Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakteriell Leaf Infiltrasjon analysen for Fine Karakterisering av Plant forsvar svar bruker Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53364
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

I fravær av spesialiserte mobilimmunceller, planter utnytte sine lokaliserte programmert celledød og Systemisk tilegnet resistens å forsvare seg mot patogen angrep. Bidraget fra en bestemt Arabidopsis gen til den samlede anlegget immunrespons kan være spesielt og kvantitativt vurdert av analysering patogenet vekst innenfor infisert vev. I over tre tiår har hemibiotrophic bakterien Pseudo syringae pv. Maculicola ES4326 (Psm ES4326) blitt mye brukt som modell patogen å undersøke de molekylære mekanismene bak Arabidopsis immunrespons. Å levere patogener i bladet vev, har flere inokulerings metoder er etablert, for eksempel sprøyte infiltrasjon, dip vaksinasjon, spray, vakuum infiltrasjon, og flom vaksinasjon. Følgende protokoll beskriver en optimalisert sprøyte infiltrering metode for å levere virulente Psm ES4326 inn i bladene av voksenjord dyrket Arabidopsis planter og nøyaktig screene for økt sykdom mottakelighet (EDS) mot dette patogenet. I tillegg kan denne protokollen bli supplert med flere pre-behandlinger for å ytterligere dissekere spesifikke immundefekter innenfor ulike lag av planteforsvar, inkludert Salisylsyre (SA) -Triggered immunitet (STI) og MAMP utløste immunitet (MTI).

Introduction

På grunn av deres fastsittende natur, planter stadig truet av en mengde patogener stiller ulike livsstiler og ernæringsmessige strategier 1. Til en første tilnærming, biotrophic patogener opprettholde sin verten i live for å hente næringsstoffer, mens necrotrophic patogener aktivt hemmelige giftstoffer og enzymer for å drepe verten vev og lever av døde celler 1. En annen gruppe av patogener, betegnes hemibiotrophs begynner sin infeksjon kurs med biotrophic scenen og skift til necrotrophic scenen ved oppnådd en viss terskel for patogen opphopning to. For effektivt å forsvare seg mot disse mikroorganismer, planter har utviklet seg en komplisert medfødte immunsystemet utstyrt med flere overvåkningsmekanismer for å detektere patogene angrepet og utløse lokalisert programmert celledød 3 samt systemisk ervervet resistens (SAR) 4. Aktuell forskning er fokusert på å karakterisere den essensielle signaling komponenter og kryss-forhandlingene i anlegget immunsystemet 5.

Som foreslått i "sikk-sakk" modell 5, det første laget av anlegget medfødte immunrespons krever tilstedeværelse av plasmamembran-lokaliserte mønstergjenkjenning reseptor (PRRS) for å detektere invasjonen av en mikrobe. PRRS er i stand til å gjenkjenne mikrobe-Associated Molecular Patterns (MAMPs) og etablere MAMP utløste immunitet (MTI) 6. I tillegg til å indusere en transkripsjons oppregulering av gener som koder for antimikrobiell PR-proteiner 7, fører MTI til en rekke hendelser som arrest patogen vekst, inkludert produksjon av reaktive oksygen arter (ROS) og reaktive nitrogenforbindelser (RNS), avsetning av callose til celleveggen så vel som aktivering av flere kinase signalveier 8.

Inntil nå har flere MAMPs blitt identifisert til å utløse MTI i Arabidopsis, inkludert bakteriell flg22 9 10 (18 aminosyrer fra det bakterielle oversettelses elongeringsfaktor Tu) og et strukturelt celleveggkomponent 11 peptidoglykaner. Å etablere en vellykket infeksjon, har noen spesialiserte patogener utviklet evnen til hemmelige virulens effektor proteiner i de intracellulære eller mellomrom mellom, og dermed undertrykke MTI og utløse Effector utløste Følsomhet (ETS) 12,13. For eksempel kan virulens effektorer inaktivere mitogenaktiverte Protein kinase (MAPK) fosforyleringsseter kaskader av MTI å indusere sykdom utvikling innen infisert vev 14-16. Under den dynamiske co-evolusjon mellom vertene og patogener, planter også utviklet Kontringen strategi for å gjenkjenne effektor proteiner og dempe patogenet virulens molekyler 17. Denne direkte eller indirekte effektor anerkjennelse formidles av sykdom motstand (R) proteiner 18. Mesteparten av them er medlemmer av NB-LRR (Nucleotide innbinding og leucine-Rich repriser) familie 19. Oppfatningen av en avirulent effector av en R protein utløser en sterkere og bredere immunrespons karakterisert som Effector utløste immunitet (ETI) 20. Foruten å indusere uttrykk for forsvarsgener 21 og produksjon av forsvars metabolitter 22, fører ETI ofte til en rask lokalisert programmert celledød kalles Overfølsom Response (HR) for å begrense patogenet spre seg i nærliggende vev tre.

I tillegg til den lokaliserte programmert celledød 23 planter er i stand til å initiere et langsiktig og system-wide immunrespons kalt Systemisk tilegnet resistens (SAR) 4. Ved utfordring med en biotrophic patogen, planteceller utløse biosyntese og akkumulering av en endogen phytohormone salisylsyre (SA) og PR-proteiner i både lokale og systemiske vev 24. Gjennom thans prosess blir en økt tilstand av beredskap oppnådd i de ikke-infiserte blader som gjør det mulig for montering hurtigere forsvar svar i løpet av en etterfølgende infeksjon av et bredt spekter av patogener 24. SA og dets syntetiske analoger som for eksempel benzo- (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic syre S-methylester (BTH) og 2,6-diklorisonikotinsyre (INA) er i stand til kjemisk å indusere Salisylsyre (SA) -Triggered immunitet (STI) ved eksternt program 24. Nonexpressor av patogeneserelaterte gener 1 (NPR1) er foreslått å være en av de SA reseptorer og fungerer som en viktig transcriptional regulator under SA-mediert forsvar respons i både lokale og systemiske vev 21,25,26. Det har entydig vist at NPR1 kreves for SAR etablering og tap av NPR1 fører til dramatiske mottakelighet mot Pseudo syringae 25.

Til omfattende karakterisere molekylære bidrag av plantekomponenter i anlegget-patogen interaksjoner, har flere bioassay blitt utviklet for å måle spesifikke forsvars hendelser, herunder ROS brast 27 callose deponering 28, forsvarsgener uttrykk og akkumulering av sine protein produkter 21. Mens disse individuelle analyser kan gi innsikt i en spesifikk form av anlegget immunrespons, er ingen av dem, men er i stand til å representere hele forsvaret respons på hele anlegget nivå. Motsatt, kvantifisering av patogen vekst etter infeksjon gir en samlet beregning av immunrespons på organismenivå. Derfor er kritisk til drivstoff opp forskning og funn på Arabidopsis immunresponser utvikling og optimalisering av en presis og svært standardisert patogen vaksinasjon analysen.

Pseudomonas syringae, en Gram-negativ bakterie, ble identifisert som en phytopathogen stand til å forårsake sykdom hos et utvalg plante verter, inkludert Arabidopser 29. Ettersom modellen plante-patogen system, Arabidopsis - P. syringae samhandling har blitt mye brukt til å forstå de molekylære mekanismene bak plante forsvar svar 29. Inntil nå, over 50 P. syringae pathovars har blitt identifisert basert på deres evne til å infisere forskjellige plantearter 30 . P. syringae pv. tomat DC3000 (Pst DC3000) 31 og P. syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) 32 er de to mest brukte og utstrakt preget virulente stammer. Bortsett fra å bli anerkjent av anlegget og utløser MTI respons, Pst DC3000 og Psm ES4326 er i stand til å skille ut virulente effektor proteiner for å undertrykke MTI og utløse ETS å favorisere patogenet vekst 31,33.

Til funksjonelt dissekere samspillet mellom Arabidopsis og P. syringae, multippel0; patogen infeksjon metoder har blitt utviklet basert på patogen levering tilnærming. For jord dyrket planter, kan patogen leveres med sprøyte infiltrasjon, vakuum infiltrasjon, dip vaksinasjon og spray inokulasjon 29,34. Nylig ble frøplante flom-vaksinasjon analyse utviklet til å utføre store skjermer på vevskulturplater voksen unge Arabidopsis planter 35. Sprøyte infiltrasjon, som en av de mest brukte metode, leverer patogenet inn i apoplast gjennom naturlig bladåpningene betegnet stomata 29 manuelt. Gjennom denne tilnærmingen, like mengder P. syringae kan infiltreres inn i den infiserte blad og styrken av anlegget immunrespons er inverst korrelert til de patogen vekstnivåer. Derfor kvantifisering av patogen vekst tjener som en optimal tilnærming for å vurdere immunfunksjonen hos hele anlegget nivå. I tillegg kan sprøyte infiltrasjon skille de lokale og systemiske vev, noe som kan be anvendelig for å karakterisere de molekylære mekanismer som ligger under SAR-36.

I det følgende protokollen, beskriver vi en optimalisert sprøyte infiltrasjon analysen med Psm ES4326 å skjerme Arabidopsis mutanter for økt sykdom mottakelighet (EDS). Denne protokollen vil ansette to Arabidopsis genotyper: en vill-type ecotype Columbia-0 (Col-0) planter (kontroll) og npr1-1 tap-av-funksjon mutanter (hypersusceptible) som vil bli smittet med virulent bakteriestamme Psm ES4326 37. Den npr1-1 mutant bærer en punktmutasjon i det ankyrin-repeat konsensussekvensen til NPR1 molekylet, som endrer den svært konserverte histidin til tyrosin og gjengir protein som ikke er funksjonelt 25. I tillegg er en rekke modifikasjoner av sprøyten infiltrasjons analysen beskrevet som tillater kvantifisering av defekter i de enkelte lag av immunresponsen, inkludert MTI og STI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende tekst beskriver en trinnvis protokoll for å utføre optimalisert Psm ES4326 sprøyte infiltrasjon analysen i Arabidopsis. De viktigste prosedyrer for denne analysen er vist i et forenklet flytdiagram (figur 1).

1. plantevekst betingelser

  1. Sår frø
    1. Forbered 2 Potter (4 i diameter, 3,75 i høye) løst fylt med jord og vann potter ved å dyppe dem fra bunnen O / N før du tømmer overflødig vann.
    2. Sow 50-100 Arabidopsis frø, villtype Col-0 eller npr1-1 mutant, på hver pott med foldede 70 mm som veier ark eller annet papir.
    3. Dekker potten med en vann-sprayet gjennomsiktig kuppel for å øke den relative fuktighet til 80 til 90% (figur 2A).
  2. Inkuber potten ved 4 ° C i 72 timer for å tillate fullstendig lagdeling og synkront spiring.
  3. Overfør potten til standard vekstforhold (12 timers lys/ 12 timer mørke, 21 ° C, lysintensitet 100 umol / m2 / sek, relativ fuktighet 40%) for å tillate frøene å spire. Sprekk kuppelen til å generere en 2-3 i åpnings umiddelbart etter overføring til vekst rom, noe som vil bidra til å unngå vann kondens.
  4. Når den første virkelige bladet når størrelsen på 2-3 mm i lengde, transplantere frøplantene fra potten til en 72-brønner flat fylt med jord.
    1. Bruke en finger eller en 1 ml pipette for å lage en 1-i dyp depresjon midt på jordoverflaten på det flate.
    2. Forsiktig skille individuelle frøplanter med så lite rot skade som mulig. Nøye plukke opp frøplanter som har intakte røtter med tang.
    3. Plasser ett enkelt skilt frøplante sammen med holde jord klump å redusere transplantasjon sjokk inn i depresjon og forsiktig klapp ned rundt jorda for å fylle depresjon. Kast de ekstra frøplanter og jord i biologisk avfallsbeholder og destrueres i samsvarmed de lokale biohazard avfalls retningslinjer.
    4. Vann overføres frøplanter fra toppen og fullstendig dekke den flate med et vann sprayet gjennomsiktig kuppel for å opprettholde 80-90% fuktighet. Hold kuppelen på i 3 dager, deretter knekke kuppelen i morgen på dag 4 og fjerne den helt på slutten av dagen.
      Merk: sådd frø kan bli alternativt utført ved stratifiseringsinnretningen frø i 1,5 ml sentrifugerør inneholdende 1 ml 0,1% agar i 48 timer ved 4 ° C, etterfulgt av overføring av 2-3 frø med et glass-pipette til en 72-brønner flat fylt med jord. Flats trenger å være dekket med en gjennomsiktig kuppel som kan fjernes en uke etter spiring. Ekstra frøplanter kan fjernes for å la bare en frøplante per brønn.
  5. Vannplanter hver dag etter soaking leiligheter i 1-i vann i 20 minutter, deretter tappe overflødig vann.
    Merk: Tidsintervallet for vanning planter er avhengig av fuktighet vekst rom og behov for å være fast bestemt på basend på kontinuerlig observasjon av brukerens plantevekst anlegget. Sjekk planter daglig for å sørge for at de er godt vannes. Hvis bare noen få flekker er tørking, vann disse plantene fra toppen med en skvett flaske.
  6. Utføre patogen infeksjon assays (trinn 3-5) på planter som er ved eller i nærheten av utviklingsstadiet # 3.50 (når rosett størrelse er 50% endelig størrelse), som svarer til 3-5 uker, avhengig av vekstbetingelser (fotoperiode, temperatur). Ikke infisere planter etter blomsterstand veksten (scenen # 5) på grunn av utbruddet av aldersrelatert motstand 38,39.

2. Utarbeidelse av Culture Media og Plates

  1. Lag 1 L av Kongens B (KB) flytende medium. Forsiktig røre 20 g proteose pepton og 2 g kaliumhydrogenfosfat-trihydrat ved hjelp av en magnetisk rørestav med 1000 ml deionisert H2O til det ikke er synlig pellet. Delmengde 100 ml i 150 ml glassflasker og autoklav på en 20-min væske syklus.
  2. Forberedekultur plater med KB solid medium.
    1. Forsiktig røre 20 g proteose Peptone, 2 g Potassium Phosphate Dibasic trihydrat og 15 g Agar med 1000 ml avionisert H 2 O. Autoklav.
    2. Kjøle ned medium på en magnetisk oppsikt plate før det er kult å berøre for å minimere fremtidige kondens og unngå degradering av antibiotika. Legg 18 ml steril 80% glycerol og 5 ml sterilt 1 M MgSO4 til mediet. Gitt at Psm ES4326 bærer resistens mot streptomycin, streptomycin legge inn de avkjølte mediet til en sluttkonsentrasjon på 50 ug ml - 1.
    3. Hell platene. Forbered to forskjellige størrelser av KB medie plater: 100 mm x 15 mm og 150 mm x 15 mm petriskåler. Den mindre petriskål som inneholdt medium tjener som det primære bakteriekultur plate, og den større petriskål tjener som bakterier telle plate.
      Merk: For bakterier telleplatene kan rektangulære formede plater benyttes for å redusereForbruks koste siden dobbelt så mange behandlinger kan plottes per plate i forhold til tradisjonelle runde plater.
      1. Hell platene før infeksjonen eksperimentet. Lagre KB mellom plater ved 4 ° C i opptil 2-3 måneder siden streptomycinsulfat mister gradvis antibiotika aktivitet 40.

3. Forbedret Disease Følsomhet (EDS)

  1. Dag 1 - Streak bakterier på plate
    1. To dager før EDS-analysen, strek Psm ES4326 fra -80 ° C glyserol lager på en KB-Strep bakteriekultur plate og inkuberes ved 28 ° C i 24-48 timer.
  2. Dag 2 - initiere flytende kultur og vannplanter
    1. Initiere den flytende kulturen i et sterilt prøverør med 4 ml flytende medium inneholdende 50 KB ug ml - 1 streptomycin og riste ved 250 opm, 28 ° CO / N.
      Merk: For EDS infeksjon analysen, med 6 planter per genotype er anbefalted. For STI og MTI analyser, er 6 planter per genotype per behandling anbefales. For bakterier inoculum, anbefales det å bruke en fersk flytende kultur med optisk tetthet på λ 600nm mellom 0,3 og 0,6.
    2. Mark petioles av bladene nummer 5 og 6 med en butt-end vannfast tusj for enkel identifisering av infisert vev ved prøvetaking (Figur 1). For å øke åpningen av stomata og letter inngangen av patogenet løsningen inn i bladet, vanne plantene godt ved å dyppe den flate fra bunnen i 20 min, deretter tappe det overskytende vann.
      Merk: Alternativt dekke flat med en gjennomsiktig kuppel og suge den i vann i 2-4 timer for å øke stomatal åpningen.
    3. Dag 3 - Patogen fortynning og sprøyte infiltrasjon
      Merk: Patogen infeksjon i løpet av morgentimene er optimal for patogen spredning og utvikling av de mest markante sykdomssymptomer på mottakelige genotyper. Gjøre vårt ytterste for å holde infisereion timing konsekvent å eliminere effekten av cirkadianske rytmer og diurnal genregule 41,42, noe som bidrar til å redusere variasjonen blant eksperimentkjøringer.
      1. Pelletere bakteriekultur i en mikro 1,5 ml rør ved 9600 xg i 2 min ved RT og kast supernatant. Resuspender den bakterielle pellet med 1 ml steril 10 mM MgCl2.
        Merk: Magnesium kationer kan forbedre motilitet og adhesjon av P. syringae 43. Alternativt kan du bruke MgSO4 på samme konsentrasjon. Sterilt vann er en akseptabel erstatning for Mg-saltløsninger.
      2. Fortynn bakteriesuspensjon med 9 ml 10 mM MgCl2 i et 50 ml sentrifugerør og måle den optiske tetthet (OD) av bakterier med et spektrofotometer ved λ = 600 nm. Fortynn bakterier med 10 mM MgCl2 til den endelige OD 600nm = 0,0002 for infeksjon EDS analyse.
      3. Infiltrere bladmed en 1 ml butt ende nålløs sprøyte (vanligvis kjent som insulinsprøyte) som inneholder den fortynnede bakteriell løsning.
      4. Ikke fyll sprøyten opp til full kapasitet. Fylle den med 0,5-0,6 ml for å gi en mye bedre kontroll under infiltreringsprosessen.
      5. Utsette den nedre overflaten av bladet på toppen av pekefingeren, og deretter forsiktig justere bladet stilling ved hjelp av tommelen. Plasser sprøyten vertikalt mot bladet overflaten for å sikre at trykket blir jevnt fordelt. Prøv å unngå midrib området i løpet av infiltrasjon for å redusere blad skade.
      6. Trykk forsiktig stempelet for å infiltrere bakteriell løsning; væske inntreden i bladet mesophyll vil bli visualisert som antydet med mørkere blad farge. Forsøk på å infiltrere hele overflaten av bladet. Hvis dette ikke gjøres i ett enkelt forsøk, velg en annen infiltrasjon sted og gjenta handlingene beskrevet ovenfor inntil hele bladet overflaten er dekket.
      7. Etter fullført, forsiktig blot blad med absorberende vev for å fjerne den ekstra patogen løsning. Inspiser smittet bladvev for skader.
        Merk: Den sirkulære sprøyte inntrykk bør ikke være synlig etter at infiltrasjon er fullført.
      8. La de infiltrerte plantene tørke i 1-2 timer før du returnerer dem i deres opprinnelige vekstvilkår. Deretter spray en klar kuppel med vann og dekker de infiserte plantene i 2 timer, deretter sprekk kuppelen for å generere en 2-3 i åpning og la det på hele resten av infeksjonen eksperimentet.
        Merk: Siden P. syringae er ikke et luftbåret patogen, er det ingen fare for spredning av smittestoffet til andre planter dyrket i det samme anlegget. Men som en ekstra forholdsregel, unngå fysisk kontakt mellom infiserte planter og andre eksperimentelle planter i nærheten. Dekker flat med en gjennomsiktig kuppel vil øke patogenet virulens og akselerere sykdomsprogresjon. Dentrenger for dette trinnet og optimal varighet dekker perioden må bestemmes basert på luftfuktighet i brukerens plantevekst anlegget.
    4. Dag 5 - Pre-tørke medie plater
      1. Ta 150 mm x 15 mm KB platene ut av det kalde lagringsenheten og tørk noen pre-eksisterende vannkondens på tallerkenen. Tørre plater ved å holde dem ved romtemperatur i omtrent 24 timer. Å fremskynde denne prosessen, plassere dem i en laminær hette med sine lokk sprakk for 30-60 min.
        Merk: Dette trinnet er kritisk for dannelsen av sirkulære dråpe på overflaten av platen i det neste trinn.
    5. Dag 6 - Kvantifisering patogenet vekst
      Merk: Den følgende patogen kvantifiseringen prosedyre kan utføres på tidligere tidspunkter etter infeksjonen for å bekrefte at like mengder av bakterier blir levert inn i bladet, spesielt når plantene har endret bladet morfologi.
      1. Behandle infisert vev etter fremvekstenav klorose indikert ved gulning av infisert vev i mottakelige genotyper, men før utviklingen av nekrotiske lesjoner (figur 2B).
        Merk: Forslag til prøvetaking tid er tre dager etter patogenet vaksinasjonen. Men siden patogen vekst avhenger av en rekke miljøfaktorer, kan lengden av inkubasjon variere innenfor et område på 2?-3? Dager, og må bestemmes ved forsiktig observasjoner av infeksjonen progresjon i brukerens plantevekst anlegg.
        1. Forbered 6 sliping rør for hver genotype (figur 1). Plasser en rustfritt stål sliping ball og legge 500 mL sterilt 10 mM MgCI2 inn i hvert rør.
        2. Løsne infiserte blad fra planten og punch et blad plate med en 1-hulls papir punsj (figur 1).
          Merk: For å minimere feil prøvetaking, prøver å sparke hver samplet blad i samme posisjon. Prøvetaking av bladet plate fra toppenav bladet er anbefalt.
        3. Tilfeldig plassere 2 blad plater (fra to forskjellige planter) i hver sliping rør ved hjelp av pinsett.
        4. Forsegl røret og homogenisere vevet med en high-throughput-homogenisator ved maksimal hastighet (1600 slag pr minutt) i 10 minutter. Gjenta denne prosessen om nødvendig inntil vevet er godt homogenisert og løsningene blir grønne skyldes klorofyll utgivelse fra den infiserte bladene.
      2. Mens du venter på homogenisering, fylle de første 6 rader med en 96-brønn kultur plate med 180 ul 10 mM MgCI2 ved hjelp av en flerkanals pipette og en pipettering reservoaret.
      3. Etter maling overføre 20 ul bakken vevsuspensjon inn i den første raden i 96-brønns plate og blandes ved gjentatt pipettering væsken opp og ned. Hvis små fragmenter av vev tette spissen, klippet det med 2-3 mm for å skaffe den riktige volumet av løsningen.
        1. Å gi nok plass for dråpen på toppen of platen, plass vev fra forskjellige genotyper i alternative rader (figur 1). For å forberede en ti-fold serie fortynning, overføre 20 mL væske inn i andre rad, og gjenta denne prosedyren til den sjette fortynning.
      4. Overføring 20 pl av oppløsningen fra 96-brønn plate på 150 mm x 15 mm plate ved hjelp av KB oppdelte pipettespisser (figur 1). Arbeid fra den mest fortynnede suspensjonen til den mest konsentrerte.
        Merk: Fortsetter fra de fleste fortynnet til mest konsentrerte gjør det unødvendig å endre pipetter mellom fortynninger. Hvis platen er godt fortørket, må den overførte dråpe forbli intakt på toppen av medium til den er absorbert (vanligvis 15-30 min). Tørketiden varierer med RT og fuktighet.
      5. Tørk platen ved RT med lokk sprakk. Når det ikke mer væske kan observeres på plateoverflaten, lukker lokket, invertsukker og inkuber platen ved romtemperatur, eller en 28 ° C inkubator.
      6. Inkuber platene i 40-60 timer inntil koloniene blir synlige. Bekrefter at veksten på platene reflekterer forutsigbar 10-fold fall i kolonidannende enheter (cfu) (figur 2C). Telle bakterier før de overgrow og kolonier sikring. Bestem antall bakterier i den laveste fortynning som ikke har overlappende kolonier. Vanligvis er den foretrukne fortynning skal telles vil inneholde mellom 10-50 kolonier.
        Merk: Variasjon kan være til stede blant tekniske replikater; derfor bør den laveste fortynning for hver replikere bestemmes separat.
      7. For å beregne nivåene av bakteriell spredning, dokumentere nummeret på rad (R), så vel som antall bakterier i hver teknisk replikere (T) skriftlig. Bestem antall kolonidannende enhet - cfu / blad plate gjennom formelen: cfu / blad plate = (T × 10 R / 20) x 500/2
      8. Skriv inn data i følgende regnearkmalen til Produce en graf (Figur 1) (for regnearkdataanalyse mal fil, se tabell 2). Hvert datapunkt er representert som gjennomsnittet av seks tekniske replikater på en logaritmisk skala. Feilfelt representerer 95% konfidensintervall for gjennomsnittet (n = 6).
        Merk: Beregningen av 95% konfidensintervall må justeres basert på antall tekniske replikater.

4. SA-Utløst immunitet (STI)

  1. Dag 1: Følg samme prosedyre som beskrevet i trinn 3.1.
  2. Dag 2: I tillegg til vanning av plantene og initiere den flytende bakteriekultur (trinn 3.2), induserer motstand ved ytre påføring av SA-derivat natriumsalicylat 21.
    Merk: Pure SA har dårlig vannløselighet og krever forhånds pH justering, slik at det ikke er anbefalt for denne analysen.
    1. Å indusere SA-mediert forsvar mot P. syringae og prime plantene for fremtidig infeksjon 21,24, spray planter med en fin tåke av 1 mM natriumsalicylat eller H 2 O (som mock) 16-24 timer før patogenet infeksjon.
  3. Dag 3: Forbered patogen fortynning til OD 600nm = 0,001 og presse bakterier i hele bladet overflaten ved sprøyte infiltrasjon (trinn 3.3).
  4. Dag 6: For patogen kvantifisering og opptellingen, følg prosedyren som beskrevet for EDS-analysen (trinn 3.4 og 3.5). Plate og telle H 2 O og natriumsalicylat - forbehandlet prøver separat. For villtype Arabidopsis, er en 1-2 log reduksjon i patogen vekst forventes i natriumsalicylat - forbehandlet planter.

5. MAMP utløste immunitet (MTI)

Merk: I denne analysen bruker vi Arabidopsis villtype Col-0 og mutante fls2 og EFR planter. FLS2 og EFR er plasmamembran-lokaliserte Pattern Recognition reseptor (PRRS) som kan gjenkjenne flg22 og elf18, respectively 9,10. Tap av hver PRR resultater i ufølsomhet overfor den spesifikke type MAMP, som er indikert ved den uforandrede patogen vekst i mutanten følgende ytre MAMP forbehandling og sprøyte infiltrering med Psm ES4326.

  1. Dag 1 og 2: Følg samme prosedyre som beskrevet i trinn 3.1 og 3.2.
  2. Dag 3: MAMP forbehandling og Patogen infeksjon
    1. Å etablere MAMP utløste Immunity, forberede 1fiM løsning av flagellin epitope flg22 eller EF-Tu epitope elf18 og sprøyte-infiltrere det inn hele bladet overflaten 4 timer før patogenet infeksjon (Steps 3.3.3-3.3.6). Dette vil gi rom for induksjon av MAMP-mediert forsvar mot P. syringae og prime plantene for fremtidig infeksjon 6,37.
      Merk: Offentlig tilgjengelige microarray data indikerer maksimal transkripsjonen omprogrammering av MAMP-responsive gener skjer fire timer etter flg22 eller elf18 behandling 37,44. Således er fire timer ble anbefaltVarigheten av MAMP pre-behandling som resulterer i å oppnå en klar forskjell i patogenet vekst mellom MAMP behandlet Col-0 og fls2 og EFR mutanter.
    2. Fjern den ekstra MAMP løsning med absorberende vev og la plantene avdekket å fremskynde væskeabsorpsjon prosessen i bladet. Å redegjøre for såret virkning fra sprøyte press infiltrasjon, infiltrere H 2 O i bladene av kontrollanlegg.
    3. Forbered patogen fortynning til OD 600nm = 0,001 og presse bakterier i hele bladet overflaten av MAMP / H 2 O forbehandlet blad med sprøyte infiltrasjon (trinn 3.3).
  3. Dag 6: For patogen kvantifisering og opptellingen, følg prosedyren som beskrevet i trinn 3.4 og 3.5. Plate og telle H 2 O og MAMP-forbehandlet prøvene separat. I villtype Arabidopsis, er en 1-2 log reduksjon i patogen vekst forventes i MAMP-forbehandlet planter, med litt sterker reduksjon mediert av flg22 forhold til elf18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen vi beskriver her representerer en optimalisert P. syringae sprøyte infiltrasjon assay for kvantitativt å vurdere immunresponsen i Arabidopsis planter. Som illustrert i figur 1, er sprøyten infiltrasjon av Psm ES4326 fulgt av patogen ekstraksjon og kvantifisering via serielle fortynninger og kolonier telling.

Som beskrevet i trinn 3 i protokollen teksten, kan Enhanced Disease Følsomhet (EDS) mot Psm ES4326 vurderes ved infeksjon med et inokulum med OD = 0,0002. Som vist i figur 3, er de svært følsomme npr1-1 mutanter har tilnærmet 2,5 log (300 ganger) mer patogen vekst sammenlignet med villtype-Col-0 planter. Avhengig av forsøksbetingelsene, kan npr1-1 planter støtte opp til 3,0 log mer bakterievekst enn Col-0, med de fleste vanlige resultater innen området fra 1,5 til 2,5 log. Derfor denne EDS assay gir et bredt vindu av forskjell, hvor forskerne kan være i stand til å plassere sine Arabidopsis mutanter og transgene for å identifisere kandidatgener potensielt er involvert i anlegget immunrespons.

I tillegg til å bestemme EDS, kan Psm ES4326 sprøyte infiltrering analysen modifiseres til å dissekere forskjellige lag av immunrespons. For å evaluere Salisylsyre utløste Immunity, er utvendig påføring av den kjemiske natriumsalicylat brukes til å utløse immunresponsen, som er kvantifisert ved patogenet vekst (figur 4A). Tapet av NPR1, som fungerer som SA-reseptoren og større transkripsjonelle co-regulator av SA-avhengige målgener, medfører ufølsomhet overfor eksogen anvendelse av salicylsyre-derivat. Denne ufølsomhet overfor SA er demonstrert av den uforandrede patogen veksten i npr1-1 natriumsalicylat forbehandlede planter i motsetning til en markert reduksjon i Col-0 planter (20 ganger mindre patogene no ved natriumsalicylat søknad) (figur 4B).

Å karakterisere MAMP utløste Immunity, forbehandling med flg22 eller elf18 ble utført som vist i figur 5A. Å karakter flagellin-utløst immunitet, er Col-0 og fls2 muterte planter brukes. FLS2, en membran-lokaliserte reseptor-lignende kinase, gjenkjenner flg22 og utløser MTI 9. Som vist i figur 5B, er flg22 behandlede Col-0 planter understøttet a ~ en logg (10 ganger) reduksjon i bakteriepopulasjon, mens fls2 mutant plantene mislyktes i å utløse bakterievekst begrensning effekt. Tilsvarende, tap av EF-Tu reseptoren EFR i EFR mutant planter fører til ufølsomhet for elf18 forbehandling som demonstrert ved den uforandrede patogen vekst etter elf18 forbehandling (figur 5B).

iles / ftp_upload / 53364 / 53364fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk fremstilling av Psm ES4326 sprøyte infiltrering assay på Arabidopsis planter. Blader nummer 5 og 6 av voksen jord dyrket Arabidopsis planter er merket og infisert med Psm ES4326 via sprøyte infiltrasjon. Etter fremveksten av sykdomssymptomer, løsne bladene og høst blad plater for vev homogenisering. Godt homogenisert vev blir seriefortynnet i 96-brønners plater før de overføres til en bakterier telle plate. Etter kolonier veksten på plate, telle antall bakterier og behandle data for å generere en graf. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Representative prosedyrer i EDS-analysen.(A) Pots er dekket med et vann sprayet gjennomsiktig kuppel etter såing frø. (B) Representative symptomer på Col-0 og npr1-1 blader utsatt for EDS-analysen (OD 600nm = 0,0002) 3 dager etter vaksinasjonen. Legg merke til alvorlig klorose på npr1-1 og nesten normalt utseende Col-0. (C) Serielle fortynninger av Psm ES4326 vokser på KB (50 ug / ml streptomycin) media plate etter ~ 45 time av inkubasjon. Fem fortynninger er synlige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representative resultatene av EDS-analysen Psm ES4326 vekst (kolonidannende enheter -. Cfu / blad plate, expressed på en logg skala) ble kvantifisert i fire uker gamle Col-0 og npr1-1 planter 3 dager etter vaksinasjonen (OD 600nm = 0,0002). Feilfelt representerer 95% konfidensintervall av gjennomsnittet (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Representant prosedyre og resultatene av STI analysen. (A) Skjematisk fremstilling av Salisylsyre utløste immunitet (STI) assay. (B) Salisylsyre utløste Immunity ble kvantifisert basert på patogen vekst i plantene forbehandlet med 1mM natriumsalicylat eller H 2 O 16 timer før Psm ES4326 sprøyte infiltrasjon (OD 600nm = 0,001). Patogen vekst ble kvantifisert 3dager etter vaksinasjonen. Feilfelt representerer 95% konfidensintervall av gjennomsnittet (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Representative prosedyren og resultatene av analysen MTI. (A) Skjematisk representasjon av MAMP utløste immunitet (MTI) assay. (B) MTI ble kvantifisert ved patogen vekst hos planter pre-behandlet med 1 uM oppløsning av flg22, elf18 eller H 2 O (som kontroll) 4 timer før Psm ES4326 sprøyte infiltrasjon (OD 600 nm = 0,001). Patogen vekst ble kvantifisert 3 dager etter vaksinasjonen. Feilfelt representerer 95% konfidensintervall av gjennomsnittet (n = 6). Klikk hanre for å se en større versjon av dette tallet.

Problem Mulige årsaker Anbefalte Handlinger
Ingen bakterievekst i det flytende mediet etter O / N kultur Redusert bakterier aktivitet Initiere væske kultur fra en nylig stripete plate
Rundskriv sprøyte inntrykk presenterer på bladet etter sprøyten infiltrasjon For mye press under infiltrasjon Reduser pressue under infiltrasjon
Delvis sprøyte inntrykk presenterer på bladet etter sprøyten infiltrasjon Upassende posisjonering av sprøyten Juster sprøyten kan plasseres vertikalt mot bladet overflaten
Leaf wilts wthtin par timer etter infiltrasjon For mye patogen oppløsning infiltrert i bladet Stop infiltrating umiddelbart etter at hele bladet overflaten blir mørkere grønn i fargen
Ikke noen sykdomssymptomer tre dager etter infeksjon Luftfuktigheten er for lav for patogen å spre Øke luftfuktigheten der infiserte plantene holdes
Patogen entrer necrotrophic scenen på eller før 3 dpi Feilaktig konsentrasjon av patogen løsning Bruk OD 600nm = 0,0002 for EDS-analyse; bekrefte fortynning bruker indepedent spektrofotometer
Dråper flette på toppen av bakterier teller plate Bakterier telle plate er ikke riktig tørket Pre-tørr plate O / N før bruk
Patogen utvanning representerer ikke 10-fold reduksjon Fortynningen ikke nøyaktig utført Bruk en godt kalibrert flerkanals pipette for å overføre væske; bekrefter at all væske er utlevert
Patogen vekst i villtypen stiger 8 log cfu / blad plate Patogen overgrew i infisert vev - Prøvetaking utført for sent Eksempel infisert vev etter fremveksten av klorose
Big variasjon blant tekniske replikater Planter er ikke på samme utviklingsstadiet eller infiltrert blad nummer er inkonsekvent Bruk kun planter innenfor samme utviklingsstadiet for infeksjon. Bekreft synkron spiring. Infisere konsekvent blad nummer mellom ulike planter

Tabell 1. feilsøking av sprøyten infiltrasjon analysen.

Klikk her for å se tabell 2.

Tabell 2. regneark for statistisk analyse av patogen vekst data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med avtagende tilgjengelig jordbruksareal og økende befolkning, er forskere rundt om i verden utfordret med presserende behov for avling forbedring. Utbyttet kan bli sterkt påvirket av ulike biotiske og abiotiske påkjenninger. Blant dem er patogen smitte en av de viktigste årsakene til avling reduksjon, ansvarlig for omtrent 12% tap i USA alene 45. For å løse dette problemet, har massiv forskning utført i modellen Arabidopsis - P. syringae pathosystem til omfattende karakterisere komponenter og reguleringsmekanismer av anlegget immunresponser. Her presenterer vi en optimalisert P. syringae ES4326 sprøyte infiltrasjon analysen til kvantitativt vurdere subtile forskjeller i anlegget immunrespons på hele anlegget nivå.

Selv om flere patogene smitte analyser er blitt utviklet for å karakterisere anlegget immunrespons 29,35, gir sprøyten infiltrasjonen godt kontrollert system hvor like mengder av patogen blir administrert inn i den infiserte vevet. Med andre smitte analyser, inkludert dukkert vaksinasjon og spray vaksinasjon, er patogen påføres hele aerial tissue, inkludert cotyledons samt sant forlater 34. Det har blitt rapportert at cotyledons fra ecotype Landsberg erecta (L er) er mye mer utsatt for patogenet under dip inokulasjon analysen, som kan forskyve data og føre til feilaktige konklusjoner på det generelle sykdomsresistens 34. I tillegg er de to ovennevnte analysene krever patogen for å gå inn i bladet gjennom stomata, som er kontrollert av en rekke miljøfaktorer, inkludert fuktighet og lys. Svingning av disse faktorene bidrar til en høyere grad av variasjon i sykdomssymptomene i forhold til sprøyten 35 infiltrasjon analysen. For vakuum infiltrering, de viktigste ulempene omfatter behovet for store volumer av patogen oppløsning, problemerå effektivt infiltrere alle bladene mens unngå skader, og et betydelig arbeid intensitet 29. Dessuten, planter infisert med spray, dip eller vakuum inokulering har mindre sannsynlighet for å komme seg etter hele frøplante er infisert med patogen. Gitt de mange begrensninger av andre metoder, forblir sprøyten infiltrasjon assay metode for valg for å oppnå jevn og meget forutsigbar sykdomsprogresjon og nøyaktig kvantifisering av organismen for pålitelig å karakterisere immunresponsen i ekte blad. I tillegg kan denne analysen enkelt endres for å karakter MAMP utløste Immunitet og Systemisk tilegnet resistens. Bortsett fra det, kunne lovende fremtidige anvendelser av teknikken brukes for å teste effekten av flere phytohormones, kjemikalier eller hemmere pre-behandlinger etterfulgt av patogen sprøyte infiltrasjon å dissekere forskjellige lag av anlegget immunsignalnettverk eller identifisere roller i en bestemt bane i anlegget immun respons. Infeksjon with en økt dose av organismen (OD 600 nm = 0,001) i fravær av ethvert forsvar priming forbehandlinger, kjent som den forbedrede motstandsdyktighet mot sykdom (EDR) test, er en annen nyttig modifikasjon av denne metode som kan brukes til å identifisere mutanter eller transgene med forbedret sykdomsresistens.

Det bør bemerkes at sprøyten infiltrering assay ikke gjelder karakterisering av pre-invasiv stadium av forsvaret respons siden patogenet er levert direkte inn i bladvev via stomata. Stomatal nedleggelse, som fungerer som fysisk barriere for patogen inngangen, blir ofte utløst å begrense patogen oppføring ved etablering av MAMP utløste Immunity 46. I tillegg bidrar phytohormone abscisic syre til stomatal nedleggelse under pre-invasive scenen 47. Derfor kan sprøyting eller dypping fremgangsmåter vise seg fordelaktig å karakterisere stomatal lag av immunrespons, til tross for begrensningene forbundetmed de typer vaksiner, omtalt ovenfor 29.

Siden plante-patogen interaksjoner kan endres ved ulike biotiske og abiotiske faktorer, er det avgjørende å fokusere på de nedenfor nevnte kritiske trinn i protokollen for å oppnå vellykket infeksjon og få pålitelige utganger:

Plant status og bakterieaktivitet

Arabidopsis planter kan lett stresset av ulike abiotiske faktorer, inkludert sub-optimal temperatur, tørke og osmotisk stress, og utløse cellulære responser som forstyrrer immun utgang 48. Derfor er det avgjørende å dyrke planter under optimale vekstforhold og beskytte dem mot miljømessige stressfaktorer. I tillegg, siden det utviklingsstadium av den infiserte blad kan også endre den eksperimentelle resultat, er det nødvendig å gjennomgående infisere bladene nummer 5 og 6 for å unngå artifakter. Framdrift langs utviklingsstadier, forhøyet remotstands mot noen virulente og avirulente patogener korrelerer med overgangen fra vegetative stadiet til reproduktive fasen av Arabidopsis planter. Denne dynamiske motstand løpet utviklingsstadiet kalles Age-Related Resistance (ARR) 38. For å unngå ARR interferens med den egentlige immunresponsen, er det avgjørende å utføre infeksjon i riktig utviklingsstadium som angitt i protokollen og avstå fra å forsøke smitteforsøk etter utbruddet av den reproduktive fase. Videre bakteriell fitness og aktivitet vesentlig påvirke patogenet spredning i infisert vev. Derfor er det viktig å initiere bakterie flytende kultur fra en fersk streket kulturplate som ikke er mer enn 2 dager gamle.

Sprøyte infiltrasjon ferdighet

Under sprøyten infiltrasjon, prøv å unngå fysisk skade på bladet siden såret effekten er godt kjent for å forstyrreAnlegget immunrespons, hovedsakelig via jasmonic syre-mediert signalering som kan undertrykke SA-utløst forsvaret trasé 49. Etter infeksjon, bør et blad som ble infiltrert fullt igjen til normal fysisk utseende uten synlige skader. For nybegynnere anbefales det å praktisere denne teknikken ved hjelp av ikke-eksperimentelle planter først før du utfører Psm ES4326 sprøyte infiltrasjon analysen.

Patogen utvinning og fortynning

For å måle nøyaktig patogen vekst, er det viktig å effektivt trekke patogen ut av den infiserte plantevevet. Sammenlignet med andre utvinningsmetoder, mekanisk vev homogenisering gjennom high-throughput homogenizers effektivt trekker patogen uten tap av vevsprøve og krysskontaminering. Deretter bør prøvefortynninger være presist utføres med en pålitelig kalibrert flerkanals pipette for å redusere pipetteringsfeil.Avviket så lite som ± 1 ul i fortynning prosessen ville slå ut i en ~ 5% forskjell i patogen vekst kvantifisering. For flere feilsøkings eksempler på sprøyten infiltrasjon analysen, se tabell 1.

Avslutningsvis beskriver vi optimalisert Psm ES4326 sprøyte infiltrasjon analysen på Arabidopsis å kvantitativt og pålitelig vurdere anlegget immunrespons. Med hjelp av denne pathosystem, vil forståelsen av plante-patogen interaksjoner bli fremskyndet i laboratoriet og til slutt bli søkt om plantevern i felten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MetroMix 360  Grosouth SNGMM360
Large pots Grosouth TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts Grosouth LM1206
11x 21 Flats with no holes Grosouth LM1020
11x 21 Flats with holes Grosouth LM1020H
Vinyl propagation domes Grosouth CW-221
Proteose Peptone Fisher Scientific DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate  MP Biomedicals 151946
Agar  Fisher Scientific A360-500
Streptomycin sulfate Bio Basic Inc SB0494
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific R80150
Rectangular plate Fisher Scientific 12-565-450 
MgCl2 Hexahydrate Bio Basic Inc MB0328
Glycerol Bio Basic Inc GB0232
MgSO4  Bio Basic Inc MN1988
1 ml syringe Fisher Scientific NC9992493 
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-A
Grinding tubes  Denville Scientific B1257
Caps for grinding tubes Denville Scientific B1254
Stainless steel grinding ball Fisher Scientific 2150
96-well plate  Fisher Scientific 12-556-008
Sodium Salicylate Sigma Aldrich s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) Genescript Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) Genescript Made to order
Hole puncher Staples 146308
Biophotometer plus Eppendorf 952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer Fisher Scientific 02-215-503
Accu spin micro centrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl) Eppendorf 3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl) Eppendorf 3122 000.060
Pipette (20µl) Eppendorf 3120 000.038
Pipette tips Fisher Scientific 3552-HR
Sharpie permanent marker Staples 507130
1.5 ml tube Eppendorf 22363204
Forceps Fisher Scientific 08-890

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
  3. Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
  4. Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
  5. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
  6. Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
  7. Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
  8. Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
  9. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
  10. Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
  11. Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
  12. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
  13. Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
  14. He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
  15. Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
  16. Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
  17. Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
  18. Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
  19. Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
  20. Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
  21. Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
  22. Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
  23. Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
  24. Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
  25. Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
  26. Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
  27. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
  28. Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
  29. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
  30. Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
  31. Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
  32. Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
  33. Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
  34. Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
  35. Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
  36. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
  37. Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
  38. Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
  39. Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
  40. Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
  41. Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
  42. Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
  43. Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
  44. Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
  45. Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
  46. Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
  47. Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
  48. Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
  49. León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).

Tags

Infeksjon , infeksjon sprøyte infiltrasjon anlegg immunitet salisylsyre (SA) Enhanced Disease Følsomhet systemisk ervervet resistens mikrobe-Associated Molecular Patterns (MAMPs) MAMP utløste Immunity SA-Utløst Immunitet
Bakteriell Leaf Infiltrasjon analysen for Fine Karakterisering av Plant forsvar svar bruker<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudo syringae</em&gt; Pathosystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C.… More

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter