Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53364
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

בהיעדרם של תאים חיסוניים ניידים מיוחדים, צמחים לנצל מקומי מותם המתוכנת תא והמערכתי נרכשת ההתנגדות להגן על עצמם נגד התקפת הפתוגן. תרומתו של גן ארבידופסיס ספציפי לתגובה החיסונית הצמח הכולל יכולה להיות ספציפי וכמותית הוערכה על ידי מנסה לאמוד את צמיחת הפתוגן בתוך הרקמה נגועה. במשך יותר משלושה עשורים, את חיידק Pseudomonas hemibiotrophic syringae PV. Maculicola ES4326 (ES4326 PSM) כבר מיושם באופן נרחב כמחולל מחל המודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובה החיסונית ארבידופסיס. כדי לספק פתוגנים לתוך רקמת העלה, שיטות חיסון מרובות הוקמו, למשל, חדירת מזרק, חיסון טבילה, ריסוס, חדירת אבק, וחיסון מבול. הפרוטוקול הבא מתאר שיטת חדירת מזרק מותאמת לספק ארסי PSM ES4326 לעלים של מבוגריםהאדמה גדלה צמחי ארבידופסיס ומדויק למסך לרגישות משופרת מחלה (EDS) לפתוגן זו. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להשלים עם-טיפולים מראש מרובים לנתח נוסף פגמים חיסוניים ספציפיים בתוך שכבות שונות של הגנת צומח, הכוללים חומצה סליצילית (SA) חסינות -Triggered (STI) וחסינות מופעלת על-MAMP (MTI).

Introduction

בשל אופיים הנייח, צמחים מאוימים ללא הרף על ידי שפע של פתוגנים המציגים את אורח החיים שונים ואסטרטגיות תזונתיות 1. להערכה ראשונה, פתוגנים biotrophic לשומרם מארח בחיים כדי לאחזר חומרים מזינים, ואילו רעלים באופן פעיל סוד פתוגנים necrotrophic ואנזימים להרוג רקמת מארח ולהאכיל על התאים המתים 1. קבוצה נוספת של פתוגנים, hemibiotrophs מכונה, מתחילה כמובן הזיהום שלהם עם שלב biotrophic ומשמרות לשלב necrotrophic עם הגיע לסף מסוים של הפתוגן הצטברות 2. על מנת להגן על עצמם יעילות נגד מיקרואורגניזמים אלה, צמחים התפתחו מערכת חיסון מולדת מסובכת מצויד במנגנון מעקב מרובה כדי לזהות את התקפת הפתוגן ולעורר מקומיים מתוכנת תא מוות 3, כמו גם התנגדות המערכתית נרכשת (SAR) 4. על אפיון sig החיוני מחקר נוכחי מתמקדרכיבי naling וצלב-שיחות בתוך המערכת החיסונית הצמח 5.

כפי שהוצע במודל "זיג-זג" 5, השכבה הראשונה של התגובה החיסונית המולדת הצמח דורשת הנוכחות של תבנית-מקומי קרום פלזמה ההכרה רצפטורים (PRRs) כדי לזהות את הפלישה של חיידק. PRRs מסוגל לזהות דפוסי חיידקים, Associated מולקולרי (MAMPs) ולהקים חסינות מופעלת על-MAMP (MTI) 6. מלבד גרימת upregulation תעתיק של גני המקודדים חלבוני יחסי ציבור מיקרוביאלית 7, MTI מוביל למגוון רחב של אירועים שיעצור את צמיחת הפתוגן, כוללים הייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ומיני חנקן תגובתי (RNS), בתצהיר של callose לקיר התא כמו גם את ההפעלה של איתות קינאז מרובה מסלולי 8.

עד עכשיו, כמה MAMPs זוהה להפעיל MTI בארבידופסיס, לרבות flg22 חיידקי 9 10 (18 חומצות אמינו מגורם חיידקי התארכות תרגום ט"ו) וקיר תא רכיב מבני peptidoglycans 11. להקים זיהום מוצלח, כמה פתוגנים מיוחדים התפתחו יכולת חלבוני מפעיל אלימות סוד לחללים תאיים או אינטר, וכתוצאה מכך להדחיק MTI ולעורר רגישות מופעלת על-מפעיל (ETS) 12,13. לדוגמא, effectors הארסיות יכולה להשבית מפלי קינאז זירחון (MAPK) חלבון פעיל-mitogen של MTI לגרום להתפתחות המחלה בתוך הרקמה נגועה 14-16. במהלך שיתוף האבולוציה הדינמית בין מארחים ופתוגנים, צמחים פיתחו גם את אסטרטגית התקפת נגד להכיר חלבוני מפעיל ולהחליש את ארסיות הפתוגן מולקולות 17. הכרת מפעיל ישירה או עקיפה זה מתווכת על ידי התנגדות מחלה חלבונים (R) 18. רוב tאמרה הן חברים של NB-LRR (נוקלאוטיד כריכה ולאוצין-ריץ חזרות) משפחה 19. התפיסה של מפעיל לֹא אַלִים ידי חלבון R מעורר תגובה חיסונית חזקה יותר ורחב יותר מאופיינת כחסינות מופעלת על-מפעיל (ETI) 20. מלבד גרימת הביטוי של גני ההגנה 21 והייצור של מטבוליטים הגנה 22, אתי לעתים קרובות מוביל למוות מהיר מקומי לתכנת תאים הידועים כרגישה להפליא תגובה (HR) כדי להגביל את הפתוגן מלהתפשט לרקמות הסמוכות 3.

בנוסף למקומי מתוכנת המוות של תאי 23, צמחים מסוגלים ליזום טווח ארוך ותגובה חיסונית מערכתית כינה מערכתית נרכשת התנגדות (SAR) 4. על אתגר עם הפתוגן biotrophic, תאי צמח לעורר את ביוסינתזה והצטברות של חומצה סליצילית phytohormone אנדוגני (SA) וחלבוני יחסי הציבור בשתי רקמות מערכתיות ומקומיות 24. באמצעות tהתהליך שלו, מדינה מוגברת של מוכנות מושגת בעלים נגוע המאפשר להרכבת תגובות הגנה מהירות יותר במהלך זיהום לאחר מכן על ידי קשת רחבה של פתוגנים 24. SA ותחליפיו סינטטיים כגון benzo- (1,2,3) -thiadiazole 7-carbothioic-אסתר -methyl S החומצה (BTH) וחומצת 2,6-dichloroisonicotinic (INA) מסוגלים כימי התרמה חומצה סליצילית (SA) חסינות -Triggered (STI) על יישום חיצוני 24. Nonexpressor של גנים הקשורים פתוגנזה 1 (NPR1) מוצע לאחד את הקולטנים SA ומתפקד כרגולטור תעתיק עיקרי בתגובת הגנת תיווך SA בשתי רקמות מערכתיות ומקומיות 21,25,26. הוכח בודאות כי NPR1 נדרש לכינון SAR ואובדן NPR1 מוביל לרגישות דרמטית לקראת syringae Pseudomonas 25.

הרחבה לאפיין את התרומה המולקולרית של צמחרכיבים באינטראקציות צמח לפתוגן, bioassays מרובה פותחו כדי למדוד אירועים ביטחוניים ספציפיים, כולל ROS פרץ 27, callose תצהיר 28, ביטוי גני הגנה והצטברות של מוצרי החלבון שלהם 21. בעוד מבחני הבודדים אלה יכולים לספק תובנות צורה מסוימת של התגובה החיסונית הצמח, אף אחד מהם, לעומת זאת, יכול לייצג את תגובת הגנה המלאה ברמת המפעל כולו. לעומת זאת, כימות של צמיחת הפתוגן לאחר ההדבקה מספקת הערכה כוללת של תגובה חיסונית ברמת האורגניזם. לכן, הפיתוח ואופטימיזציה של assay חיסון הפתוגן מדויק ואחיד ביותר הוא קריטי לדלק את המחקר ותגליות בתגובות החיסונית ארבידופסיס.

Pseudomonas syringae, חיידק גראם שלילי, זוהה כphytopathogen מסוגל לגרום למחלות במגוון של מארחי מפעל כולל Arabidopsהוא 29. כמערכת מודל הצמח לפתוגן, ארבידופסיס - פ האינטראקציה syringae כבר מיושמת באופן נרחב כדי להבין את המנגנונים המולקולריים תגובות הגנת צמח בסיס 29. עד עכשיו, יותר מ- 50 P. pathovars syringae זוהה על סמך יכולתם כדי להדביק מיני צמחים שונים 30 . פ syringae PV. DC3000 עגבניות (PST DC3000) 31 ופ syringae PV. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 שני זנים אלימים ביותר בשימוש נרחב והרחבה המאופיינת. מלבד להיות מוכר על ידי המפעל ומפעיל את תגובת MTI, PST DC3000 וPSM ES4326 מסוגל להפריש חלבוני מפעיל ארסיים לדכא MTI ולעורר ETS להעדיף 31,33 צמיחת הפתוגן.

פונקציונלי לנתח את האינטראקציה בין ארבידופסיס ופ syringae, מרובה0; שיטות זיהום הפתוגן פותחו בהתבסס על גישת מסירת הפתוגן. לצמחים שגודל באדמה, הפתוגן יכול להיות מועבר על ידי חדירת מזרק, חדירת אבק, חיסון טבילה וחיסון תרסיס 29,34. לאחרונה, assay שיטפון חיסון השתיל פותח כדי לבצע מסכי בקנה מידה גדול בתרבית רקמת צלחות גדלו צמחי ארבידופסיס צעירים 35. חדירת מזרק, כאחד מהגישה הנפוצה ביותר, באופן ידני מספקת את הפתוגן לאפופלסט דרך הפתחים טבעי העלה כינו הפיוניות 29. באמצעות גישה זו, כמויות שווה מפ syringae יכול להיות חדר לעלה הנגוע ואת הכוח של תגובה חיסונית מפעל בקורלציה הופך לרמות צמיחת הפתוגן. לכן, כימות של צמיחת הפתוגן משמשת כגישה אופטימלית כדי להעריך את תפקוד מערכת החיסון ברמת המפעל כולו. בנוסף, חדירת מזרק יכולה להבחין הרקמה מערכתית והמקומית, שיכול בדואר החל באפיון המנגנונים המולקולריים שבבסיס SAR 36.

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים assay חדירת מזרק מותאם עם PSM ES4326 למסך מוטציות ארבידופסיס לרגישות מוגברת למחלות (EDS). פרוטוקול זה יעסיק שני גנוטיפים ארבידופסיס: אקוטיפ wild-type קולומביה-0 (Col-0) צמחים (שליטה) ומוטציות פסד של הפונקציה npr1-1 (רגיש במידה קיצונית) אשר נגוע בזן חיידקים הארסי PSM ES4326 37. המוטציה npr1-1 נושאת מוטציה נקודה בתוך רצף קונסנסוס ankyrin-חוזר של מולקולת NPR1, אשר משנה את היסטידין השמור ביותר לטירוזין והופך את החלבון שאינו פונקציונלי 25. בנוסף, מספר השינויים של assay חדירת מזרק מתואר המאפשר כימות של פגמים בשכבות מסוימות של תגובה חיסונית, כולל MTI וSTI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הטקסט שלהלן מתאר פרוטוקול שלבים לביצוע אופטימיזציה assay חדירת מזרק PSM ES4326 בארבידופסיס. נהלים העיקריים של assay זה מיוצגים בתרשים זרימה פשוטה (איור 1).

1. תנאי גידול של צמח

  1. זרעים לזרוע
    1. הכן 2 סירים (4 בקוטר, 3.75 בגובה) מלאים באופן רופף עם סירי קרקע ומים על ידי טבילתם מO התחתון / N לפני ניקוז המים העודפים.
    2. לזרוע זרעי 50-100 ארבידופסיס, Col-0 או npr1-1 מוטציה wild-type, על כל סיר עם 70 מ"מ מקופל במשקל וכו 'או נייר אחר.
    3. מכסה את הסיר עם כיפה שקופה-ריססו מים כדי להגדיל את לחות היחסית ל80-90% (איור 2 א).
  2. דגירה הסיר על 4 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות כדי לאפשר לריבוד מלא ונביטת סינכרוני.
  3. העבר את הסיר לתנאי גידול הסטנדרטי (אור 12 שעות/ 12 שעות אפלות, 21 ° C, עוצמת אור של 100 μmol / m 2 / sec, לחות היחסית של 40%) על מנת לאפשר לזרע לנבוט. לפצח את הכיפה כדי ליצור 2-3 בפתיחה מייד לאחר העברה לחדר הצמיחה, שיעזור למנוע עיבוי מים.
  4. כשהעלה האמיתי הראשון מגיע לגודל של 2-3 מ"מ באורך, להשתיל את השתילים מהסיר ל- 72 בארות שטוחות מלאות באדמה.
    1. השתמש באצבע או קצה פיפטה 1 מיליליטר ליצור דיכאון עמוק 1-באמצע פני הקרקע בדירה.
    2. בעדינות להפריד שתילים בודדים עם נזק שורש קטן ככל האפשר. בזהירות להרים שתילים שיש להם שורשים בשלמותה עם מלקחיים.
    3. מניחים שתיל יחיד מופרד יחד עם הקפדה על גוש האדמה למזער הלם השתלה לתוך הדיכאון וללטף בעדינות את האדמה סביב למלא את הדיכאון. מחק את השתילים נוספים ואדמה לתוך מיכל פסולת ביולוגית מסוכן ולהיפטר בהתאםלהנחיות לסילוק פסולת הביולוגי מסוכן המקומיות.
    4. מים הועברו שתילים מלמעלה ולכסות לחלוטין שטוח עם כיפה שקופה-ריססו מים כדי לשמור על לחות 80-90%. שמור את הכיפה על במשך 3 ימים, ולאחר מכן לפצח את הכיפה בבוקרו של יום 4 ולחלוטין להסיר אותו עד סוף באותו היום.
      הערה: לזרוע זרעים יכולים להתבצע לחלופין על ידי זרעים יצרו רבדים ב 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה המכילים אגר 1 מיליליטר 0.1% למשך 48 שעות ב 4 ° C ואחרי העברת 2-3 זרעים עם טפטפת זכוכית על 72 בארות שטוחות מלאות באדמה. דירות צריכה להיות מכוסות בכיפה שקופה שניתן להסיר שבוע לאחר הנביטה. שתילים נוספים ניתן להסיר לצאת רק אחד שתילים בכל טוב.
  5. צמחי מים כל יומיים על ידי שריה במי דירות 1-בבמשך 20 דקות, ולאחר מכן לנקז את המים העודפים.
    הערה: מרווח הזמן להשקיית צמחים תלוי בלחות בחדר צמיחה וצריך להיות בסיס נחושד על תצפית רציפה של מתקן גידול צמחים של המשתמש. בדקו צמחים יומיים לוודא שהם להשקות היטב. אם רק כמה נקודות מתייבשות, מים אלו צמחים מלמעלה עם בקבוק להשפריץ.
  6. לבצע מבחני זיהום הפתוגן (שלב 3-5) על צמחים כי הם ליד או שלב התפתחותי # 3.50 (כאשר גודל שושנה הוא 50% גודל סופי), אשר תואם את 3-5 שבועות בהתאם לתנאי גידול (photoperiod, טמפרטורה). לא להדביק צמחים לאחר הופעת תפרחת (# שלב 5) בשל התפרצות של התנגדות הקשורים בגיל 38,39.

2. הכנת תרבות מדיה וצלחות

  1. הפוך 1 ליטר של B של המלך (KB) מדיום נוזלי. בעדינות מערבב peptone proteose 20 גרם וtrihydrate dibasic פוספט אשלגן 2 גרם באמצעות סרגל מערבבים מגנטי עם 1,000 מיליליטר H 2 O deionized עד אין גלולה גלויה. Aliquot 100 מיליליטר לבקבוקי זכוכית 150 מיליליטר וחיטוי במחזור נוזל 20 דקות.
  2. הכןתרבות צלחות עם מדיום מוצק KB.
    1. בעדינות מערבב H 20 גרם Proteose Peptone, 2 גרם אשלגן פוספט dibasic הידראט ו -15 אגר גרם עם 1,000 מיליליטר deionized 2 O. החיטוי.
    2. להתקרר הבינוני בצלחת ומערבבים מגנטית עד שהוא מגניב לגעת כדי למזער עיבוי עתיד ולמנוע השפלה של אנטיביוטיקה. להוסיף 18 מיליליטר 80% סטרילי גליצרול ו -5 מיליליטר סטרילי 1 M MgSO 4 לבינוני. בהתחשב בכך שPSM ES4326 נושא התנגדות נגד סטרפטומיצין, להוסיף סטרפטומיצין לתקשורת מקוררת לריכוז סופי של 50 מיליליטר מיקרוגרם - 1.
    3. יוצקים את הצלחות. הכן שני גדלים שונים של צלחות KB תקשורת: 100 מ"מ x 15 מ"מ ו -150 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי. בינוני צלחת פטרי המכיל הקטן משמש כצלחת תרבות חיידקים העיקריים, ואת צלחת פטרי הגדולה משמשת כחיידקי ספירת צלחת.
      הערה: חיידקי ספירת צלחות, יכולות לשמש צלחות מלבניות כדי להפחית אתמתכלה עלה מאז ניתן להתוות פעמיים טיפולים רבים לכל צלחת בהשוואה לצלחות סיבוב מסורתיות.
      1. יוצקים את הצלחות לפני ניסוי הדלקת. צלחות בינוניות KB חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד 2-3 חודשים מאז סולפט סטרפטומיצין מאבדת בהדרגה את פעילות האנטיביוטיקה 40.

3. מחלות רגישות משופרת (EDS)

  1. יום 1 - חיידקי Streak על צלחת
    1. אחרי יומיים לפני assay EDS, פס PSM ES4326 -80 ° C מניית גליצרול בצלחת תרבות חיידקי KB-דלקת ודגירה על 28 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות.
  2. יום 2 - ליזום מפעלי תרבות ומים נוזליים
    1. ליזום תרבות הנוזל במבחנה סטרילי עם 4 מיליליטר נוזל KB המכיל 50 מיקרוגרם מיליליטר - סטרפטומיצין 1 וללחוץ על 250 סל"ד, 28 ° CO / N.
      הערה: עבור assay זיהום EDS, באמצעות 6 צמחים לכל גנוטיפ הוא ממליץאד. עבור מבחני STI וMTI, 6 צמחים לכל גנוטיפ לטיפול מומלצים. לבידוד החיידקים, מומלץ להשתמש תרבות נוזל טרי עם צפיפות אופטית ב600nm λ בין 0.3 ו -0.6.
    2. סמן את הפטוטרות של מספר עלים 5 ו -6 עם סמן waterproof בוטה סוף לזיהוי קל של רקמות נגועות בדגימה (איור 1). כדי לשפר את הפתיחה של הפיוניות ולהקל על הכניסה של פתרון הפתוגן לעלה, להשקות את הצמחים היטב על ידי השריית השטוחה מלמטה במשך 20 דקות, ולאחר מכן לנקז את המים העודפים.
      הערה: לחלופין, לכסות את שטוחה עם כיפה שקופה ויש להשרות במים במשך 2-4 שעות כדי להגדיל את הפתיחה הפיוניות.
    3. חדירת דילול פתוגן ומזרק - יום 3
      הערה: זיהום פתוגן בשעות הבוקר הוא אופטימלי להתפשטות הפתוגן ופיתוח של תסמיני מחלה הבולט ביותר בגנוטיפים רגישים. לעשות כל מאמץ כדי לשמור להדביקתזמון יון קנה לחסל את השפעת מקצבי היממה וויסות הגנים יומית 41,42 המסייעת להפחית את השונות בין משוכפלים ניסיוניים.
      1. גלולה תרבות החיידקים בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge ב9,600 XG במשך 2 דקות ב RT וזורקים supernatant. Resuspend גלולה חיידקים עם 1 מיליליטר של 10 סטרילי מ"מ MgCl 2.
        הערה: קטיונים מגנזיום יכולים לשפר את תנועתיות והדבקה של פ syringae 43. לחלופין, להשתמש MgSO 4 באותו הריכוז. מים סטריליים הוא תחליף מקובל לפתרונות מלח Mg.
      2. לדלל את ההשעיה חיידקים עם 9 מיליליטר של 10 מ"מ MgCl 2 בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר ולמדוד את הצפיפות האופטית (OD) של חיידקים עם ספקטרופוטומטר בλ = 600 ננומטר. לדלל את החיידקים עם 10 מ"מ MgCl 2 ל600nm OD הסופי = 0.0002 עבור assay זיהום EDS.
      3. לחדור העלהעם מזרק 1 מיליליטר קצה קהה מחטים (הידוע בכינוי מזרק האינסולין) המכיל את פתרון חיידקים בדילול מלא.
      4. אין למלא את המזרק עד מלוא יכולתו. למלא אותו עם 0.5-0.6 מיליליטר, כדי לאפשר שליטה טובה יותר בתהליך החדירה.
      5. לחשוף את פני השטח התחתונים של העלה בחלק העליון של אצבע, ולאחר מכן בעדינות להתאים את מיקום העלה בעזרת אגודל. מקם את המזרק בצורה אנכית כנגד פני העלה כדי להבטיח לחץ שמופץ באופן שווה. נסה להימנע משטח midrib במהלך החדירה לצמצום נזק עלה.
      6. לאט לאט לדחוף את הבוכנה לחדור פתרון החיידקים; כניסת נוזל לmesophyll העלה תהיה דמיין כפי שצוינה על ידי צבע העלה הכהה יותר. תנסה לחדור את כל פני השטח של העלה. אם זה לא נעשה בניסיון אחד, לבחור נקודת חדירה נוספת ולחזור על הפעולות שתוארו לעיל, עד שכל פני השטח העלה מכוסים.
      7. ברגע שהושלם, בעדינות למחוק את העלה עם רקמה סופגת כדי להסיר את פתרון הפתוגן הנוסף. ראייה לבדוק את רקמת העלה הנגוע לנזק.
        הערה: רושם המזרק המעגלי לא צריך להיות גלוי לאחר החדירה היא מלאה.
      8. השאר את הצמחים הסתננו לייבוש במשך 1-2 שעות לפני החזרתם לתנאי הגידול המקורי שלהם. לאחר מכן, לרסס כיפה ברורה עם מים ולכסות את הצמחים הנגועים לשעה 2, ואז לפצח את הכיפה כדי ליצור 2-3 בפתיחה ולהשאיר אותו על כל שאר ניסוי הזיהום.
        הערה: מאחר שפ syringae אינו פתוגן מוטס, אין סיכון של התפשטות הגורם המדבק לצמחים אחרים גדלו באותו המתקן. עם זאת, כאמצעי זהירות הוסיפה, להימנע ממגע פיזי בין צמחים הנגועים וצמחים ניסיוניים אחרים בקרבת מקום. הכיסוי שטוח עם כיפה שקופה יגדיל את ארסיות הפתוגן ולהאיץ את התקדמות מחלה.צריך לצעד זה ומשך אופטימלי של תקופת הכיסוי צריכה להיות נקבעו על בסיס תנאי לחות של מתקן גידול צמחים של המשתמש.
    4. יום 5 - טרום לייבש את צלחות התקשורת
      1. קח את צלחות KB X 15 מ"מ 150 מ"מ מיחידת האחסון הקר ויבשים כל עיבוי קיים מראש מים על הצלחת. צלחות יבשים על ידי שמירה על אותם ב RT עבור בערך 24 שעות. כדי לזרז את התהליך הזה, למקם אותם בזרימה למינרית מכסה המנוע עם המכסים שלהם נסדקו במשך 30-60 דקות.
        הערה: שלב זה הנו קריטי להיווצרות טיפה מעגלית על פני השטח של הצלחת בשלב הבא.
    5. יום 6 - כימות צמיחת הפתוגן
      הערה: הליך כימות הפתוגן הבא עשויה להתבצע בנקודות זמן קודמות לאחר הזיהום לאשר סכומים שווים חיידקים מועברים לעלה, במיוחד כאשר צמחים שינו מורפולוגיה עלה.
      1. לעבד את הרקמה נגועה לאחר ההופעהשל ירקון שצוין על ידי ההצהבה של הרקמות נגועות בגנוטיפים הרגישים, אבל לפני התפתחות נגעי נמקים (איור 2).
        הערה: זמן דגימה מוצע הוא שלושה ימים לאחר חיסון הפתוגן. עם זאת, מאז צמיחת הפתוגן תלוי במספר הגורמים הסביבתיים, משך הדגירה עשוי להשתנות בטווח של 2 וחצי -3 וחצי ימים וצריך להיקבע על ידי תצפיות מדוקדקות של התקדמות הזיהום במתקן גידול צמחים של המשתמש.
        1. הכן 6 צינורות השחזה עבור כל גנוטיפ (איור 1). הנח כדור טחינת מתכת אל חלד אחד ולהוסיף 500 μl סטרילית -10 מ"מ MgCl 2 בכל שפופרת.
        2. לנתק את העלה הנגוע מהמפעל ואגרוף דיסק עלה עם אגרוף 1-חור נייר (איור 1).
          הערה: כדי למזער את טעות הדגימה, מנסה אגרוף כל עלה שנדגמו באותה התנוחה. דגימה של הדיסק עלה מלמעלהשל העלה מומלץ.
        3. באופן אקראי מקום 2 דיסקי עלה (משני צמחים שונים) לתוך צינור אחד שחיקה באמצעות מלקחיים.
        4. לאטום את הצינור וhomogenize הרקמה עם homogenizer תפוקה גבוהה במהירות המרבית (1,600 משיכות לדקה) במשך 10 דקות. חזור על תהליך זה במידת הצורך עד הרקמה היא גם הומוגני והפתרונים להפוך ירוקים בשל שחרור כלורופיל מהעלים הנגועים.
      2. בזמן המתנה להומוגניות, למלא את 6 השורות הראשונות של צלחת תרבות 96-היטב עם 180 μl 10 מ"מ MgCl 2 בעזרת פיפטה רב ערוצית ומאגר pipetting.
      3. לאחר הטחינה, להעביר 20 μl של השעיה רקמת קרקע לשורה הראשונה של הצלחת 96-היטב ומערבבים על ידי pipetting חזר נוזל למעלה ולמטה. אם שברים קטנים של רקמה להדביק את הקצה, סגור אותה על ידי 2-3 מ"מ שישיג לו את הנפח הנכון של הפתרון.
        1. כדי לספק מספיק מקום עבור אגל על ​​o העליונהF הצלחת, חלל הרקמה מגנוטיפים שונים בשורות חלופיות (איור 1). כדי להכין פי עשרה דילול סדרתי, להעביר 20 נוזלי μl לשורה השנייה ולחזור על הליך זה עד הדילול השישי.
      4. העברה 20 μl של הפתרון מהצלחת 96-היטב לצלחת KB x 15 מ"מ 150 מ"מ באמצעות טיפים פיפטה מחולקים (איור 1). עבודה מההשעיה לדלל ביותר המרוכז ביותר.
        הערה: הליך מרוב מדולל למרוכז ביותר מייתרת את הצורך לשנות את הטיפים פיפטה בין דילולים. אם הצלחת היטב מראש מיובשת, אגל הועבר צריך להישאר ללא שינוי בחלק העליון של המדיום עד לספיגה (בדרך כלל 15-30 דקות). זמן הייבוש משתנה עם RT והלחות.
      5. ייבש את הצלחת ב RT עם מכסה סדוק. ברגע שאין יותר נוזל יכול להיות שנצפה על פני השטח הצלחת, לסגור את המכסה, להפוך ודגירת הצלחת ב RT או C חממת 28 מעלות.
      6. דגירה צלחות ל40-60 שעות עד המושבות להיות גלויות. ודא שהצמיחה בצלחות משקפת את הירידה הצפויה של פי 10 במושבה להרכיב יחידות (CFU) (איור 2 ג). ספירת החיידקים לפני שהם לגדול ומושבות הפתיל. לקבוע את מספר החיידקים בדילול הנמוך ביותר שאין לי מושבות חופפות. בדרך כלל, הדילול העדיף לסמוך יכיל בין 10-50 מושבות.
        הערה: הווריאציה עשויה להיות נוכחת בין משכפל טכני; לכן, את הדילול הנמוך ביותר עבור כל לשכפל צריך להיות נקבע בנפרד.
      7. כדי לחשב את הרמות של התפשטות חיידקים, לתעד את מספר השורה (R), כמו גם את מספר החיידקים בתוך כל לשכפל טכני (T) בכתב. לקבוע את מספר היחידה להרכיב מושבה - CFU / דיסק לדפדף בנוסחא: דיסק CFU / עלה = (T × 10 R / 20) × 500/2
      8. הקלד את הנתונים בתבנית הגיליון האלקטרוני הבאה כדי produהספירה גרף (איור 1) (לקובץ תבנית ניתוח נתוני גיליון אלקטרוני, ראה טבלה 2). כל נקודת נתונים מיוצגת כממוצע של שישה משכפל על טכני בקנה מידה לוגריתמים. ברים שגיאה מייצגים 95% מהממוצע (n = 6).
        הערה: חישוב רווח סמך 95% צריך להיות מותאמים המבוסס על מספר החזרות טכניות.

4. חסינות מופעלת על-SA (STI)

  1. יום 1: בצע את אותו ההליך כמתואר בשלב 3.1.
  2. יום 2: בנוסף להשקיית הצמחים וייזום תרבות חיידקים הנוזלית (שלב 3.2), לגרום התנגדות על ידי יישום חיצוני של SA נתרן סליצילט הנגזר 21.
    הערה: יש SA הטהור מסיסות מים ירודה ודורש התאמת pH לפני, כך שזה לא מומלץ לassay זה.
    1. כדי לגרום לגינות בתיווך SA נגד פ syringae וראש הצמחים לזיהום בעתיד 21,24, צמחי תרסיס עם ערפל קנס של 1 מ"מ נתרן סליצילט או H 2 O (כמדומה) 16-24 שעות לפני זיהום הפתוגן.
  3. יום 3: הכן דילול הפתוגן ל600nm OD = 0.001 ולדחוף את החיידקים לפני השטח כולו עלה בחדירת מזרק (שלב -3.3).
  4. יום 6: לכימות הפתוגן ותהליך לספור, אחרי ההליך כפי שתואר עבור assay EDS (שלבי 3.4 ו -3.5). דגימות pretreated בנפרד - צלחת ולספור את H 2 O ונתרן סליצילט. לארבידופסיס wild-type, הפחתת 1-2 יומן בצמיחת הפתוגן צפוי בנתרן סליצילט - צמחי pretreated.

5. חסינות-מופעלת על MAMP (MTI)

הערה: בassay זה, אנו משתמשים בצמחי fls2 וEFR Col-0 ומוטציה פראי סוג ארבידופסיס. FLS2 וEFR הם תבנית פלזמה מקומי קרום ההכרה רצפטורים (PRRs) שיכולים לזהות flg22 וelf18, respectively 9,10. הפסד של כל תוצאות PRR בחוסר הרגישות לסוג המסוים של MAMP, אשר מסומן על ידי צמיחת הפתוגן ללא שינוי במוטציה הבאה מראש טיפול חיצוני MAMP וחדירת מזרק עם PSM ES4326.

  1. יום 1 ו- 2: בצע את אותו ההליך כמתואר בשלב 3.1 ו -3.2.
  2. יום 3: לפני טיפול MAMP וזיהום פתוגן
    1. להקים את החסינות מופעלת על-MAMP, להכין 1 מיקרומטר פתרון של flg22 epitope flagellin או elf18 epitope EF-ט"ו ומזרק לחדור אותו לכל h פני עלה 4 לפני זיהום הפתוגן (שלבי 3.3.3-3.3.6). זה יאפשר לאינדוקציה של ההגנות בתיווך MAMP נגד פ syringae וראש הצמחים לזיהום עתיד 6,37.
      הערה: נתוני microarray זמינים בפומבי חשפו את תכנות מחדש תעתיק המרבי של גני MAMP מגיבים קורה 4 שעות לאחר טיפול flg22 או elf18 37,44. לפיכך, 4 שעות היא מומלצתמשך הטיפול מראש MAMP כי תוצאות בהשגת הבדל ברור בצמיחת הפתוגן בין המטופלים MAMP-Col-0 ומוטציות fls2 וEFR.
    2. הסר את פתרון MAMP הנוסף עם רקמה סופגת ולהשאיר את הצמחים שנחשפו כדי להאיץ את תהליך קליטת הנוזל בתוך העלה. כדי להסביר את השפעת הפציעה מחדירת לחץ מזרק, לחדור H 2 O לעלים של צמחי שליטה.
    3. הכן דילול הפתוגן ל600nm OD = 0.001 ולדחוף את החיידקים לכל שטח העלה של MAMP / H 2 O מראש שטופל על ידי עלה חדירת מזרק (שלב 3.3).
  3. יום 6: לכימות הפתוגן ותהליך ספירה, בצע את ההליך כפי שמתואר בשלב 3.4 ו -3.5. צלחת ולספור את O H 2 ודגימות pretreated-MAMP בנפרד. בפרא-סוג ארבידופסיס, הפחתת 1-2 יומן בצמיחת הפתוגן צפוי בצמחים-pretreated MAMP, עם מעט חזקהפחתת ER בתיווך flg22 השוואה לelf18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול אנו מתארים כאן מייצג פ מותאם assay חדירת מזרק syringae להעריך כמותית את התגובה החיסונית בצמחי ארבידופסיס. כפי שמודגם באיור 1, חדירת המזרק של PSM ES4326 ואחריו חילוץ הפתוגן וכימות באמצעות מניין דילולים ומושבות סידוריים.

כפי שתוארו בשלב 3 בטקסט הפרוטוקול, רגישות משופרת מחלות (EDS) נגד PSM ES4326 ניתן להעריך על ידי זיהום עם הבידוד עם OD = 0.0002. כפי שניתן לראות באיור 3, מוטציות npr1-1 רגישות מאוד יש כ 2.5 יומן (300 פעמים) יותר צמיחת הפתוגן בהשוואה לפרא-הסוג Col-0 צמחים. בהתאם לתנאי הניסוי, צמחי npr1-1 יכולים לתמוך בעד 3.0 יומן התפתחות חיידקים יותר מ Col-0, עם רוב התוצאות נפוצות בטווח של 1.5-2.5 יומן. לכן, התחת EDS זהאיי מספק חלון רחב של הבדל, שבו החוקרים ייתכן שיוכלו למקם את מוטציות ארבידופסיס וtransgenics לזהות גני מועמדים פוטנציאליים מעורבים בתגובה החיסונית הצמח.

בנוסף לקביעת EDS, assay חדירת מזרק PSM ES4326 יכול להיות שונה כדי לנתח השכבות שונות של תגובה חיסונית. מנת להעריך חסינות מופעלת על חומצה סליצילית, בקשת חוץ של נתרן סליצילט הכימיקלים המשמשת להפעלת התגובה החיסונית, אשר לכמת ידי צמיחת הפתוגן (איור 4 א). אובדן NPR1, המתפקד כקולט SA ושיתוף רגולטור תעתיק גדול של גני המטרה SA-תלויים, מוביל לחוסר רגישות ליישום אקסוגני של נגזר חומצה סליצילית. חוסר רגישות זה לSA בא לידי הביטוי בצמיחה ללא שינוי הפתוגן בצמחים שטופלו מראש נתרן סליצילט npr1-1 בניגוד לירידה ניכרת בCol-0 צמחים (פחות pathog 20 פעמים en על יישום סליצילט נתרן) (איור 4).

כדי לאפיין את החסינות, הטיפול מראש-מופעלת על MAMP עם flg22 או elf18 בוצע כפי שמודגם באיור 5 א. לאפיין חסינות-מופעל flagellin, Col-0 וצמחים מוטנטים fls2 משמשים. FLS2, קינאז כמו קולט-מקומי קרום, מכיר flg22 ומפעיל 9 MTI. כפי שמודגם באיור 5, הצמחים שטופל flg22 Col-0 נתמכים יומן ~ 1 (10 פעמים) ירידה באוכלוסיית החיידקים, בעוד הצמחים מוטנטים fls2 לא הצליחו להפעיל את השפעת הגבלת התפתחות חיידקים. באופן דומה, אובדן קולט EF-ט"ו EFR בצמחים מוטנטים EFR מוביל לחוסר רגישות לelf18 טיפול מראש כפי שהודגם על ידי צמיחת הפתוגן ללא שינוי הבא elf18 מראש הטיפול (איור 5).

Iles / ftp_upload / 53,364 / 53364fig1.jpg "/>
איור 1. ייצוג סכמטי של assay חדירת מזרק PSM ES4326 בצמחי ארבידופסיס. משאיר את המספר 5 ו -6 של צמחי ארבידופסיס גדל אדמת מבוגרים מסומנים ונגוע בPSM ES4326 באמצעות חדירת מזרק. לאחר הופעת תסמיני מחלה, לנתק את העלים ודיסקי עלה קציר להומוגניזציה רקמה. רקמה היטב הומוגני מדוללת ב96-גם צלחות סדרתי לפני העברה על חיידקי ספירת צלחת. לאחר הופעת מושבות בצלחת, לספור את מספר החיידקים ולעבד את הנתונים כדי ליצור גרף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. נהלי נציג של assay EDS.קדרות () מכוסות בכיפה שקוף ריססו מים לאחר זריעת זרעים. (ב) נציג תסמינים על Col -0 ועלים npr1-1 נתון assay EDS (600nm OD = 0.0002) -3 ימי חיסון הודעה. הערה ירקון חמור על npr1-1 וההופעה כמעט הנורמלית של Col-0. (ג) דילולים סידוריים של PSM ES4326 גדלו בKB (50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין) צלחת תקשורת לאחר ~ 45 שעות של דגירה. חמישה דילולים גלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
3. תוצאות איור נציג של assay EDS צמיחת PSM ES4326 (יחידות להרכיב מושבה -. CFU / דיסק עלה, Expressed בקנה מידת יומן) היה לכמת בצמחי Col-0 וnpr1-1 4 שבועות בן 3 ימים לפרסם חיסון (600nm OD = 0.0002). ברים שגיאה מייצגים 95% מרווחי ביטחון של הממוצע (n = 6). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור הליך 4. נציגים ותוצאות של assay STI. (א) ייצוג סכמטי של החסינות מופעלת על-חומצה סליצילית (STI) assay. חסינות מופעלת על-חומצה (B) סליצילית היה לכמת מבוססים על צמיחת הפתוגן בצמחים שטופל מראש עם 1 מ"מ חדירת סליצילט נתרן או H 2 O 16 שעות לפני PSM ES4326 מזרק (600nm OD = 0.001). צמיחת פתוגן הייתה לכמת 3ימי חיסון הודעה. ברים שגיאה מייצגים 95% מרווחי ביטחון של הממוצע (n = 6). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. הליך נציג ותוצאות של assay MTI. נציגות סכמטית של החסינות מופעלת על-MAMP (א) (MTI) assay. (ב) MTI לכמת ידי צמיחת הפתוגן בצמחים מראש טופל עם פתרון 1μM בflg22 H, elf18 או 2 O (כמו שליטה) 4 שעות לפני PSM חדירת ES4326 מזרק (OD 600 ננומטר = 0.001). צמיחת פתוגן הייתה לכמת 3 ימי חיסון הודעה. ברים שגיאה מייצגים 95% מרווחי ביטחון של הממוצע (n = 6). אנא לחצו עליומחדש כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

נושא סיבות אפשריות פעולות מומלצות
אין צמיחת חיידקים במדיום הנוזלי לאחר O / תרבות N פעילות חיידקים מופחתת ליזום תרבות נוזלית מצלחת מפוספסת חדש
רושם מזרק חוזר מציג על העלה לאחר חדירת המזרק יותר מדי לחץ במהלך חדירה להפחית את pressue במהלך חדירה
רושם מזרק חלקי מציג על העלה לאחר חדירת המזרק מיצוב הולם של המזרק התאם את המזרק להיות ממוקם אנכי נגד פני העלה
wilts העלה wthtin כמה שעות לאחר חדירה מדי תמיסה הרבה הפתוגן היא חדר לעלה INF התחנהiltrating מייד לאחר כל משטח העלה הופך לירוק כהה בצבע
אין תסמיני מחלה שלושה ימים לאחר הדבקה לחות נמוכה מדי לפתוגן להתרבות להגדיל את לחות שבו נשמרים צמחים נגועים
פתוגן נכנס שלב necrotrophic באו לפני 3 dpi ריכוז נכון של פתרון הפתוגן 600nm OD השימוש = 0.0002 עבור assay EDS; לאשר דילול באמצעות ספקטרופוטומטר indepedent
טיפות למזג בחלק העליון של חיידקי ספירת צלחת חיידקי ספירת צלחת לא יבשים כראוי טרום יבש O הצלחת / N לפני השימוש
דילול פתוגן אינו מייצג ירידה של פי 10 דילול אינו מבוצע באופן מדויק השתמש פיפטה רב-ערוצים מכוילים היטב להעברת נוזל; לאשר כי כל הנוזל הוא לוותר
צמיחת פתוגן בסוג בר עולה על 8 CFU היומן / דיסק עלה overgrew הפתוגן בתוך הרקמה נגועה - דגימה מבוצע מאוחר מדי מדגם נגוע רקמות לאחר הופעתה של ירקון
וריאציה גדולה בין משכפל טכני צמחים הם לא באותו שלב התפתחותי או מספר עלה שחדר אינו עולה בקנה השתמש רק בצמחים באותו השלב התפתחותי לזיהום. לאשר נביטת סינכרוני. להדביק מספר עלה בקנה אחד בין צמחים שונים

טבלת 1. פתרון בעיות של assay חדירת מזרק.

אנא לחץ כאן לצפייה בטבלה 2.

שולחן גיליון אלקטרוני 2. לניתוח סטטיסטי של נתוני צמיחת הפתוגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בהפחתה חקלאית זמין והגדלת אוכלוסייה, חוקרים ברחבי העולם מאותגרים עם צרכי דחופים ליבול השבחה. התשואה יכולה להיות מושפעת במידה רבה מלחצי יוטיים ואביוטי מגוון. ביניהם, זיהום הפתוגן הוא אחד הגורמים המובילים של הפחתת תשואת יבול, אחראי לכ -12% הפסדים בארה"ב 45 בלבד. כדי לפתור בעיה זו, מחקר מאסיבי נערך בארבידופסיס המודל - פ pathosystem syringae לאפיין באופן מקיף את הרכיבים ומנגנוני ויסות של התגובות חיסוני הצמח. כאן, אנו מציגים פ מותאם assay חדירת מזרק syringae ES4326 להעריך כמותית את ההבדלים הדקים בתגובה חיסונית מפעל ברמת המפעל כולו.

אף על פי מבחני זיהום הפתוגן המרובים פותחו כדי לאפיין את התגובה החיסונית צמח 29,35 את חדירת המזרק מספקתמערכת מבוקרת היטב שבו כמויות שווה של הפתוגן מנוהלות לתוך הרקמה נגועה. במבחני זיהום אחרים, לרבות חיסון לטבול וחיסון תרסיס, הפתוגן יוחל על רקמת האוויר השלם, כולל פסיגים כמו גם כמו אמיתי משאיר -34. זה כבר דווח כי פסיגים מerecta נדסברג אקוטיפ (אה L) הם הרבה יותר רגיש לפתוגן במהלך assay חיסון טבילה, שעשוי להטות את הנתונים ולהוביל למסקנות שגויות על התנגדות המחלה הכללית 34. בנוסף, שני מבחני האמורים דורשים הפתוגן להיכנס לעלה דרך הפיוניות, הנשלטת על ידי גורמים סביבתיים שונים, לרבות לחות והאור. גורמים אלה תנודות תורמת לרמה גבוהה של שינוי בתסמיני המחלה השוואה לassay חדירת המזרק 35. לחדירת אבק, החסרונות העיקריים כוללים את הצורך בכמויות גדולות של פתרון הפתוגן, קושילחדור ביעילות את כל העלים ואילו למנוע נזק, ואת עוצמת עבודה ניכרת 29. יתר על כן, הצמחים נגועים בתרסיס, לטבול או חיסון ואקום נוטים פחות לשחזר מאז את כל השתיל נגוע בפתוגן. בהתחשב במגבלות הרבות של שיטות אחרות, assay חדירת המזרק נשאר בשיטה של ​​בחירה כדי להשיג התקדמות מחלה אחידה וצפויה מאוד וכימות מדויק של הפתוגן לאפיין את התגובה החיסונית בתוך העלה הנכון מהימן. בנוסף, assay זה ניתן לשנות בקלות לאפיין חסינות מופעלת על-MAMP ומערכתי נרכשת התנגדות. חוץ מזה, מבטיח יישומים עתידיים של הטכניקה יכולה להיות מיושם לתופעות בדיקות של phytohormones מרובה, כימיקלים או מעכבים לפני טיפולים ואחרי חדירת מזרק הפתוגן לנתח שכבות שונות של רשת חיסונית איתות צמח או לזהות תפקידים של מסלול ספציפי בצמח חיסוני תשובה. Wi זיהוםth מינון מוגבר של (600nm OD = 0.001) הפתוגן בהעדר הגנה תחול מראש טיפולים, המכונים מבחן משופר מחלת ההתנגדות (EDR), הוא עוד שינוי שימושי של שיטה זו, שניתן להשתמש כדי לזהות מוטציות או transgenics עם התנגדות מחלה משופרת.

יש לציין כי assay חדירת מזרק אינו חל על האפיון של שלב טרום-פולשנית של תגובת הגנה מאז הפתוגן מועבר ישירות לתוך רקמת העלה באמצעות הפיוניות. סגירת הפיוניות, המשמשת כמחסום הפיזי לכניסת הפתוגן, לעתים קרובות מופעלת להגביל כניסת הפתוגן על הקמת החסינות-מופעלת על MAMP 46. בנוסף, חומצת abscisic phytohormone תורמת לסגירת הפיוניות בשלב טרום-פולשני 47. לכן, שיטות ריסוס או טבילה יכולות להוכיח יתרון לאפיין את השכבה הפיוניות של התגובה החיסונית, למרות אזהרות קשורותעם סוגים אלה של חיסונים, שנדון לעיל 29.

מאז ניתן לשנות אינטראקציות הצמח לפתוגן על ידי גורמים ביוטיים וא-ביוטי שונים, זה קריטי להתמקד בשלבים הקריטיים המפורטים להלן בפרוטוקול כדי להשיג זיהום מוצלח ולהשיג תפוקות אמינות:

פעילות מצב צמח וחיידקים

צמחי ארבידופסיס ניתן הדגישו בקלות על ידי גורמי א-ביוטי שונים, כוללים טמפרטורה תת-אופטימליים, הבצורת ולחץ האוסמוטי, ולעורר תגובות תאיות שמפריעות לתפוקה החיסונית 48. לכן, חשוב לגדל צמחים בתנאי גידול אופטימליים ולהגן עליהם מפני פגעי הסביבה. בנוסף, מאז השלב ההתפתחותי של העלה הנגוע עלול גם לשנות את תוצאת הניסוי, יש צורך להדביק באופן עקבי עלים מספר 5 ו -6, כדי למנוע חפצים. התקדמות לאורך שלבים התפתחותיים, מחדש מוגבהsistance נגד כמה פתוגנים אלימים ולֹא אַלִים בקורלציה עם המעבר מן השלב גטטיבי לשלב רבייה צמחי ארבידופסיס. התנגדות דינמית זה על שלב ההתפתחותי שמכונה גיל הקשורות התנגדות (ARR) 38. כדי להימנע מהתערבות ARR עם התגובה החיסונית נכון, זה קריטי לבצע את הזיהום בשלב ההתפתחותי הנכון כפי שצוין בפרוטוקול ולהימנע מניסיון ניסויי זיהום לאחר תחילת שלב הרבייה. יתר על כן, כושר ופעילות חיידקים באופן משמעותי להשפיע על התפשטות הפתוגן בתוך הרקמה נגועה. לפיכך, חשוב ליזום תרבות נוזל חיידקים מצלחת תרבות טרי מפוספסת שהיא בן לא יותר מ 2 ימים.

skill חדירת מזרק

במהלך חדירת המזרק, מנסה למנוע נזק פיזי לעלה מאז פציעת השפעה ידועה היטב להתערב בתגובת המפעל חיסונית, בעיקר באמצעות איתות בתיווך החומצה jasmonic שיכול לדכא את ההגנה מופעלת-SA מסלולי 49. לאחר הזיהום, עלה אשר חדר צריך להתאושש לחלוטין למראה הנורמלי הפיזי ללא כל נזק ויזואלי. למתחילים, מומלץ לתרגל טכניקה זו משתמשת בצמחים שאינם ניסיוניים הראשון לפני ביצוע assay חדירת מזרק PSM ES4326.

חילוץ פתוגן ודילול

מדויק למדוד את צמיחת הפתוגן, הוא חיוני, כדי לחלץ הפתוגן ביעילות מרקמות הצמח הנגועים. בהשוואה לשיטות אחרות חילוץ, הומוגניזציה רקמה מכאנית באמצעות homogenizers תפוקה גבוהה ביעילות תמציות הפתוגן ללא האובדן של דגימת רקמה וזיהום צולב. בהמשך לכך, דילולים מדגם צריכים להתבצע דווקא עם טפטפת רב-ערוצים מכוילים באופן מהימן כדי להפחית את שגיאת pipetting.סטייה קטנה ככל ± 1 μl בתהליך הדילול היה לתרגם את הבדל ~ 5% בכימות צמיחת הפתוגן. לדוגמאות נוספות לפתרון בעיות של assay חדירת מזרק, אנא ראה טבלה 1.

לסיכום, אנו מתארים מותאם assay חדירת מזרק PSM ES4326 בארבידופסיס כמותית ואמין על מנת להעריך את התגובה החיסונית הצמח. בעזרתו של pathosystem זה, הבנה של אינטראקציה הצמח לפתוגן תואץ במעבדה וסופו של דבר להיות מיושמת להגנת הצומח בתחום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MetroMix 360  Grosouth SNGMM360
Large pots Grosouth TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts Grosouth LM1206
11x 21 Flats with no holes Grosouth LM1020
11x 21 Flats with holes Grosouth LM1020H
Vinyl propagation domes Grosouth CW-221
Proteose Peptone Fisher Scientific DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate  MP Biomedicals 151946
Agar  Fisher Scientific A360-500
Streptomycin sulfate Bio Basic Inc SB0494
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific R80150
Rectangular plate Fisher Scientific 12-565-450 
MgCl2 Hexahydrate Bio Basic Inc MB0328
Glycerol Bio Basic Inc GB0232
MgSO4  Bio Basic Inc MN1988
1 ml syringe Fisher Scientific NC9992493 
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-A
Grinding tubes  Denville Scientific B1257
Caps for grinding tubes Denville Scientific B1254
Stainless steel grinding ball Fisher Scientific 2150
96-well plate  Fisher Scientific 12-556-008
Sodium Salicylate Sigma Aldrich s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) Genescript Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) Genescript Made to order
Hole puncher Staples 146308
Biophotometer plus Eppendorf 952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer Fisher Scientific 02-215-503
Accu spin micro centrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl) Eppendorf 3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl) Eppendorf 3122 000.060
Pipette (20µl) Eppendorf 3120 000.038
Pipette tips Fisher Scientific 3552-HR
Sharpie permanent marker Staples 507130
1.5 ml tube Eppendorf 22363204
Forceps Fisher Scientific 08-890

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
  3. Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
  4. Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
  5. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
  6. Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
  7. Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
  8. Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
  9. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
  10. Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
  11. Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
  12. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
  13. Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
  14. He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
  15. Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
  16. Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
  17. Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
  18. Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
  19. Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
  20. Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
  21. Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
  22. Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
  23. Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
  24. Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
  25. Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
  26. Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
  27. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
  28. Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
  29. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
  30. Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
  31. Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
  32. Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
  33. Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
  34. Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
  35. Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
  36. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
  37. Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
  38. Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
  39. Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
  40. Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
  41. Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
  42. Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
  43. Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
  44. Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
  45. Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
  46. Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
  47. Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
  48. Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
  49. León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).

Tags

זיהום גיליון 104, זיהום חדירת מזרק חסינות צמח חומצה סליצילית (SA) משופר מחלת רגישות ומערכתית נרכש התנגדות תבניות חיידקים Associated מולקולרי (MAMPs) חסינות מופעלת על-MAMP חסינות מופעלת על-SA
חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C.… More

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter