Enkelt och exakt Mechano-profilering på Micropost Arrays

Introduction

Mekano känsliga cellbaserade analyser tillåter för att undersöka vidhäftande celler, med ett brett spektrum av tillämpningar som återspeglar den centrala roll som mekaniker kan spela i cellbiologi. Dessa program fokuserar ofta på de bakomliggande mekanismer som driver subcellulära processer eller hela-cellens beteende. Å ena sidan, kan yttre miljöfaktorer såsom extracellulär matriskomposition eller matrisstelhet dramatiskt påverka den mekaniska och biologiska responsen av en cell. ¹ Detsamma kan observeras efter användning av många klasser av farmaceutiskt aktiva föreningar, vars effekter är kännetecknas ofta med hjälp av cellodlingsmodeller. ² Å andra sidan genotypiska egenskaper, såsom de som orsakas av spontana eller experimentellt inducerad genetiska mutationer, kan inducera markerade förändringar i cellfenotyp som är associerade med förändringar i cytoskelettet struktur och funktion. ³ Dessa exempel är bara några av de många möjligaämnen för vilka mekanisk fenotypning av celler är relevant, och alla dessa har fördel undersökts med micropost matriser.

Vid tidpunkten för denna skrift, har cirka 200 artiklar publicerats som beskriver cell micropost interaktion. Dessa arbeten diskutera teoretiska aspekter av micropost böjnings principer samt praktiska anvisningar om deras tillverkning. Den första artikeln beskriver samspelet mellan celler och flexibla micropost matriser publicerades av Tan och kollegor under 2003. ⁴ I motsats till klassisk dragkraft mikroskopi (TFM) där kontinuerliga mjuka underlag används för att uppskatta nanonewton skala cellkontraktilitet, Tan et al. beskrivit ett förfarande med hjälp av flera tätt åtskilda vertikala balkar av silikonelastomer. De främsta fördelarna med denna teknik dyker upp från två viktiga funktioner. Först för att ändra cell uppenbara substrat styvhet behöver man bara ändra micropost dimensioner samtidigtsubstratkompositionen annars konstant och därmed undvika skillnader i ytan topologi och kemi. Andra microposts agera som enskilda fjädrar som kan diskret analyseras med kraft och rumsliga resolutioner om i storleksordningen enskilda fokala sammanväxningar och kan minska de analytiska utmaningar som är förbundna med liknande analys av standard TFM.

Idag utbudet av applikationer för micropost arrayer vida överstiger bara kartläggning av krafterna för några enstaka celler. Exempelvis Akiyama rapporterar användningen av en isolerad dorsala kärl vävnad från en mal caterpillar som ett manövreringsorgan för en micropost matris, i syfte att utveckla en insekt muskeldriven autonom mikro roboten. ⁵

Emellertid har de flesta publicerade tillämpningar av microposts fokuserat på studier av medicinska tillstånd som infektion eller cancer. Exempelvis har micropost arrayer använts för att studera kraftgenereringen av medföljande typ IV pili av Neisseria gonorrhOEA kolonier som är associerad med signalkaskader öka infektion. ⁶ Andra har använt microposts att studera celler bröstcancer som behandlats med läkemedelssubstanser som riktar cytoskelettet. ⁷

Avböjning av en micropost beskrivs ofta med användning av klassisk balkteori för en konsol med en ändbelastning med antagande cellen fäster endast till den yttersta spetsen av den micropost. Här den anbringade kraften F som orsakar en nedböjning δ beror på micropost s "böjstyvhet" k och beräknas genom:

(1)

med E, I och L är Youngs modul, område tröghetsmoment och bomlängd respektive. Men resultaten från denna ekvation ger endast en allmän uppskattning av de krafter i arbetet, eftersom strålen klippning och bockning samt substrat skevhet inte tas i acräkna. Med tanke på att microposts är oftast gjorda av mjuka material som polydimetylsiloxan (PDMS) -baserade silikongummi dessa faktorer måste tas med. . Schoen m.fl. visade att det finns en sådan korrektionsfaktor baserad på bildformat för micropost (L / D) och motsvarande polymerens Poisson förhållande v ⁸ Det ges av.:

(2)

Med T _tilt (v) är en tiltkoefficient som innehåller passande parameter a = 1.3 som kan hittas i samma artikel:

(3)

Det innebär en micropost rättade styvhet k _corr är produkten av den rena böj styvhet k = k _{böj och} korrektionsfaktorn corrgetts av:

(4)

Därför bör cellkraftberäkningar utföras med mer förfinad variant av ekvation (1) nu läser:

(5)

Effekterna av korrigeringen blir mer uppenbara så snart som typiska värden för micropost dimensioner används. Till exempel, en 15-micron långa micropost med ett cirkulärt tvärsnitt och en diameter av 5 pm gjord av PDMS-baserade silikongummi leder till en korrektionsfaktor på 0,77 och därmed ett okorrigerat beräkning skulle överskatta utövade cellkrafterna med 23%. Detta blir ännu allvarligare för microposts med mindre bildformat.

Traditionellt har micropost bildanalys även baserats på idealiserade balkböjning teori. År 2005 den grupp som börjat använda sig av MICRopost arrayer publicerade en bildanalysprogram lämpad för micropost analys ⁹ Programmet kräver en programvarulicens och användaren måste ta tre bilder för varje position. en vardera från micropost s topp- och bottenplan i sändningsläge och en annan i fluorescensläge med den färgade cellen. Efter att ha jämfört de övre och nedre positionerna för varje micropost mjukvaran bestämmer en kraftvektorfält och beräknar relaterade parametrar såsom kraft per tjänst. Andra mjukvarupaket finns och deras analys principer kortfattat nämns i motsvarande artiklar som beskriver dem, men dessa analytiska programvarupaket är i allmänhet inte tillgängliga för allmänheten. ^10,11

De micropost matriser avsedda för kartläggning cell krafter kan klassificeras som antingen är i ett ortogonalt micropost layout eller en hexagonal en, den senare som har fördelen av ekvidistanta mellanrum mellan alla grann microposts. Typiska microposts hektarve ett cirkulärt tvärsnitt och deras dimensioner varierar från 1,0 | im till 10 | j, m i diameter och två till 50 ^ m i längd. ⁴ emellertid microposts med elliptiskt eller kvadratiskt tvärsnitt har också rapporterats. ^12,13

Användningen av PDMS-baserade silikonblandningar som micropost material medger att lägga till nanopartiklar i blandningen. Till exempel att lägga till kobolt nanostavar möjliggör en magnetisk aktivering av micropost och därmed ger ett annat frihetsgrad till potentiella experimentell design. ¹⁴ De flesta grupper producera sina micropost arrayer på plana styva substrat såsom skyddsglas eller inuti en petriskål. Men Mann och medarbetare rapporterade nyligen en micropost array bildas på ett töjbart membran. ¹⁵ Detta gör att tillämpningen av cellsträckkrafter till vidhäftande celler medan de studerar levande celler subcellulär dynamiska svar när det gäller cellkontraktilitet.

Den allmänt använda och mest om inrättandeinrättats förfarande för framställning micropost matriser är baserad på mjuk litografi, såsom beskrivs i de insikts protokollen för Sniadecki och kollegor. ^16-18 I korta standardrenrumsprocesser används för att generera mikrostrukturerna på toppen av en kiselskiva med användning SU8 fotoresist. Detta följs av en kopieringsprocess, vari silikongummit gjuts över de strukturer överföra dem i formar. I ett andra steg är dessa formar användes för att replikera den initiala mikrostruktur med användning av silikongummi på toppen av ett valt substrat. Men trots det stora och växande antal publikationer relaterade till deras ansökan om upprättande av ett tillverkningsprocess för microposts tar avsevärd tid även för mikrotekniska experter, det finns många processteg som kräver optimering och anpassning till den specifika labbmiljö och micropost layout för att ge en acceptabel kvalitetsnivå.

Kommersiella micropost arrayer finns nu i en färdig-to-användning ("off-the-shelf") format med en genomgående hög kvalitet. Som sådana är de ett alternativ till de komplexa och tidskrävande tillverkningsprocess som krävs för tillverkning på plats. I denna uppsats en kommersiellt tillgänglig micropost array användes för att kartlägga cellulära krafter med hjälp av en enda ljusa fält mikroskopi bild. Ännu viktigare här artikeln beskriver och dokumenterar en fullt fungerande öppen källkod som heter MechProfiler, som är tillgänglig för nedladdning som kompletterande material till detta manuskript. En aktivt underhållna version av programvaran kan också hittas på http://www.orthobiomech.ethz.ch.

Kombinationen av en "off-the-shelf" analys och en kompatibel öppen källkod analysprogram sänker markant posten hindret för att uppnå korrekta TFM experiment. Forskare utan tillgång till vare sig renrumsfaciliteter eller mjukvaruutveckling expertis kan analysera cellulära krafter framgångsrikt. Det gör det möjligt för en användare att inrikta sig på de mechanosensitivity analys utgång snarare än tekniken i sig, och gör dragkraft mätningar tillgängliga för en bredare gemenskap. Dessutom är detta ett viktigt steg för att bana väg för helautomatisk screening av micropost matriser.

Den MechProfiler analysprogram behandlar bilder i filformatet tiff, png, bmp och jpg. Bilderna kan tas med användning av fluorescens, faskontrast eller ljusfält Ijusmikroskopi. Den fristående program körs tillsammans med den fria Matlab Compiler Runtime (tillgänglig på: Figur 12) och underliggande algoritmer möjliggör strömlinjeformad bildbehandling, vilket gör det möjligt för användaren att bearbeta bilder med enkla eller multipla celler i ca 1 min. Vidare kan dessa celler antingen levande eller "fasta".

Den MechProfiler programvara kan kraftigt öka dataanalys genomströmningen genom att förlita sig på reproducerbarhet kvalitet kommersiella micropost arrayer, närmare bestämt standard & #8220, icke-böjs "position varje inlägg i gruppen kan antas mot en idealisk galler (avvikelser för nätet i grupperna som används i denna studie var mindre än 100 nm).

Kort sagt en öppnar ett urval av bildfiler för analys, beskär dem till regionen av intresse, definierar de tjänster som omfattas av celler eller som måste kasseras, bestämmer postpositioner, beräknar deflektioner / krafter mot den ideala nätet, och slutligen sparar alla cellspecifika data med möjlighet till export, bland annat till en vanlig kontors kalkylblad.

Protocol

1. odling av celler på Micropost Arrays

Obs: Alla steg måste utföras i en biosäkerhet skåp för att säkerställa sterilitet. De volymer som anges här är för T25 cellodlingsflaskor. Cellodlingsmediet recept och cellsåddtäthet är optimerade för ben cancercellinjer HuO9 och M132.

1. Förbered en cellkultur för sådd på en micropost array.
   1. Inspektera cellodlingskvalitet genom att placera odlingskolven på en standardljusmikroskop. Se till att cellerna visar en typisk tillväxt och morfologi genom att uppskatta hur mycket av odlingskolven botten är täckt. En täckning på 70% -80% återspeglar en sund tillväxt. Var uppmärksam på mängden flytande celler eftersom de utgör döda celler och / eller en övervuxen kultur.
   2. Trypsinisera celler genom avlägsnande mediet och tvättning med 4 ml 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) -buffert. Lägg 0,8 ml 1x Trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och inkubera vid RT tills cellens RUBBA, som tar ca 2-4 min. Kontrollera processen med mikroskop och ibland knacka kolven försiktigt för att stödja lossnar.
   3. Lägg 5 ml cellodlingsmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) / F12 med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptavidin (Pen / Strep)) för att stoppa reaktionen och för att tvätta bort kvarvarande celler som fortfarande sitter på kolven botten. Pipettera denna suspension upp och ned flera gånger för att få en homogen blandning. Se till att pipet alla lösningar över den ursprungliga tillväxtområdet kolven att få en effektiv rubbning.
   4. Överför cellsuspensionen i ett 15 ml rör och centrifugera den med en bordscentrifug vid 0,5 xg under 3 min.
   5. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 ml medium genom pipettering upp och ned 5 gånger. Se till att undvika uppkomsten av bubblor medan du gör det.
   6. Bestämma celldensitet genom användning av en cellräkningskammare och en lätt microscope. Kontrollera cellsuspensionen i cellräkningskammare för cellaggregat och säkerställa att endast ha enstaka celler för efterföljande experiment. Pipett igen upp och ned flera gånger om cellerna tenderar att bilda aggregat för att åtskilja dem.
   7. Späd cellsuspensionen med tillräcklig medium för att få en cell lösning av 25.000 celler / ml. Blanda väl genom att vända det slutna röret flera gånger.
2. Förbered en micropost array för cellsådd.
   Kritisk Obs: Inte pipett på micropost arrayen direkt eftersom detta skulle kunna skada microposts, särskilt när oönskade bubblor introduceras. Dessutom, se till att micropost arrayen torkar aldrig ut som inträffar kapillärkrafterna leder till kollaps av microposts.
   1. Placera glassubstrat med micropost arrayen sidan uppåt i en brunn i en 12-brunnsplatta med hjälp av en pincett och fukta det genom tillsats av 1 ml etanol (99%). Inkubera vid rumstemperatur under 20 till 30 sek.
   2. Späd etanolenstegvis genom att tillsätta cirka 1 ml sterilt avjoniserat vatten (DI vatten) på väl sidan och aspirera ca 1 ml med hjälp av en pipett eller aspiration enhet. Upprepa detta steg åtminstone 3 gånger.
   3. Ersätt DI-vatten med PBS-buffert på samma sätt genom att lägga till och aspirera ungefär 1 ml. Upprepa detta steg 3 gånger.
   4. Byt ut PBS-buffert med medium genom att tillsätta och aspirera ca 1 ml medium. Upprepa detta steg 3 gånger.
3. Pipett 1 ml cellösningen (25.000 celler) på toppen av varje beredda micropost array. Stäng flera brunnar och överföra den till en inkubator (CO ₂ 5%, 37 ° C). Låt cellerna fästa och växa på toppen av microposts för 6 -7 timmar.
4. Inspektera adhesionsprocessen ibland genom användning av en ljus ett mikroskop. Kontrollera att de flesta av cellerna visas utspridda över flera microposts.

2. Fastställande och färgade celler

Obs: Alla steg ochvolymer som anges här är för en enda brunn i en 12-brunnar. Det rekommenderas att bearbeta högst fyra av de tolv brunnar vid en tid för att undvika en uttorkning av brunnarna efter aspiration av någon vätska, vilket resulterar i en kollaps av microposts.

1. Aspirera medium från brunnen och tvätta cellerna 2x med 1 ml PBS-buffert. Se till att applicera en mild kraft medan tvättning med PBS för att avlägsna cellrester som samlats på micropost matrisen under inkubation och för att lösgöra döda celler.
2. Fixera cellerna med 0,5 ml 3,7% buffrad formaldehydlösning under 5 min.
3. Byt formaldehydlösningen genom tvättning av micropost array 2x med 1 ml sterilt avjoniserat vatten.
4. Färga cellerna med färgämne (0,05% Coomassie Brilliant Blue i 50% vatten, 40% etanol och 10% ättiksyra) under ca 90 sek. Tvätta överskott färgningslösning av 2x med 1 ml sterilt avjoniserat vatten. Tillsätt 1 ml Dl-vatten för att micropost arrayen.
5. Kontrollera färgning resultat med användning av ett ljusmikroskop. Upprepa than färgning steg, om cellkroppen är för svag för att visualiseras.
6. Butiks micropost arrayer med färgade celler på toppen i kylskåp vid 4 ° C. Se till att hålla dem under vatten vid alla tidpunkter.

3. cell imaging

Obs: Steg 4 gäller endast mikroskop utan oändlighet korrigeras optik.

1. Lägg 2 ml Dl-vatten till en petriskål med en tunn glasbotten för högupplöst avbildning.
2. Överför micropost array med en pincett i bild skålen med microposts uppåt.
3. Placera avbildning petriskål på en flyttbara steget av ett ljusmikroskop.
4. Vrid kompensationsringen på objektivet används för avbildning tills numret på skalan representerar den totala tjockleken av alla material längs den optiska vägen för att kompensera för obalansen i brytningsindex för glassubstratet, silikonelastomeren och vätskan på toppen. Detta bör leda till ett ljust utseende på micropostskärnor.
5. Stäng iris på belysningssidan ner till 50% och ta bort eventuella fas kontrastringar från den optiska banan möjliggör en vanlig ljusfält läge.
6. Rikta micropost array att microposts bildar en horisontell linje över observationsområdet. Definiera en startpunkt (t.ex. längst upp till vänster) och flytta petriskålen stegvis över scenen skanna micropost uppsättningen samtidigt som ett stort antal bilder.
7. Ta alla bilder med högsta upplösning för kameran med en 20X eller 40X objektiv. Sikta på att ha en enda cell i mitten av bilden.
8. Sopa längs z-axeln genom substratet tills micropost tips är i fokus. Använd finjustering fokus hjul mikroskopet och vrid den mot att fokusera på micropost botten för ca 2-3 pm.
9. Inrätta en standard avbildningsförfarande genom att ta serie testbilder av en array avsnittet sveper genom bild parametrarna en i taget (t.ex. exponeringstid,iris inställning, lampa inställningar etc.). Analysera bilder MechProfiler och bestämma en lämplig parameteruppsättning för en snabb och tillförlitlig analys.

4. Bildanalys med Open Source Software "MechProfiler"

Obs: Alla mjukvarufunktioner kan aktiveras med ett pekdon med hjälp av vänster musknapp. Dock kommer en utbildad operatör använder de dokumenterade kortkommandon utformade för att vara på den vänstra halvan av tangentbordet för att möjliggöra en effektiv två-handed bildbehandling.

1. Starta bildanalysmjukvara MechProfiler och öppna en rad bilder som måste analyseras genom att klicka på "Open".
2. Sätt alla parametrar i avsnittet "Inställningar" från programutvecklare. Bestämma de parametrar som måste vara anpassade konfigurerade (dvs. konturtröskeln och minimalt avstånd) enligt de förfaranden som beskrivs i detalj av mjukvaran.
3. Analysera bilds en i taget genom att beskära dem till området av intresse genom att använda "Crop" (klicka och dra med musknappen nedtryckt). Dubbelklicka inuti den dragna rektangel för att avsluta denna åtgärd.
4. Märkning varje synlig cell skissera en efter en genom att klicka på "Rita cell konturerna" och använd hårkorset för att rita inklusive alla microposts cellen knutna till.
5. Kasta oönskade microposts genom att klicka på "Släng inlägg" och använd hårkorset för att rita. Innesluta alla microposts som hör till en cell utanför bildsektionen eller som böjs av någon annan anledning, men inte av cellen av intresse.
6. Starta programmet subrutinen "Hitta centroids" av musklick. Justera filtret inställningen intill "Sök centroids" knappen tills alla microposts registreras, vilket syns genom ett rött kryss i sitt centrum. Om inställningen filtret är alltför låga microposts kommer att ignoreras, om den är för hög multiple positioner markeras för en enda micropost. Håll filtret inställningen konstant under en analys session.
7. Använd den manuella redigeringsfunktion "Manuell Redigera" för centroider med flera eller missade micropost positioner. Använd musen korset för att välja micropost i fråga genom att klicka och dra den över. Dubbelklicka inuti rektangeln och placera den saknade röda markören i den förstorade bilden avsnitt, som automatiskt stänger. Kasta en sådan micropost om det är utanför den ritade cell kontur (se steg 4,5) innan du fortsätter.
8. Hitta den idealiska micropost nätet genom att aktivera "Generera Grid" funktion med ett musklick. Se till att positionen motsvarar den sanna micropost huvudet, framgår av en blå ring, inuti den dragna cell kontur.
9. Rätta någon felplacerad grid tillverkare inuti cellen där det behövs med hjälp av motsvarande "Manuel Redigera" funktion med ett musklick. Använd hårkorset för att välja micropost i question genom att klicka och dra den över. Dubbelklicka inuti visas rektangeln och placera den saknade blå markören i den förstorade bilden avsnitt, som automatiskt stänger.
10. Använd knappen "Beräkna Nedböjningar" genom musklick för att få ett histogram av de beräknade böjningsvärden baserat på skillnaden mellan en micropost position inne i bildsektionen och den genererade perfekt nätet.
11. Spara komplett analys inklusive tabeller med värden genom ett musklick på "Spara".
12. Fortsätt bildanalysen antingen genom att klicka på "Reset View" och analysera en annan bild sektion eller musklick på "Nästa bild", som lämpligen kan göras med hjälp av rätt tangentbords markören nyckel.

5. Data Analysis - Mechanoprofiling

1. Öppna filen "results.xls" med ett kontor kalkylprogram från mappen med de analyserade bilderna. Den innehåller data med all beräknade värden inklusive alla micropost omläggning och standardiserade derivat åtgärder såsom arbete (dvs substrat deformation energi) av det analyserade cellen.

Representative Results

Den största fördelen med den beskrivna tekniken ligger i dess enkelhet och potential för snabb och effektiv integrering i den rutinmässiga laborationer. Kombinationen av högkvalitativa kommersiella sensorsystem parat med öppen källkod ger information om mekano-känslighet som annars skulle kräver tillgång till renrumsfaciliteter och fördjupad kunskap om bildanalys och mjukvaruutveckling. Figur 1 visar arbetsflödet för den presenterade metoden. Det börjar med att förbereda och sådd celler på micropost array. Efter fixering och färgning av cellerna de micropost arrayer är redo för bildframställning. Den centrala delen av tekniken är bildanalys med hjälp av MechProfiler programvaran. En användare kan börja analyszng bilder direkt efter att alla relevanta parametrar i "Inställningar" i GUI. Motsvarande pixelstorlek är längden som representeras av en enda pixel och beror på användarens inställningar. Den behöverfastställas separat för varje använd förstoring genom att ta bilder av objekt med känd storlek. Ett exempel ges i det kompletterande figur 9.

Bildkvaliteten är en nyckelfaktor som påverkar starkt analysprocessen. För att uppnå högsta kvalitet bör man se till att ha en stabil och rutinmässigt service avbildning plattform som visas i figur 2. I synnerhet, är anpassningen av ljuskällan viktigt eftersom snedställning kommer att orsaka oönskade skuggor som kan vara problematiskt när man analyserar bilder. Vidare placera ljusmikroskop ovanpå ett antivibrationsbord eller plattan är fördelaktigt i de flesta laboratorier som det ger ytterligare stabilitet under avbildning.

Fördelarna med att använda ett tunt glas botten petriskål för avbildning inkluderar högre effektiva numeriska bländarvärden som översätts till ljusare bilder med högre upplösning.

När Taking bilderna i ljusfält läget en 50% slutna iris rekommenderas, som fokuserar på microposts tips underlättas på grund av de periferier som uppträder som en skarp mörk ring. Dessutom, om den använda målet har en kompensationsringen, är det viktigt att ställa in den rätt att erhålla korrekta kraft avläsning. Effekterna av den funktionen kan ses genom att jämföra fig 3A och fig 3B. Bilder som snabbt kan analyseras uppnås genom att kombinera den korrekta inställningen av kompensationsringen tillsammans med optimal belysning, såsom visas i fig 3C. Stark kontrast mellan en micropost och dess omgivande minskar analystiden som det snabbar sökningsalgoritmen. Användarna kommer att tycka att endast minimal erfarenhet krävs för att uppnå bilder som kan analyseras med lätthet.

Det är viktigt att protokollen ovan övervinna en kritisk och gemensam hinder för en snabb och effektiv integrering av micropost matriser i rutinlaborationer. Detta hinder härrör från behovet av att kontrollera array kvalitet - ett krav som kan uppnås endast genom noggrann och detaljerad försöks karakterisering av sensor reproducerbarhet, känslighet och precision. Men genom att vända sig till kommersiellt tillgängliga micropost arrayer denna betydande hinder undviks helt. Figurerna 4A och 4B illustrerar noggrannheten hos sådan micropost matris. Avvikelsen av microposts utgångsläge ligger väl under 200 nm och som sådan kan jämföras med en "pixel fel" som medföljer kameran / objektiv kombination som resulterade i en pixelstorlek på 82 nm för den använda inställningen. Analysen av bilder med celler avböjande de microposts visar att värdena för en cell pålagda nedböjning är väsentligt högre än 200 nm (såsom visas i figur 4C och figur 4D) som leder till en bekväm signal-brusförhållande.

Figur 5 illustrates de olika utseenden för microposts inom en bild beroende på om det avlänkas eller inte. Som nämnts ovan icke avböjda microposts har en ljus cirkulär utseende med en mörk ring runt dem. Deras ståndpunkt kan fastställas med hjälp av en Hough transformation, vilket är en feature extraction teknik för digital bildanalys.

Dessutom visar det sig att avböjda microposts på ett inverterat mikroskop visar två motstående mörka halvmåne former (se figur 5A). I en upprätt mikroskop kanten av micropost spetsen och en mörk halvmåne form är ordentligt synliga medan den andra en blir svåra att upptäcka. Dessa egenskaper är grunden för beräkningen av positionerna av ljusa fält mikroskop bilder av tips från avböjda microposts, som har utvecklats för detta protokoll och hette "Contour Approach".

Figur 5B är ett exempel på en HuO9 bencancercell på microposts avbildade på ett inverterat mikroskop (överst). Den analyserade version av den bilden visar resultaten från den pålagda konturtillvägagångssättet (botten). Figur 5C togs genom att använda samma micropost array med en upprätt mikroskop (överst). Återigen analyserade versionen visar resultaten från att använda konturtillvägagångssättet.

Varje bildanalys session inleds av en användare kontroll av parametrarna i avsnittet "Inställningar" i MechProfiler. Vissa är ges av micropost tillverkaren som micropost matrisdimensionerna och fjäderkonstant. Andra definieras av användaren, såsom värdena för kontur tröskeln och en minimal böjning tröskel enligt förfaranden som anges i handboken till programmet. Det är emellertid viktigt att notera att dessa värden bör väljas med omsorg och måste vara konstant för alla bilder i en sammanhängande uppsättning av bilder för att säkerställa jämförbarheten. De för-bearbetningssteg för bilden analysis, som beskärning, är självförklarande de bakomliggande strategier för programvarufunktioner som "Finding centroids", "Generera Grid" och "Contour Approach" behöver mer detaljerade förklaringar.

Algoritm detektering av standard micropost läge (som levereras av tillverkaren) börjar genom att använda "Söka centroider" programvara funktion. Algoritmen börjar i övre vänstra hörnet av en bild söker efter den första micropost. Därefter alla andra microposts finns baserat på koordinaterna för den första micropost plus värdena för nätet och micropost storlek anges av tillverkaren efter sexkantiga geometri. Tyngd för varje hittat micropost beräknas med en Hough transformation. Filter reglaget bredvid kommandoknappen i det grafiska gränssnittet tillåter justering av känsligheten hos denna omvandling. Alla hittade microposts är markerade med ett rött kryss och deras positioner noteras för subsequent processer.

Därefter leder "Generera Grid" -funktion för att koordinaterna för alla microposts tips. De är resultaten från en flerstegsprocess. Först en optimeringsfunktion är löst, inklusive de ursprungliga positioner från den tidigare avrättade "Hitta centroider" algoritm för att fastställa den idealiska nätet. Andra positionerna för microposts inuti cellen området beräknas. Microposts med mindre nedböjning än definierade i inställningen parametern "Minimum nedböjning tröskel" i förhållande till den ideala nätet behandlas med en Hugh transformation. Alla andra micropost spetspositioner beräknas med tillämpning av ovan beskrivna kontur strategi för avböjda microposts. Här programmet börjar söka från den ursprungliga tyngdpunkten bort från cellkärnan för en cirkulär kant (ljus till mörk) inom en vinkel på 15 ° (se figur 5A). När denna kant påträffas en cirkel med given micropost diametern är monterad till thatt kanten med konturtröskelvärdet från inställningarna i GUI. Denna parameter bestämmer vilken pixel gråvärde används för anpassningsprocessen. Ju högre detta värde är desto mer passande lutar mot ljusare micropost centrera lägre än värdesätter mer det passar att cirkeln till mörkare micropost kontur. När valt detta värde bör vara konstant för alla bild analyser inom en given studie för att undvika att lägga konstgjorda böjning eller ringa deflektioner alltför konservativt.

Till exempel visar fig 6 illustrerar betydelsen av att avgöra en lämplig kontur tröskelvärde. Mjukvaran gör det möjligt för användaren att välja för ett brett spektrum (0,1 till 0,9) till att omfatta alla fysiskt möjliga belysningssituationer. Översättningen av den optiska informationen i böjnings avstånd som anges för båda ytterligheterna och ett mer praktiskt värde i mitten ges i figur 6B. Men utbildade programvara användare ofta converge till mycket likartade kontur tröskelvärden, vilket leder till jämförbara resultat som kan ses i figur 6C. Dessutom använder standardiserade förfaranden för cellfärgning och imaging minimerar risken för ogiltiga kontur tröskelvärden, som i allmänhet bör stanna konstant inom för sammankopplade bilder.

För att demonstrera robustheten metoden ett urval av mekano-profilering Resultaten sammanfattas i figur 7. I figur 7A två resultat från ben cancerceller HuO9 och två från M132 jämförs. Alla fyra arrayer är från samma tillverkningssats och därför har identiska mekaniska egenskaper. Analysen utfördes med en fast uppsättning parametrar för minimal nedböjning (0,25 um) och konturgränsen (0,125). Dessutom har två identiska uppsättningar av bilder från SaOS 2 skelettcancer ges till två analytiker utan vidare information om parameterinställningar (se figur 7B). Inverkan av färgningen på den analys testades genom att ta bilder av ben cancer celler färgade med Coomassie Blue R. Därefter färgämnet avlägsnades. Efter re-färgning med Coomassie Blue G en andra uppsättning bilder togs. Figur 7C illustrerar resultaten från båda serierna, som analyserades av samma användare med identiska värden för den minimala nedböjning (0,25 | im) och tröskelkonturen (0,25) .

Ett typiskt exempel på tillämpad mekano-profilering visas i Figur 8A, där den sammanställda data presenteras för ben cancercellinjer HuO9 och M132 efter att ha analyserat 151 celler poolade från var och en av fyra matriser. I denna översikt samtliga indikatorvärden är högre för HuO9 än M132 redan indikerar att HuO9 celler tillämpa mer kraft än M132. Data från bildanalysen innehåller emellertid en stor mängd ytterligare encelliga information som kan brytas för att bättre förstå fenotypic cellinje beteende och cell-till-cell-variation inom en viss linje. Genom att presentera resultaten för den kraft per micropost i ett lådagram finner man att trots liknande minima och maxima är datavärden olika fördelade och faktiskt låg metastatisk cellinje HuO9 celler tenderar att tillämpa mer kraft än den mycket metastatisk M132 linjen (se figur 8B). Vidare genom att kategorisera de kraftvärden med avseende på den cellområdet en finner att den genomsnittliga kraften per cell inte bara är förhöjd för HuO9 celler jämfört med M132 utan även att den genomsnittliga kraften per micropost ökar när cellerna sprids tills genomsnittlig kraft per post når ett mer stabilt värde (såsom kan ses i figur 8C). Dessutom för celler som täcker sju microposts värdena är nästan identiska, vilket troligen beror på det faktum att de visas normalt i hexagonal form med en central icke-böjs micropost oberoende av deras cellinje. Bortsett från diffrenser kontraktionsförmåga, kan morfologiska skillnaderna kvantifieras med intressanta resultat. Till exempel i motsats till de ytterst metastatiska M132-celler fanns mycket få HuO9 celler som täckte endast tre microposts. Andra morfologiska jämförelser mellan cellinjerna kan göras, bland annat fördelningen av cellområde som representeras av antalet microposts omfattas. Figur 8D visar att de två cellinjer skiljer sig också i dynamisk spridning beteende när växer på toppen av microposts. Kort sagt, mechanoprofile för modercellinjen HuO9 visar att de täcker vanligtvis ett större område och tillämpa lite mer kraft microposts medan den metastatiska cellinjen M132, en aggressiv cell som härrör från HuO9, karakteristiskt omfattar färre microposts och tillämpar mindre kraft per micropost . Dessa resultat visar potentialen hos en TFM baserad strategi för diskriminerande tillämpningar.

Figur 1. Experiment Workflow. (A) Den totala proceduren innehåller fem på varandra följande stora steg från sådd celler på en micropost array för att profilera sina mekaniska egenskaper. (B) bildanalys utförs med den beskrivna MechProfiler programvaran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Imaging Setup. En standard inverterat mikroskop används för att avbilda celler på micropost matriser. Installationen innehåller också en mikroskopkamera och dess styrning, som även kan ge datalagringsfunktioner. Den stora skärmen som visas är inte nödvändigt men ändå är bekvämt för utökad avbildningsessioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Riktlinjer för micropost avbildning. (A) Bild av färgade celler på en micropost array tas med en 40X lins i ljusfält läge. Icke-avböjda microposts visas som mörka ringar när avbildas. Avlänkade inlägg antar en elliptisk form med både mörkare och ljusare underregioner. Färgade celler som täcker microposts gör dem verkar ännu mörkare till den grad att det inte finns någon skillnad mellan micropost och cell. (B) Identiska bilder tagna efter justering av linskompensationsringen och återfokusering. Här kärnor microposts blir betydligt ljusare och ge mer kontrast. (C) Samma läge avbildas igen efter justerting alla belysningsparametrar med kameran controller. De fritt stående microposts visas som ljusa cirklar med en mörk ring. Avlänkade microposts visar en tydlig halvmåne "skugga" runt bukten kärnan längs dragaxeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.>

Figur 4. MechProfiler skärm av analyserade microposts. (A) Ett typiskt exempel på en tom micropost array kan ses i denna skärmdump. De microposts är anordnade i ett konstant hexagonalt mönster. (B) Histogrammet med avböj värden för dessa microposts visar att alla värden ligger under 200 nm. (C) Typiskt exempel för en HuO9 bencancer celltäckandeoch dra i flera microposts. Det kan ses att mängden dragning är heterogen. (D) Histogrammet med böjningsvärdena för HuO9 cell visar det breda spektrum av böjningar som uppstår från cellerna interaktion med micropost substratet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Micropost framträdanden i ljusfält belysning och strategierna för att beräkna sin position inom en bild. (A) icke-avböjda microposts visas som en ljus cirkulärt område med en mörk ytterring. Tyngd beräknas genom en Hough transformation. Avböjda microposts visar mörka halvmåne former. Beroende på mikroskopet inställningen om microposts möta ligh t källa (t.ex. inverterat mikroskop) finns det två väl synliga halvmåne former. Om microposts inför linsen (t.ex. upprätt mikroskop) är väl synlig, men också själva kanten av spetsen endast en halvmåne. I båda fallen ska användas konturtillvägagångssättet för att beräkna micropost spets. (B) Ett original bild (överst) med användning av ett inverterat mikroskop från en HuO9 bencancer cellen och dess analyserade versionen (botten) med hjälp av kontur tillvägagångssätt. (C) Original avbildar från samma micropost array (överst) med användning av en upprätt mikroskop och den analyserade versionen, återigen applicera konturtillvägagångssättet (botten) men med en mycket lägre kontur tröskelvärde lämpligare för att anropa mörk ring-formad kant. Vänligen Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ladda upp / 53350 / 53350fig6.jpg "/>
Figur 6. Kontur strategi och välja lämplig tröskelvärdet. (A) De tre skärmdumpar illustrerar samma analyserade microposts med hjälp av tre olika kontur tröskelvärden. Om värdet är satt för lågt (vänster) eller för hög (till höger) än programvaran passar den blå ringen som representerar micropost huvudet felaktigt. Det underskattar eller skjuter den verkliga läget för micropost huvudet. En korrekt valt tröskelvärde gör att programvaran för att passa den blå ringen till halvmåneformad mörkt område inne i micropost som bildar genom böjning. (B) Diagrammet visar den genomsnittliga mängden böjning beroende på vald kontur tröskeln för microposts visas i ovan. Det visar också att de värden för microposts utanför cell kontur inte påverkas eftersom konturpassning inte tillämpas där. (C) Diagrammet visar att valetett tröskelvärde inom en måttlig intervall minimalizes risken för över- eller underskatta micropost omläggning. Skillnaden mellan de värden som väljs av olika utbildade användare är normalt mindre än 0,05, vilket resulterar i acceptabla skillnader i genomsnittsböjningsvärdena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7. Robusthet test för mekano-profil resultat från olika skelettcancer cellinjer; de felstaplarna representerar en standardavvikelse (A) Mechano-profilering resultat från fyra identiska micropost arrayer efter sådd HuO9 celler på rad 1 och M132 på matrisen 3 -. fyra dagar senare sådd HuO9 på rad 2 och M132 på matrisen 4. (B) Jämförelse av resultat från mechano-profilering bygger på identiska uppsättningar av bilder efter analys av två oberoende bedömare. (C) Jämförelse av bildanalysresultat från två olika bildserie första tas efter färgning med Coomassie Blue R och den andra efter fullständigt avlägsnande av färg och åter färgning med Coomassie Blue G. Klicka här för att se en större version av denna siffra .>

Figur 8. Mechano-profilering av ben cancercellinjer. (A) Jämförelsen mellan de två ben cancercellinjer HuO9 (låg metastatisk potential) och M132 (mycket metastaserande) Figuren visar att alla indikatorvärden är högre för HuO9 cellinje ( Totalt N = 302; två oberoende uppsättningar av experiment, felstapel = standardavvikelse). (B trong>) Den lådagram visar att de tillämpade krafterna per micropost är i nedre nano-Newton sortiment. Men HuO9 celler drar mer än M132-celler (Whiskers representerar data lägsta och högsta). (C) Ett liknande resultat kan ses genom att jämföra celler som täcker samma antal microposts. HuO9 cell applicera mer kraft än M132-celler. Antalet HuO9 celler som täcker tre microposts är inte representativt och endast ingår för fullständighet (felstapel = standardavvikelse). (D) De olika distributioner över antalet omfattas microposts visar att varje ben cancer cellinje har sin egen spridningskarakteristik när de interagerar med micropost arrayer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ppfig9.jpg "/>
Kompletterande Figur 9. Pixelstorleken för ett mikroskop inställning bestäms typiskt med hjälp av en särskild objektsglas med en skala bar på det; alternativt micropost array layout, som ges av tillverkaren kan användas. Till exempel 15 enheter med 13 mikrometer (195 um total längd) dividerat med 2.375 pixlar (upprättats med en bildbehandlingsverktyg) leder till 0,082 um / pxl. Klicka här att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Figur 10. Jämförelse av bilder av en HuO9 skelettcancercell tagen från samma position med användning av två belysningstekniker på ett inverterat mikroskop; DIO färgade microposts är grönt fluorescerande. (A ljusfält läge. (B) analyserade jag Mage tas efter att byta till grön fluorescens kanal utan omfokusering.   (C) Andra fluorescens bild efter korrigering av fokus till de allra micropost tips. (D) Overlay båda belysningskanalerna endast för illustrativa ändamål.   (E) Mechano-profilering indikatorer som resultat från de tre bilderna. Trots att korrigera fokus på fullt utslag kan inte beräknas från fluorescens bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Figur 11. Bild sekvens av samma position av fluorescerande färgade microposts använder DII på en upprätt mikroskop (A) Bright-fältsbilden. det finns tre microposts berör varandra vid spetsen. (B) Samma läge efter byte till den fluorescerande kanalen något över microposts huvuden. (C) Sänkning fokalplanet till den yttersta spetsen av de microposts. (DE) På varandra följande bilder efter ytterligare sänkning fokalplanet stegvis mot microposts "botten. (F) Bild av microposts efter att sänka fokalplanet inne silikonelastomeren substratet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Figur 12. Skärmdump på MechProfiler GUI. Typisk analysresultat från profilera en HuO9 skelettcancercell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta arbete syftar till att främja det gäller dragkraft mikroskopi genom att väsentligt sänka tekniska och praktiska hinder för inträde. Dessa hinder kommer från två sidor. Först och främst är de många icke-triviala tekniska utmaningar som måste övervinnas för att reproducerbart tillverka och experimentellt beställa en micropost array. För det andra, är det likaledes icke-triviala behov av en tillförlitlig halvautomatisk analys av encelliga krafter - med tanke på att ett typiskt experiment kan kräva analys av hundratals eller tusentals celler. De ovan beskrivna tekniker utvecklats för att göra micropost baserad dragkraft mikroskopi tillgänglig inom cellbiologiska laboratorier som inte har hemvist ingenjörskompetens. Sensorerna och analystekniker som presenteras i denna artikel bör tillåta icke-experter att lätt och exakt analysera de krafter som utövas av enskilda celler.

Förutom tillgång till en cellbiologi lab med åtminstone en mid-grade ljus-fält mikroskop, de beskrivna metoder kräver ytterligare några tekniska element. Här flesta användare kan utföra giltiga dragkraft mikroskopi experiment med ännu begränsad erfarenhet, trots kraften och mångsidigheten hos tekniken. Icke desto mindre finns det tre kritiska aspekter i den presenterade protokoll som måste beaktas. Först är det nödvändigt att säkerställa att de micropost arrayer alltid är täckta med vätska för att undvika att deras kollaps på grund av kapillärkrafter. Andra måste man optimera avbildningsparametrar för förvärvade micropost bilder, vilket sker bäst genom att ta serie bilder av samma array läge medan varierande exponeringstid, iris öppning, och ersättning ringpositionen. Det är viktigt att hitta rätt fokalplanet för micropost spetsen, och denna aspekt tar lite erfarenhet med tanke på den lilla dimensionella djup sensoruppsättningarna. Tredje man måste ladda ner öppet tillgängliga bildanalysmjukvara MechProfiler discussed här, för vilka en detaljerad användarhandbok och träningsexempel finns på hämtningsplatsen. Efter viss erfarenhet av att använda programvaran för att analysera exemplen med den manuella, bör användaren ta testbilder på bildinställningar som ska användas för att konfigurera lämpliga mikroskop inställningar. Baserat på de erhållna bilder bör konturen tröskelvärdet på liknande sätt optimeras. En enda micropost bild kan analyseras av en utbildad användare inom en minut med öppen källkod MechProfiler programvara, oavsett om den innehåller en eller flera celler, vilket gör generering av statistiskt relevanta resultat (analys av flera hundra celler) inom några timmar .

En annan aspekt som kräver viss inställning är optimering av någon tillämpad cellfärgningsproceduren. När cellerna alltför färgas mjukvaran kan undgå att registrera rätt micropost positionerna. Å andra sidan om färgningen är för svag det kräver mer ansträngning av användaren för att detektera en"True" cell kontur som tunna cell utsprång kan missas.

Men genom att tillämpa en fast protokoll cellfärgning och array avbildningsförfarande intervallet för detta fel blir acceptabelt låg. Under detta arbete olika cellfärgningsförfaranden testades, baserat på olika koncentrationer av kristallviolett, närvaro av ytaktiva såsom Tween 20 eller Triton-X, eller en kombination av färgämnen genom tillsats eosin. Trots att intensiteten i färgningen samt dess stabilitet varierade kraftigt från experiment experimentera. Endast användning av Brilliant Blue G som beskrivits ovan visade en acceptabel cellfärgning robusthet i kombination med tillräckligt intensitet för att fortfarande se den tunna cell kontur men utan att störa den utvecklade konturtillvägagångssättet.

I allmänhet finns det alternativ för att ändra den presenterade tekniken. Till exempel genom att kombinera de ljusa fälttekniker som presenteras här med fluorescensmikroskopi färgning organsom kärnan eller aktin filament nät, vilket kan ge ytterligare information om de underliggande cellprocesserna i samband med cellmekanik. Vidare använder långkedjiga dialkyl carboxycyanines (DII eller DIO) de microposts blir fluorescerande. ¹⁴ Icke desto mindre är det viktigt att kontrollera varje avvikelse från den presenterade tekniken. De kompletterande figurerna 10 och Figur 11 illustrerar potentiella fallgropar. Bilder tagna av en Coomassie Blue G färgade NIH 3T3 fibroblastcell i det gröna fluorescenskanalen (Figur 10B och 10C) med hjälp av inverterat mikroskop presentera de viktigaste micropost organen men inte deras tips som leder till en felaktig positionsanalys (Figur 10E). Trots den bästa för att omfokusera efter byte från ljusfält-läge (fig 10A) de micropost tips kan inte avbildas, vilket skulle kunna bero på absorption av fluorescenssignalen av cellen fläcken. Detta är i motsats till imaGES tagna med den gula fluorescenskanalen av en upprättstående mikroskop (Figur 11B-11F), varvid multipla skarpa bilder kan vara erhålla längs z-axeln. Här kan användaren måste se till att bilden tas med fokalplanet längst ut på spetsen (Figur 11C) och inte någonstans närmare micropost botten för att undvika att ringa felaktiga böjnings värden.

Det bör noteras att det även finns tekniska begränsningar för micropost analyser. Till exempel, noggrannheten hos en detekterad böjning beror på kvaliteten hos den optiska installationen. Mikroskop ofta optimerade för fluorescens avbildning, där ljuskänsligheten på den anslutna kameran har en högre prioritet än ett stort antal pixlar. Naturligtvis leder detta till bilder med en större pixelstorlek. Vidare bör det noteras att ljus-fält bilder inte kan avgöra om cell utsprång når substratet botten. Men var de kommersiella micropost arrayer testats med hjälp av konfokalmikroskopi. Det visade sig att celler verkar för att acceptera den binära beläggning som främjar enbart vidhäftning på micropost spetsar och inte för resten av micropost arrayen. En annan faktor härrör från lägesfel av micropost arrayen, som har visat sig vara 0,2 | j, m. Tillsammans med den givna fjäderkonstant av 2,8 nN / um leder detta till ett fel i kraft utläsning av 0,6 NN. En annan begränsning för micropost analyser härrör från det faktum att de pålagda krafter från microposts delas av flera celler inte kan fastställas. Därför kan endast isolerade enkelceller analyseras. En särskild begränsning för den presenterade protokollet härrör från en korrekt tillämpning av den känsliga konturtillvägagångssättet, vilket kräver ett visst mått av utbildning för användaren för att få tillförlitliga resultat. Vidare, för en snabbare analys bör användaren ta bilder, varvid micropost arrayen är inriktad för att bilda en horisontell eller en vertikal linje längs kanten av observationsfältet. Despite av att mjukvarualgoritm för att hitta microposts inom ett hexagonalt rutnät geometri inte är begränsad av en rotationsvinkel för avbildning av microposts mer än 5 ° från axeln gör det svårt att beskära till en bildsektion utan att innehålla ofullständiga microposts, som sedan leder till en brist av "Generera Grid" -funktion. I ett sådant fall kan användaren använda den integrerade rotationsfunktionen innan du börjar analysera micropost positionerna.

Den beskrivna metoden i huvudsak tillämpas för att karakterisera två ben cancercellinjer, en modercellinjen namngav HuO9 och en härledd mycket metastatisk linje denominerade M132. I detta sammanhang över sexhundra encelliga bilderna togs i ljusa fält läge och analyseras med hjälp av MechProfiler programvaran. Den efterföljande data mining avslöjade att modercellinjen HuO9 utövar lite mer kraft och vanligtvis täcker fler microposts per cell än celler från metastaserande cellinje M132. Emellertid cellernavar inte synkroniserade och därför i olika stadier av cellcykeln vid tidpunkten för fixering, vilket sannolikt bidragit till det breda spektrum av resultat. Genom att ta levande cellbilder över tidsperioder på upp till 24 timmar, visade det sig att efter spridning många celler kvar på sin ursprungliga plats medan andra flyttar, spridning, koppla ur och flytta igen med olika hastigheter (se kompletterande videor). Detta tyder på att den mekaniska profilen av en cell är ofta inte konstant och kan variera kraftigt över en cellpopulation eller till och med inom en enda cell beroende på dess aktuella aktiviteten. En annan bidragande orsak kan vara att på en micropost array en cell tvingas att utföra diskreta migrations åtgärder för att nå en annan micropost, vilket står i kontrast till den klassiska TFM, där celler följa plana ytor och kan migrera med små steg. Men det är i sin ordning att analysera dessa små steg som krävs för att ta fluorescerande bilder av kontaktvidhäftningspunkter, som kräver tillgång till mycket avancerad microscopes och mycket genomarbetade bildanalysmjukvara. Ändå är fördelningen av mekaniska profiler inom större populationer fortfarande ofta ett kännetecken för en cellinje. Sålunda kan en hög genomströmning metod som möjliggör karaktärisering av ett stort antal celler är väsentlig. Den manuella avbildningsprocessen och öppen tillgång programvara som presenteras här hyser en stor potential för skalning till helautomatiska system mikroskop.

Sammanfattningsvis en robust dragkraft mikroskopi tillvägagångssätt presenteras som är lätt tillgängligt för adoption i en vanlig cellbiologi lab. Hela arbetsflödet från cell sådd till bildanalys är enkel och effektiv. Medan de protokoll som beskrivs här är fullt fungerande, förbättringar pågår för att anpassa analys algoritmer för att också kunna hantera micropost arrayer med ortogonala layouter och utveckla rutiner som förenklar analysen av bildsekvenser från levande cell imaging. I samband med resultaten för ben cancer cell lines, kan de metoder som beskrivs här kan användas för att screena celler från kliniska biopsier för att fastställa huruvida sådana analyser kan ha prognostiskt värde, gör det möjligt för läkare att förutsäga metastaspotential av biopsier celler från patienter skelettcancer. En sådan analys skulle påverka de terapeutiska strategier. Andra potentiella tillämpningar avser att testa farmaceutiskt aktiva föreningar på mekaniskt aktiva celler som glatta muskelceller eller kardiomyocyter, eventuellt för att underlätta upprättande av ett läkemedels effekt eller toxicitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera