Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53350

Introduction

מבחני מבוססי תאי Mechano רגישים לאפשר לחקירת תאים חסיד, עם מגוון רחב של יישומים המשקפים את התפקיד המרכזי שמכניקה יכולה לשחק בביולוגיה של תא. יישומים אלה לעתים קרובות להתמקד במנגנונים המניעים את תהליכי subcellular או כל תא התנהגות. מצד אחד, גורמים סביבתיים חיצוניים, כגון הרכב נוסף סלולארי מטריצה ​​או מטריצת קשיחות יכולים להשפיע באופן דרמטי את התגובה המכנית וביולוגית של תא. 1 ניתן לראות אותו לאחר שימוש בכיתות רבות של תרכובות פעילים pharmaceutically, את ההשפעות של אשר לעתים קרובות מאופיין באמצעות מודלים תרבית תאים. 2 בנכסים האחרים יד genotypic, כגון אלה הנגרמים על ידי מוטציות גנטיות ספונטניות או מושרה בניסוי, יכול לגרום לשינויים מסומנים בפנוטיפ תא הקשורים לשינויים במבנה שלד התא ותפקודו. 3 דוגמאות אלה רק כמה מן רבים אפשרייםנושאים שphenotyping המכני של תאים הוא רלוונטי, וכל אלה נחקרו מועילים עם מערכי micropost.

בשעת כתיבה זו, כ -200 מאמרים פורסמו מתארים אינטראקציה התא-micropost. עבודות אלה לדון בהיבטים התיאורטיים של עקרונות סטיית micropost כמו גם הוראות מעשיות בייצור שלהם. המאמר הראשון המתאר את האינטראקציה של תאים ומערכי micropost גמישים פורסם על ידי טאן ועמיתים בשנת 2003. 4 בניגוד למיקרוסקופ הקלאסי כוח המתיחה (TFM) שבו מצעים רכים רציפים משמשים לאמידת התכווצות תא nanonewton קנה מידה, טאן et al. תאר שיטה באמצעות קורות אנכיות צפופות מרובות עשויות אלסטומר סיליקון. היתרונות העיקריים של שיטה זו עולים משתי תכונות עיקריות. ראשון כדי לשנות את מצע נוקשות תא-לכאורה צריך רק לשנות את ממדי micropost תוך שמירההרכב המצע אחר קבוע ובכך להימנע מהבדלים בטופולוגיה משטח וכימיה. microposts השני מתנהג כמו מעיינות בודדות שניתן לנתח דיסקרטי עם כוח והחלטות מרחבית על סדר הידבקויות מוקד בודדים ויכול להפחית את האתגרים אנליטיים שטבועים לניתוח דומה על ידי TFM הסטנדרטי.

היום המגוון הרחב של יישומים למערכי micropost עולה בהרבה על רק המיפוי של כוחות לכמה תאים בודדים. לדוגמא, אקיאמה מדווחת על שימוש ברקמת כלי גב מבודד מזחל עש כמפעיל למערך micropost, על מנת לפתח מיקרו-רובוט אוטונומי המונע בשריר חרקים. 5

עם זאת, יישומים שפורסמו רוב microposts התמקדו במחקרים של מצבים רפואיים כמו זיהום או סרטן. לדוגמא, מערכי micropost שימשו ללמוד דור הכוח של פילי סוג IV ארוזים של gonorrh Neisseriaמושבות oea המשויכת למפלי אות שיפור זיהום. 6 אחרים השתמשו microposts ללמוד תאי סרטן השד שטופלו בתרופות תרכובות מיקוד שלד התא. 7

סטייה של micropost מתוארת לעתים קרובות תוך שימוש בתאוריה קלסית קרן לשלוחה עם עומס סוף ההנחה התא מייחס רק לקצה קצו של micropost. כאן F הכוח ליישם שגורם δ סטייה תלוי בk "קשיחות כיפוף" של micropost ומחושב על ידי:

משוואת 1 (1)

עם E, אני, ולהיות L מודולוס של יאנג, רגע תחום אורך אינרציה וקרן בהתאמה. עם זאת, תוצאות ממשוואה זו נותנת קירוב כללי של הכוחות בעבודה מאז גז קרן וכיפוף גם רק כהשתאה מצע אינם נלקחים בACלִסְפּוֹר. בהתחשב בכך שmicroposts עשוי בדרך כלל מחומרים רכים כמו polydimethylsiloxane (PDMS) מבוסס גומי סיליקון הגורמים האלה צריכים להיות כלולים. . שון et al הראה שיש גורם תיקון כזה המבוסס על היחס של micropost (L / D) ונ 'יחס פואסון של הפולימר המתאים 8 זה ניתן על ידי.:

משוואה 2 (2)

עם ההטיה T (v) להיות מקדם הטיה הכולל הולם פרמטר = 1.3 ניתן למצוא כמו באותו המאמר:

משוואה 3 (3)

כלומר, הנוקשות המתוקנות של micropost k קור היא התוצר של K = עיקול k כיפוף קשיחות הטהור וגורם תיקון קורניתנו על ידי:

משוואה 4 (4)

לכן, יש לבצע חישובי כוח התא באמצעות הווריאציה מעודנת יותר של משוואה (1) קוראים עכשיו:

משוואה 5 (5)

ההשפעה של התיקון הופכת להיות ברורה יותר ברגע שהערכים אופייניים לממדי micropost משמשים. לדוגמא, micropost ארוך 15 מיקרון עם חתך עגול וקוטר של 5 מיקרומטר עשוי מגומי סיליקון מבוסס PDMS מוביל לגורם תיקון של 0.77 ולכן חישוב מתוקן היה להעריך את כוחות התא המופעל על ידי 23%. זה הופך להיות אפילו יותר קשה לmicroposts עם ההיבט ratios הקטן יותר.

באופן מסורתי, ניתוח תמונת micropost גם היה מבוסס על תיאורית כיפוף קרן האידיאלית. בשנת 2005 הקבוצה שהיה חלוצה בשימוש בMICRמערכי opost פורסמו תוכנת ניתוח תמונה המתאימה לניתוח micropost 9 התוכנה דורשת רישיון תוכנה והמשתמש חייב לקחת שלוש תמונות לכל תפקיד.; אחד מכל המטוסים העליונים ותחתונים של micropost במצב הולכה ועוד אחד במצב הקרינה עם התא המוכתם. לאחר השוואת העמדות העליונה ותחתונים לכל micropost התוכנה קובעת שדה כוח וקטור ומחשבת פרמטרים הקשורים כמו כוח למשרה. חבילות תוכנה אחרות קיימות ועקרונות ניתוחם מוזכרים בקצרה במאמרים המקביל המתארים אותם, אבל חבילות תוכנה אנליטיים אלה הן בדרך כלל לא זמינות לציבור. 10,11

מערכי micropost מיועדים לכוחות תא מיפוי יכולים להיות מסווגים כאו להיות בפריסה מאונך micropost או אחד משושה, האחרון שבם יש את היתרון של פערים במרחק שווה בין כל microposts השכן. חה microposts הטיפוסייש חתך עגול וממדיהם נעים בין 1.0 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר בקוטר 2 עד 50 מיקרומטר באורך. 4 עם זאת, microposts עם חתך אליפטי או מרובע גם דווח. 12,13

השימוש בתערובות סיליקון מבוסס PDMS כחומר micropost מאפשר להוספת חלקיקים לתוך התערובת. לדוגמא הוספת ננו-מוטות קובלט מאפשר הפעלה מגנטית של micropost ובכך נותן עוד תואר של חופש עיצובים ניסיוניים פוטנציאל. 14 רוב הקבוצות לייצר מערכי micropost על מצעים קשיחים שטוחים כמו מכסה זכוכית או בתוך צלחת פטרי. עם זאת, מאן ועמיתים לעבודה דיווחו לאחרונה מערך micropost נוצר על קרום מתיחה. 15 זה מאפשר היישום של כוחות תא מתיחה לתאים חסיד בזמן לימודי תגובות דינמיות לחיות תאי subcellular במונחים של התכווצות תא.

ורוב estab המועסקים נרחבתהליך lished להכנת מערכי micropost מבוסס על יתוגרפיה הרכה כפי שתואר בפרוטוקולים תובנה של Sniadecki ועמיתים. 16-18 בתהליכי חדר נקי סטנדרטיים קצרים משמשים ליצירת microstructures על גבי פרוסות סיליקון באמצעות photoresist SU8. זה ואחריו תהליך העתקה שבו גומי סיליקון הוא יצוק על מבני העברתם לתוך תבניות. בשלב שני תבניות אלה משמשות לשכפל מיקרו הראשוני באמצעות גומי סיליקון על גבי מצע נבחר. עם זאת, למרות המספר הגדול והולך וגדל של פרסומים הקשורים ליישומם, הקמת תהליך ייצור לmicroposts לוקח כמות ניכרת של זמן אפילו למומחי מיקרו-הנדסה; יש שלבי תהליך רבים הדורשים אופטימיזציה והתאמה לסביבת המעבדה הספציפית ופריסת micropost להניב רמת איכות מקובלת.

מערכי micropost מסחריים זמינים כעת במוכן-tפורמט o-שימוש ("מחוץ למדף") עם איכות גבוהה באופן עקבי. ככזה הוא אלטרנטיבה לתהליך הייצור המורכב וארוך הנדרש לייצור באתר. במאמר זה מערך micropost זמין מסחרי שימש למיפוי כוחות סלולריים באמצעות תמונת מיקרוסקופ שדה בהיר אחד. חשוב ממאמר זה מתאר ומתעד תוכנת מלוא תפקודי קוד פתוח בשם MechProfiler, שזמינה להורדה כחומר משלים לכתב היד הזה. ניתן למצוא גם גרסה נשמרה באופן פעיל של התוכנה בhttp://www.orthobiomech.ethz.ch.

השילוב של assay "מחוץ למדף" ותוכנת ניתוח קוד פתוח תואמת במידה ניכרת מוריד את משוכת הכניסה להשיג ניסויי TFM מדויקים. חוקרים ללא גישה למתקנים או חדר נקיים או מומחיות בפיתוח תוכנה יכולים לנתח כוחות סלולריים בהצלחה. זה מאפשר למשתמש להתמקד בmechanosפלט ensitivity assay ולא הטכנולוגיה עצמה, ועושה מדידות כוח המתיחה זמינות לקהילה רחבה יותר. יתר על כן, זה הוא צעד חשוב כדי לסלול את הדרך לכיוון הקרנה אוטומטית מלא של מערכי micropost.

תוכנת ניתוח MechProfiler מעבדת תמונות בפורמט קובץ TIFF, PNG, BMP ו- JPG. ניתן לקחת את התמונות באמצעות הקרינה, לעומת שלב או מיקרוסקופ אור בהיר השדה. התכנית העצמאית פועלת יחד עם Matlab מהדר זמן הריצה החופשי (זמינה בכתובת: איור 12) ואלגוריתמים בסיסיים לאפשר לעיבוד תמונה יעיל, המאפשר למשתמש לעיבוד תמונות עם תאים בודדים או מרובים בכ -1 דקות. יתר על כן, תאים אלה יכולים גם להיות חיים או "קבוע".

תוכנת MechProfiler יכולה להגדיל את תפוקת ניתוח נתונים רבה על ידי הסתמכות על שחזור של מערכי micropost המסחרי האיכותי, # ספציפי יותר, ברירת המחדל ו8220;-הסיט אינם "עמדה של כל הודעה במערך ניתן להניח נגד רשת אידיאלית (סטיות ייצור לרשת במערכים המשמשים למחקר זה היו פחות מ -100 ננומטר).

בקיצור אחד פותח בחירה של קבצי תמונה לניתוח, יבוליהם לאזור של עניין, מגדיר את ההודעות מכוסות על ידי תאים או שצריך להיות מושלך, קובע פוסט עמדות, מחשבים את הסטיות / כוחות נגד הרשת האידיאלית, ולבסוף שומר את כל נתוני התא ספציפי עם אפשרות ליצוא, כולל לגיליון אלקטרוני משרדי סטנדרטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תאים culturing על מערכי Micropost

הערה: כל הצעדים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית על מנת להבטיח סטריליות. הכרכים הניתנים כאן הם לצלוחיות תרבית תאי T25. צפיפות המתכון וזריעת תאי תרבית תאים בינונית מותאמות לשורות תאי סרטן עצמות HuO9 וM132.

  1. הכן תרבית תאים לזריעה על מערך micropost.
    1. בדוק את איכות תרבית תאים על ידי הנחת בקבוק התרבות במיקרוסקופ אור רגילה. ודא שהתאים להראות צמיחה טיפוסית ומורפולוגיה ידי אומדן כמה תחתית בקבוק התרבות מכוסה. כיסוי של 70% -80% משקף שיעור צמיחה בריא. שים לב לכמות צף תאים כפי שהם מייצגים תאים מתים ו / או תרבות מגודל.
    2. Trypsinize תאים על ידי הסרת בינונית ושטיפה עם 4 מיליליטר 1x בופר פוספט חיץ (PBS). להוסיף 0.8 מיליליטר 1x טריפסין חומצה / Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לדגור על RT עד התאלסלק S, אשר לוקח בערך 2-4 דקות. בדוק את התהליך עם מיקרוסקופ ולעתים לנצל את הבקבוק בעדינות כדי לתמוך בדחיקה.
    3. הוסף 5 מיליליטר תרבית תאים בינוני (המדיום השתנה Dulbecco הנשר (DMEM) / F12 עם סרום 10% שור עוברי (FBS), פניצילין 1% / streptavidin (עט / סטרפטוקוקוס)) כדי לעצור את התגובה ולשטוף תאים שיורית שעדיין יושבים בתחתית של הבקבוק. בהמשך לכך פיפטה השעיה זו מעלה ומטה מספר פעמים כדי לקבל תערובת הומוגנית. הקפד פיפטה כל הפתרונות על פני שטח הצמיחה המקורי של הבקבוק כדי לקבל דחיקה יעילה.
    4. מעבירים את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות זה באמצעות צנטריפוגות בראש טבלה ברמה של 0.5 XG במשך 3 דקות.
    5. הסר את supernatant מחדש להשעות את התא גלולה ב 5 מיליליטר בינוני על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. הקפד להימנע מהדור של בועות תוך כדי כך.
    6. לקבוע צפיפות תאים באמצעות תא ספירת תאים וmicrosco אורפ. בדוק את ההשעיה התא בתא ספירת תאים לאגרגטים תא ולהבטיח שתהיה לי תאים בודדים בלבד לניסוי הבא. פיפטה שוב למעלה ולמטה כמה פעמים אם התאים נוטים ליצור אגרגטים להפריד ביניהם.
    7. לדלל את ההשעיה התא עם מדיום מספיק כדי להשיג פתרון תא של 25,000 תאים / מיליליטר. מערבבים אותו היטב על ידי צינור היפוך הסגור מספר פעמים.
  2. הכן מערך micropost לזריעת תאים.
    הערה קריטית: אל פיפטה על גבי מערך micropost ישירות כמו זה עלול לפגוע בmicroposts, במיוחד כאשר בועות לא רצויות הם הציגו. יתר על כן, לוודא כי מערך micropost לא מתייבש כמתרחש כוחות הנימים להוביל לקריסה של microposts.
    1. מניחים את מצע הזכוכית עם מערך micropost להתמודד בטוב של צלחת 12 גם באמצעות פינצטה ולהרטיב אותו על ידי הוספת 1 מיליליטר אתנול (99%). לדגור על RT במשך 20-30 שניות.
    2. לדלל את אתנולבשלבים על ידי הוספה כ 1 מיליליטר מים המיוננים סטרילי (מים DI) בצד טוב וaspirating בערך 1 מיליליטר בעזרת פיפטה העברה או מכשיר שאיפה. חזור על שלב זה לפחות 3 פעמים.
    3. החלף את DI-המים עם PBS-חיץ באותו אופן על ידי הוספה וaspirating כ 1 מיליליטר. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
    4. החלף את PBS-החיץ עם מדיום על ידי הוספה וaspirating כ 1 מיליליטר של מדיום. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
  3. פתרון פיפטה 1 מיליליטר תא (25,000 תאים) בחלק העליון של כל מערך micropost מוכן. לסגור צלחת רב היטב ולהעביר אותו לחממה (CO 2% 5, 37 מעלות צלזיוס). בואו התאים לדבוק ולגדול על גבי microposts ל6 -7 שעות.
  4. בדוק את תהליך ההדבקה מדי פעם באמצעות אור מיקרוסקופ. בדוק שרוב התאים מופיעים פרושים על פני מספר רב של microposts.

2. תאי תיקון ומכתים

הערה: כל הצעדים וכרכים הניתנים כאן הם לטוב אחד של צלחת 12 גם. מומלץ לעבד לא יותר מארבע שנתי עשר הבארות בכל פעם, כדי למנוע התייבשות של הבארות לאחר השאיפה של כל נוזל, אשר יגרום לקריסה של microposts.

  1. בינוני לשאוב מהבאר ותאים לשטוף 2X עם 1 מיליליטר PBS-חיץ. הקפד להחיל כוח עדין בזמן שטיפה עם PBS להסיר פסולת תא שהצטברה על מערך micropost במהלך דגירה ולנתק תאים מתים.
  2. תקן את התאים עם 0.5 מיליליטר 3.7% תמיסת פורמלדהיד שנאגרו במשך 5 דקות.
  3. החלף את פתרון פורמלדהיד על ידי שטיפת 2x מערך micropost עם 1 מיליליטר מים די סטרילי.
  4. כתם התאים עם צבע (0.05% כחול מבריק Coomassie ב -50% מים, 40% אתנול ו -10% חומצה אצטית) לכ -90 שניות. לשטוף פתרון מכתים עודף מ2x עם 1 מיליליטר מים די סטרילי. מוסיף מים DI 1 מיליליטר לmicropost מערך.
  5. בדוק תוצאת צביעה באמצעות מיקרוסקופ אור. לא חזורהוא מכתים צעד, אם גוף תא הוא קלוש מכדי להיות דמיינו.
  6. מערכי micropost חנות עם התאים המוכתמים על גבי במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. להבטיח כדי לשמור אותם מתחת למים בכל העת.

הדמיה 3. סלולארי

הערה: שלב 4 חל רק על מיקרוסקופים ללא אופטיקה אינסוף מתוקן.

  1. להוסיף DI-מים 2 מיליליטר לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית דקה להדמיה ברזולוציה גבוהה.
  2. העבר את מערך micropost באמצעות פינצטה לתוך צלחת ההדמיה עם microposts פונה כלפי מעלה.
  3. מניחים את צלחת פטרי הדמיה בשלב ניד של מיקרוסקופ אור.
  4. הפעל את טבעת הפיצוי של העדשה המשמשת להדמיה עד המספר על הסולם מייצג את העובי הכולל של כל החומרים בדרך האופטית כדי לפצות על חוסר ההתאמה במדדי שבירה של מצע הזכוכית, אלסטומר סיליקון ונוזל על גבי. זה צריך להוביל להופעה בהירה של micropostsליבות.
  5. סגור את איריס בצד התאורה עד 50% ולהסיר כל טבעות ניגוד שלב מהנתיב האופטי המאפשר מצב בהיר שדה רגיל.
  6. יישר את מערך micropost שmicroposts יוצר קו אופקי על פני שדה התצפית. הגדרת נקודת התחלה (למשל, למעלה משמאל) ולהעביר את שלבי צלחת פטרי על הבמה סריקת מערך micropost תוך לקיחת תמונות רבות.
  7. קח את כל התמונות עם הגדרת הרזולוציה הגבוהה ביותר עבור המצלמה באמצעות מטרת 20X או 40X. שואף להיות תא בודד במרכז התמונה.
  8. לטאטא לאורך ציר z דרך המצע עד הטיפים micropost הם בפוקוס. השתמש בגלגל פוקוס כוונון העדין של המיקרוסקופ ולהפוך אותו לכיוון התמקדות בתחתית micropost כ 2-3 מיקרומטר.
  9. לקבוע נוהל הדמיה סטנדרטי על ידי לקיחת סדרה של תמונות מבחן סעיף מערך אחד שוטף את הפרמטרים הדמיה אחד בכל פעם (למשל, זמן חשיפה,הגדרת איריס, הגדרות מנורה וכו '). ניתוח תמונות עם MechProfiler ולקבוע סט פרמטר מתאים לניתוח מהיר ואמין.

ניתוח 4. תמונה עם תוכנות הקוד פתוח "MechProfiler"

הערה: ניתן להפעיל כל פונקציות התוכנה עם התקן הצבעה באמצעות לחצן העכבר השמאלי. עם זאת, מפעיל מיומן יהיה להשתמש במקשי הקיצור המתועדים נועדו להיות במחצית השמאלית של המקלדת כדי לאפשר עיבוד תמונה בשתי ידיים יעילה.

  1. התחל MechProfiler תוכנת ניתוח תמונה ולפתוח מגוון של תמונות שצריכות להיות מנותחים על ידי לחיצה על "פתח".
  2. הכנס את כל הפרמטרים לסעיף "הגדרות" שניתן על ידי מפתח התוכנה. לקבוע את הפרמטרים שחייבים להיות מוגדר אישית (כלומר, סף גובה ומרחק מינימאלי) בהתאם לנהלים שתוארו בפירוט על ידי התוכנה ידנית.
  3. לנתח תמונהשל אחד על אחד על ידי חיתוכם לאזור של עניין באמצעות "חתוך" (לחץ וגרור עם כפתור העכבר לחוץ למטה). לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן נמשך לסיים פעולה זו.
  4. סימון כל מתווה גלויה תא אחד על אחד על ידי לחיצה על "צייר קווי המתאר תא" ולהשתמש בסמן שיער הצלב לציור כולל את כל microposts התא מצורף.
  5. לבטל את כל microposts לא רצוי על ידי לחיצה על "בטל הודעות" ולהשתמש בסמן שיער הצלב לציור. הקף את כל microposts ששייך לתא מחוץ לתמונה או הקטע שהסיטו מכל סיבה אחרת, אבל לא על ידי התא של עניין.
  6. התחל שגרת התוכנה "מצא centroids" על ידי לחיצת עכבר. התאם את מסנן הגדרה ממש ליד הכפתור "מצא centroids" עד שכל microposts רשום, אשר גלוי על ידי צלב אדום במרכזם. אם הגדרת המסנן היא גם microposts הנמוך יתעלם, אם הוא גבוה מדי muעמדות ltiple תסומן לmicropost יחיד. שמור את מסנן הגדרה קבוע במהלך פגישת ניתוח.
  7. השתמש בפונקצית עריכה הידנית "העריכה ידנית" לcentroids עם עמדות micropost מרובות או שלא נענו. השתמש בשיער צלב עכבר כדי לבחור את micropost בשאלה על ידי לחיצה וגרירתו על פני. לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן ומניחה את הסמן האדום החסר בסעיף התמונה המוגדל, אשר באופן אוטומטי סוגר. בטל micropost כזה אם הוא מחוץ לקווי מתאר התא נמשך (ראה שלב 4.5) לפני שימשיך.
  8. מצא את רשת micropost האידיאלית על ידי הפעלת הפונקציה "צור רשת" בלחיצת עכבר. להבטיח את המיקום מתאים עם הראש האמיתי micropost, שמוצג על ידי טבעת כחולה, בתוך קווי המתאר התא נמשך.
  9. לתקן כל יצרנית רשת במקומה בתוך שטח התא שבו צורך בשימוש בפונקציה המקבילה "מנואל ערוך" בלחיצת עכבר. השתמש בשיער הצלב כדי לבחור את micropost בquestion על ידי לחיצה וגרירתו על פני. לחץ לחיצה כפולה בתוך המלבן מופיע ולמקם את הסמן הכחול החסר בסעיף התמונה המוגדל, אשר באופן אוטומטי סוגר.
  10. השתמש בכפתור "חישוב הסטיות" על ידי לחיצת עכבר לקבל היסטוגרמה של ערכי הסטייה מחושבים על בסיס ההבדל בין העמדה של micropost בתוך סעיף התמונה והרשת האידיאלית שנוצרה.
  11. שמור את הניתוח המלא כולל השולחנות של ערכים על ידי לחיצת עכבר על "שמור".
  12. המשך ניתוח התמונה או על ידי לחיצה על "איפוס צפה" ולנתח סעיף אחר של תמונות או לחיצת עכבר על "התמונה הבאה", בו בנוחות ניתן לעשות זאת באמצעות מפתח גדפן מקלדת תקין.

5. ניתוח נתונים - Mechanoprofiling

  1. פתח את הקובץ "results.xls" עם תכנית גיליון אלקטרוני משרד מהתיקייה עם התמונות מנותחות. הוא מכיל את הנתונים עם אלערכי l מחושבים כוללים את כל סטיות micropost ואמצעים נגזרים סטנדרטיים כגון עבודה (כלומר, אנרגיית עיוות מצע) על ידי התא נותח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

היתרון העיקרי של הטכניקה המתוארת טמון בפשטות שלה ופוטנציאל להשתלבות מהירה ויעילה לעבודת מעבדה שגרתית. השילוב של מערכי חיישן מסחריים באיכות גבוהה יחד עם תוכנות קוד פתוח מספק מידע על mechano-רגישות שאחרת היה דורש גישה למתקני חדר נקי ובידע המעמיק של ניתוח תמונה ופיתוח תוכנה. איור 1 מדגים את זרימת העבודה של השיטה שהוצגה. זה מתחיל בהכנה וזריעת תאים על גבי מערך micropost. לאחר תיקון ומכתים את תאי מערכי micropost מוכנים להדמיה. חלק מהטכניקה המרכזי הוא ניתוח התמונה באמצעות תוכנת MechProfiler. משתמש יכול להתחיל analyszng תמונות מייד לאחר שנכנס לכל הפרמטרים הרלוונטיים ב" הגדרות "של GUI. גודל פיקסל המקביל הוא האורך שמיוצג על ידי פיקסל בודד ותלויה בהגדרה של המשתמש. זה צריךשיוקם בנפרד עבור כל הגדלה בשימוש על ידי לקיחת תמונות של אובייקטים עם גודל ידוע. דוגמא ניתן באיור 9 המשלים.

איכות תמונה היא גורם מפתח כפי שהוא מאוד משפיע על תהליך הניתוח. על מנת להשיג את האיכות הגבוהה ביותר יש לוודא שיש פלטפורמת הדמיה יציבה ושירות באופן שגרתי, כפי שמוצג באיור 2. בפרט, היישור של מקור האור הוא חשוב כחוסר תיאום יגרום צללים לא רצויים שיכול להיות בעייתי בעת הניתוח תמונות. יתר על כן, הצבת מיקרוסקופ האור על גבי שולחן נגד רעידות או צלחת מועילה ברוב המעבדות כפי שהוא נותן יציבות נוספת במהלך הדמיה.

היתרונות של שימוש בצלחת פטרי תחתונה דקה זכוכית להדמיה כוללים ערכי צמצם מספריים יעילים גבוה יותר, המתרגמים לתמונות בהירות עם רזולוציה גבוהה יותר.

כאשר טאקיng התמונות במצב בהיר שדה קשתית סגורה 50% מומלצת, כמו התמקדות בטיפי microposts הוא הקל בשל ההיקפים מופיעים כטבעת כהה ופריכה. יתר על כן, במקרה המטרה בשימוש יש טבעת פיצוי, זה חיוני כדי להגדיר אותו בצורה נכונה כדי להשיג את קריאות כוח מדויקות. ההשפעה של תכונה שניתן לראות על ידי השוואת איור 3A ואיור 3. תמונות שניתן לנתח במהירות מושגות על ידי שילוב של ההגדרה הנכונה של טבעת הפיצוי יחד עם תאורה אופטימלית כפי שמוצג באיור 3 ג. ניגוד חזק בין micropost והסביבה מפחית את זמן הניתוח כפי שהוא מאיץ את חיפוש אלגוריתם. משתמשים ימצאו כי נדרש רק ניסיון מינימאלי כדי להשיג תמונות שניתן לנתח בקלות.

חשוב לציין, הפרוטוקולים מעל להתגבר על מכשול קריטי ומשותף לשילוב מהיר ויעיל של מערכי micropost לשגרהעבודת מעבדה. מכשול זה נובע מהצורך לשלוט באיכות מערך - דרישה שהיא בר השגה רק על ידי אפיון ניסיוני יסודי ומפורט של שחזור חיישן, רגישות ודיוק. עם זאת, על ידי הפיכה למערכי micropost זמינים מסחרי המשוכה גדולה למדי זה הוא נמנעה לחלוטין. איורים 4 א ו -4 ב להמחיש את הדיוק של מערך כזה micropost. הסטייה של עמדת microposts היא גם תחת 200 ננומטר וככזה דומה עם "שגיאת פיקסל" המלווה את המצלמה / שילוב האובייקטיבי שהביא לגודל פיקסל של 82 ננומטר להתקנה בשימוש. הניתוח של תמונות עם תאים להסיט microposts מוכיח כי הערכים לסטייה-הוטל סלולארי הם גבוהים באופן משמעותי מ- 200 ננומטר (כפי שמוצגים באיור 4C ואיור 4D) שמוביל לאות נוחה יחס רעש.

illustrat 5 איורes הסוגים השונים של הופעות לmicroposts בתוך תמונה בהתאם בין אם הוא הסיט או לא. כפי שצוין לעיל microposts-הסיט הלא יש מראה עגול בהיר עם טבעת כהה סביבם. עמדתם ניתן לקבוע באמצעות שינוי האף, שהיא טכניקת חילוץ תכונה לניתוח תמונה דיגיטלית.

יתר על כן, זה מראה שmicroposts מוסט על מיקרוסקופ הפוכה להראות שני מול צורות חצי ירח כהות (ראה איור 5 א). במיקרוסקופ זקוף בקצה של קצה micropost וצורת חצי ירח כהה אחד הוא כראוי גלוי ואילו שנייה אחת הופך קשה לזהות. מאפיינים אלו הם הבסיס לחישוב העמדות של תמונות מיקרוסקופ השדה בהירות של הטיפים מmicroposts הסיט, אשר פותח עבור פרוטוקול זה ונקרא "גישת קונטור".

איור 5 היא דוגמא אחת של סרטן עצמות HuO9תא בmicroposts צילם על מיקרוסקופ הפוכה (למעלה). הגרסה ניתחה של תמונה שמראה את התוצאות מהגישה הגובה יישומית (תחתון). איור 5 ג נלקחו תוך שימוש באותו המערך micropost עם מיקרוסקופ זקוף (למעלה). שוב את הגרסה ניתחה מראה את התוצאות משימוש בגישת הגובה.

כל פגישה מתחילה בניתוח תמונת אימות משתמש של הפרמטרים בסעיף "הגדרות" של MechProfiler. חלקם ניתנו על ידי יצרן micropost כמו ממדי מערך micropost וקבוע קפיץ. אחרים מוגדרים על ידי המשתמש, כגון הערכים לסף הגובה וסף סטייה מינימאלי בהתאם לנהלים המפורטים בתוכנה ידנית. עם זאת, חשוב לשים לב כי יש לבחור בערכים אלה בזהירות וחייבים להיות קבוע לכל התמונות בסט קשורים של תמונות כדי להבטיח השוואה. ואילו צעדים מראש העיבוד לanalysi התמונהים, כמו חיתוך, הם עצמי מסבירים את האסטרטגיות הבסיסיות לפונקציות תוכנה כמו "centroids מציאת", "צור רשת" ואת "גישת קונטור" צריכים הסברים מפורטים יותר.

זיהוי אלגוריתמי של עמדת micropost ברירת המחדל (כפי שנמסר על ידי היצרן) מתחיל באמצעות "centroids מציאת" פונקצית התוכנה. האלגוריתם מתחיל בפינה השמאלית העליונה של תמונה מחפשת micropost הראשון. בהמשך לכך כל microposts האחר נמצאים מבוססת על הקואורדינטות של שmicropost הראשון בתוספת הערכים לגודל הרשת וmicropost ניתנו על ידי היצרן הבא הגיאומטריה המשושה. Centroid לכל micropost מצא מחושב באמצעות שינוי האף. מחוון המסנן לצד לחצן פקודה של GUI מאפשר התאמת הרגישות של השינוי הזה. כל microposts מצא מסומנים בצלב אדום ועמדותיהם ציינו לsuתהליכי bsequent.

בשלב הבא, פונקצית "צור רשת" מובילה לקואורדינטות של כל הטיפים microposts. הם תוצאות מתהליך רבי שלבים. ראשון פונקצית אופטימיזציה נפתרת כולל עמדות הראשוניות מהאלגוריתם לפני להורג "מצא centroids" להקים את הרשת האידיאלית. שנית את עמדותיהם של microposts בתוך שטח התא מחושבות. Microposts עם פחות מ סטייה מוגדרת בפרמטר ההגדרה "סף סטייה מינימאלי" ביחס לרשת האידיאלית מעובד עם שינוי יו. כל עמדות קצה micropost האחרות מחושבות באמצעות גישת מתאר שתוארה לעיל לmicroposts הסיט. הנה התוכנה מתחילה בחיפוש מcentroid הראשוני ממרכז התא לקצה עגול (בהיר לכהה) בזווית של 15 מעלות (ראה איור 5 א). ברגע שהקצה נמצא במעגל עם קוטר micropost נתון מצויד לtקצה כובע באמצעות ערך סף גובה מההגדרות בGUI. הפרמטר שקובע שערך אפור פיקסל משמש לתהליך הראוי. גבוה יותר הערך שיותר המתאים נוטה לכיוון מרכז micropost הבהיר הנמוך שמעריכים את זה יותר מתאים שהמעגל למתווה micropost הכהה יותר. ברגע שבחר שהערך צריך להישאר קבוע לכל תמונת הניתוחים במחקר ניתנו להימנע מהוספת סטייה מלאכותית או קוראת סטיות מדי שמרני.

לדוגמא, איור 6 ממחיש את החשיבות של החלטה לערך סף הגובה מתאים. התוכנה מאפשרת למשתמש לבחור עבור מגוון רחב (0.1-0.9) להקיף את כל מצבי התאורה האפשריים מבחינה פיזית. התרגום של המידע האופטי למרחקי סטייה ניתנו לשני הקצוות וערך מעשי יותר באמצע ניתנים באיור 6. עם זאת, משתמשי תוכנה מיומנים לעתים קרובות convergלערכי סף גובה דומים מאוד דואר, שמוביל לתוצאות דומות כפי שניתן לראות באיור 6 ג. יתר על כן, באמצעות נהלים אחידים למכתים תא והדמיה ממזער את הסיכון של ערכי סף גובה לא חוקיים, אשר בדרך כלל צריך להישאר קבוע בתוך עבור ערכות קשורות של תמונות.

כדי להדגים את חוסנה של שיטת בחירה של תוצאות הפרופיל-mechano מסוכמות באיור 7. באיור 7 א שתי תוצאות מתאי סרטן עצמות HuO9 ושתיים מM132 מושווים. כל ארבעה המערכים הם מאותו אצווה הייצור ולכן יש תכונות מכאניות זהות. הניתוח בוצע עם סט קבוע של פרמטרים לסטייה מינימאלית (0.25 מיקרומטר) ולסף הגובה (0.125). בנוסף, שני סטים זהים של תמונות מסרטן העצם 2 SaOS ניתנו לשני אנליסטים ללא מידע נוסף אודות הגדרות פרמטר (ראה איור 7B). ההשפעה של הצביעה על הניתוח נבדקה על ידי לקיחת תמונות של תאי סרטן העצם מוכתמים עם Coomassie הכחול ר 'בהמשך הצבע הוסר. לאחר מחדש צביעה עם Coomassie הכחול G סט שני של תמונות נלקח. איור 7C ממחיש את התוצאות משתי הסדרות, שנותחו על ידי אותו משתמש עם ערכים זהים לסטייה המינימלית (0.25 מיקרומטר) וסף הגובה (0.25) .

דוגמא טיפוסית של mechano-פרופיל מיושם מוצגת באיור 8 א, שבו על הנתונים שנאספו מוצגים לשורות תאי סרטן עצמות HuO9 וM132 לאחר ניתוח 151 תאים אספו מכל אחד מארבעה מערכים. בסקירה זו את כל ערכי המדד הם גבוהים יותר עבור HuO9 מאשר לM132 כבר מצביעים על כך שתאי HuO9 להחיל יותר כוח מאשר M132. עם זאת, נתונים מניתוח התמונה מכילים כמות גדולה של מידע מתא בודד נוסף שיכול להיות ממוקש להבין פן טוב יותרקו התנהגות תא otypic והשתנות תא אל התא בתוך קו נתון. על ידי הצגת התוצאות לכוח לmicropost בעלילה תיבה אחת מגלה כי למרות מינימום ומקסימום דומים, ערכי הנתונים שונים שהופצו ואכן שורת התאים גרורתי הנמוכה תאי HuO9 נוטים להחיל יותר כוח מאשר קו M132 גרורתי מאוד (ראה תרשים 8B). יתר על כן, על ידי סיווג ערכי הכוח ביחס לתא שטח אחד מגלה כי הכוח הממוצע לתא אינו גבוה רק לתאי HuO9 לעומת M132 אלא גם שהכח הממוצע לעליות micropost כתאים להתפשט עד כוח ממוצע למשרה מגיעה ערך יציב יותר (כפי שניתן לראות באיור 8C). יתר על כן לתאים המכסים שבע microposts הערכים כמעט זהים, שהוא כנראה בשל העובדה שהם מופיעים בדרך כלל בצורת משושה עם אחד מרכזי עצמאי micropost של הקו הסלולרי שלהם-הסיט לא. מלבד ההבדלerences בהתכווצות, ניתן לכמת הבדלים מורפולוגיים עם תוצאה מעניינת. לדוגמא, בניגוד לתאי M132 גרורתי מאוד היו מעט מאוד תאי HuO9 שכיסו רק שלוש microposts. השוואות מורפולוגיים אחרות בין שורות התאים יכולות להתבצע, לרבות חלוקת שטח תא המיוצג על ידי מספר microposts המכוסה. איור 8D ממחיש כי שתי שורות התאים שונות גם בהתנהגות הפצה דינמית כאשר גדלו על גבי microposts. בקיצור, mechanoprofile לקו תא ההורים HuO9 מגלה שהם בדרך כלל לכסות יותר שטח וליישם מעט יותר כוח לmicroposts בעוד שורת התאים גרורתי M132, תא אגרסיווי שנובע מHuO9, אופייני מכסה פחות microposts וחל פחות כוח לmicropost . תוצאות אלו מראות את הפוטנציאל של גישה מבוססת TFM עבור יישומים מפלים.

ניסוי באיור 1. זרימת עבודה. (א) ההליך הכולל מכיל חמישה שלבים עיקריים ברציפות מזריעת תאים במערך micropost לפרופיל התכונות המכנית שלהם. ניתוח התמונה (ב) מתבצע עם תוכנת MechProfiler תיארה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. התקנת הדמיה. מיקרוסקופ הפוכה סטנדרטית משמשת להדמית התאים על מערכי micropost. ההתקנה מכילה גם מצלמה מיקרוסקופ ובקר שלה, אשר יכול גם לספק פונקציות אחסון נתונים. המסך הגדול שיופיע אינו חיוני אך בכל זאת הוא נוח להדמיה מורחבתהפעלות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. קו מנחה להדמיה micropost. תמונה () של תאים מוכתמים במערך micropost צולם עם עדשת 40X במצב בהיר שדה. microposts הסיט-ללא יופיע טבעות כהות כאשר צילם. הודעות הסיטו להניח צורת אליפטי עם שני אזורי משנה כהים ובהירים. תאים מוכתמים שמכסים microposts גורמים להם להיראות אפילו יותר כהים עד כדי כך שאין ניגוד בין micropost ותא. (ב) תמונות זהות נלקחו לאחר התאמת טבעת פיצוי העדשה מחדש התמקדות. כאן הליבות של microposts להיות משמעותי בהירות ולתת יותר קונטרסט. אותו העמדה צילמה שוב לאחר adjus (C)טינג כל הפרמטרים התאורה עם בקר המצלמה. Microposts עומד בחופשיות מופיע עיגולים בהירים כמו עם טבעת כהה. microposts הסיט להראות "צל" ירח חצי ברור סביב ליבת המפרץ לאורך הציר מושך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.>

איור 4
איור 4. צילומי מסך MechProfiler של microposts ניתח. (א) דוגמא אופיינית לריקה מערך micropost שניתן לראות בצילום מסך זה. Microposts מסודר בתבנית משושה קבועה. (ב) היסטוגרמה עם ערכי הסטייה לmicroposts אלה מראה כי כל הערכים הם מתחת ל -200 ננומטר. (ג) דוגמא אופיינית לכיסוי תא סרטן עצמות HuO9ומושך על microposts מרובה. ניתן לראות כי כמות מושך היא הטרוגנית. (ד) היסטוגרמה עם ערכי הסטייה לתא HuO9 מציגה קשת הרחבה של סטיות שנובעת מהאינטראקציה של התאים עם מצע micropost. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. הופעות Micropost בתאורה בהירה שדה והאסטרטגיות לחישוב המיקום שלהם בתוך תמונה. Microposts-הסיט עישון () מופיע כאזור עגול בהיר עם טבעת חיצונית כהה. Centroid מחושב על ידי שינוי האף. microposts הסיט להראות צורות חצי ירח כהות. בהתאם להגדרת מיקרוסקופ אם microposts להתמודד ניהול התאורה מקור לא (למשל מיקרוסקופ הפוכה,) קיימות שתי צורות חצי ירח גם גלויות. אם microposts להתמודד העדשה (למשל, מיקרוסקופ הזקוף) רק מחצית הירח הוא גם נראה לעין, אלא גם את הקצה של הקצה. בשני המקרים יש להשתמש בגישת הגובה כדי לחשב את קצה micropost. תמונה (למעלה) מקורי (ב ') באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מתא סרטן עצמות HuO9 וגרסתה ניתחה (למטה) בגישת הגובה. (C) תמונה מקורית מאותו מערך micropost (למעלה) באמצעות מיקרוסקופ זקוף והגרסה ניתחה, שוב החלת הגישה המתאר (התחתון), אך עם ערך נמוך בהרבה גובה סף מתאים יותר לקוראים קצה בצורת הטבעת הכהה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

להעלות / 53,350 / 53350fig6.jpg "/>
איור 6. גישת הגובה ובחירת ערך הסף המתאים. (א) שלושה צילומי מסך להמחיש את אותו microposts נותח באמצעות שלושה ערכי סף גובה שונים. אם הערך מוגדר או נמוך מדי (משמאל) או גבוה מדי (מימין) מהתוכנה מתאימה הטבעת הכחולה, המייצגת את ראש micropost באופן שגוי. זה ממעיט או overshoots העמדה האמיתית של ראש micropost. ערך סף שנבחר בצורה נכונה מאפשר תוכנה כדי שיתאים שלטבעת הכחולה לחץ הירח בצורת האזור חשוך micropost המהווה דרך סטייה. (ב) הגרף מראה את כמות הסטייה הממוצעת תלויה על סף הגובה שנבחר לmicroposts מוצג בלעיל. זה גם ממחיש שהערכים לmicroposts מחוץ לקווי מתאר התא אינם מושפעים מאז הולם מתאר אינו מיושמים שם. (ג) הגרף ממחיש כי בחירהערך סף בתוך מרווח מתון minimalizes הסיכון של סטיות micropost יתר או להמעיט. ההבדל בין הערכים שנבחרו על ידי משתמשים מיומנים שונים הוא בדרך כלל פחות מ 0.05, וכתוצאה מכך הבדלים מקובלים בערכי סטייה ממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. בדיקת חוסן לתוצאות mechano פרופיל משורות תאי סרטן העצמות שונות; הברים השגיאה מייצגים סטיית תקן אחת () Mechano-פרופיל תוצאות מארבעה מערכי micropost זהים לאחר זריעת תאי HuO9 על מערך 1 וM132 במערך 3 -. ארבעה ימים לאחר מכן זריעת HuO9 על מערך 2 וM132 במערך 4. (ב) השוואה של תוצאות ממ 'echano-פרופיל המבוסס על ערכות זהות של תמונות לאחר ניתוח על ידי שני אנליסטים עצמאיים. (ג) השוואה של תוצאות ניתוח תמונה משתי סדרות של תמונות שונות ראשון נלקחו לאחר צביעה עם Coomassie הכחול R והשני לאחר הסרה מלאה של צבע וצביעה מחדש עם Coomassie הכחול ג 'אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .>

איור 8
איור 8. Mechano-פרופיל של שורות תאי סרטן העצמות. () ההשוואה בין HuO9 שורות תאי סרטן שתי עצמות (פוטנציאל גרורתי נמוך) וM132 (גרורתי מאוד) גרף מראה שכל ערכי המדד הם גבוהים יותר עבור קו תא HuO9 ( N = 302 סך הכל, שתי קבוצות בלתי תלויות של ניסויים, בר שגיאה = סטיית תקן). טרונג>) עלילת התיבה ממחישה כי הכוחות יושמו לmicropost הם בטווח ננו-ניוטון נמוך יותר. עם זאת, תאי HuO9 למשוך יותר מאשר תאי M132 (שפם מייצג את המינימום ומקסימום נתונים). (ג) תוצאה דומה ניתן לראות על ידי השוואת תאים המכסים את אותו המספר של microposts. תא HuO9 להחיל יותר כוח מאשר תאי M132. מספר תאי HuO9 מכסים שלוש microposts הוא לא נציג וכלל רק לשלמות (בר שגיאה = סטיית תקן). (ד) ההפצות השונות ברחבי המספרים של microposts המכוסה להוכיח כי יש לכל שורת תאי סרטן עצמות האופיינית משלו מתפשט בעת אינטראקציה עם מערכי micropost. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ppfig9.jpg "/>
איור משלים 9. גודל פיקסל להתקנת המיקרוסקופ בדרך כלל נקבע באמצעות שקופיות מיקרוסקופ מיוחדות עם סרגל קנה מידה עליו; לחלופין פריסת מערך micropost, שניתנה על ידי היצרן יכולה לשמש. לדוגמא, 15 יחידות עם 13 מיקרון (195 מיקרומטר אורך כולל) מחולק ב2375 פיקסלים (הוקמו בכלי עיבוד תמונה) מובילה ל0.082 מיקרומטר / PXL. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור משלים 10
איור משלים 10. השוואה בין התמונות של תאי סרטן עצם HuO9 נלקחו מאותה התנוחה באמצעות שתי טכניקות תאורה על מיקרוסקופ הפוכה; microposts DIO המוכתם הוא ניאון ירוק. ( מצב בהיר שדה. (ב) ניתח אני קוסם נלקח לאחר המעבר לערוץ הקרינה הירוק ללא מיקוד מחודש.   תמונת הקרינה שנייה לאחר התיקון מתמקד בטיפים מאוד micropost (C). כיסוי (D) של שני ערוצי התאורה למטרה המחשה בלבד.   (ה) Mechano-פרופיל אינדיקטורים כתוצאות משלוש תמונות. למרות תיקון במוקד הסטייה המלאה לא ניתן להעריך מתמונות הקרינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור משלים 11
אינטרנט אלחוטי משליםאיור 11. רצף תמונה של אותה התנוחה של microposts המוכתם fluorescently באמצעות DiI על מיקרוסקופ זקוף תמונה בהירה שדה ().; יש שלוש microposts נוגע זה בזה בקצה. אותה תנוחה לאחר המעבר לערוץ הניאון מעט מעל ראשיהם של microposts (B). (ג) הפחתת מישור המוקד לקצה קצו של microposts. (DE) תמונות עוקבות אחרי הורדה הדרגתי מישור המוקד לתחתית "microposts נוסף. (F) תמונה של microposts לאחר הורדת מישור המוקד בתוך מצע סיליקון אלסטומר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור משלים 12 איור משלים 12. צילום מסך של ממשק MechProfiler. תוצאת ניתוח אופיינית מפרופיל תא סרטן עצמות HuO9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבודה זו מבקשת לקדם את התחום של כוח המתיחה מיקרוסקופי על ידי באופן משמעותי הפחתת מחסומים טכניים ומעשיים לכניסה. מחסומים אלה באים משני צדדים. בראש ובראשונה הם האתגרים הטכניים לא טריוויאלית הרבים שיש להתגבר כדי לייצר reproducibly וניסוי עמלה מערך micropost. שנית, הוא הצורך באופן דומה לא טריוויאלית עבור ניתוח אוטומטי למחצה אמין של כוחות תא בודדים - תוך התחשבות שבניסוי טיפוסי עשוי לדרוש הניתוח של מאות או אפילו אלפים של תאים. הטכניקות שתוארו לעיל פותחו כדי להפוך micropost מיקרוסקופ כוח מתיחה המבוסס נגיש בתוך מעבדות ביולוגיה של תא שאין לי מומחיות הנדסת תושב. החיישנים וטכניקות ניתוח שהוצגו במאמר זה אמורים לאפשר שאינם מומחים בקלות ובאופן מדויק כדי לנתח את הכוחות המופעלים על ידי תאים בודדים.

מלבד גישה לl ביולוגיה של תאab עם לפחות מיקרוסקופ שדה בהיר באמצע כיתה, השיטות שתוארו דורשים כמה אלמנטים טכניים נוספים. כאן רוב המשתמשים יכולים לבצע ניסויי כוח המתיחה מיקרוסקופי תקפים עם אף ניסיון מוגבל, למרות הכח והגמישות של הטכניקה. יחד עם זאת יש שלושה היבטים קריטיים בפרוטוקול המובא שיש לקחת בחשבון. ראשית יש צורך להבטיח כי מערכי micropost תמיד מכוסים בנוזל, כדי למנוע שקריסתם עקב כוחות נימים. שנית, יש צורך לייעל את הפרמטרים הדמיה עבור תמונות micropost רכשו, שנעשה הכי טוב על ידי לקיחת סדרה של תמונות של אותה תנוחת מערך בעוד משתנה זמן חשיפה, צמצם קשתית, ועמדת טבעת פיצוי. חשוב למצוא את מישור המוקד הנכון לקצה micropost, והיבט זה לוקח קצת ניסיון נתן עומק ממדים הקטן של מערכי החיישן. שליש חייב להוריד את discusse MechProfiler תוכנת ניתוח תמונה בגלוי הנגישהיית כאן, שלדוגמאות מדריך למשתמש והדרכה מפורטות זמינות באתר להורדה. לאחר קצת ניסיון באמצעות התוכנה לנתח דוגמאות מסופקות עם המדריך, צריך המשתמש לקחת תמונות בדיקה על התקנת ההדמיה כדי לשמש כדי לקבוע הגדרות מיקרוסקופ מתאימות. בהתבסס על התמונות שהושגו, ערך סף הגובה צריך להיות מותאם באופן דומה. תמונת micropost יחידה יכולה להיות מנותחת על ידי משתמש מאומן בתוך דקות באמצעות תוכנת MechProfiler קוד הפתוח ללא קשר אם הוא מכיל תא אחד או יותר, המאפשרת את הדור של תוצאות רלוונטיות מבחינה סטטיסטית (ניתוח של כמה מאות תאים) בתוך כמה שעות .

היבט נוסף שדורש קצת כוונון הוא אופטימיזציה של כל הליך מכתים תא שימושי. כאשר תאים מוכתמים מדי התוכנה יכולה שלא לרשום את עמדות micropost הנכונות. מצד השני, אם הצביעה היא קלושה מדי זה דורש יותר מאמץ על ידי המשתמש כדי לזהותניתן לפספס מתאר תא "אמיתי" כבליטות תא דקות.

עם זאת, על ידי יישום פרוטוקול קבוע של הליך מכתים תא והדמיה מערך מגוון לשגיאה זו הופך נמוך מקובל. במהלך עבודה זו נהלי מכתים תא שונים נבדקו, המבוסס על ריכוזים שונים של סגול גביש, הנוכחות של פעילי שטח כמו Tween 20 או טריטון-X, או שילוב של צבעים על ידי הוספת Eosin. עם זאת, עוצמת מכתימה כמו גם היציבות שלה מגוונת באופן משמעותי מניסוי לניסוי. רק השימוש בG הכחול מבריק כפי שתואר לעיל הראה חוסן מכתים תא מקובל בשילוב עם מספיק עוצמה עדיין לראות את קווי המתאר התא הדקים אבל בלי להתערב עם גישת הגובה המפותחת.

באופן כללי, יש אפשרויות כדי לשנות את הטכניקה שהוצגה. לדוגמא על ידי שילוב של הטכניקות בהירות השדה מוצגות כאן עם האברונים צביעת מיקרוסקופ פלואורסצנטיכמו הגרעין או רשת נימה אקטין, אשר יכול לספק מידע נוסף על התהליכים בתא הבסיסיים בהקשר של מכניקת תא. יתר על כן, באמצעות carboxycyanines ארוכת השרשרת dialkyl (DiI או DIO) microposts הפך ניאון. 14 עם זאת, חשוב לשלוט בכל סטייה מהטכניקה שהוצגה. הדמויות המשלימות 10 ו -11 איור ממחישים בעיות פוטנציאליות. תמונות שצולמו בתא פיברובלסטים NIH 3T3 Coomassie הכחול G מוכתם בערוץ הקרינה הירוק (איור 10 ב ו10C) באמצעות מיקרוסקופ ההפוכה להציג את הגופים העיקריים micropost אבל לא העצות שלהם מובילים לניתוח עמדה פגום (איור 10E). למרות המאמץ הטוב ביותר ולמקד לאחר מעבר ממצב בהיר שדה (איור 10 א) לא ניתן הדמיה הטיפים micropost, אשר יכול להיות עקב ספיגה של אות הקרינה על ידי כתם התא. זאת בניגוד לאמאGES שצולמה בערוץ הקרינה הצהוב של מיקרוסקופ זקוף (איור 11B-11F) שבו תמונות חדות מרובות יכולה להיות להשיג לאורך ציר z. כאן המשתמש צריך להבטיח שהתמונה שצולמה במישור המוקד בקצה מאוד (11C איור) ולא במקום הקרוב יותר לתחתית micropost להימנע קוראות ערכי סטייה פגומים.

יש לציין שיש גם מגבלות טכניות למבחני micropost. לדוגמא, את הדיוק של סטייה זוהתה תלוי באיכות של ההתקנה האופטית. מיקרוסקופים לעתים קרובות מותאמים להדמיה הקרינה בי הרגישות לאור של המצלמה המחוברת יש עדיפות גבוהה יותר מאשר מספר גדול של פיקסלים. באופן טבעי, זה מוביל לתמונות בגודל פיקסל גדול יותר. יתר על כן, יש לציין כי תמונות בהירה שדה לא יכולות לקבוע אם בליטות תא להגיע לתחתית המצע. עם זאת, מערכי micropost המסחריים נבדקו באמצעות confocalמיקרוסקופ. נמצא כי תאים נראים לקבל את הציפוי בינארי שמקדם רק הידבקות בטיפי micropost ולא לשאר מערך micropost. גורם נוסף נובע משגיאת positional של מערך micropost, אשר הוכח להיות 0.2 מיקרומטר. יחד עם קבוע הקפיץ נתון של 2.8 ננ / מיקרומטר זה מוביל לשגיאה בכוח קריאה מתוך 0.6 NN. אילוץ נוסף למבחני micropost נובע מכך שלא ניתן לקבוע את הכוחות מיושמים מmicroposts המשותף על ידי תאים מרובים. לכן, ניתן לנתח חד-תאים רק מבודדים. הגבלה ספציפית לפרוטוקול המובא נובעת מהיישום הנכון של גישת הגובה רגישה, שדורש כמות מסוימת של הכשרה למשתמש על מנת לקבל תוצאות אמינות. יתר על כן, לניתוח מהיר יותר למשתמש צריך לקחת תמונות בי מערך micropost מיושר כדי ליצור אופקי או קו אנכי לאורך קצה שדה התצפית. Despitדואר העובדה שאלגוריתם התוכנה למציאת microposts בתוך גיאומטריה רשת משושה אינו מוגבל על ידי זווית סיבוב ההדמיה של microposts יותר מ 5 מעלות מעל הציר להקשות לחתוך לסעיף תמונה ללא מכיל microposts שלם, אשר לאחר מכן מוביל לכישלון של הפונקציה "צור רשת". במקרה כזה המשתמש יכול להשתמש בפונקציית הסיבוב המשולבת לפני שמתחיל לנתח את עמדות micropost.

השיטה המתוארת יושמה בעיקר כדי לאפיין שתי שורות תאי סרטן העצמות, קו הורי תא בשם HuO9, וקו גרורתי מאוד נגזר הנקוב M132. בהקשר זה למעלה משישה מאה תמונות מתא בודד נלקחו במצב בשדה בהיר ונותחו באמצעות תוכנת MechProfiler. הנתונים הבאים הכרייה גילתה כי קו תא ההורים HuO9 מפעיל מעט יותר כוח ובדרך כלל מכסה יותר microposts לכל תא מתאים משורת התאים גרורתי M132. עם זאת התאיםלא מסונכרן, ולכן בשלבים שונים של מחזור תא ברגע הקיבעון, שסביר להניח תרם למגוון הרחב של תוצאות. על ידי לקיחת תמונות תא חיות על פני תקופות של עד 24 שעות זמן, נמצא כי לאחר הפצת תאים רבים להישאר בעמדה הראשונית שלהם ואילו אחרים נודדים, התפשטות, ניתוק ולהעביר שוב עם מהירויות שונות (ראה קטעי וידאו נוספים). זה מצביע על כך הפרופיל המכני של תא הוא לעתים קרובות לא קבוע ויכול להשתנות במידה רבה על פני אוכלוסיית תא או אפילו בתוך תא בודד בהתאם לפעילותו השוטפת. גורם נוסף שתרם יכול להיות שעל מערך micropost תא נאלץ לבצע צעדי הגירה בדידים להגיע micropost אחר, שהוא בניגוד לTFM הקלאסי, שבו תאים לדבוק משטחים שטוחים וניתן להעביר בצעדי דקות. עם זאת, על מנת לנתח את הצעדים קטנים האלה יש צורך לקחת תמונות ניאון של נקודות הידבקות מוקד, אשר דורשת גישה למטר מאוד מתקדםicroscopes ותוכנת ניתוח תמונה מורכבת מאוד. יחד עם זאת, חלוקת פרופילים מכאניים בתוך אוכלוסיות גדולות יותר היא עדיין לעתים קרובות מאפיין בולט של קו תא. כך שיטת תפוקה גבוהה, המאפשרת אפיון של מספר גדול של תאים חיונית. התהליך הידני ההדמיה ותוכנת גישה פתוחה שהוצג כאן נמלי פוטנציאל גדול לקנה מידה למערכות מיקרוסקופ אוטומטי מלא.

לסיכום גישת כוח המתיחה מיקרוסקופית חזקה שמוצגת הוא לאימוץ בקלות במעבדה בביולוגיה של תא סטנדרטית. כל העבודה מזריעת תאים לניתוח תמונה היא פשוט ויעיל. בעוד הפרוטוקולים שתוארו כאן הם מתפקד במלואה, השיפורים מתמשכים להתאים את אלגוריתמי הניתוח כדי להיות מסוגל גם להתמודד עם מערכי micropost עם פריסות המאונכות ונהלי פיתוח המפשטים את ניתוח רצפי תמונה מהדמית תא חי. בהקשר עם התוצאות עבור li תאי סרטן העצםנס, הגישות המתוארות כאן יכולים לשמש לתאי מסך מביופסיות קליניות על מנת לקבוע אם מבחני כאלה עשויים להחזיק ערך פרוגנוסטיים, המאפשרים לרופאים לחזות את הפוטנציאל גרורתי של תאי ביופסיה מחולים בסרטן העצמות. כגון assay ישפיע אסטרטגיות הטיפוליות. יישומים אפשריים אחרים מתייחסים לתרכובות פעילים pharmaceutically בדיקות על תאים מכניים פעילים כמו תאי שריר חלק או שריר לב, שעלול לסייע בהקמת היעילות של תרופה או רעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T25 cell culture flasks Nunc 156367
1x PBS-buffer Sigma D8537
0.5% Trypsin-EDTA Life Technologies 15400054
Medium DMEM/F12 Sigma D8437
FBS South America Life Technologies 10270106
Penicillin-Streptomycin 100x Sigma P4333
15 ml centrifuge vials Sarstedt 62.554.502 
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin MicroDuits MPA-col1/FN Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A. Merck 100.983
12-well plate Nunc 150628
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma HT5011
Brilliant Blue G-250 Sigma 27815 Coomassie blue
Methanol ACS p.A. Merck 1.06009
Acetic acid Sigma 695092
Glass bottom dish WillCo Wells BV GWSb-3522 35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse Nikon n/a Inverted microscope
D3-L3 Nikon n/a Camera controler
DS Fi2 Nikon Camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
  2. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
  3. Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
  4. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  5. Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
  6. Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
  7. Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
  8. Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
  9. Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
  10. Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
  11. Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
  12. Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
  13. Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
  14. Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
  15. Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
  16. Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311 (2007).
  17. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
  18. Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 105 mechanobiology הידבקות תא מכניקת תא התכווצות מטריקס כוח המתיחה מיקרוסקופי assay mechanosensitive
Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goedecke, N., Bollhalder, M.,More

Goedecke, N., Bollhalder, M., Bernet, R., Silvan, U., Snedeker, J. Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays. J. Vis. Exp. (105), e53350, doi:10.3791/53350 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter