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Immunology and Infection

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ doi: 10.3791/53364 Published: October 1, 2015

Abstract

専門のモバイル免疫細胞の非存在下では、植物は、病原体の攻撃から身を守るために彼らのローカライズされたプログラム細胞死と全身獲得抵抗性を利用します。プラント全体の免疫応答に特有のシロイヌナズナ遺伝子の寄与は、特異的かつ定量的に感染した組織内の病原体の成長を測定することによって評価することができます。 30年以上にわたり、hemibiotrophic細菌シュードモナスシリンPV。maculicola ES4326(PSMの ES4326)が広くシロイヌナズナ免疫応答の根底にある分子メカニズムを研究するためのモデル病原体として適用されています。葉組織への病原体を提供するために、複数の接種方法が確立されている、 例えば、シリンジ浸潤、ディップ接種、スプレー、真空浸透、および洪水接種。以下のプロトコルは、大人の葉に毒性の強いPSM ES4326を提供するために最適化された注射器浸潤法を説明土壌栽培シロイヌナズナ植物と正確には、この病原体に向けて強化された疾患感受性(EDS)をスクリーニング。また、このプロトコルは、さらに、サリチル酸(SA)-Triggeredイミュニティ(STI)とMAMP・トリガ免疫(MTI)を含む植物防御の異なる層内に特異的な免疫欠陥を分析するために、複数の前処理で補充することができます。

Introduction

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それらの固着性のために、植物は、常に様々なライフスタイルや栄養戦略1を示す病原体の過多によって脅かされています。壊死栄養性病原体積極的に秘密の毒素や酵素が宿主組織を殺すために、死んだ細胞1に供給するようにしながら、最初の近似として、生物栄養性病原体は、栄養素を取得する生きている彼らのホストを維持します。病原体と呼ばれるhemibiotrophsの別のグループは、病原体の蓄積2の特定のしきい値に達した時に壊死栄養段階への生物栄養段階とシフトとの感染のコースを開始します。効果的にこれらの微生物に対して自身を守るために、植物は、病原体の攻撃を検出してトリガするために、複数の監視機構を搭載した複雑な先天性免疫系を進化させてきた細胞死3だけでなく、全身獲得抵抗性(SAR)を4プログラム局在しました。現在の研究は不可欠SIGを特徴付けるに焦点を当てていますnalingコンポーネントと植物免疫系5内のクロストーク。

「ジグザグ」モデル5で提案されているように、植物の先天性免疫応答の最初の層は、微生物の侵入を検出するために、原形質膜局在パターン認識受容体(のPRR)の存在を必要とします。 PRRは、微生物関連分子パターン(ミリアンペア)を認識し、MAMP・トリガ免疫(MTI)6を確立することができます。抗菌PRタンパク7をコードする遺伝子の転写のアップレギュレーションを誘導するだけでなく、MTIは、細胞壁の活性酸素種の産生(ROS)および活性窒素種(RNS)、カロースの堆積を含む病原体の増殖を、停止イベントの様々なつながり同様に、複数のキナーゼシグナル伝達の活性化は、8が経路として。

これまで、いくつかのミリアンペア、細菌flg22 9を含む 、シロイヌナズナでMTIをトリガするために同定されています10(細菌の翻訳伸長因子Tuから18アミノ酸)11ペプチドグリカン。成功した感染を確立するには、いくつかの特殊な病原体は、細胞内または細胞間空間に秘密の病原性エフェクタータンパク質の能力を進化させ、その結果、MTIを抑制し、エフェクター・トリガ感受性(ETS)12,13をトリガしています。例えば、病原性エフェクターは感染組織14-16内の疾患の発症を誘導するためにMTIのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)のリン酸化カスケードを不活性化することができます。ホストと病原体との間の動的共進化の間に、植物もエフェクタータンパク質を認識し、病原体の病原性分子17を減衰させるために反撃の戦略を開発しました。この直接的または間接的エフェクターの認識は、病害抵抗性(R)タンパク質18によって媒介されます。トンの大部分裾はNB-LRRのメンバー(ヌクレオチドが結合およびロイシンリッチリピート)ファミリー19です。 Rタンパク質によって非病原性エフェクターの認識は、エフェクタートリガ免疫(ETI)20として特徴付け強く、より広範な免疫応答を誘発します。防御遺伝子21の発現および防衛代謝物22の産生を誘導するほかに、ETIは、多くの場合、隣接する組織3に広がるの病原体を制限するために過敏反応(HR)として知られている急速なローカライズされたプログラムされた細胞死につながります。

プログラムされたローカライズされた細胞死23に加えて、植物は(SAR)4全身獲得抵抗性と呼ばれる長期的かつシステム全体の免疫応答を開始することができます。生物栄養性病原体でのチャレンジの際に、植物細胞は、局所および全身の組織24の双方において、内因性の植物ホルモンのサリチル酸(SA)とPRタンパク質の生合成および蓄積を誘発します。トンを通して彼のプロセスは、準備の高まり状態は、病原体24の広いスペクトルによってその後の感染の間に速い防御応答を取り付けるため可能に感染していない葉で達成されます。 SAおよびそのようなベンゾなどの合成類似体(1,2,3) -チアジアゾール-7-カルボチオ S -メチルエステル(BTH)および2,6-ジクロロ酢酸(INA)、化学的にサリチル酸を誘導することができる(SA)外部アプリケーション24時-Triggeredイミュニティ(STI)。病原性関連遺伝子1(NPR1)のNonexpressorは、局所および全身の組織21,25,26の両方でSA媒介防御応答時の主要な転写調節因子としてのSA受容体および機能の一つであることが提案されています。それは決定的にNPR1は、SARの確立のために必要とされ、NPR1の損失はシュードモナスシリン 25の方に劇的な感受性につながることが実証されています。

広く植物の分子の寄与を特徴づけるために、植物病原体相互作用のコンポーネントは、複数のバイオアッセイは、ROSは27バーストを含め、具体的な防衛のイベントを測定するために、それらのタンパク質生成物21のカロース沈着28、防御遺伝子の発現および蓄積を開発されてきました。これらの個々のアッセイは、植物免疫応答の特定のフォームへの洞察を提供することができるが、それらのどれも、しかし、植物全体レベルでの完全な防御応答を表現することができません。逆に、感染後の病原体の成長の定量化は、生物レベルでの免疫応答の全体的な推定値を提供します。したがって、正確性の高い標準化された病原体接種アッセイの開発と最適化は、シロイヌナズナの免疫応答の研究と発見を燃料することが重要です。

シュードモナスシリン 、グラム陰性細菌は、Arabidops含む植物宿主の範囲の疾患を引き起こすことができる植物病原体として同定されました29です。 P. -モデル植物病原体システム、シロイヌナズナとして、 syringaeの相互作用は、広く植物の防御応答に29の基礎となる分子メカニズムを理解するために適用されています。今までは、P。50を超えますシリンゲの pathovarsは、異なる植物種30に感染する能力に基づいて同定されました 。P. syringaeの PV。 トマトDC3000(PST DC3000)31 P. syringaeのPV。maculicola ES4326(PSM ES4326)32は、二つの最も広く使用され、広範囲に特徴付け病原性株です。別に植物によって認識され、MTI応答を誘発されることから、pstファイル DC3000とPSM ES4326は、MTIを抑制し、病原体の成長31,33を支持するETSをトリガするために病原性エフェクタータンパク質を分泌することができます。

機能的にシロイヌナズナとPとの間の相互作用を分析するために、複数のシリン、0;病原体感染の方法は、病原体の送達アプローチに基づいて開発されてきました。土壌生育した植物は、病原体は、シリンジ浸潤、真空浸透、浸漬、噴霧接種接種29,34によって送達することができます。最近、苗洪水接種アッセイは、組織培養での大規模なスクリーニングを行うために開発された若いアラビドプシス植物35の成長プレート。シリンジ浸潤は、最も一般的に使用される手法の一つとして、手動で気孔29と呼ばれる自然の葉の開口部を通してアポプラストに病原体を提供しています。 Pのこのアプローチにより、等量syringaeのは、感染した葉に浸潤することができ、植物の免疫応答の強度が反比例病原菌の成長レベルと相関しています。したがって、病原体の成長の定量化は、植物全体レベルでの免疫機能を評価するための最適なアプローチとして機能します。また、シリンジ浸潤がbのできる局所および全身の組織を、区別することができますSAR 36の根底にある分子機構の特性を明らかにするのに適切な電子。

以下のプロトコルでは、強化された疾患感受性(EDS)のためのシロイヌナズナ変異体をスクリーニングするために、PSM ES4326と最適化された注射器浸潤アッセイを説明します。このプロトコルは、2つのシロイヌナズナの遺伝子型を採用する:野生型生態型コロンビア-0(COL-0)植物(コントロール)とnpr1-1の機能喪失型変異体を (hypersusceptible) それは、病原性細菌株PSM ES4326 37で感染します。 npr1-1変異体は、チロシンに高度に保存されたヒスチジンを変更し、25の非機能性タンパク質をレンダリングNPR1分子のアンキリンリピートのコンセンサス配列内の点変異を保有します。また、シリンジ浸潤アッセイの改変の数は、MTIおよびSTIを含む免疫応答の特定の層の欠陥の定量化を可能にすることが記載されています。

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Protocol

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次のテキストは、シロイヌナズナに最適化されたPSM ES4326シリンジ浸潤アッセイを実行するための段階的なプロトコルを記述します。このアッセイの主要な手順が簡略化されたフローチャート( 図1)に示されています。

1.植物の成長条件

  1. 種をまきます
    1. loosely底Oからそれらを浸すことによって土壌や水ポットで満たされた2鉢(直径4、背の高い3.75)を準備/ N余分な水分を排出する前に。
    2. シートまたは他の用紙を折られた計量70ミリメートルで各ポットに、50〜100シロイヌナズナの種子、野生型COL-0またはnpr1-1変異種をまきます。
    3. 80〜90%( 図2A)に相対湿度を高めるために水を噴霧し、透明ドームで鍋をカバー。
  2. 完全な成層と同期発芽を可能にするために、72時間4℃で鍋をインキュベートします。
  3. 標準的な成長条件に鍋を転送(12時間の明/ 12時間の暗闇、21℃で、光強度100マイクロモル/ m 2の/秒、相対湿度40%)は、種子が発芽することを可能にします。結露を防ぐことができます成長室への転送後すぐに開くことで2-3を生成するために、ドームをクラック。
  4. 最初の真の葉は長さ2〜3ミリのサイズに達すると、平らな土を充填した72ウェルにポットから苗を移植。
    1. フラットの土壌表面の中央に1-に深いくぼみを作成するために、指または1ミリリットルピペットチップを使用してください。
    2. 静かできるだけ根の損傷と個々の苗を分離。慎重にピンセットで無傷の根を持っている苗を拾います。
    3. うつ病への移植の衝撃を最小限に抑え、静かにうつ病を埋めるために周囲の土壌をダウンパットに付着した土の塊と一緒に単一の分離苗を置きます。バイオハザード廃棄物容器の中に余分な苗と土を捨て、に従って処分地元のバイオハザード廃棄物処理ガイドラインに。
    4. 水は上から苗を移して、完全に80〜90%の湿度を維持するために水スプレー透明ドームとフラットをカバーしています。その後、4日目の午前中にドームをクラックし、完全にその日の終わりまでにそれを削除し、3日間でドームを維持します。
      注:播種種子あるいは平坦な土壌を充填した72ウェルの上にガラスピペットで2~3種を転送することにより、続いて4℃で48時間、1 mlの0.1%寒天を含有する1.5 mlの遠心チューブに種子を階層化することにより行うことができます。フラッツは、発芽後1週間を取り除くことができる透明なドームに覆われる必要があります。余分な苗はよくごとに1つだけ苗を残すために除去することができます。
  5. 20分間の1で水にフラットを浸漬することにより水の植物2日ごとには、その後、余分な水分を排出します。
    注:植物を散水するための時間間隔は、成長室の湿度に依存し、塩基を決定する必要がありますユーザーの植物成長施設の連続観測の研究開発。彼らはよく水をやっていることを確認する毎日植物を確認してください。わずか数スポットが噴出ボトルと上から、水、それらの植物を乾燥している場合。
  6. で、または増殖条件(日長、温度)に応じて、3-5週齢の対応発育ステージ#3.50(ロゼットサイズが50%最終的なサイズ)、近くにある植物に病原体感染アッセイ(ステップ3-5)を実行します。花序の出現(ステージ#5)による年齢に関連した抵抗38,39の発症後の植物に感染しないでください。

培養培地とプレートの作製

  1. 王のB(KB)液体培地の1リットルを作ります。静かに20グラムプロテオースペプトンと目に見えるペレットがなくなるまで千ミリリットルで磁気攪拌棒を脱イオンH 2 Oを使用して、2グラムのリン酸カリウム二塩基三水和物をかき混ぜます。 20分液体サイクルで150ミリリットルのガラス瓶にAliquot 100ミリリットルおよびオートクレーブ。
  2. 準備KB固形培地で培養プレート。
    1. 静かに20グラムプロテオースペプトン、2グラムカリウム第二リン酸三水和物と千ミリリットルと15グラムの寒天を脱イオンH 2 Oをかき混ぜますオートクレーブ。
    2. それは将来の結露を最小限にし、抗生​​物質の劣化を回避するために触れてクールになるまで、磁気撹拌プレート上の培地をクールダウン。培地に18ミリリットルの滅菌80%グリセロールおよび5 mlの滅菌、1MのMgSO 4を追加しますPSM ES4326は、50μgのmlの最終濃度になるように冷却媒体にストレプトマイシンを追加し、ストレプトマイシンに対する耐性を運ぶことを考える- 1。
    3. プレートを注ぎます。 100ミリメートルX 15ミリメートル、150ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿:KB培地プレートの2つの異なるサイズを用意。小さいペトリ皿を含有する培地は、一次細菌培養プレートとして機能し、細​​菌プレートをカウントするように、より大きなペトリ皿に役立ちます。
      注意:プレートを計数する細菌には、矩形状のプレートを低減することができます二倍の治療は、従来の丸いプレートに比べてプレートごとにプロットすることができるので、消耗品がかかります。
      1. 感染実験の前に、プレートを注ぎます。までの2〜3ヶ月4℃で保存KB媒体プレート硫酸ストレプトマイシンは次第に抗生物質活性40を失うからです。

3.強化された疾患感受性(EDS)

  1. 1日目 - プレート上にストリーク細菌
    1. 二日のEDS分析の前に、ストリークPSM ES4326から-80℃のグリセロールストック°KB-連鎖球菌細菌培養プレート上で24〜48時間、28℃でインキュベートします。
  2. 2日目 - 液体培養し、水の植物を開始
    1. 、28°のCO / Nを1ストレプトマイシン、250rpmで振る-を50μgmlを含む4ミリリットルの液体KB培地で無菌の試験管で液体培養を開始します。
      注:EDS感染アッセイのために、遺伝子型がお勧めであるごとに6工場を使用してエド。 STIとMTIアッセイのために、処理当たりの遺伝子型あたり6植物が推奨されています。細菌接種のためには、0.3と0.6の間のλ600nmでの光学密度の新鮮な液体培養を使用することをお勧めします。
    2. マーク・サンプリングでの感染組織を容易に識別するための平滑末端防水マーカーで葉数5と6の葉柄( 図1)。気孔の開口部を強化し、葉に病原体液の進入を容易にし、20分間の下からフラットを浸漬しても植物に水には、その後、余分な水分を排出します。
      注意:別の方法として、透明ドームとフラットをカバーし、気孔の開口部を増加させるために2-4時間水に浸します。
    3. 3日目 - 病原体希釈し、シリンジ浸潤
      注意:朝の時間帯に病原体感染を受けやすい遺伝子型の最も顕著な疾患症状の病原体の増殖および発達のために最適です。未感染を保つためにあらゆる努力をします概日リズムと実験複製間のばらつきを減らすことができます昼間の遺伝子調節41,42の影響を排除するために一貫性のあるイオンタイミング。
      1. 室温で2分間9600×gでマイクロ遠心1.5mlチューブに細菌培養物をペレット化し、上清を捨てます。無菌の10mMのMgCl 2、1 mlの細菌ペレットを再懸濁します。
        注:マグネシウムカチオン 、Pの運動性および接着性を向上させることができますシリン 43は 、また、同じ濃度で硫酸マグネシウムを使用しています。滅菌水は、Mg塩溶液のための許容可能な代替です。
      2. 50mlの遠心管中での10mMのMgCl 2を9 mlの細菌の懸濁液を希釈し、λ= 600 nmで分光光度計を用いて細菌の光学密度(OD)を測定します。最終OD 600nmでの10のMgCl 2 = EDS感染アッセイのための0.0002で細菌を希釈します。
      3. 葉を潜入希釈した菌液を含んでいる(一般的にインスリン注射器として知られている)1ミリリットル平滑末端針無し注射器。
      4. その全容量のシリンジまでを記入しないでください。浸透プロセスの間にはるかに優れた制御を可能にするために、0.5〜0.6ミリリットルでそれを埋めます。
      5. 人差し指の上に葉の下面を露出させ、その後、ゆっくりと親指の助けを借りて、葉の位置を調整します。圧力が均等に分散されることを確実にするために葉の表面に対して垂直方向に注射器を置きます。葉の損傷を低減するために浸透中肋エリアを避けるようにしてください。
      6. ゆっくり菌液を浸透させるためのプランジャーを押してください。暗い葉の色によって示されるように、葉肉内への液体のエントリが可視化されます。葉の表面全体に侵入しようとしました。これは一つの試みで達成されていない場合は、別の浸潤スポットを選択し、全体の葉の表面が覆われるまで、上記のアクションを繰り返します。
      7. 完了したら、優しく余分な病原体溶液を除去するための吸収性組織と葉をブロット。視覚損傷のための感染した葉組織を検査します。
        注:浸潤が完了した後、円形シリンジ印象は見えないはずです。
      8. 元の成長条件にそれらを戻す前に1〜2時間乾燥させるために浸透させた植物を残します。次に、水との明確なドームをスプレーし、カバー感染した植物を2時間、その後、開口部2-3を生成し、感染実験の残りの部分でそれを残すためにドームをクラック。
        注意:P.のでsyringaeのは、同じ施設で成長した他の植物に感染性物質拡散の危険性がない、空気中の病原体ではありません。しかし、追加の予防策として、感染した植物や近くにある他の実験植物との間の物理的接触を避けます。透明ドームとフラットをカバーすることは、病原体の毒性を増加させ、疾患の進行を加速させて​​いきます。ザ・被覆期間のこの段階で最適な持続時間は、ユーザの植物成長施設の湿度条件に基づいて決定する必要があるために必要です。
    4. 5日目 - プレ乾燥培地プレート
      1. 冷蔵ユニットのうち、150ミリメートル×15ミリメートルKBプレートを取り、プレート上の既存の水の凝縮を乾燥させます。およそ24時間、室温でそれらを維持することにより乾板。このプロセスをスピードアップするために、30〜60分間割れその蓋との層流フード内に置いてください。
        注意:この手順は、次のステップで、プレートの表面上に円形の液滴の形成に重要です。
    5. 6日目 - 病原体の増殖を定量化
      注:以下の病原体の定量化手順は、細菌の等量植物が葉の形態が変化している場合は特に、葉に送達されたことを確認するために、感染後の早い時点で行うことができます。
      1. 出芽後感染組織を処理白化の影響を受けやすい遺伝子型での感染組織の黄で示されるが、壊死性病変の発生( 図2B)の前に。
        注意:推奨サンプリング時間が3日、病原体接種後です。病原体の成長は、環境要因の数に依存するので、インキュベーションの長さは2 1/2 3半日の範囲内で変化し、ユーザの植物成長施設における感染の進行の注意深い観察によって決定する必要がある場合があります。
        1. 各遺伝子型( 図1)のために6研削チューブを準備します。 1ステンレス鋼研削ボールを配置し、各チューブに10 mMのMgCl 2を無菌500μlを添加します。
        2. 植物から感染した葉を外し、1ホールのペーパーパンチ( 図1)とリーフディスクをパンチ。
          注:サンプリング誤差を最小限に抑えるために、同じ位置でサンプリングされた各葉をパンチしてみてください。上からリーフディスクのサンプリング葉のをお勧めします。
        3. ランダムに鉗子を使用して、各研削チューブに(二つの異なる植物から)2葉のディスクを配置します。
        4. チューブを密封し、10分間、最高速度での高スループットホモジナイザー(毎分1,600ストローク)を用いて組織をホモジナイズします。必要に応じて組織が十分に均質化され、ソリューションが原因で感染した葉からクロロフィルリリースに緑色に変わるまで、このプロセスを繰り返します。
      2. 均質化を待っている間に、マルチチャンネルピ ​​ペットおよびピペットリザーバを使用して180μlの10 mMのMgCl 2を用いて96ウェル培養プレートの最初の6行を埋めます。
      3. 粉砕した後、96ウェルプレートの最初の行にグランド組織懸濁液の20μlのを転送し、液体を上にピペッティングを繰り返して混和。組織の小さな断片が、先端を詰まらせた場合は、ソリューションの正しいボリュームを習得するために2〜3ミリメートルことによってそれをクリップ。
        1. トップO上の液滴のための十分なスペースを提供するために、プレート、スペースの代替行の異なる遺伝子型の組織( 図1)は、f。 10倍連続希釈を調製するためには、2行目に20μlの液体を転送し、第六の希釈まで、この手順を繰り返します。
      4. 転送分割ピペットチップ( 図1)を使用して 150ミリメートルX 15ミリメートルのKBプレート上に96ウェルプレートからの溶液20μl。最も集中に最も希薄懸濁液から作業してください。
        注:ほとんどの集中に希釈し、最もから進んですることは、不必要な希釈液との間にピペットチップを変化させることができます。プレートをよく予備乾燥された場合(通常は15〜30分)に吸収されるまで、転送された液滴は、媒体の上にそのまま滞在する必要があります。乾燥時間はRTと湿度に応じて変化します。
      5. 蓋が割れて室温でプレートを乾燥させます。これ以上の液体は、プレート表面に観察されないことができたら、蓋、反転を閉じて、RTでプレートまたは28℃のインキュベーターをインキュベートします。
      6. コロニーが見えるようになるまで40〜60時間培養します。プレート上の成長が形成単位(cfu)コロニーで予測可能な10倍の低下( 図2C)を反映していることを確認してください。彼らは過剰に増殖し、コロニーが融合する前に細菌をカウントします。重複コロニーを持っていません最低希釈における細菌の数を決定します。通常、カウントされるのに好ましい希釈は10〜50個のコロニーの間に含まれています。
        メモ:バリエーションは、技術的な反復の間に存在することができます。そのため、各反復の最安希釈は個別に決定されるべきです。
      7. 細菌の増殖のレベルを計算するには、行(R)だけでなく、書面で各技術的複製(T)内の細菌の数の数を記録します。コロニー形成単位の数を決定-式を通じてCFU /リーフディスクを:CFU /リーフディスクは=(T×10、R / 20)2分の500×
      8. PRODUするには、以下のスプレッドシートテンプレートにデータを入力グラフ( 図1)、CE(スプレッドシートデータ解析テンプレートファイルは、表2を参照のこと)。各データ点は、対数スケールで6技術的複製の平均として表されています。エラーバーは、平均の95%信頼区間を表す(N = 6)。
        注:95%信頼区間の計算は、技術的反復の数に基づいて調整する必要があります。

4. SA-トリガ免疫(STI)

  1. 1日目:ステップ3.1で説明したのと同じ手順に従ってください。
  2. 2日目は:液体細菌培養(ステップ3.2)植物を散水し、開始することに加えて、SA派生サリチル酸ナトリウム21の外部アプリケーションによって抵抗性を誘導します。
    注:純粋なSAが乏しい水溶性を有しており、事前のpH調整を必要とし、したがって、このアッセイのためにお勧めしません。
    1. P.に対するSA媒介防御を誘導するために、 syringaeのおよび将来の感染21のための主な植物(モックなど)細かい1 mMのサリチル酸ナトリウムのミストやH 2 Oで 24、スプレー植物病原体感染の前に16〜24時間。
  3. 3日目:OD 600nmで= 0.001に病原体の希釈を準備し、シリンジ浸潤(ステップ3.3)で全体の葉の表面に細菌を押してください。
  4. 6日目は:EDS分析(ステップ3.4および3.5)で説明したように、病原体の定量及びカウント処理のために、手順に従ってください。プレートとカウントH 2 O、およびサリチル酸ナトリウム-個別に前処理したサンプル。前処理された植物 - 野生型シロイヌナズナでは、病原体の成長の1-2対数減少は、サリチル酸ナトリウムに期待されています。

5. MAMP・トリガ免疫(MTI)

注:このアッセイでは、我々はシロイヌナズナの野生型COL-0および変異体FLS2EFR植物を使用しています。 FLS2とEFRは、原形質膜に局在するパターン認識受容体(PRRの)flg22とelf18が認識できる、respeですctively 9,10。 PSM ES4326外部MAMP前処理シリンジ浸潤以下の変異体で変更されていない病原体の成長によって示されMAMPの特定のタイプ、に対する非感受性の各PRR結果の損失。

  1. 1日目と2:ステップ3.1および3.2で説明したのと同じ手順に従ってください。
  2. 3日目:MAMP前処理および病原体感染
    1. 病原体感染(ステップ3.3.3-3.3.6)の前に全体の葉面4時間にそれを、MAMPトリガ型免疫を確立フラジェリンエピトープflg22またはEF-Tuのエピトープelf18の1μM溶液を調製し、シリンジ潜入します。これ 、Pに対するMAMP媒介防御の誘導を可能にしますsyringaeのプライム将来の感染6,37のための植物。
      注意:一般に入手可能なマイクロアレイデータはflg22またはelf18治療37,44 4時間後に起こるMAMP応答性遺伝子の最大転写再プログラミングを明らかにしました。このように、4時間をお勧めしますCOL-0 MAMP処理し、FLS2EFR変異体との間に病原体の成長に明確な差を達成することになるMAMP前処理の期間。
    2. 吸収性組織と余分なMAMP溶液を除去し、葉内の液体吸収過程を高速化するために発見された植物を残します。シリンジ圧浸透から負傷効果を説明するために、対照植物の葉の中にH 2 Oを浸透させます。
    3. OD 600nmでの病原体への希釈を準備= 0.001とMAMP / H 2 Oの前処理された注射器浸潤によって葉(ステップ3.3)の全体の葉の表面に細菌を押してください。
  3. 6日目:ステップ3.4と3.5で説明したように、病原体の定量及びカウント処理のために、手順に従ってください。プレートと別に、H 2 OおよびMAMPで前処理したサンプルを数えます。やや強いと野生型シロイヌナズナでは、病原体の成長の1-2対数減少は、MAMP前処理プラントで期待されていますflg22によって媒介ERの減少はelf18と比較。

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Representative Results

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私たちはここで説明するプロトコルは、最適化されたPを表し、 syringaeのシリンジ浸潤アッセイは、定量的に、シロイヌナズナ植物における免疫応答を評価しました。 図1に示すように 、PSM ES4326のシリンジ浸潤を連続希釈し、コロニー計数を介して病原体の抽出および定量化が続きます。

プロトコルテキスト内のステップ3で説明したように、PSM ES4326に対する強化された疾患感受性(EDS)は、OD = 0.0002と接種物の感染によって評価することができます。 図3に示すように 、非常に敏感npr1-1変異体は、野生型COL-0植物と比較して約2.5ログ(300回)複数の病原体の成長を持っています。実験条件に応じて、npr1-1植物は1.5〜2.5ログの範囲内で最も一般的な結果で、COL-0よりも3.0ログに多くの細菌の増殖をサポートすることができます。したがって、このEDS尻AYは、研究者は、潜在的に植物免疫応答に関与する候補遺伝子を同定するために、それらのシロイヌナズナ変異体およびトランスジェニック動物を配置することができる可能性のある差の広い窓を提供します。

EDSを決定することに加えて、PSM ES4326シリンジ浸潤アッセイは、免疫応答の異なった層を分析するように変更することができます。サリチル酸トリガ免疫を評価するために、化学サリチル酸ナトリウムの外部アプリケーションは、病原体の増殖( 図4A)によって定量化された免疫応答をトリガするために使用されます。 SA依存性標的遺伝子のSA受容体と主要な転写コレギュレーターとして機能NPR1の損失は、サリチル酸誘導体の外因性の適用に対する非感受性をもたらします。 SAにこのinsensitivityは、COL-0植物の著しい減少とは対照的にnpr1-1サリチル酸ナトリウムの前処理された植物で変更されていない病原体の成長(20倍以下pathogによって実証されますサリチル酸ナトリウムの適用時にアン)( 図4B)。

MAMP・トリガ免疫を特徴付けるために、flg22またはelf18による前処理は、 図5Aに示されたように行きました。フラジェリントリガ免疫を特徴付けるために、COL-0とFLS2変異体植物が使用されています。 FLS2、膜局在受容体様キナーゼは、flg22を認識し、MTI 9トリガします。 図5Bに示されるようFLS2変異体植物は、細菌の増殖制限効果をトリガーすることができなかった一方で、flg22処理されたCOL-0植物は、〜1ログ(10回)細菌集団の減少を支持しました。同様に、EFRの変異体植物におけるEF-Tuの受容体EFRの損失はelf18前処理( 図5B)は、次の変更されていない病原体の成長によって示されるように、前処理をelf18に対する非感受性につながります。

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シロイヌナズナ植物のPSM ES4326シリンジ浸潤アッセイの図1略図。数5と大人土壌栽培シロイヌナズナ植物の6がマークされ、シリンジ浸潤を通じてPSM ES4326に感染している葉。疾患症状の出現後、組織均質化のための葉と収穫リーフディスクを切り離します。十分に均質化した組織は、シリアルプレートを計数する細菌へ転送する前に、96ウェルプレート中で希釈されます。プレート上のコロニーの出現後、細菌の数をカウントし、グラフを生成するためのデータを処理する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
EDS分析の2代表的な手順を図。(A)ポットは種子を播種した後、水噴霧透明ドームで覆われている。(B)代表症状をCOL-0およびEDSアッセイに供npr1-1葉(OD 600nmで= 0.0002)に3日は接種後。 npr1-1に深刻な白化とCOL-0のほぼ正常な外観に注意してください。(C)を KBで成長しているPSM ES4326の連続希釈を、メディアプレート(/ mlストレプトマイシンを50μg)後〜インキュベーションの45 hrでした。ファイブ希釈が表示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
EDS分析の図3.代表的な結果 PSM ES4326成長(コロニー形成単位- 。CFU /リーフディスク、EXP対数スケールでressed)は、4週齢のCOL-0とnpr1-1植物で定量した3日)のOD 600nmで = 0.0002(接種後。エラーバーは、平均の95%信頼区間を表す(n = 6)である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4.代表的手順とSTIアッセイの結果。(A)サリチル酸・トリガ免疫の概略図は(STIが)アッセイ。(B)サリチル酸・トリガ免疫は、植物における病原体の成長に基づいて定量化した1mMので前処理サリチル酸ナトリウムまたはH 2 Oの16時間前PSMにES4326シリンジ浸潤(OD 600nmで= 0.001)。病原体の成長を定量化した3日は接種後。エラーバーは、平均の95%信頼区間を表す(n = 6)である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5.代表的手順とMTIアッセイの結果。 (A)MAMPトリガ型免疫の模式図(MTI)アッセイ。(B)MTIは、植物2 O 4時間(対照として)前PSMにflg22、elf18またはHの1μM溶液で前処理された中の病原体の増殖によって定量化しましたES4326シリンジ浸潤(600nmの OD = 0.001)。病原体の成長は、3日には接種後定量しました。エラーバーは、(N = 6)の平均の95%信頼区間を表す彼をクリックしてくださいこの図の拡大版を表示するために再。

問題考えられる原因推奨されるアクション
O / N培養後の液体培地中の細菌なし成長しません減少細菌の活動新たに画線プレートから液体培養を開始
円形シリンジ印象は、シリンジ浸潤後に葉の上に提示します浸潤中にあまりにも多くの圧力浸透中pressueを削減
部分的なシリンジの印象は、シリンジ浸潤後に葉の上に提示します注射器の不適切な位置決め葉の表面に対して垂直に配置されるように、注射器を調整
リーフwiltsが浸透した後、数時間をwthtin あまりにも多くの病原体溶液が葉に浸透させます停止INF全体の葉の表面の直後iltratingは、色が暗い緑色に変わります
無疾患症状感染3日後病原体が増殖するために湿度が低すぎます感染した植物が維持されている湿度を増やします
病原体は、3 dpiで以前に壊死栄養段階に入り、 病原体液の誤った濃度 ODを600nmで =のEDS分析のための0.0002使用。 indepedent分光光度計を用いて希釈を確認
液滴は、プレートをカウントする細菌の上にマージプレートをカウント細菌は適切に乾燥されていません前乾板O / N使用する前に
病原体の希釈は10倍の低下を示すものではありません希釈が正確に行われません液体を転送するための十分キャリブレーションマルチチャンネルピペットを使用します。すべての液体が分配されていることを確認
野生型における病原体の成長は8ログCFU /リーフディスクを超えました感染した組織内の病原体overgrewは - 遅すぎる行わサンプリングにサンプルは、クロロシスの出現後の組織に感染
技術的反復の間で大きなばらつき植物は同じ発達段階にないか潜入葉数が矛盾しています唯一の感染のために、同じ発達段階内の植物を使用しています。同期発芽を確認してください。異なる植物の間で一貫性のある葉の数を感染

シリンジ浸潤アッセイの表1のトラブルシューティング。

表2を見るにはこちらをクリックしてください。

病原体の成長データの統計分析のために、表2のスプレッドシート。

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Discussion

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利用可能な農地が減少し、人口が増加すると、世界中の研究者が作物改良のためのニーズを押すでチャレンジされています。収率が大幅に様々な生物的および非生物的ストレスによって影響を受ける可能性があります。その中でも、病原体感染だけでは45米国では約12%の損失を担当する作物収量の減少の主な原因の一つです。この問題を解決するには、大規模な研究は、モデルのシロイヌナズナで行われている- P.総合植物免疫応答の構成要素と調節機構を特徴づけるシリン pathosystem。ここでは、最適化されたPを提示しますsyringaeの ES4326シリンジ浸潤アッセイは、定量的に植物全体レベルでの植物の免疫応答の微妙な違いを評価しました。

複数の病原体感染アッセイは植物免疫応答29,35を特徴付けるために開発されてきたが、シリンジ浸潤が提供します病原体の等量が感染組織に投与され、十分に制御システム。ディップ接種および噴霧接種を含む他の感染アッセイでは、病原体は、子葉を含め、全体空中組織に適用されるだけでなく、真の34を残します 。これは、生態型ランツベルクエレクタ (L 胞体)からの子葉がはるかに影響を受けやすいデータを歪曲し、全体的な耐病性34に誤った結論につながる可能性がありディップ接種アッセイ中に病原体にしていることが報告されています。さらに、2つの前述のアッセイは、湿度及び光を含む様々な環境因子によって制御される気孔を通して葉を入力するように病原体を必要とします。これらの要因の変動は、シリンジ浸潤アッセイ35に比べて疾患の症状の変化のより高いレベルに貢献しています。真空浸透については、主な欠点は、病原体溶液を、難易度の大量の必要性を含みます損傷し、かなりの労働強度29を回避しながら、効率的にすべての葉に潜入します。また、スプレー、浸漬または真空接種に感染した植物は全体の苗が病原体に感染しているので、回復する可能性が低いです。他の方法の多数の限界を考えると、シリンジ浸潤アッセイは、確実に葉内の免疫応答を特徴づけるために、均一性の高い予測可能な疾患の進行および病原体の正確な定量化を達成するための最適な方法のまま。さらに、このアッセイは、容易にMAMP・トリガ免疫および全身獲得抵抗性を特徴づけるために修飾することができます。それに加えて、技術の将来のアプリケーションを約束することは植物免疫シグナル伝達ネットワークの異なる層を分析または免疫植物に特異的経路の役割を識別するために、病原体のシリンジ浸潤が続く複数の植物ホルモン、化学物質または阻害剤の前処理のテスト効果を適用することができます応答。感染のwi強化された病害抵抗性(EDR)テストとして知られている前処理を、プライミング任意の防衛の不在下での病原体(OD 600nmで= 0.001)の増加用量番目、突然変異体を同定またはするために使用することができ、この方法の別の有用な変更があります強化された耐病性を持つトランスジェニック。

これは、病原体は、気孔を介した葉組織に直接送達されているので、シリンジ浸潤アッセイは防御応答の前侵襲段階の特性評価には適用されないことに留意すべきです。病原体の入り口のための物理的障壁として働く気孔の閉鎖は、多くの場合、MAMPトリガ型免疫46の確立時に病原体の侵入を制限するためにトリガされます。また、植物ホルモンアブシジン酸は、事前侵襲段階47の間に気孔閉鎖に貢献しています。したがって、噴霧または浸漬方法は、関連する警告にもかかわらず、免疫応答の気孔層を特徴付けるために有利であることを証明することができます接種のようなタイプで、29の上に議論しました。

植物 - 病原体相互作用は、種々の生物的および非生物的要因によって変えることができるので、成功した感染を達成し、信頼性の高い出力を得るためのプロトコルで以下に示す重要なステップに焦点を合わせることが重要です。

プラントの状態や細菌の活動

シロイヌナズナ植物は簡単にサブ最適な温度、干ばつや浸透圧ストレスを含む様々な非生物的要因によって強調、および免疫出力48と干渉する細胞応答を誘発することができます。したがって、最適な増殖条件下で植物を生育し、環境ストレスから保護するために重要です。感染した葉の発育段階は、実験結果を変化させることができるので、また、それは一貫してアーチファクトを回避するために、葉数5および6を感染させるために必要です。発達段階に沿って進み、高架再いくつかの病原性および非病原性病原体に対するsistanceは、シロイヌナズナ植物の繁殖期に栄養段階からの移行と相関します。発達段階を超えるこのダイナミック抵抗は(ARR)38加齢性と呼ばれます。真の免疫応答とARRの干渉を回避するために、プロトコルに示されるように、正確な発達段階で感染を行い、生殖期の開始後の感染実験を試みる控えることが重要です。また、細菌のフィットネスや活動は、実質的に感染組織内の病原体の増殖に影響を与えます。したがって、これ以上の2日以内古いたて画線培養プレートから細菌液体培養を開始することが重要です。

シリンジ浸潤スキル

シリンジ浸潤の間に、十分に干渉することが知られている効果を負傷するので、葉の物理的ダメージを避けるようにしてくださいSA-トリガー防御を抑制することができる主にジャスモン酸媒介性シグナル伝達を介した植物免疫応答は、49の経路。感染後、浸潤させた葉は完全に任意の視覚的な損傷を与えることなく、通常の物理的な外観に回復する必要があります。初心者のためには、まずPSM ES4326シリンジ浸潤アッセイを実行する前に非実験植物を使用して、この技術を練習することをお勧めします。

病原体の抽出および希釈

正確に病原体の増殖を測定するために、効率的に感染した植物組織から病原体を抽出することが重要です。他の抽出法と比較して、高スループットのホモジナイザーを介して機械的な組織の均質化は効果的に、組織試料との交差汚染を失うことなく、病原体を抽出します。その後、サンプル希釈液を正確に分注誤差を低減するために確実に較正したマルチチャンネルピペットを用いて実施されるべきです。希釈工程で±1μlの病原体の成長定量化で約5%の差につながるだろうとして少し偏差。シリンジ浸潤アッセイのより多くのトラブルシューティングの例については、 表1を参照してください。

結論として、我々は定量的にかつ確実に植物免疫応答を評価するために、シロイヌナズナに最適化されたPSM ES4326シリンジ浸潤アッセイを説明します。このpathosystemの助けを借りて、植物 - 病原体相互作用の理解は実験室で加速され、最終的には、フィールドでの作物保護のために適用されます。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MetroMix 360  Grosouth SNGMM360
Large pots Grosouth TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts Grosouth LM1206
11x 21 Flats with no holes Grosouth LM1020
11x 21 Flats with holes Grosouth LM1020H
Vinyl propagation domes Grosouth CW-221
Proteose Peptone Fisher Scientific DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate  MP Biomedicals 151946
Agar  Fisher Scientific A360-500
Streptomycin sulfate Bio Basic Inc SB0494
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific R80150
Rectangular plate Fisher Scientific 12-565-450 
MgCl2 Hexahydrate Bio Basic Inc MB0328
Glycerol Bio Basic Inc GB0232
MgSO Bio Basic Inc MN1988
1 ml syringe Fisher Scientific NC9992493 
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-A
Grinding tubes  Denville Scientific B1257
Caps for grinding tubes Denville Scientific B1254
Stainless steel grinding ball Fisher Scientific 2150
96-well plate  Fisher Scientific 12-556-008
Sodium Salicylate Sigma Aldrich s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) Genescript Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) Genescript Made to order
Hole puncher Staples 146308
Biophotometer plus Eppendorf 952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer Fisher Scientific 02-215-503
Accu spin micro centrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl) Eppendorf 3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl) Eppendorf 3122 000.060
Pipette (20µl) Eppendorf 3120 000.038
Pipette tips Fisher Scientific 3552-HR
Sharpie permanent marker Staples 507130
1.5 ml tube Eppendorf 22363204
Forceps Fisher Scientific 08-890

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References

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使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem
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Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).More

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).

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