Abstract
I mangel af specialiserede mobile immunceller, planter udnytte deres lokaliserede programmeret celledød og systemisk erhvervet resistens til at forsvare sig mod patogen angreb. Bidraget af en specifik Arabidopsis gen immunrespons hele anlægget kan være specifikt og kvantitativt vurderet ved at analysere patogenet vækst inden det inficerede væv. I mere end tre årtier har hemibiotrophic bakterie Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) i vid udstrækning blevet anvendt som model patogen til at undersøge de molekylære mekanismer der ligger til grund respons Arabidopsis immunrespons. At levere patogener i bladet væv, er der etableret flere podning metoder, fx sprøjte infiltration, dip podning, spray, vakuum infiltration, og oversvømmelse podning. Følgende protokol beskriver en optimeret sprøjte infiltration metode til at levere virulente Psm ES4326 i blade af voksnejord-dyrket Arabidopsis planter og præcist screene for øget sygdom modtagelighed (EDS) mod dette patogen. Desuden kan denne protokol suppleres med flere forbehandlinger til yderligere dissekere specifikke immundefekter inden for forskellige lag af vegetabilsk forsvar, herunder salicylsyre (SA) -Triggered immunitet (STI) og MAMP-udløste immunitet (MTI).
Introduction
På grund af deres sessile natur er planter til stadighed truet af en overflod af patogener udviser forskellige livsstil og ernæringsmæssige strategier 1. Til en første tilnærmelse, biotrofe patogener opretholde deres vært i live til at hente næringsstoffer, mens necrotrophic patogener aktivt hemmelige toksiner og enzymer til at dræbe vært væv og foder på de døde celler 1. En anden gruppe af patogener, betegnes hemibiotrophs, begynder deres infektion kursus med den biotrofe scene og skift til den necrotrophic etape efter at have nået en vis tærskel af patogen ophobning 2. For effektivt at forsvare sig mod disse mikroorganismer, planter har udviklet et kompliceret medfødte immunsystem udstyret med flere overvågningsmekanismer til påvisning patogenet angreb og udløse lokaliseret programmeret celledød 3 samt Systemisk erhvervet resistens (SAR) 4. Aktuel forskning er fokuseret på at karakterisere de væsentlige SIGnaling komponenter og cross-samtaler inden anlægget immunsystemet 5.
Som foreslået i "siksak" model 5, det første lag af respons anlægget medfødte immunforsvar kræver tilstedeværelsen af plasmamembran-lokaliserede mønstergenkendelse receptorer (PRRS) for at detektere invasionen af en mikrobe. PRRS er i stand til at genkende Microbe-associerede Molekylære mønstre (MAMPs) og etablere MAMP-udløst immunitet (MTI) 6. Udover at inducere et transkriptionelt opregulering af gener, der koder antimikrobielle PR-proteiner 7, MTI fører til en række arrangementer, der standser patogen vækst, herunder produktion af reaktive oxygenarter (ROS) og reaktiv nitrogenforbindelser (RNS), aflejring af callose til cellevæggen samt aktiveringen af multiple kinase signalveje 8.
Indtil nu har flere MAMPs blevet identificeret til at udløse MTI i Arabidopsis, herunder bakteriel flg22 9 10 (18 aminosyrer fra den bakterielle oversættelse elongeringsfaktor Tu) og en strukturel cellevægsbestanddel peptidoglycaner 11. At etablere en succesfuld infektion, har nogle specialiserede patogener udviklet evnen til hemmelige virulens effektor proteiner i de intracellulære eller intercellulære rum, og dermed undertrykke MTI og udløse Effector-udløst Følsomhed (ETS) 12,13. For eksempel kan virulens effektorer inaktivere mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) phosphorylering kaskader af MTI at inducere udvikling af sygdommen i inficerede væv 14-16. Under den dynamiske co-evolution mellem værter og patogener, planter også udviklet kontra strategi for at anerkende de effektor proteiner, og dæmpe patogen virulens molekyler 17. Denne direkte eller indirekte effektor anerkendelse medieres af sygdomsresistens (R) proteiner 18. De fleste af them er medlemmer af NB-LRR (nucleotidbindende og leucin-rige gentagelser) familie 19. Opfattelsen af en avirulent effektor af en R protein fremkalder en stærkere og bredere immunrespons karakteriseret som Effector-udløst immunitet (ETI) 20. Udover at inducere ekspressionen af forsvar gener 21 og produktionen af forsvarsprodukter metabolitter 22, ETI ofte fører til en hurtig lokaliseret programmeret celledød kendt som Overfølsomme Response (HR) for at begrænse patogenet spredes i tilstødende væv 3.
Ud over de lokaliserede programmeret celledød 23, planter er i stand til at initiere en langsigtet og immunrespons hele systemet betegnes Systemisk erhvervet resistens (SAR) 4. Efter belastning med en biotrofe patogen, planteceller udløser biosyntesen og akkumulering af et endogent phytohormonet salicylsyre (SA) og PR-proteiner i både lokale og systemiske væv 24. Gennem thans proces, er en forhøjet beredskab opnået i de inficerede blade, der giver mulighed for montering hurtigere forsvar reaktioner under en efterfølgende infektion med et bredt spektrum af patogener 24. SA og dets syntetiske analoger, såsom benzo- (1,2,3) thiadiazol-7-carbothiosyre S-methylester (BTH) og 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) er i stand til kemisk at inducere salicylsyre (SA) -Triggered immunitet (STI) ved eksternt program 24. Nonexpressor i de sygdomsfremkaldende gener 1 (Npr1) foreslås at være en af de SA receptorer og fungerer som en stor transkriptionel regulator under SA-medieret forsvar reaktion i både lokale og systemiske væv 21,25,26. Det er blevet endegyldigt bevist, at Npr1 er nødvendig for SAR etablering og tabet af Npr1 fører til dramatiske modtagelighed over for Pseudomonas syringae 25.
Ekstensivt karakterisere molekylære bidrag anlægkomponenter i plante-patogen interaktioner, er der udviklet flere bioassays til at måle specifikke forsvar begivenheder, herunder ROS brast 27, callose deposition 28, forsvar gener udtryk og akkumulering af deres proteinprodukter 21. Mens disse enkelte assays kan give indsigt i en særlig form for immunreaktion anlægget, ingen af dem, er imidlertid i stand til at repræsentere den fuldstændige forsvarsrespons på helplanteniveau. Omvendt kvantificering af patogen vækst efter infektion giver en overordnet vurdering af immunrespons på organismal niveau. Derfor er udvikling og optimering af en præcis og yderst standardiseret patogen podning analysen er afgørende for brændstof op af forskning og opdagelser på Arabidopsis immunreaktioner.
Pseudomonas syringae, en gram-negativ bakterie, blev identificeret som en phytopathogen stand til at forårsage sygdom hos en række plantearter værter, herunder Arabidopser 29. Som modelplante-patogen systemet, Arabidopsis - P. syringae interaktion har været almindeligt anvendt til at forstå de molekylære mekanismer underliggende plante forsvarsmekanismer reaktioner 29. Hidtil over 50 s syringae pathovars er blevet identificeret baseret på deres evne til at inficere forskellige plantearter 30 . P. syringae pv. tomat DC3000 (Pst DC3000) 31 og P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 er de to mest anvendte og omfattende karakteriseret virulente stammer. Bortset fra at blive anerkendt af anlægget og udløser MTI respons, Pst DC3000 og PSM ES4326 er i stand til at udskille virulente effektor proteiner at undertrykke MTI og udløse ETS til at favorisere 31,33 patogen vækst.
Til funktionelt dissekere interaktionen mellem Arabidopsis og P. syringae, multipelDer er blevet udviklet patogeninfektion metoder baseret på patogenet levering tilgang; 0. For jord dyrket planter, kan patogen leveres med en sprøjte infiltration, vakuum infiltration, dip podning og spray podning 29,34. For nylig blev sætteplante oversvømmelse-podning assay udviklet til at udføre store skærme på vævskulturplader dyrket unge Arabidopsis planter 35. Sprøjte infiltration, som en af de mest almindeligt anvendte fremgangsmåde, leverer patogenet i apoplasten gennem naturlige blad åbninger betegnes stomata 29 manuelt. Gennem denne tilgang, lige store mængder af P. syringae kan infiltreret i det inficerede blade og styrken af immunrespons anlægget er omvendt korreleret med niveauerne patogen vækst. Derfor kvantificering af patogen vækst tjener som en optimal tilgang til at evaluere immunfunktionen på helplanteniveau. Derudover kan sprøjten infiltration skelne det lokale og systemiske væv, som kan be der gælder i karakterisering af molekylære mekanismer der ligger til grund SAR 36.
I det følgende protokol, beskriver vi en optimeret sprøjte infiltration assay med Psm ES4326 at screene Arabidopsis mutanter for øget sygdom modtagelighed (EDS). Denne protokol vil ansætte to Arabidopsis genotyper: en vildtype økotype Columbia-0 (Col-0) planter (kontrol) og npr1-1 tab-of-funktion mutanter (hypersusceptible) der vil blive inficeret med virulent bakteriestamme Psm ES4326 37. Den npr1-1 mutant bærer en punktmutation i ankyrin-repeat konsensussekvens af Npr1 molekylet, som ændrer den meget konserverede histidin til tyrosin og gør proteinet ikke-funktionelt 25. Desuden er en række ændringer af sprøjten infiltration analysen beskrevet, at tillader kvantificering af fejl i de specifikke lag af immunrespons, herunder MTI og STI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende tekst beskriver en trinvis protokol til at udføre optimeret Psm ES4326 sprøjte infiltration assay i Arabidopsis. Større procedurerne i denne assay er repræsenteret i et forenklet rutediagram (figur 1).
1. plantevækst Betingelser
- Så frø
- Forbered 2 potter (4 i diameter, 3,75 i højt) løst fyldt med jord og vand potter ved opblødning dem fra bunden O / N før dræne det overskydende vand.
- So 50-100 Arabidopsis frø, vildtype Col-0 eller npr1-1 mutant, på hver potte med et foldet 70 mm vejer ark eller andet papir.
- Dække potten med en vand-sprøjtet transparent dome at øge den relative fugtighed til 80-90% (figur 2A).
- Inkuber potten ved 4 ° C i 72 timer for at tillade fuldstændig lagdeling og synkront spiring.
- Overfør puljen til faste vækstbetingelser (12 h lys/ 12 timer mørke, 21 ° C, lysintensitet 100 pmol / m2 / sek, den relative fugtighed 40%) for at tillade frøet at spire. Knæk kuplen til at generere en 2-3 i åbne umiddelbart efter overførsel til væksten værelse, som vil bidrage til at undgå dannelse af kondensvand.
- Når den første sande blad når den størrelse på 2-3 mm i længden, transplantation de planter fra puljen til en 72-brønde flad fyldt med jord.
- Brug en finger eller en 1 ml pipettespids at skabe en 1-i dyb fordybning i midten af jordoverflade på den flade.
- Forsigtigt adskille de enkelte frøplanter med så lidt rod skade som muligt. Afhente forsigtigt frøplanter, der har intakte rødder med pincet.
- Placer et enkelt adskilt kimplanter sammen med vedhængende jord klump at minimere transplantation stød i depression og blidt pat ned omgivende jord til at fylde depression. Kassér de ekstra kimplanter og jord i biohazard affaldsbeholder og bortskaffes i overensstemmelsemed de retningslinjer lokale biologisk farligt affald bortskaffelse.
- Vand overføres kimplanter fra toppen og helt at dække den flade med en vand-sprøjtet transparent dome at opretholde 80-90% fugtighed. Hold kuplen på i 3 dage, og derefter knække kuplen om morgenen af dag 4 og helt fjerne den ved udgangen af den dag.
Bemærk: såning frø kan alternativt udføres ved lagdeling frø i 1,5 ml centrifugerør indeholdende 1 ml 0,1% agar i 48 timer ved 4 ° C efterfulgt af overførsel 2-3 frø med et glas pipette på en 72-brønde flade fyldt med jord. Lejligheder skal dækkes med et transparent kuppel, der kan fjernes en uge efter spiring. Ekstra stiklinger kan fjernes for at efterlade kun én kimplante per brønd.
- Vandplanter hver to dage ved opblødning lejligheder i 1-i vand i 20 min, derefter dræne det overskydende vand.
Bemærk: tidsinterval for vanding af planter afhænger af væksten værelse fugtighed og skal være fast besluttet på basisd på løbende observation af brugerens plantevækst facilitet. Check planter dagligt for at sikre, at de er godt vandes. Hvis kun få pletter er tørring, vand disse planter fra toppen med en sprøjteflaske. - Udfør patogen infektion assays (trin 3-5) på planter, der er ved eller nær udviklingsstadiet # 3.50 (når roset størrelse er 50% endelige størrelse), hvilket svarer til 3-5 uger gamle afhængigt af vækstbetingelserne (fotoperiode, temperatur). Må ikke inficere planter efter blomsterstand fremkomsten (fase # 5) på grund af udbrud af aldersrelateret modstand 38,39.
2. Udarbejdelse af kultur medier og Plader
- Lav 1 L Kongens B (KB) flydende medium. Omrøres forsigtigt 20 g proteosepepton og 2 g dibasisk kaliumphosphat trihydrat ved hjælp af en magnetisk omrører med 1000 ml deioniseret H2O, indtil der ikke er nogen synlig pellet. Portion 100 ml i 150 ml glasflasker og autoklaven på en 20-min væskecyklus.
- Forbereddyrkningsplader med KB fast medium.
- Forsigtigt omrøres 20 g proteosepepton, 2 g dibasisk kaliumphosphat trihydrat og 15 g agar med 1000 ml deioniseret H 2 O. Autoklave.
- Køl ned mediet på en magnetomrører plade, indtil det er cool at røre ved for at minimere fremtidige kondens og undgå nedbrydning af antibiotika. Tilføj 18 ml sterilt 80% glycerol og 5 ml sterile 1 M MgSO4 til mediet. Eftersom Psm ES4326 bærer resistens over for streptomycin, tilsættes streptomycin i de afkølede medier til en slutkoncentration på 50 ug ml - 1.
- Hæld pladerne. Forbered to forskellige størrelser af KB medier plader: 100 mm x 15 mm og 150 mm x 15 mm petriskåle. Den mindre petriskål medium fungerer som den primære bakteriekultur plade, og jo større petriskålen fungerer som bakterier tælle plade.
Bemærk: For bakterier tælle plader, kan rektangulære formede plader anvendes til at reducereforbrugsvarer koster da dobbelt så mange behandlinger kan plottes pr plade i forhold til traditionelle runde plader.- Hæld pladerne før infektionen eksperiment. Store KB medium plader ved 4 ° C i op til 2-3 måneder siden streptomycinsulfat gradvist mister antibiotisk aktivitet 40.
3. Forbedret sygdomsmodtagelighed (EDS)
- Dag 1 - Streak bakterier på plade
- To dage før EDS assay stribe Psm ES4326 fra -80 ° C glycerol stock på en KB-Strep bakteriekultur plade og inkuberes ved 28 ° C i 24-48 timer.
- Dag 2 - indlede planter flydende kultur og vand
- Indlede flydende kultur i et sterilt reagensglas med 4 ml flydende KB medium indeholdende 50 pg ml - 1 streptomycin og ryst ved 250 rpm, 28 ° CO / N.
Bemærk: EDS-infektion assay, ved hjælp af 6 planter pr genotype er anbefaleed. For STI og MTI analyser, er 6 planter pr genotype per behandling anbefales. For bakterieinokulum, anbefales det at bruge en frisk flydende kultur med optisk densitet ved 600 nm λ mellem 0,3 og 0,6. - Markér stilke af blade nummer 5 og 6 med en stump ende vandtæt markør for nem identifikation af inficeret væv ved prøvetagning (Figur 1). At øge åbningen af stomata og lette indgangen af patogenet opløsning i blad, vande planterne godt ved opblødning den flade fra bunden i 20 minutter, derefter dræne overskydende vand.
Bemærk: Du kan også dække fladt med en gennemsigtig kuppel og suge det i vand i 2-4 timer for at øge stomatal åbning. - Dag 3 - Patogen fortynding og sprøjte infiltration
Bemærk: patogeninfektion under morgentimerne er optimal for patogen spredning og udvikling af de mest markante sygdomssymptomer på modtagelige genotyper. Gøre alt for at holde inficereion timing konsekvent at eliminere effekten af døgnrytmen og daglige genregulering 41,42, hvilket hjælper med at reducere variation blandt eksperimentelle gentagelser.- Pellet bakteriekulturen i en mikrocentrifuge 1,5 ml rør ved 9.600 xg i 2 min ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Resuspender den bakterielle pellet med 1 ml steril 10 mM MgCl2.
Bemærk: Magnesium kationer kan øge motilitet og adhæsion af P. syringae 43. Alternativt kan du bruge MgSO4 ved samme koncentration. Sterilt vand er en acceptabel erstatning for Mg saltopløsninger. - Bakteriesuspensionen med 9 ml 10 mM MgCl2 Fortynd i en 50 ml centrifugerør og måle den optiske densitet (OD) af bakterier med et spektrofotometer ved λ = 600 nm. Fortynd bakterierne med 10 mM MgCl2 til den endelige OD 600 nm = 0,0002 for EDS infektion assay.
- Infiltrere bladetmed en 1 ml stump ende injektionssprøjte uden nål (almindeligvis kendt som insulinsprøjte), som indeholder den fortyndede bakterieopløsning.
- Må ikke fylde sprøjten op til sin fulde kapacitet. Fyld den op med 0,5-0,6 ml for at muliggøre en langt bedre kontrol under infiltrationsprocessen.
- Udsætte den nedre overflade af bladet på toppen af pegefingeren, og derefter forsigtigt justere bladet position ved hjælp af tommelfingeren. Placer sprøjten lodret mod bladet overflade for at sikre, at trykket er jævnt fordelt. Prøv at undgå midterribben området under infiltrationen til at reducere skader blad.
- Skub langsomt stemplet til at infiltrere den bakterielle løsning; flydende ibrugtagning bladet mesophyll vil blive visualiseret som angivet af mørkere blade farve. Forsøg på at infiltrere hele overfladen af bladet. Hvis dette ikke sker i et enkelt forsøg, vælge en anden infiltration stedet og gentage de handlinger, der er beskrevet ovenfor, indtil hele bladet overfladen er dækket.
- Når du er færdig, forsigtigt skamplet bladet med absorberende væv for at fjerne ekstra patogen løsning. Visuel kontrol af inficerede blade væv for skader.
Bemærk: Den cirkulære sprøjte indtryk bør ikke være synligt efter infiltration er færdig. - Lad infiltrerede planter til at tørre i 1-2 timer før han vendte tilbage dem i deres oprindelige vækstbetingelser. Dernæst sprøjtes en klar kuppel med vand og dække de inficerede planter i 2 timer, derefter knække kuplen til at generere en 2-3 i åbningen og lad det sidde i resten af infektionen eksperimentet.
Bemærk: Da P. syringae er ikke en luftbåren patogen, er der ingen risiko for spredning af smitstoffet til andre planter dyrket i det samme anlæg. Men som en ekstra sikkerhedsforanstaltning, undgå fysisk kontakt mellem inficerede planter og andre eksperimentelle planter placeret i nærheden. Dækker den flade med en gennemsigtig kuppel vil øge patogenet virulens og fremskynde sygdomsprogression. Denbehov for dette skridt og optimale varighed af overdækningen periode skal bestemmes på grundlag af vilkårene for brugerens plantevækst facilitet luftfugtighed.
- Pellet bakteriekulturen i en mikrocentrifuge 1,5 ml rør ved 9.600 xg i 2 min ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Resuspender den bakterielle pellet med 1 ml steril 10 mM MgCl2.
- Dag 5 - Pre-tørre medier plader
- Tag 150 mm x 15 mm KB plader ud af kulden lagerenhed og tør alle allerede eksisterende vand kondens på pladen. Tørre plader ved at holde dem ved stuetemperatur i ca. 24 timer. For at fremskynde denne proces, placere dem i en laminar flow hætte med deres låg krakket i 30-60 min.
Bemærk: Dette trin er afgørende for dannelsen af cirkulære dråbe på overfladen af pladen i det næste trin.
- Tag 150 mm x 15 mm KB plader ud af kulden lagerenhed og tør alle allerede eksisterende vand kondens på pladen. Tørre plader ved at holde dem ved stuetemperatur i ca. 24 timer. For at fremskynde denne proces, placere dem i en laminar flow hætte med deres låg krakket i 30-60 min.
- Dag 6 - Kvantificering væksten patogen
Bemærk: Følgende patogen kvantificering procedure kan udføres ved tidligere tidspunkter efter infektionen for at bekræfte lige store mængder af bakterier leveres i blad, især når planterne har ændret blad morfologi.- Behandle inficerede væv efter fremkomstenaf klorose angivet ved gulfarvning af det inficerede væv af modtagelige genotyper, men før udvikling af nekrotiske læsioner (figur 2B).
Bemærk: Foreslået prøveudtagning tid er tre dage efter patogenet podning. Men da patogen vækst afhænger af en række miljømæssige faktorer, kan længden af inkubationen variere inden for et interval på 2 ½-3 ½ dage og skal bestemmes af omhyggelige observationer af infektionen progression i brugerens plantevækst facilitet.- Forbered 6 slibning rør for hver genotype (figur 1). Placer en rustfri stål slibning bolden og tilsæt 500 pi sterilt 10 mM MgCl2 i hvert rør.
- Frigør den inficerede blade fra planten og punch et blad disk med en 1-hullers papir Hulning (figur 1).
Bemærk: For at minimere fejlprocenten, så prøv at slå hvert blad samplet i samme position. Prøveudtagning af bladet disken fra toppenaf bladet anbefales. - Tilfældigt placere 2 bladskiver (fra to forskellige planter) i hver slibning rør ved hjælp af pincet.
- Forsegle røret og homogenisere væv med et højt gennemløb homogenisator ved maksimal hastighed (1.600 slag i minuttet) i 10 minutter. Gentag denne proces, hvis det er nødvendigt, indtil vævet er godt homogeniseret og løsningerne bliver grøn på grund af klorofyl frigivelse fra de inficerede blade.
- Mens de venter homogeniseringen, udfylde de første 6 rækker af en 96-brønds dyrkningsplade med 180 pi 10 mM MgCl2 ved anvendelse af en multi-kanal pipette og et pipettering reservoir.
- Efter formaling overføre 20 pi jorden vævssuspension i den første række i 96-brønds plade og bland ved gentagen pipettering væsken op og ned. Hvis små fragmenter af væv tilstoppe spidsen, klip det af 2-3 mm for at hjælpe erhverve den korrekte volumen af opløsningen.
- At give plads til den lille dråbe på øverste of pladen, rummet i væv fra forskellige genotyper i alternative rækker (Figur 1). For at forberede en ti-fold seriel fortynding, overføres 20 pi væske ind i anden række og gentage denne procedure, indtil den sjette fortynding.
- Transfer 20 pi af opløsningen fra 96-brønds plade på 150 mm x 15 mm KB pladen ved hjælp af opdelte pipettespidser (figur 1). Arbejde fra den mest fortyndede suspension til den mest koncentrerede.
Bemærk: Proceeding fra de fleste fortyndet til mest koncentrerede gør det unødvendigt at ændre pipettespidser mellem fortyndingerne. Hvis pladen er godt fortørret, bør den overførte dråbe forblive intakt på toppen af mediet, indtil absorberet (sædvanligvis 15-30 min). Tørretid varierer med RT og fugtighed. - Tør pladen ved stuetemperatur med låg krakket. Når kan observeres ikke mere væske på pladens overflade, luk låget, invertsukker og inkuber pladen ved RT eller et 28 ° C inkubator.
- Pladerne inkuberes 40-60 timer, indtil kolonierne bliver synlige. Kontroller, at væksten på pladerne afspejler forudsigelige 10-fold fald i kolonidannende enheder (CFU) (figur 2C). Tæl bakterier, før de overgrow og kolonier smelter. Bestem antallet af bakterier i laveste fortynding, der ikke har overlappende kolonier. Normalt til foretrukne fortynding tælles vil indeholde mellem 10-50 kolonier.
Bemærk: Variation kan være til stede blandt tekniske gentagelser; Derfor bør den laveste fortynding for hver replikat bestemmes separat. - At beregne niveauerne af bakteriel proliferation, dokumentere antallet af rækken (R) samt antallet af bakterier i hver teknisk replikat (T) skriftligt. Bestem antallet af formningsenhed koloni - cfu / blad disk via formlen: cfu / blad skive = (T × 10 R / 20) × 500/2
- Skrive data i følgende regnearksskabelon at produce en graf (figur 1) (til regneark dataanalyse skabelonfil, se tabel 2). Hvert datapunkt er repræsenteret som gennemsnittet af seks gentagelser tekniske på en logaritmisk skala. Fejlsøjler repræsenterer 95% konfidensinterval på middelværdien (n = 6).
Bemærk: Beregningen af 95% konfidensintervaller skal justeres på basis af antallet af tekniske gentagelser.
- Behandle inficerede væv efter fremkomstenaf klorose angivet ved gulfarvning af det inficerede væv af modtagelige genotyper, men før udvikling af nekrotiske læsioner (figur 2B).
- Indlede flydende kultur i et sterilt reagensglas med 4 ml flydende KB medium indeholdende 50 pg ml - 1 streptomycin og ryst ved 250 rpm, 28 ° CO / N.
4. SA-udløst immunitet (STI)
- Dag 1: Følg samme fremgangsmåde som beskrevet i trin 3.1.
- Dag 2: Ud over vanding af planterne og initiere flydende bakteriekultur (trin 3.2), inducere resistens ved ekstern anvendelse af SA-derivat natriumsalicylat 21.
Bemærk: Pure SA har ringe vandopløselighed og kræver forudgående pH-justering, således det ikke anbefales til denne analyse.- For at inducere SA-medierede forsvar mod P. syringae og prime planterne til fremtidig infektion 21,24, spray planter med en fin tåge af 1 mM natriumsalicylat eller H2O (som mock) 16-24 timer før patogeninfektionen.
- Dag 3: Forbered patogen fortynding til OD 600 nm = 0,001 og skubbe bakterier i hele bladet overfladen med en sprøjte infiltration (trin 3.3).
- Dag 6: Til patogen kvantificering og optælling proces, følge proceduren som beskrevet for EDS-analysen (trin 3.4 og 3.5). Plate og tælle H 2 O og natriumsalicylat - forbehandlede prøver separat. For vildtype Arabidopsis, forventes en 1-2 log reduktion i patogen vækst i Natriumsalicylat - forbehandlede planter.
5. MAMP-udløst immunitet (MTI)
Bemærk: I dette assay anvender vi Arabidopsis vildtype-Col-0 og mutant fls2 og EFR planter. FLS2 og EFR er plasmamembran-lokaliserede mønstergenkendelse receptorer (PRRS), der kan genkende flg22 og elf18, respectively 9,10. Tab af hver PRR resulterer i følsomhed over for den specifikke type MAMP, som er angivet med uforandret patogen vækst i mutanten følgende eksterne MAMP forbehandling og sprøjte infiltration med Psm ES4326.
- Dag 1 og 2: Følg den samme procedure som beskrevet i trin 3.1 og 3.2.
- Dag 3: MAMP forbehandling og patogeninfektion
- At etablere MAMP-Triggered Immunity, forberede 1 uM opløsning af flagellin epitop flg22 eller EF-Tu epitop elf18 og sprøjte-infiltrere den ind i det hele bladoverfladen 4 timer før patogeninfektionen (trin 3.3.3-3.3.6). Dette vil give mulighed for induktion af mAmp-medierede forsvar mod P. syringae og prime planterne til fremtidig infektion 6,37.
Bemærk: Offentligt tilgængelige microarray data viste den maksimale transkriptionelle omprogrammering af MAMP-responsive gener sker 4 timer efter flg22 eller elf18 behandling 37,44. Således 4 timer er den anbefaledevarighed MAMP forbehandling, der resulterer i opnåelse af en klar forskel i væksten mellem patogen MAMP-behandlede Col-0 og fls2 og EFR mutanter. - Fjern den ekstra MAMP løsning med absorberende væv og lade planterne udækkede at fremskynde den flydende absorptionsproces inden bladet. At tage højde for såret virkning fra sprøjten pres infiltration, infiltrere H2O i bladene af kontrolplanter.
- Forbered patogen fortynding til OD 600 nm = 0,001 og skubbe bakterier i hele bladoverfladen af MAMP / H2O forbehandlet blad med en sprøjte infiltration (trin 3.3).
- At etablere MAMP-Triggered Immunity, forberede 1 uM opløsning af flagellin epitop flg22 eller EF-Tu epitop elf18 og sprøjte-infiltrere den ind i det hele bladoverfladen 4 timer før patogeninfektionen (trin 3.3.3-3.3.6). Dette vil give mulighed for induktion af mAmp-medierede forsvar mod P. syringae og prime planterne til fremtidig infektion 6,37.
- Dag 6: Til patogen kvantificering og optælling proces, følge proceduren som beskrevet i trin 3.4 og 3.5. Plate og tælle H2O og MAMP-forbehandlede prøver hver for sig. I vildtype Arabidopsis, forventes en 1-2 log reduktion i patogen vækst i MAMP-forbehandlet planter, med noget stærkER reduktion medieret af flg22 forhold til elf18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her repræsenterer en optimeret P. syringae sprøjte infiltration assay til kvantitativt at evaluere immunresponset i Arabidopsis planter. Som illustreret i figur 1, er sprøjten infiltration af Psm ES4326 efterfulgt af patogen ekstraktion og kvantificering via serielle fortyndinger og kolonier tælling.
Som beskrevet i trin 3 i protokollen tekst, kan Enhanced sygdomsmodtagelighed (EDS) mod Psm ES4326 vurderes ved infektion med et inokulum med OD = 0,0002. Som vist i figur 3, de meget modtagelige npr1-1 mutanter har omtrent 2,5 log (300 gange) mere patogen vækst i forhold til vildtype-Col-0 planter. Afhængigt af de eksperimentelle betingelser, kan de npr1-1 planter understøtte op til 3,0 log mere bakterievækst end Col-0, med de fleste almindelige resultater inden for området 1,5-2,5 log. Derfor er denne EDS assay giver en bred vindue forskel, hvor forskerne kan være i stand til at placere deres Arabidopsis mutanter og transgene at identificere kandidatgener potentielt involveret i immunrespons anlægget.
Ud over at bestemme EDS, kan Psm ES4326 sprøjte infiltration assay modificeres til at dissekere forskellige lag af immunrespons. For at evaluere Salicylsyre-Triggered Immunity, er ekstern applikation af kemikaliet natriumsalicylat bruges til at udløse immunrespons, som kvantificeres ved væksten patogen (figur 4A) af. Tabet af Npr1, der fungerer som SA-receptoren og større transkriptionel co-regulator af SA-afhængige målgener, fører til ufølsomhed over for eksogen anvendelse af salicylsyrederivat. Denne ufølsomhed over for SA fremgår af uforandret patogen vækst i de npr1-1 natriumsalicylat forbehandlede planter i modsætning til en markant reduktion i Col-0 planter (20 gange mindre Pathog Or upon natriumsalicylat ansøgning) (figur 4B).
At karakterisere MAMP-udløste Immunity, forbehandling med flg22 eller elf18 blev udført som vist i figur 5A. For at karakterisere flagellin-udløste immunitet, er Col-0 og fls2 mutant planter, som anvendes. FLS2, en membran-lokaliserede receptor-lignende kinase, genkender flg22 og udløser MTI 9. Som vist i figur 5B, støttet flg22-behandlede Col-0 anlæg a ~ 1 log (10 gange) reduktion i den bakterielle population, mens fls2 mutantplanter undladt at udløse bakterievækst restriktion. Tilsvarende tabet af EF-Tu receptor EFR i EFR mutant planter fører til ufølsomhed over for elf18 forbehandling, hvilket fremgår af det uændrede patogen vækst efter elf18 forbehandling (figur 5B).
iles / ftp_upload / 53364 / 53364fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk fremstilling af Psm ES4326 sprøjte infiltration assay på Arabidopsis planter. Blade nummer 5 og 6 af voksne jord dyrket Arabidopsis planter er mærket og inficeret med Psm ES4326 gennem sprøjte infiltration. Efter fremkomsten af sygdomssymptomer, løsrive blade og høst bladskiver for væv homogenisering. Med homogeniseret væv seriefortyndet i 96-brønds plader før overførsel på en bakterie tælle plade. Efter kolonier fremkomst på pladen, tælle antallet af bakterier og behandle data til at generere en graf. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative procedurer i EDS-assay.(A) Pots er dækket med en vand-sprøjtet transparent dome efter såning frø. (B) Repræsentative symptomer på Col-0 og npr1-1 blade udsat for EDS assay (OD 600 nm = 0,0002) 3 dage efter inokulering. Bemærk alvorlig klorose på npr1-1 og næsten normale udseende Col-0. (C) Seriefortyndinger PSM ES4326 vokser på KB (50 ug / ml streptomycin) medier plade efter ~ 45 hR inkubation. Fem fortyndinger er synlige. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative resultater af EDS-analysen Psm ES4326 vækst (kolonidannende enheder -. Cfu / blad disc, expressed på en logaritmisk skala) blev kvantificeret i 4 uger gamle Col-0 og npr1-1 planter 3 dage efter inokulering (OD 600 nm = 0,0002). Fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller for middelværdien (n = 6). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative procedure og resultaterne af STI assay. (A) Skematisk repræsentation af Salicylsyre-udløste immunitet (STI) assay. (B) Salicylsyre-udløst Immunitet blev kvantificeret på grundlag af patogen vækst i planter forbehandlet med 1 mM natriumsalicylat eller H2O 16 timer før Psm ES4326 sprøjte infiltration (OD 600 nm = 0,001). Patogen vækst blev kvantificeret 3dage efter inokulering. Fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller for middelværdien (n = 6). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentant procedure og resultaterne af MTI analysen. (A) Skematisk repræsentation af MAMP-udløste immunitet (MTI) assay. (B) MTI blev kvantificeret ved patogen vækst i planter forud behandlet med 1 pM opløsning af flg22, elf18 eller H2O (som kontrol) 4 timer før Psm ES4326 sprøjte infiltration (OD 600 nm = 0,001). Patogen vækst blev kvantificeret 3 dage efter inokulering. Fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller for middelværdien (n = 6). Klik hanre for at se en større version af dette tal.
| Problem | Mulige årsager | Anbefalede aktioner |
| Nr bakterievækst i det flydende medium efter O / N-kulturen | Reduceret bakterieaktivitet | Initiere flydende kultur fra en nyligt udstrøget plade |
| Cirkulære sprøjte indtryk præsenterer på bladet efter sprøjten infiltration | For meget tryk under infiltration | Reducer pressue under infiltration |
| Delvis sprøjte indtryk præsenterer på bladet efter sprøjten infiltration | Uhensigtsmæssig positionering af sprøjten | Juster sprøjten skal placeres lodret mod bladoverfladen |
| Leaf wilts wthtin få timer efter infiltration | For meget patogen opløsning infiltreret i bladet | Stop infiltrating umiddelbart efter at hele bladoverfladen mørkere grøn farve |
| Ingen sygdomssymptomer tre dage efter infektion | Luftfugtigheden er for lav til at formere patogen | Øge luftfugtigheden, hvor inficerede planter opretholdes |
| Patogen kommer ind necrotrophic scenen på eller før den 3. dpi | Forkert koncentration af patogen løsning | Brug OD 600 nm = 0,0002 for EDS-analysen; bekræfter fortynding ved afhaenger spektrofotometer |
| Dråber fusionere på toppen af bakterier tælle plade | Bakterier tælle plade ikke er behørigt tørres | Pre-tør pladen O / N før brug |
| Patogen fortynding repræsenterer ikke 10 gange reduktion | Fortynding er ikke præcist udføres | Brug en godt kalibreret multi-kanal pipette til at overføre flydende; bekræfte, at al væske dispenseres |
| Patogen vækst i vildtype overstiger 8 log cfu / bladskive | Patogen overgrew inden det inficerede væv - prøvetagning udført for sent | Prøve inficeret væv efter fremkomsten af klorose |
| Stor variation blandt tekniske gentagelser | Planter er ikke på samme udviklingstrin eller infiltreret blad nummer er inkonsekvent | Brug kun planter inden for samme udviklingsstadiet for infektion. Bekræft synkron spiring. Inficere konsekvent blad nummer blandt forskellige planter |
Tabel 1. fejlfinding af sprøjten infiltration assay.
Tabel 2. Regneark til statistisk analyse af patogener vækst data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med faldende tilgængelige landbrugsjord og stigende befolkning er forskere rundt om i verden udfordret med presserende behov for afgrøden forbedring. Udbyttet kan blive kraftigt påvirket af forskellige biotiske og abiotiske påvirkninger. Blandt dem, patogen infektion er en af de førende årsager til høstudbytte reduktion, der er ansvarlig for ca. 12% tab i USA alene 45. Du kan løse problemet, er massiv forskning udført i modellen Arabidopsis - P. syringae pathosystem til omfattende karakterisere komponenter og reguleringsmekanismer af plante immunreaktioner. Her præsenterer vi en optimeret P. syringae ES4326 sprøjte infiltration analyse til kvantitativ vurdering af de subtile forskelle i immunrespons anlæg på hele planten niveau.
Selvom flere patogeninfektion assays er blevet udviklet til at karakterisere immunrespons anlægget 29,35, sprøjten infiltration giveren velkontrolleret system, hvor der indgives i det inficerede væv lige mængder af patogen. I anden infektion assays, herunder dip inokulering og spray inokulering er det patogen anvendt på hele antennen væv, herunder kimblade samt løvblade 34. Det er blevet rapporteret, at kimblade fra økotype Landsberg erecta (L er) er langt mere modtagelige for patogenet under dip podning assay, hvilket kan forvrænge dataene og føre til fejlagtige konklusioner om den samlede sygdomsresistens 34. Desuden er de to førnævnte assays kræver patogen at indtaste bladet gennem spalteåbninger, som styres af forskellige miljømæssige faktorer, herunder fugtighed og lys. Udsving i disse faktorer bidrager til et højere niveau af variation i sygdomssymptomerne sammenlignet med sprøjten infiltration assay 35. Til vakuum infiltration, de vigtigste ulemper omfatter behovet for større mængder af patogen opløsning, sværttil effektivt at infiltrere alle blade, mens undgå skader, og en betydelig arbejdskraft intensitet 29. Desuden er mindre tilbøjelige til at inddrive da hele kimplante er inficeret med patogenet planter inficeret med spray, dip eller vakuum inokulering. I betragtning af de mange begrænsninger af andre metoder, sprøjten infiltration assay stadig den foretrukne metode til at opnå en ensartet og høj grad af forudsigelighed sygdomsprogression og nøjagtig kvantificering af patogenet på pålidelig karakterisering immunrespons inden den sande blade på. Desuden kan dette assay let modificeres til at karakterisere MAMP-udløst Immunitet og systemisk erhvervet resistens. Ud over, at kunne lovende fremtidige anvendelser af teknikken anvendes til at teste virkningerne af flere plantehormoner, kemikalier eller inhibitorer forbehandlinger efterfulgt af patogen sprøjte infiltration at dissekere forskellige lag af vegetabilsk immune signalnet eller identificere roller en specifik pathway i anlægget immune respons. Infektion with en øget dosis af patogenet (OD 600 nm = 0,001) i mangel af forsvaret priming forbehandlinger, kendt som Enhanced Disease Resistance (EDR) test, er en anden nyttig modifikation af denne metode, der kan bruges til at identificere mutanter eller transgene med forøget sygdomsresistens.
Det skal bemærkes, at sprøjte infiltration analysen ikke gælder for karakterisering af præ-invasiv fase af forsvar reaktion, da patogenet leveres direkte ind i bladet væv via spalteåbninger. Stomatal lukning, der tjener som den fysiske barriere for patogen indgang, er ofte udløst at begrænse patogen post ved oprettelsen af MAMP-udløst Immunity 46. Desuden phytohormonet abscisinsyre bidrager til stomatal lukning under præ-invasiv stadie 47. Derfor kan spray- eller dypning metoder viser sig fordelagtigt at karakterisere stomatal lag af immunresponset, trods forbehold forbundetmed de typer af vaccinationer, diskuteret ovenfor 29.
Da anlægget-patogen interaktion kan ændres ved forskellige biotiske og abiotiske faktorer, er det afgørende at fokusere på de nedenfor anførte kritiske trin i protokollen for at opnå vellykket infektion og få pålidelige resultater:
Plant status og bakterier aktivitet
Arabidopsis planter kan let stresset af forskellige abiotiske faktorer, herunder sub-optimale temperatur, tørke og osmotisk stress og udløse cellulære responser, der interfererer med immun udgang 48. Derfor er det afgørende at dyrke planter under optimale vækstbetingelser og beskytte dem mod de miljømæssige stressfaktorer. Eftersom udviklingsstadium det inficerede blade også kan ændre den eksperimentelle resultat, er det nødvendigt at konsekvent inficere blade nummer 5 og 6 for at undgå artefakter. Forløber langs udviklingsstadier, forhøjet resistance mod nogle virulente og avirulente patogener korrelerer med overgangen fra vegetative stadie til reproduktiv fase af Arabidopsis planter. Denne dynamiske modstand i udviklingsstadiet betegnes Age-Related Resistance (ARR) 38. For at undgå ARR interferens med responset sande immunrespons, er det vigtigt at udføre infektion på korrekt udviklingsstadiet som angivet i protokollen og afstå fra at forsøge infektion eksperimenter efter indtræden af kønsmodenhed. Desuden bakteriel fitness og aktivitet i væsentlig grad påvirker patogenet spredning inden for det inficerede væv. Det er således vigtigt at indlede den bakterielle flydende kultur fra en frisk udstrøget dyrkningsplade, der er ikke mere end 2 dage gammel.
Sprøjte infiltration dygtighed
Under sprøjten infiltration, forsøge at undgå fysisk skade på bladet siden såring virkning er velkendt at interferere medimmunrespons anlæg, hovedsageligt via jasmonsyre-medieret signalering, der kan undertrykke SA-udløst forsvarsmekanismer 49. Efter infektionen, bør et blad, der blev infiltreret komme sig helt til den normale fysiske udseende uden nogen visuel skade. For begyndere, anbefales det at praktisere denne teknik ved hjælp af ikke-eksperimentelle planter først, før du udfører PSM ES4326 sprøjte infiltration assay.
Patogen udvinding og fortynding
Til præcist at måle væksten patogen, er det afgørende at effektivt at udvinde patogen ud af den inficerede plantevæv. Sammenlignet med andre ekstraktionsmetoder, mekanisk væv homogenisering ved højt gennemløb homogenisatorer effektivt udtrækker patogen uden tab af vævsprøven og krydskontaminering. Efterfølgende skal prøvefortyndinger nøjagtigt udført med et pålideligt kalibreret multikanalpipette at reducere pipetteringsfejl.Afvigelse så lidt som ± 1 pi i fortynding processen ville udmønte sig i en forskel ~ 5% i kvantificering patogen vækst. For eksempler på sprøjtens infiltration analysen flere fejlfinding, se tabel 1.
Afslutningsvis beskriver vi den optimerede PSM ES4326 sprøjten infiltration assay på Arabidopsis til kvantitativ og pålidelig vurdering immunrespons anlægget. Ved hjælp af denne pathosystem, vil forståelse af planters-patogen interaktion fremskyndes i laboratoriet og i sidste ende anvendes til plantebeskyttelse i marken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
