Abstract
En l'absence de cellules immunitaires mobiles spécialisées, les plantes utilisent leur mort cellulaire programmée localisée et systémique résistance acquise à se défendre contre les attaques de pathogènes. La contribution d'un gène d'Arabidopsis spécifique à la réponse immunitaire de l'installation globale peut être spécifiquement et évalué quantitativement par dosage de la croissance de l'agent pathogène dans le tissu infecté. Pendant plus de trois décennies, la bactérie hémibiotrophe Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) a été largement appliquée comme le modèle pathogène pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la réponse immunitaire Arabidopsis. Afin de fournir des agents pathogènes dans les tissus foliaires, de multiples méthodes de vaccination ont été mis en place, par exemple, une seringue infiltration, dip inoculation, pulvérisation, infiltration sous vide, et l'inoculation d'inondation. Le protocole suivant décrit une méthode d'infiltration seringue optimisé pour fournir virulente Psm ES4326 dans les feuilles de l'adultesol cultivé des plants d'Arabidopsis et l'écran avec précision pour une meilleure sensibilité à la maladie (EDS) en direction de cet agent pathogène. En outre, ce protocole peut être complétée avec de multiples pré-traitements pour disséquer défauts immunitaires spécifiques au sein des différentes couches de défense de la plante, y compris l'acide salicylique (SA) Immunité -Triggered (IST) et immunitaires MAMP-Triggered (MTI).
Introduction
En raison de leur nature sessiles, les plantes sont constamment menacés par une pléthore d'agents pathogènes présentant différents modes de vie et des stratégies nutritionnelles 1. En première approximation, les agents pathogènes biotrophes maintiennent leur hôte vivante pour récupérer les nutriments, tandis que les agents pathogènes et les toxines nécrotrophes enzymes activement secrets pour tuer le tissu hôte et se nourrissent sur les cellules mortes 1. Un autre groupe d'agents pathogènes, hemibiotrophs appelés, commence leur cours de l'infection par le stade biotrophe et les changements à l'étape nécrotrophe après avoir atteint un certain seuil de pathogène accumulation 2. Afin de se défendre efficacement contre ces micro-organismes, les plantes ont développé un système immunitaire inné compliquée équipé de mécanismes de surveillance multiples pour détecter l'attaque d'agents pathogènes et de déclencher localisée mort cellulaire programmée 3 ainsi que la résistance systémique acquise (SAR) 4. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation de la sig essentielcomposants naling et croisées pourparlers dans le système immunitaire de la plante 5.
Comme proposé dans le modèle "Zig-Zag" 5, la première couche de l'usine de la réponse immunitaire innée nécessite la présence de plasma membrane localisée Motif Recognition Receptors (PRR) pour détecter l'invasion d'un microbe. PRR sont capables de reconnaître des modèles Microbe-Associated Molecular (MAMPS) et d'établir l'immunité MAMP-Triggered (MTI) 6. Outre induire une régulation positive de la transcription des gènes codant pour des protéines PR antimicrobiens 7, MTI conduit à une variété d'événements qui arrête la croissance des pathogènes, y compris la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de l'azote réactif espèces (RNS), le dépôt de callose à la paroi cellulaire ainsi que l'activation de la signalisation de la kinase de multiples voies 8.
Jusqu'à présent, plusieurs MAMPS ont été identifiés pour déclencher MTI chez Arabidopsis, y compris Flg22 bactérienne 9 10 (18 elf18 acides aminés de la traduction bactérienne facteur d'élongation Tu) et une pièce de structure de la paroi cellulaire 11 peptidoglycanes. Pour établir une infection réussie, certains agents pathogènes spécialisés ont évolué la capacité de protéines secrets virulence effectrices dans les espaces intracellulaires ou intercellulaires, et par conséquent réprimer MTI et de déclencher sensibilité effecteur-Triggered (ETS) 12,13. Par exemple, les effecteurs de virulence peuvent inactiver mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation cascades de MTI pour induire le développement de la maladie dans le tissu infecté 14-16. Lors de la co-évolution dynamique entre hôtes et pathogènes, les plantes ont également développé la stratégie de contre-attaque de reconnaître les protéines effectrices et atténuer la virulence des agents pathogènes 17 molécules. Cette reconnaissance directe ou indirecte effecteur est médiée par la résistance aux maladies (R) 18 protéines. La plupart des tourlet sont membres de NB-LRR (Nucleotide Binding et riche en leucine répétitions) famille 19. La perception d'un effecteur avirulent par une protéine R provoque une réponse immunitaire plus forte et plus large que l'immunité caractérisé effecteur-Triggered (ETI) 20. Outre induire l'expression de gènes de défense 21 et la production de métabolites de la défense 22, ETI conduit souvent à une mort rapide localisée cellulaire programmée connu comme réponse hypersensible (HR) pour restreindre l'agent pathogène de se propager dans le tissu adjacent 3.
En plus de l'localisé mort cellulaire programmée 23, les plantes sont capables d'initier une longue durée et la réponse immunitaire systémique appelée résistance systémique acquise (SAR) 4. Lors de l'épreuve avec un agent pathogène biotrophe, les cellules végétales déclenchent la biosynthèse et l'accumulation d'un acide salicylique de phytohormone endogène (SA) et des protéines PR dans les deux tissus locaux et systémiques 24. Grâce à tsa démarche, un état de préparation est réalisée dans les feuilles non infectées qui permet de monter des réponses plus rapides de la défense au cours d'une infection ultérieure par un large spectre d'agents pathogènes 24. SA et ses analogues synthétiques tels que le benzo (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioïque ester de l'acide S-méthyl (BTH) et l'acide 2,6-dichloro-isonicotinique (INA) sont capables d'induire chimiquement l'acide salicylique (SA) Immunité -Triggered (IST) à la demande externe 24. Nonexpressor de la pathogenèse-Les gènes associés (1 NPR1) est proposé pour être l'un des récepteurs et des fonctions SA en tant que régulateur transcriptionnel majeur au cours de la réaction de défense SA-médiation dans les deux tissus locaux et systémiques 21,25,26. Il a été démontré de façon concluante que NPR1 est nécessaire à l'établissement SAR et la perte de NPR1 mène à susceptibilité dramatique vers Pseudomonas syringae 25.
Pour caractériser largement la contribution moléculaire de l'usinecomposants dans les interactions plante-pathogène, de multiples essais biologiques ont été développés pour mesurer des événements spécifiques de la défense, y compris ROS éclatement 27, dépôt de callose 28, l'expression des gènes de défense et l'accumulation de leurs produits protéiques 21. Bien que ces dosages individuels peuvent fournir des indications sur une forme spécifique de la réponse immunitaire de la plante, aucun d'entre eux, cependant, sont en mesure de représenter la réponse complète de la défense au niveau de la plante entière. A l'inverse, la quantification de l'évolution de l'infection par l'agent pathogène après fournit une estimation globale de la réponse immunitaire au niveau des organismal. Par conséquent, le développement et l'optimisation d'un test pathogène inoculation précis et hautement normalisé est essentiel pour alimenter la recherche et les découvertes sur les réponses immunitaires Arabidopsis.
Pseudomonas syringae, une bactérie à Gram-négatif, a été identifié comme un phytopathogène capable de provoquer une maladie chez une gamme de plantes hôtes y compris Arabidopsest 29. Comme le système plante-pathogène modèle, Arabidopsis - P. interaction syringae a été largement appliqué à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents réponses végétales défense 29. Jusqu'à maintenant, plus de 50 P. pathovars syringae ont été identifiés sur la base de leur capacité à infecter les 30 espèces végétales différentes . P. syringae pv. DC3000 de tomate (Pst DC3000) 31 et P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sont les deux souches virulentes plus largement utilisés et largement caractérisés. En plus d'être reconnu par la plante et le déclenchement de la réponse MTI, Pst DC3000 et PSM ES4326 sont capables de sécréter des protéines effectrices virulentes de supprimer MTI et de déclencher ETS de favoriser la croissance de 31,33 pathogène.
Pour disséquer fonctionnellement l'interaction entre Arabidopsis et P. syringae, multiple0; méthodes d'infection des agents pathogènes ont été développés sur la base de l'approche de prestation des agents pathogènes. Pour les plantes des sols cultivés, agent pathogène peut être délivré par la seringue infiltration, infiltration sous vide, dip inoculation et inoculation par pulvérisation 29,34. Récemment, des semis dosage inondations inoculation a été développé pour effectuer des écrans de grande envergure sur la culture de tissus plaques cultivés jeunes plants d'Arabidopsis 35. Seringue infiltration, comme l'un de l'approche la plus couramment utilisée, délivre manuellement l'agent pathogène dans le apoplaste à travers les ouvertures de la feuille naturelle appelés stomates 29. Grâce à cette approche, des quantités égales de P. syringae peut être infiltré dans la feuille infectée et la force de la réponse immunitaire de la plante est inversement corrélée aux niveaux de croissance des agents pathogènes. Par conséquent, la quantification de la croissance de l'agent pathogène sert une approche optimale pour évaluer la fonction immunitaire au niveau de la plante entière. En outre, une seringue infiltration peut distinguer le tissu local et systémique, qui peut be applicable à caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents SAR 36.
Dans le protocole suivant, nous décrivons une seringue infiltration dosage optimisé avec Psm ES4326 pour cribler des mutants d'Arabidopsis pour une meilleure sensibilité à la maladie (EDS). Ce protocole consiste à employer deux génotypes d'Arabidopsis: une de type sauvage écotype Columbia-0 (Col-0) plantes (contrôle) et des mutants npr1-1 perte de fonction (hypersensible) qui seront infectés avec la souche bactérienne virulente Psm ES4326 37. Le mutant npr1-1 porte une mutation ponctuelle dans la séquence consensus de répétition ankyrine-NPR1 de la molécule, ce qui modifie l'histidine hautement conservé de tyrosine et rend la protéine non fonctionnelle 25. En outre, un certain nombre de modifications de la seringue de dosage infiltration sont décrits qui permettent la quantification des défauts dans les couches spécifiques de la réponse immunitaire, y compris MTI et IST.
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Protocol
Le texte qui suit décrit un protocole par étapes à accomplir optimisé Psm ES4326 dosage seringue d'infiltration chez Arabidopsis. Les principales méthodes de ce test sont représentés dans un organigramme simplifié (figure 1).
1. Plante conditions de croissance
- Semer des graines
- Préparez 2 pots (4 de diamètre, 3,75 en hauteur) remplis sans tasser avec le sol et l'eau des pots en les trempant du fond O / N avant de drainer l'excès d'eau.
- Semez les graines d'Arabidopsis 50-100, de type sauvage Col-0 ou npr1-1 mutantes, sur chaque pot avec une pliées 70 mm pesant feuille ou autre papier.
- Couvrir la casserole avec un dôme transparent pulvérisé de l'eau pour augmenter l'humidité relative à 80-90% (figure 2A).
- Incuber le pot à 4 ° C pendant 72 heures pour permettre la stratification complète et la germination synchrone.
- Transférez le pot aux conditions de croissance standard (12 heures de lumière/ 12 h sombre, 21 ° C, l'intensité lumineuse de 100 pmol / m 2 / sec, l'humidité relative de 40%) pour permettre à la graine de germer. Crack le dôme pour générer un 2-3 à ouvrir immédiatement après le transfert à la salle de la croissance, qui permettra d'éviter la condensation de l'eau.
- Lorsque la première vraie feuille atteint la taille de 2-3 mm de longueur, transplanter les plants de pot pour un 72-puits plat remplis de terre.
- Utilisez un doigt ou une pointe de pipette de 1 ml pour créer une dépression profonde 1-en dans le milieu de la surface du sol sur le plat.
- Séparez délicatement les plants individuels avec aussi peu de dommages aux racines que possible. Prenez soigneusement plants qui ont des racines intactes avec une pince.
- Placez un semis séparés avec le bouquet du sol adhérant à minimiser le choc de la transplantation dans la dépression et tapotez doucement sur le sol environnant pour remplir la dépression. Jeter les plants supplémentaires et des sols dans le récipient pour déchets biologiques dangereux et mettre au rebut conformémentavec les directives d'élimination des déchets biologiques dangereux locales.
- Eau transféré semis à partir du haut et couvrir complètement le plat avec un dôme transparent pulvérisé-eau pour maintenir 80-90% d'humidité. Gardez le dôme pendant 3 jours, puis casser le dôme dans le matin du jour 4 et le supprimer complètement d'ici la fin de cette journée.
Remarque: semer des graines peuvent également être réalisé par des graines de stratification dans 1,5 ml tubes de centrifugeuse contenant 1 ml 0,1% d'agar pendant 48 heures à 4 ° C, puis en transférant 2-3 graines avec une pipette en verre sur un 72-puits plat remplis de terre. Logements doivent être couvertes avec un dôme transparent qui peut être enlevée une semaine après la germination. Plants supplémentaires peuvent être retirés pour ne laisser qu'un seul plant par puits.
- Les plantes aquatiques tous les deux jours par trempage appartements en 1-dans l'eau pendant 20 min, puis égoutter l'excès d'eau.
Remarque: L'intervalle de temps pour arroser les plantes dépend de l'humidité ambiante de croissance et doit être la base déterminéeD sur une observation permanente de l'usine de la croissance des plantes de l'utilisateur. Vérifiez plantes tous les jours pour vous assurer qu'ils sont bien arrosées. Si seulement quelques taches sont le séchage, l'eau ces plantes depuis le sommet avec un vaporisateur. - Effectuer des tests d'infection pathogène (étape 3-5) sur les plantes qui sont à ou près de stade de développement # 3.50 (lorsque la taille de la rosette est de 50% de la taille finale), ce qui correspond vieux pour 3-5 semaines en fonction des conditions de croissance (photopériode, température). Ne pas infecter les plantes après épiaison (stade n ° 5) en raison d'apparition d'une résistance liée à l'âge 38,39.
2. Préparation de la Culture, des Médias et plaques
- Faire 1 L de la B King (KB) de milieu liquide. Incorporer délicatement 20 g protéose peptone et 2 g de phosphate de potassium trihydrate dibasique en utilisant une barre d'agitation magnétique avec 1000 ml de H 2 O déminéralisée jusqu'à ce qu'il n'y culot visible. Aliquote de 100 ml dans 150 ml bouteilles en verre et en autoclave sur un cycle liquide 20 min.
- Préparerdes plaques de culture avec KB milieu solide.
- Incorporer délicatement H 20 g Protéose Peptone, 2 g de phosphate de potassium dibasique trihydrate et 15 g d'agar avec 1.000 ml déminéralisée 2 O. Autoclave.
- Refroidir le moyen sur une plaque d'agitation magnétique jusqu'à ce qu'elle soit froide au toucher pour minimiser la condensation avenir et éviter la dégradation des antibiotiques. Ajouter 18 ml stérile 80% de glycerol et 5 ml stériles MgSO 4 1 M dans le milieu. Étant donné que Psm ES4326 porte contre la résistance à la streptomycine, ajouter de streptomycine dans le milieu refroidi à une concentration finale de 50 pg ml - 1.
- Pour les plaques. Préparer deux différentes tailles de plaques de milieu KB: 100 mm x 15 mm et 150 mm x 15 mm de boîtes de Pétri. La boîte de Pétri contenant un milieu plus petit sert de plaque de culture de bactéries primaires, et le plus grand boîte de Pétri sert bactéries compter plaque.
Remarque: Pour les bactéries de comptage plaques, plaques de forme rectangulaire peuvent être utilisés pour réduire leconsommables coûtent depuis deux fois plus nombreux traitements peuvent être tracées par plaque par rapport à des plaques rondes traditionnelles.- Pour les plaques avant l'expérience d'infection. KB moyennes Magasin plaques à 4 ° C pendant jusqu'à 2-3 mois depuis sulfate de streptomycine perd progressivement l'activité antibiotique 40.
3. sensibilité accrue des maladies (EDS)
- Jour 1 - bactéries Streak sur la plaque
- Deux jours avant le dosage EDS, série ES4326 Psm de -80 ° C stock de glycérol sur une plaque de culture bactérienne KB-Strep et incuber à 28 ° C pendant 24-48 h.
- Jour 2 - initier la culture et de l'eau plantes liquides
- Initier la culture liquide dans un tube à essai stérile avec 4 ml de milieu KB liquide contenant 50 ug ml - 1 streptomycine et serrer à 250 tpm, 28 ° CO / N.
Remarque: Pour EDS dosage de l'infection, en utilisant 6 plantes par génotype est recommandééd. Pour les tests IST et MTI, 6 plantes par génotype par traitement sont recommandés. Pour l'inoculum de bactéries, il est recommandé d'utiliser un liquide de culture frais densité optique à 600 nm λ entre 0,3 et 0,6. - Mark les pétioles des feuilles numéro 5 et 6 avec un marqueur indélébile extrémité émoussée pour faciliter l'identification des tissus infectés lors de l'échantillonnage (figure 1). Pour améliorer l'ouverture des stomates et de faciliter l'entrée de la solution d'agent pathogène dans la feuille, arroser les plantes et par trempage de la plate du bas pendant 20 min, puis égoutter l'excès d'eau.
Remarque: vous pouvez couvrir le plat avec un dôme transparent et laisser tremper dans l'eau pendant 2-4 heures pour augmenter l'ouverture des stomates. - Jour 3 - dilution des agents pathogènes et la seringue infiltration
Remarque: l'infection des agents pathogènes pendant les heures de la matinée est optimale pour la prolifération des agents pathogènes et le développement de symptômes de la maladie les plus prononcées sur les génotypes sensibles. Faites tous les efforts pour maintenir la Infection synchronisation conforme à éliminer l'effet des rythmes circadiens et la régulation des gènes diurne 41,42, ce qui permet de réduire la variation entre les répétitions expérimentales.- Pellet la culture bactérienne dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse à 9600 g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot bactérien avec stérile 1 ml de MgCl2 10 mM.
Remarque: cations de magnésium peut améliorer la motricité et l'adhérence de P. syringae 43. Sinon, utilisez MgSO 4 à la même concentration. L'eau stérile est un substitut acceptable pour les solutions de sel de Mg. - Diluer la suspension bactérienne avec 9 ml de 10 mM de MgCl2 dans un tube centrifuge de 50 ml et mesurer la densité optique (DO) de bactéries avec un spectrophotomètre à λ = 600 nm. Diluer avec les bactéries 10 mM de MgCl2 à la DO 600nm = 0,0002 finale de dosage de l'infection par EDS.
- Infiltrez la feuilleavec un 1 ml de seringue sans aiguille extrémité émoussée (communément appelée la seringue à l'insuline) qui contient la solution bactérienne diluée.
- Ne pas remplir la seringue jusqu'à sa pleine capacité. Remplissez-le avec 0,5-0,6 ml pour permettre un meilleur contrôle pendant le processus d'infiltration.
- Exposer la surface inférieure de la feuille sur le dessus de l'index, puis régler en douceur la position de la feuille à l'aide de pouce. Placer la seringue verticalement contre la surface de la feuille afin d'assurer que la pression est répartie uniformément. Essayez d'éviter la zone de la nervure centrale au cours de l'infiltration pour réduire les dommages de la feuille.
- Poussez lentement le piston pour infiltrer la solution bactérienne; entrée de liquide dans le mésophylle de la feuille sera visualisée comme indiqué par la couleur de la feuille sombre. Tentative d'infiltrer toute la surface de la feuille. Si cela ne se fait pas en une seule tentative, choisissez un autre endroit de l'infiltration et de répéter les actions décrites ci-dessus jusqu'à ce que la surface de la feuille entière est couverte.
- Une fois terminé, éponger délicatement la feuille avec un tissu absorbant pour enlever la solution d'agent pathogène supplémentaire. Inspecter visuellement le tissu des feuilles infectées pour les dommages.
Remarque: L'impression de la seringue circulaire ne devrait pas être visible après l'infiltration est terminée. - Laissez les plantes infiltrés à sécher pendant 1-2 heures avant de les renvoyer dans leurs conditions de croissance d'origine. Ensuite, vaporisez un dôme transparent avec de l'eau et couvrir les plantes infectées pendant 2 heures, puis casser le dôme pour générer un 2-3 en ouverture et laisser sur tout le reste de l'expérience d'infection.
Remarque: Depuis P. syringae est pas un agent pathogène dans l'air, il n'y a aucun risque de propagation de l'agent infectieux à d'autres plantes cultivées dans le même établissement. Cependant, comme mesure de précaution supplémentaire, éviter tout contact physique entre plantes infectées et d'autres plantes expérimentales situées à proximité. Couvrant le plat avec un dôme transparent va augmenter la virulence de l'agent pathogène et d'accélérer la progression de la maladie. Labesoin pour cette étape et de la durée optimale de la période de recouvrement doit être déterminé sur la base des conditions d'humidité de l'installation de la croissance des plantes de l'utilisateur.
- Pellet la culture bactérienne dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse à 9600 g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot bactérien avec stérile 1 ml de MgCl2 10 mM.
- Jour 5 - Pré-sécher les plaques des médias
- Prenez les 150 mm x 15 mm KB plaques de l'unité de stockage à froid et sécher tout préexistante condensation de l'eau sur la plaque. Les plaques sèches en les gardant à température ambiante pendant environ 24 heures. Pour accélérer ce processus, les placer dans une hotte à flux laminaire avec leurs couvercles fissurés pendant 30-60 min.
Remarque: Cette étape est essentielle pour la formation de gouttelettes sur la surface circulaire de la plaque dans l'étape suivante.
- Prenez les 150 mm x 15 mm KB plaques de l'unité de stockage à froid et sécher tout préexistante condensation de l'eau sur la plaque. Les plaques sèches en les gardant à température ambiante pendant environ 24 heures. Pour accélérer ce processus, les placer dans une hotte à flux laminaire avec leurs couvercles fissurés pendant 30-60 min.
- Jour 6 - Quantification de la croissance de l'agent pathogène
Remarque: L'agent pathogène procédure de quantification suivante peut être réalisée à des moments antérieurs après l'infection pour confirmer des quantités égales de bactéries sont livrés dans la feuille, en particulier lorsque les plantes ont modifié la morphologie des feuilles.- Traiter le tissu infecté après l'émergencede chlorose indiqué par le jaunissement du tissu infecté dans les génotypes sensibles, mais avant le développement de lésions nécrotiques (Figure 2B).
Note: Le temps d'échantillonnage est suggérée trois jours après l'inoculation de l'agent pathogène. Cependant, étant donné que la croissance des agents pathogènes dépend d'un certain nombre de facteurs environnementaux, la durée d'incubation peut varier dans une gamme de 2 ½ 3 jours et demi et doit être déterminée par des observations minutieuses de la progression de l'infection dans le centre de la croissance des plantes de l'utilisateur.- Préparez 6 tubes de broyage pour chaque génotype (Figure 1). Placer une bille de broyage en acier inoxydable et ajouter 500 ul stérile 10 mM de MgCl2 dans le chaque tube.
- Détachez la feuille infectée de la plante et percer un disque de feuille avec un papier poinçon 1-trou (Figure 1).
Remarque: Pour réduire l'erreur d'échantillonnage, essayer de perforer chaque feuille échantillonné à la même position. L'échantillonnage du disque de feuille à partir de la partie supérieurede la feuille est recommandée. - Placer au hasard 2 disques de feuilles (à partir de deux plantes différentes) dans chaque tube de broyage en utilisant une pince.
- Scellez le tube et homogénéiser le tissu avec un homogénéisateur à haut débit à la vitesse maximale (1600 coups par minute) pendant 10 min. Répétez ce processus si nécessaire jusqu'à ce que le tissu est bien homogénéisé et les solutions passe au vert en raison de la chlorophylle libération des feuilles infectées.
- En attendant l'homogénéisation, remplissez les 6 premières lignes d'une plaque de culture à 96 puits avec 180 ul 10 mM MgCl2 aide d'une pipette multi-canal et un réservoir de pipetage.
- Après broyage, transférer 20 pi de suspension de tissu du sol dans la première rangée de la plaque à 96 puits et mélanger par pipetage répété le liquide de haut en bas. Si de petits fragments de tissus bouchent la pointe, il clip de 2-3 mm pour les aider à acquérir le volume correct de la solution.
- Pour fournir suffisamment d'espace pour la gouttelette sur le o topf la plaque, à partir de l'espace du tissu différents génotypes dans des rangées alternatives (Figure 1). Pour préparer une fois dix dilution en série, transférer 20 liquide ul dans la deuxième rangée et répétez cette procédure jusqu'à la sixième dilution.
- Transférer 20 pl de la solution de la plaque de 96 puits sur le 150 mm x 15 mm KB plaque à l'aide des embouts de pipette divisés (figure 1). Travail de la suspension la plus diluée pour le plus concentré.
Remarque: En partant de la plus dilué à la plus concentrée, il est inutile de changer les embouts de pipette entre les dilutions. Si la plaque est bien pré-séché, la gouttelette transférée doit rester intacte sur le haut du milieu jusqu'à absorption (généralement 15-30 min). Le temps de séchage varie selon la température ambiante et l'humidité. - Sécher la plaque à température ambiante avec couvercle fissuré. Une fois plus de liquide peut être observé sur la surface de la plaque, fermer le couvercle, inverti et incuber la plaque à température ambiante ou un incubateur à 28 °.
- Incuber les plaques pendant 40-60 h jusqu'à ce que les colonies deviennent visibles. Vérifiez que la croissance sur les plaques prévisible reflète la 10 fois en goutte unités formant colonie (ufc) (figure 2C). Comptez les bactéries avant qu'elles envahissent et colonies fusionnent. Déterminer le nombre de bactéries dans la plus faible dilution qui ne disposent pas de colonies qui se chevauchent. Habituellement, la dilution préféré être compté contiendra entre 10-50 colonies.
Remarque: Variation peut être présent chez les répétitions techniques; par conséquent, la plus faible dilution pour chaque réplique doit être déterminée séparément. - Pour calculer les niveaux de la prolifération bactérienne, documenter le numéro de la ligne (R) ainsi que le nombre de bactéries dans chaque réplique technique (T) par écrit. Déterminer le nombre de unité formant colonie - ufc / disque de feuille par la formule: disque ufc / feuille = (T × 10 R / 20) × 500/2
- Tapez les données dans le modèle de feuille de calcul ci-dessous pour produCE un graphique (figure 1) (pour le fichier de modèle d'analyse de données de feuille de calcul, voir le tableau 2). Chaque point de données est représenté comme la moyenne des six répétitions techniques sur une échelle logarithmique. Les barres d'erreur représentent 95% intervalle de confiance de la moyenne (n = 6).
Remarque: Le calcul des intervalles de confiance à 95% doit être ajustée en fonction du nombre de répétitions techniques.
- Traiter le tissu infecté après l'émergencede chlorose indiqué par le jaunissement du tissu infecté dans les génotypes sensibles, mais avant le développement de lésions nécrotiques (Figure 2B).
- Initier la culture liquide dans un tube à essai stérile avec 4 ml de milieu KB liquide contenant 50 ug ml - 1 streptomycine et serrer à 250 tpm, 28 ° CO / N.
4. Immunité SA-Triggered (STI)
- Jour 1: Suivez la même procédure que décrit dans l'étape 3.1.
- Jour 2: En plus de l'arrosage des plantes et d'initier la culture bactérienne liquide (Étape 3.2), induire une résistance par application externe d'SA dérivé Salicylate de sodium 21.
Remarque: Pure SA a une mauvaise solubilité dans l'eau et nécessite ajustement du pH avant, donc on ne recommande pas pour cet essai.- Pour induire défenses SA médiées par contre P. syringae et les premiers plants d'infection future 21,24, les usines de pulvérisation avec une fine brume de 1 mM Sodium salicylate ou H 2 O (comme maquette) 16-24 h avant l'infection pathogène.
- Jour 3: Préparer pathogène dilution DO 600nm = 0,001 et pousser les bactéries dans toute la surface de la feuille par une seringue infiltration (étape 3.3).
- Jour 6: Pour pathogène quantification et le processus de comptage, suivez la procédure décrite pour le dosage EDS (étapes 3.4 et 3.5). Plate et compter le H 2 O et le salicylate de sodium - prétraité échantillons séparément. Pour Arabidopsis de type sauvage, une réduction de 1-2 log de la croissance de l'agent pathogène est attendue dans les Salicylate de sodium - plantes prétraitées.
5. MAMP-Triggered Immunité (MTI)
Remarque: Dans cet essai, nous utilisons Arabidopsis sauvages FLS2 et EFR plantes Col-0 et mutantes. FLS2 et EFR sont plasma membrane localisée Motif Recognition Receptors (PRR) qui peuvent reconnaître et elf18 Flg22, respectively 9,10. Perte de chacun des résultats de PRR dans le insensibilité au type spécifique de MAMP, qui est indiqué par la croissance de l'agent pathogène inchangé dans le mutant suivante MAMP pré-traitement externe et la seringue avec l'infiltration Psm ES4326.
- Jour 1 et 2: Suivez la même procédure que celle décrite dans l'étape 3.1 et 3.2.
- Jour 3: pré-traitement et l'infection des agents pathogènes MAMP
- Pour établir l'immunité MAMP-Triggered, préparer une solution de iM Flg22 épitope de la flagelline ou EF-Tu épitope elf18 et la seringue-infiltrer dans la totalité de la surface de la feuille 4 h avant l'infection par un pathogène (étapes 3.3.3-3.3.6). Cela permettra à l'induction des défenses MAMP médiée par contre P. syringae et amorcer les plantes pour 6,37 infection future.
Nota: Les données de puces à ADN publiquement disponibles ont révélé la reprogrammation transcriptionnelle maximale de gènes MAMP-sensibles qui se passe 4 h après Flg22 ou elf18 traitement 37,44. Ainsi, 4 hr est le recommandédurée de la pré-traitement MAMP qui se traduit par la réalisation une nette différence dans la croissance de pathogènes entre MAMP traité Col-0 et mutants FLS2 et EFR. - Retirer la solution supplémentaire MAMP avec du papier absorbant et laisser les plantes découvertes pour accélérer le processus d'absorption de liquide dans la feuille. Pour tenir compte de l'effet de seringue blessant pression infiltration, infiltrer H 2 O dans les feuilles des plantes témoins.
- Préparer pathogène dilution DO 600nm = 0,001 et pousser les bactéries dans toute la surface de la feuille de MAMP / H 2 O pré-traités par feuille seringue infiltration (étape 3.3).
- Pour établir l'immunité MAMP-Triggered, préparer une solution de iM Flg22 épitope de la flagelline ou EF-Tu épitope elf18 et la seringue-infiltrer dans la totalité de la surface de la feuille 4 h avant l'infection par un pathogène (étapes 3.3.3-3.3.6). Cela permettra à l'induction des défenses MAMP médiée par contre P. syringae et amorcer les plantes pour 6,37 infection future.
- Jour 6: Pour pathogène quantification et le processus de comptage, suivez la procédure décrite à l'étape 3.4 et 3.5. Plate et compter le H 2 O et MAMP échantillons prétraités séparément. Dans Arabidopsis de type sauvage, une réduction de 1-2 log de la croissance de l'agent pathogène est attendue dans les usines de MAMP prétraités, avec un peu fortela réduction de la Flg22 er médiée par rapport à elf18.
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Representative Results
Le protocole que nous décrivons ici représente un P. optimisé syringae essai seringue d'infiltration d'évaluer quantitativement la réponse immunitaire dans des plantes Arabidopsis. Comme illustré sur la figure 1, l'infiltration de la seringue de la MSP ES4326 est suivie par l'extraction et la quantification de l'agent pathogène par des dilutions en série et colonies énumération.
Comme décrit dans l'étape 3 dans le texte du protocole, sensibilité accrue des maladies (EDS) contre Psm ES4326 peut être évaluée par une infection avec un inoculum avec OD = 0,0002. Comme le montre la figure 3, les mutants npr1-1 très sensibles ont approximativement 2,5 log (300 fois) plus la croissance de l'agent pathogène par rapport au type sauvage Col-0 plantes. Selon les conditions expérimentales, les plantes npr1-1 peuvent supporter jusqu'à 3,0 log croissance plus bactérienne que Col-0, avec la plupart des résultats communs au sein de la gamme de 1,5-2,5 journal. Par conséquent, cet âne EDSay fournit une large fenêtre de la différence, dans lequel les chercheurs pourraient être en mesure de placer leurs mutants d'Arabidopsis transgéniques et à identifier des gènes candidats potentiellement impliqués dans la réponse immunitaire de la plante.
En plus de déterminer EDS, le PSM ES4326 essai seringue d'infiltration peut être modifié pour disséquer les différentes couches de la réponse immunitaire. Pour évaluer l'immunité déclenchée par l'acide salicylique, l'application externe du produit chimique salicylate de sodium est utilisé pour déclencher la réponse immunitaire, qui est quantifiée par la croissance de l'agent pathogène (figure 4A). La perte de NPR1, qui fonctionne comme le récepteur majeur SA et co-régulateur transcriptionnel de gènes cibles SA-charge, conduit à l'insensibilité à l'application exogène de dérivé d'acide salicylique. Cette insensibilité à la SA est démontrée par la croissance inchangée des agents pathogènes chez les plantes npr1-1 de prétraités salicylate de sodium en contraste avec une réduction marquée de Col-0 plantes (20 fois moins Pathog sur demande en Salicylate de sodium) (figure 4B).
Pour caractériser l'immunité, de pré-traitement de MAMP-Déclenchée avec Flg22 ou elf18 a été réalisée comme le montre la figure 5A. Pour caractériser l'immunité de flagelline déclenché, Col-0 et plantes mutantes FLS2 sont utilisés. FLS2, un récepteur-like kinase membrane localisée, reconnaît Flg22 et déclenche MTI 9. Comme le montre la figure 5B, les Flg22 traité Col-0 plantes appuyé une ~ 1 log (10 fois) la réduction de la population bactérienne, tandis que les plantes mutantes FLS2 pas réussi à déclencher l'effet de restriction de la croissance bactérienne. De même, la perte de récepteur EF-Tu EFR dans les plantes mutantes d'EF conduit à l'insensibilité à elf18 pré-traitement tel que démontré par la croissance des agents pathogènes non modifiée suivant la elf18 de pré-traitement (figure 5B).
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Figure 1. Représentation schématique des Psm ES4326 dosage seringue d'infiltration sur les plantes d'Arabidopsis. Feuilles numéro 5 et 6 de plantes adultes du sol cultivé Arabidopsis sont marqués et infectées avec Psm ES4326 par seringue infiltration. Après l'apparition de symptômes de la maladie, détachez les feuilles et les disques récolte de feuilles pour l'homogénéisation de tissu. Tissus bien homogénéisé est dilué en série dans des plaques à 96 puits avant de les transférer sur une plaque de comptage des bactéries. Après colonies émergence sur la plaque, compter le nombre de bactéries et de traiter les données afin de générer un graphique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les procédures représentatifs de l'essai EDS.(A) Pots sont recouvertes d'un dôme transparent pulvérisé de l'eau après le semis des graines. (B) des symptômes représentant au Col-0 et feuilles npr1-1 soumis à l'essai EDS (DO de 600 nm = 0,0002) 3 jours après l'inoculation. Remarque chlorose sévère npr1-1 et l'apparence presque normale du Col-0. (C) dilutions en série de Psm ES4326 poussent sur KB (50 ug / ml de streptomycine) de la plaque des médias après ~ 45 heures d'incubation. Cinq dilutions sont visibles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les résultats représentatifs de l'essai EDS croissance Psm ES4326 (unités formant colonie -. Ufc / disque de feuille, expressed sur une échelle logarithmique) a été quantifiée dans 4 semaines vieux Col-0 et npr1-1 plantes 3 jours après l'inoculation (DO 600 nm = 0,0002). Les barres d'erreur représentent 95% des intervalles de confiance de la moyenne (n = 6). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Procédure de Représentant et les résultats de l'essai STI. (A) Représentation schématique de l'immunité acide salicylique-Triggered (IST) dosage. Immunité (B) Acide salicylique-Triggered a été quantifiée sur la base de la croissance de l'agent pathogène dans les usines de pré-traitées avec 1 mM le salicylate de sodium ou H 2 O à 16 heures avant l'infiltration Psm ES4326 seringue (DO 600nm = 0,001). La croissance de l'agent pathogène a été quantifiée 3jours après l'inoculation. Les barres d'erreur représentent 95% des intervalles de confiance de la moyenne (n = 6). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. procédure de Représentant et résultats de l'essai MTI. (A) Représentation schématique de l'immunité MAMP-Triggered (MTI) dosage. (B) MTI a été quantifiée par la croissance des pathogènes dans les plantes de pré-traitées avec une solution de 1 pM de Flg22, elf18 ou H 2 O (comme témoin) 4 h avant Psm ES4326 seringue infiltration (DO 600 nm = 0,001). La croissance de l'agent pathogène a été quantifiée 3 jours après l'inoculation. Les barres d'erreur représentent 95% des intervalles de confiance de la moyenne (n = 6). S'il vous plaît cliquer sur ilre pour voir une version plus grande de cette figure.
| Problème | Causes possibles | Actions recommandées |
| Aucune croissance de bactéries dans le milieu liquide après culture O / N | Réduction de l'activité des bactéries | Initier culture liquide à partir d'une plaque nouvellement strié |
| Circulaire impression de seringue présente sur la feuille après l'infiltration seringue | Trop de pression lors de l'infiltration | Réduire la pressue cours de l'infiltration |
| Partielle impression de seringue présente sur la feuille après l'infiltration seringue | Positionnement inapproprié de la seringue | Ajuster la seringue à être positionnée contre la surface verticale de la feuille |
| Fane Feuille wthtin quelques heures après l'infiltration | Trop solution beaucoup d'agents pathogènes est infiltré dans la feuille | Arrêter infiltrating immédiatement après la surface de la feuille entière devient vert plus foncé |
| Pas de symptômes de la maladie de trois jours après l'infection | L'humidité est trop faible pour pathogène de proliférer | Augmentez l'humidité où les plantes infectées sont maintenues |
| Pathogène entre dans sa phase nécrotrophe au plus tard le 3 dpi | Mauvaise concentration de la solution d'agent pathogène | Utiliser DO 600nm = 0,0002 pour le dosage EDS; confirmer dilution en utilisant spectrophotomètre indepedent |
| Gouttelettes fusionnent sur le dessus de la plaque de comptage des bactéries | Les bactéries de comptage plaque est pas séché correctement | Pré-sèche la plaque O / N avant utilisation |
| Pathogène dilution ne représente pas la réduction de 10 fois | La dilution est pas effectué avec précision | Utiliser une pipette multi-canal bien calibrée pour le transfert de liquide; confirmer que tout le liquide est distribué |
| La croissance de l'agent pathogène dans le type sauvage dépasse 8 log ufc / disque de feuille | Overgrew pathogène dans le tissu infecté - échantillonnage effectué trop tard | Exemple de tissus infectés après l'émergence de la chlorose |
| Big variation entre les répétitions techniques | Plantes ne sont pas au même stade de développement ou le nombre de feuilles infiltré est incompatible | Utiliser uniquement des plants dans le même stade de développement de l'infection. Confirmer la germination synchrone. Infecter nombre constant de la feuille entre les différentes plantes |
Tableau 1. Dépannage de l'essai seringue d'infiltration.
S'il vous plaît cliquez ici pour voir le Tableau 2.
Tableau 2. Feuille de calcul pour l'analyse statistique des données de croissance de l'agent pathogène.
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Discussion
Avec la diminution des terres agricoles disponibles et augmentation de la population, les chercheurs du monde entier sont mis au défi avec des besoins urgents pour l'amélioration des cultures. Le rendement peut être grandement influencée par divers stress biotiques et abiotiques. Parmi eux, une infection pathogène est l'une des principales causes de la baisse de rendement des cultures, responsable d'environ 12% de pertes dans les États-Unis seuls 45. Pour résoudre ce problème, la recherche massive a été menée dans le modèle Arabidopsis - P. syringae pathosystème de caractériser globalement les composantes et les mécanismes de régulation des réponses immunitaires de la plante. Ici, nous présentons un P. optimisé syringae ES4326 dosage seringue d'infiltration d'évaluer quantitativement les différences subtiles dans l'usine réponse immunitaire au niveau de la plante entière.
Bien pathogènes multiples tests d'infection ont été développés pour caractériser la plante réponse immunitaire 29,35, l'infiltration de la seringue offreun système bien contrôlé où des quantités égales de pathogène sont administrées dans le tissu infecté. En d'autres tests d'infection, y compris dip inoculation et inoculation par pulvérisation, l'agent pathogène est appliquée au tissu aérien entier, y compris les cotylédons ainsi que 34 vraies feuilles. Il a été rapporté que les cotylédons de écotype Landsberg erecta (L er) sont beaucoup plus sensibles à l'agent pathogène durant le test d'inoculation d'immersion, ce qui peut fausser les données et mener à des conclusions erronées sur la résistance globale de la maladie 34. En outre, les deux essais ci-dessus nécessitent pathogène pour entrer dans la feuille par les stomates, qui est contrôlé par divers facteurs environnementaux, y compris l'humidité et de la lumière. Les fluctuations de ces facteurs contribue à une plus grande variation dans les symptômes de la maladie par rapport à la seringue 35 infiltration essai. Pour l'infiltration sous vide, les principaux inconvénients comprennent la nécessité de grands volumes de solution de l'agent pathogène, difficultéd'infiltrer efficacement toutes les feuilles tandis éviter des dommages, et l'intensité du travail considérable 29. En outre, les plantes infectées par pulvérisation, par trempage ou l'inoculation de vide sont moins susceptibles de se redresser depuis l'ensemble des semis est infecté par le pathogène. Compte tenu des nombreuses limitations des autres méthodes, l'essai d'infiltration seringue reste la méthode de choix pour réaliser progression de la maladie et hautement uniforme et prévisible quantification précise de l'agent pathogène afin de caractériser la réponse immunitaire de façon fiable à l'intérieur de la feuille vraie. En outre, ce test peut être facilement modifié pour caractériser l'immunité MAMP-Triggered et systémique résistance acquise. En outre, promettant de futures applications de la technique pourrait être appliquée pour les effets de tests de plusieurs phytohormones, des produits chimiques ou des inhibiteurs pré-traitements suivis par agent pathogène seringue infiltration de disséquer les différentes couches de l'usine réseau de signalisation immunitaire ou identifier les rôles d'une voie spécifique dans l'usine immunitaire réponse. Infection with une dose accrue de la (DO 600nm = 0,001) de l'agent pathogène en l'absence de tout moyen de défense amorçage pré-traitements, connu sous le nom de résistance aux maladies (EDR) de test amélioré, est une autre modification utile de ce procédé qui peut être utilisé pour identifier des mutants ou transgéniques présentant une résistance accrue de la maladie.
Il convient de noter que la seringue test d'infiltration ne vaut pas pour la caractérisation de la phase de pré-invasive de la réponse de la défense depuis le pathogène est livré directement dans le tissu des feuilles par les stomates. La fermeture des stomates, qui sert de barrière physique pour l'entrée de l'agent pathogène, est souvent déclenchée à restreindre l'entrée des pathogènes sur la création de MAMP-Triggered Immunité 46. En outre, l'acide abscissique phytohormone contribue à la fermeture des stomates lors de l'étape de pré-invasive 47. Par conséquent, les méthodes de pulvérisation ou immersion peut se révéler avantageux pour caractériser la couche stomatique de la réponse immunitaire, en dépit de mises en garde associéesavec ces types de vaccins, discuté ci-dessus 29.
Depuis interactions plantes-parasites peuvent être modifiés par divers facteurs biotiques et abiotiques, il est essentiel de se concentrer sur les étapes critiques énumérés ci-dessous dans le protocole pour atteindre infection réussie et d'obtenir des résultats fiables:
État des plantes et bactéries activité
Plantes d'Arabidopsis peuvent être facilement stressés par divers facteurs abiotiques, y compris les sous-optimale la température, la sécheresse et le stress osmotique, et déclenchent des réactions cellulaires qui interfèrent avec la sortie 48 immunitaire. Par conséquent, il est essentiel de faire pousser des plantes dans des conditions optimales de croissance et les protéger contre les facteurs de stress environnementaux. En outre, depuis le stade de développement de la feuille infectée peut également modifier les résultats expérimentaux, il est nécessaire d'infecter constamment feuilles numéro 5 et 6 pour éviter les artefacts. Progresser le long des stades de développement, re élevéerésistance contre certains agents pathogènes virulentes et avirulentes en corrélation avec la transition du stade végétatif au stade de la reproduction des plantes d'Arabidopsis. Cette résistance dynamique sur le stade de développement est appelé Age-Related Résistance (ARR) 38. Pour éviter l'interférence ARR avec la vraie réponse immunitaire, il est essentiel d'effectuer l'infection au stade du développement correcte comme indiqué dans le protocole et abstenir de tenter des expériences d'infection après le début de la phase de reproduction. En outre, la condition physique et l'activité bactérienne affectent sensiblement la prolifération des pathogènes dans le tissu infecté. Ainsi, il est important d'initier la culture liquide bactérienne à partir d'une plaque de culture fraîchement striée qui est pas plus de deux jours.
Seringue infiltration compétences
Au cours de l'infiltration de la seringue, essayez d'éviter tout dommage physique à la feuille depuis blessant effet est bien connu pour interférer avec leréponse immunitaire de la plante, principalement via la signalisation induits par l'acide jasmonique qui peut supprimer la défense SA-déclenchée pathways 49. Après l'infection, une feuille qui a été infiltré doit pleinement récupérer à l'apparence physique normale sans aucun dommage visuel. Pour les débutants, il est conseillé de pratiquer cette technique en utilisant des plantes non-expérimentales avant de réaliser le dosage seringue d'infiltration Psm ES4326.
Extraction de pathogènes et la dilution
Pour mesurer avec précision la croissance des pathogènes, il est vital pour extraire efficacement pathogène sur le tissu végétal infecté. Comparé à d'autres méthodes d'extraction, homogénéisation de tissu mécanique par homogénéiseurs à haut débit extrait efficacement pathogène sans perte de échantillon de tissu et la contamination croisée. Par la suite, la dilution des échantillons doivent être précisément effectuées avec une pipette à canaux multiples de manière fiable calibré pour réduire l'erreur de pipetage.Déviation ± aussi peu que 1 ul dans le processus de dilution qui se traduirait par une différence de ~ 5% de la quantification de la croissance des pathogènes. Pour plus d'exemples de dépannage de l'essai seringue d'infiltration, s'il vous plaît voir le tableau 1.
En conclusion, nous décrivons le optimisé la seringue infiltration dosage Psm ES4326 sur Arabidopsis d'évaluer quantitativement et de manière fiable la réponse immunitaire de la plante. Avec l'aide de ce pathosystème, la compréhension de l'interaction plante-pathogène sera accéléré en laboratoire et éventuellement être appliqué pour la protection des cultures dans le domaine.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
