjning afhængig af den valgte kontur tærsklen for de microposts vist i ovenstående. Det illustrerer også, at værdierne for microposts uden for cellen oversigten er påvirket, da konturen montering ikke anvendes der. (C) Grafen illustrerer, at valgeten tærskelværdi inden for et moderat interval minimalizes risikoen for over- eller undervurderer micropost omlægninger. Forskellen mellem de valgt af forskellige trænede brugere værdier normalt er mindre end 0,05, hvilket resulterer i acceptable forskelle i de gennemsnitlige nedbøjning værdier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7. Robusthed test for mekanisk-profil resultater fra forskellige knoglekræft cellelinier; fejlsøjlerne repræsenterer en standardafvigelse (A) mekanisk-profilering resultater fra fire identiske micropost arrays efter podning HuO9 celler på arrayet 1 og M132 på arrayet 3 -. fire dage senere såning HuO9 på arrayet 2 og M132 på arrayet 4. (B) Sammenligning af resultater fra mechano-profilering baseret på identiske sæt af billeder efter analyse af to uafhængige analytikere. (C) Sammenligning af billedet analyseresultater fra to forskellige billedserier første taget efter farvning med Coomassie Blue R og det andet efter fuldstændig fjernelse af farvestof og re-farvning med Coomassie Blå G. Klik her for at se en større version af dette tal .>

Figur 8. mekanisk-profilering af knogle kræft cellelinjer. (A) Sammenligningen mellem de to knoglekræft cellelinjer HuO9 (lav metastatisk potentiale) og M132 (stærkt metastatisk) graf viser, at alle indikatorværdier er højere for HuO9 cellelinje ( total N = 302; to uafhængige sæt af eksperimenter, fejl bar = standardafvigelse). (B Trong>) Boksen plot illustrerer, at de anvendte kræfter pr micropost er i den nederste nano-Newton rækkevidde. Men HuO9 celler trække mere end M132 celler (Whiskers repræsenterer mindst de data og maksimum). (C) Et lignende resultat kan ses ved at sammenligne celler, der dækker det samme antal microposts. HuO9 celle anvende mere kraft end M132 celler. Antallet af HuO9 celler, der dækker tre microposts ikke er repræsentativ, og kun medtaget for fuldstændighedens (fejl bar = standardafvigelse). (D) De forskellige distributioner tværs antallet af omfattede microposts viser, at hver knoglekræft cellelinje har sin egen sprede karakteristiske når interagere med micropost arrays. Klik her for at se en større version af dette tal.

ppfig9.jpg "/>
Supplerende Figur 9. Pixelstørrelsen for et mikroskop setup bestemmes typisk ved hjælp af en særlig objektglas med en skala bar på den; alternativt micropost vifte layout, givet af producenten, kan anvendes. For eksempel, 15 enheder med 13 mikrometer (195 um samlet længde) divideret med 2.375 pixels (oprettet med en billedbehandling værktøj) fører til 0,082 um / pxl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Figur 10. Sammenligning af billeder af en HuO9 knoglekræft celle taget fra samme position ved hjælp af to belysning teknikker på et omvendt mikroskop; DIO farves microposts er grønne fluorescerende. (A lyse-field-tilstand. (B) Analyseret jeg Mage taget efter skift til den grønne fluorescens kanal uden fokusering.   (C) Anden fluorescens billede efter korrektion af fokusering på de meget micropost tips. (D) overlejring af begge belysnings kanaler for illustrative formål alene.   (E) mekanisk-profilering indikatorer resultater fra de tre billeder. Trods korrigere fokus den fulde afbøjning kan ikke estimeres ud fra fluorescensbilleder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Figur 11. Billede sekvens af den samme stilling fluorescens farvede microposts ved hjælp DiI på en opretstående mikroskop (A) lysfeltbillede.; der er tre microposts rører hinanden på spidsen. (B) Samme position efter skift til den fluorescerende kanal lidt over microposts hoveder. (C) Sænkning brændplanet til den meget spids af microposts. (DE) Konsekutive billeder efter yderligere sænkning brændplanet trinvis mod microposts 'bund. (F) Billede af microposts efter sænkning brændplanet inde i silikone elastomer substrat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Figur 12. Skærmbillede af MechProfiler GUI. Typisk analyseresultat fra profilering af en HuO9 knoglekræft celle. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette arbejde tilstræber at fremme inden for trækkraft mikroskopi ved væsentligt at sænke tekniske og praktiske adgangsbarrierer. Disse hindringer kommer fra to sider. Først og fremmest er de mange ikke-trivielle tekniske udfordringer, der skal overvindes for at reproducerbart fremstille og eksperimentelt bestille en micropost array. For det andet, er tilsvarende ikke-triviel behov for en pålidelig semi-automatiseret analyse af encellede kræfter - holde sig for øje, at et typisk forsøg kan kræve analysen af ​​hundreder eller endog tusinder af celler. De ovenfor beskrevne teknikker blev udviklet for at gøre micropost baseret trækkraft mikroskopi tilgængelige inden celle biologiske laboratorier, der ikke har bopæl ingeniør ekspertise. Sensorerne og analyseteknikker præsenteret i denne artikel bør give ikke-eksperter til let og præcist analysere de påvirkninger fra enkelte celler.

Udover adgang til en celle biologi lAB med mindst en mid-grade lyse-felt mikroskop, de beskrevne metoder kræver nogle yderligere tekniske elementer. Her fleste brugere kan udføre gyldige trækkraft mikroskopi eksperimenter med endnu begrænsede erfaringer, på trods af magt og alsidighed af teknikken. Ikke desto mindre er der tre kritiske aspekter i den præsenterede protokol, der skal overvejes. Først er det nødvendigt at sikre, at de micropost arrays altid er dækket med væske for at undgå, at deres sammenbrud på grund af kapillære kræfter. Anden er man nødt til at optimere imaging parametre for erhvervede micropost billeder, hvilket gøres bedst ved at tage serier af billeder af samme array stilling, mens varierende eksponeringstid, iris blænde, og kompensation ring stilling. Det er vigtigt at finde den korrekte brændplanet for micropost tip, og dette aspekt tager nogle erfaringer betragtning af den lille dimensionel dybde sensorarrangementerne. Tredje skal downloade åbent tilgængelige billedanalyse software MechProfiler discussed her, hvor der en detaljeret brugermanual og uddannelse eksempler findes på downloadsiden. Efter nogen erfaring med at bruge softwaren til at analysere eksempler med manualen, skal brugeren tage test billeder på den billeddannende opsætning, der skal bruges for at konfigurere egnede mikroskop indstillinger. Baseret på de opnåede billeder, hvis konturen tærskelværdien på lignende måde optimeres. En enkelt micropost billede kan analyseres af en uddannet bruger inden for et minut ved hjælp af open source MechProfiler software uanset om den indeholder en eller flere celler, således at dannelsen af ​​statistisk relevante resultater (analyse af flere hundrede celler) inden for et par timer .

Et andet aspekt, der kræver nogle tuning er optimering af eventuelt anvendt cellefarvning procedure. Når celler alt for farves softwaren kan undlade at registrere de korrekte micropost positioner. På den anden side, hvis farvningen er for svag det kræver en større indsats af brugeren for at detektere en"Sande" celle skitse som tynde celle fremspring kan blive savnet.

Men ved at anvende en fast protokol af cellefarvning og array imagografiproceduren intervallet for denne fejl bliver acceptabelt lavt. Under dette arbejde forskellige cellefarvningsprocedurer procedurer blev testet, baseret på forskellige koncentrationer af krystalviolet, tilstedeværelsen af ​​overfladeaktive stoffer som Tween 20 eller Triton-X, eller en kombination af farvestoffer ved tilsætning eosin. Ikke desto mindre, til intensiteten af ​​farvningen samt dets stabilitet varierede betydeligt fra forsøg eksperimentere. Kun anvendelsen af ​​Brilliant Blue G som beskrevet ovenfor viste en acceptabel cellefarvning robusthed kombineret med tilstrækkelig intensitet til stadig se den tynde celle omrids, men uden at interferere med den udviklede kontur tilgang.

Generelt, er der muligheder for at ændre den præsenterede teknik. For eksempel ved at kombinere de lyse-field teknikker præsenteres her med fluorescens mikroskopi farvning organellerligesom kernen eller actin filamenter netværk, som kan give yderligere oplysninger om de underliggende celle processer i forbindelse med celle mekanik. Endvidere benyttes langkædede dialkyl carboxycyanines (DII eller DIO) de microposts bliver fluorescerende. ¹⁴ Ikke desto mindre er det vigtigt at styre hver afvigelse fra den præsenterede teknik. De supplerende figur 10 og figur 11 illustrerer potentielle faldgruber. Billeder taget af en Coomassie Blå G farvet NIH 3T3 fibroblast celle i grøn fluorescens kanal (figur 10B og 10C) ved hjælp af omvendt mikroskop præsentere de vigtigste micropost organer, men ikke deres tip, der fører til en defekt position analyse (figur 10E). På trods af den bedste for at koncentrere efter skift fra lysfeltsbillede tilstand (figur 10a) micropost tips ikke kan afbildes, hvilket kan skyldes absorption af fluorescenssignalet ved cellefarvende. Dette er i modsætning til imaGES taget med gul fluorescens kanal af en opretstående mikroskop (Figur 11B-11F), hvori flere skarpe billeder kan være få langs z-aksen. Her skal brugeren sikre, at billedet er taget med brændplanet i det spidsen (Figur 11C), og ikke et sted tættere på micropost bunden for at undgå at kalde defekte nedbøjning værdier.

Det skal bemærkes, at der også er tekniske begrænsninger for micropost assays. For eksempel afhænger nøjagtigheden af ​​en detekteret udslag på kvaliteten af ​​den optiske opstilling. Mikroskoper er ofte optimeret til fluorescensimagografi hvor lysfølsomhed det tilsluttede kamera har en højere prioritet end et stort antal pixels. Naturligvis fører dette til billeder med et større pixelstørrelse. Endvidere bør det bemærkes, at lysfeltsbillede billederne ikke kan afgøre, om celle fremspring nå substratet bunden. Imidlertid blev de kommercielle micropost arrays testet ved hjælp af konfokalmikroskopi. Det blev konstateret, at celler synes at acceptere den binære belægning, der fremmer adhæsion kun på micropost tips og ikke for resten af ​​micropost array. En anden faktor, hidrører fra positionsfejl af micropost array, som har vist sig at være 0,2 um. Sammen med den givne fjederkonstanten på 2,8 NN / um dette fører til en fejl i kraft udlæsning på 0,6 NN. En anden hindring for micropost analyser skyldes, at de anvendte styrker fra microposts deles af flere celler ikke kan bestemmes. Derfor kan kun isolerede enkelt-celler analyseres. En specifik begrænsning for den præsenterede protokol stammer fra den korrekte anvendelse af den følsomme kontur tilgang, som kræver en vis mængde træning for brugeren for at få pålidelige resultater. Desuden en hurtigere analyse brugeren skal tage billeder, hvor micropost array er justeret til at danne en vandret eller en lodret linje langs kanten af ​​observation område. Despite, at software algoritme til at finde microposts inden for et sekskantet gitter geometri ikke er begrænset af en rotationsvinkel billeddannelse af microposts mere end 5 ° off-axis gør det vanskeligt at beskære et billede sektion uden indeholdende ufuldstændige microposts, som derefter fører til en mangel ved "Generate Grid" funktionen. I et sådant tilfælde kan brugeren bruge den integrerede rotationsfunktionen før man begynder at analysere micropost positioner.

Den beskrevne metode blev primært anvendt til at karakterisere to knoglekræft cellelinjer, et forældrenes cellelinje ved navn HuO9, og en afledt meget metastatisk line denomineret M132. I denne sammenhæng mere end seks hundrede encellede billeder blev taget i lyse felt mode og analyseres ved hjælp af MechProfiler softwaren. Den efterfølgende data mining afslørede, at den parentale cellelinie HuO9 udøver lidt mere kraft og typisk dækker flere microposts per celle end celler fra metastatisk cellelinie M132. Dog cellerneblev ikke synkroniseret og derfor i forskellige stadier af cellecyklussen på tidspunktet for fiksering, hvilket sandsynligvis bidrog til den brede vifte af resultaterne. Ved at tage levende celle billeder over tidsperioder på op til 24 timer, blev det konstateret, at efter at sprede mange celler forbliver på deres oprindelige position, mens andre vandrer, spredning, afbryde og migrere igen med andre hastigheder (se supplerende videoer). Dette indikerer, at den mekaniske profil i en celle er ofte ikke konstant og kan variere meget på tværs af en cellepopulation eller endda inden for en enkelt celle afhængigt af dens nuværende aktiviteter. En anden medvirkende faktor kunne være, at på en micropost vifte en celle er tvunget til at udføre diskrete migration skridt til at nå et andet micropost, hvilket er i modsætning til klassiske TFM, hvor celler klæbe til plane flader og kan migrere med små skridt. Men for at analysere disse små skridt er det nødvendigt at tage fluorescerende billeder af fokale vedhæftning punkter, der kræver adgang til meget avanceret microscopes og meget omfattende billedanalyse software. Ikke desto mindre, fordelingen af ​​mekaniske profiler inden for større befolkningsgrupper er stadig ofte et iboende træk ved en cellelinie. Således vil en high-throughput metode, som tillader karakterisering af et stort antal celler er afgørende. Den manuelle billeddannende proces og open-access software præsenteres her rummer et stort potentiale for skalering til fuldautomatiske mikroskop-systemer.

Sammenfattende er præsenteret en robust trækkraft mikroskopi tilgang, der er let anvendelig i en standard cellebiologi lab. Hele arbejdsgangen fra cellepodning til billedanalyse er enkel og effektiv. Mens protokollerne der er beskrevet her, er fuldt funktionel, forbedringer i gang for at tilpasse analysealgoritmer at kunne også håndtere micropost arrays med ortogonale layouts og udvikling af procedurer, der forenkler analysen af ​​billedsekvenser fra levende celler. I sammenhæng med resultaterne for knoglekræft celle liNes, kan de metoder der er beskrevet her bruges til at screene celler fra kliniske biopsier for at fastslå, om sådanne assays kan holde prognostisk værdi, så klinikere at forudsige metastatiske potentiale biopsi celler fra knogler kræftpatienter. En sådan analyse ville påvirke de terapeutiske strategier. Andre potentielle anvendelser vedrører testning farmaceutisk aktive forbindelser på mekanisk aktive celler som glatte muskelceller eller cardiomyocytter, potentielt at bistå med oprettelse af et lægemiddels effekt eller toksicitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera