Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53364
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

في غياب الخلايا المناعية المتنقلة المتخصصة والنباتات الاستفادة من المترجمة موت الخلايا المبرمج والجهازية المكتسبة المقاومة للدفاع عن أنفسهم ضد هجوم الممرض. مساهمة جين نبات الأرابيدوبسيس محددة لاستجابة جهاز المناعة النباتي الكلي يمكن أن يكون على وجه التحديد والكمية المقررة من قبل يعاير نمو الممرض داخل الأنسجة المصابة. لأكثر من ثلاثة عقود، والبكتيريا hemibiotrophic الزائفة syringae الكهروضوئية. maculicola ES4326 (PSM ES4326) تم تطبيق على نطاق واسع الممرض نموذج للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاستجابة المناعية نبات الأرابيدوبسيس. لتوفير مسببات الأمراض في الأنسجة ورقة، تم إنشاء طرق التلقيح متعددة، على سبيل المثال، تسلل حقنة، التلقيح تراجع، الرذاذ، فراغ تسلل، والتلقيح الفيضانات. يصف بروتوكول التالية أمثل طريقة حقنة تسلل لتسليم ضراوة PSM ES4326 في أوراق الكبارنمت التربة النباتات نبات الأرابيدوبسيس وشاشة بدقة من أجل تعزيز قابلية المرض (EDS) نحو هذا العامل الممرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استكمال هذا البروتوكول مع عدة قبل العلاج لمواصلة تشريح العيوب المناعية محددة داخل طبقات مختلفة من دفاع النبات، بما في ذلك حمض الصفصاف (SA) الحصانة -Triggered (STI) والحصانة MAMP الحفز (MTI).

Introduction

نظرا لطبيعتها اطئة، مهددة النباتات باستمرار من قبل عدد كبير من مسببات الأمراض العارضة مختلف أنماط الحياة والاستراتيجيات الغذائية 1. لتقريب الأولى، والحفاظ على مسببات الأمراض biotrophic المضيفة على قيد الحياة لاسترداد المواد الغذائية، بينما ممرضات necrotrophic السموم السرية بنشاط والانزيمات لقتل الأنسجة المضيفة وتتغذى على الخلايا الميتة 1. مجموعة أخرى من مسببات الأمراض، hemibiotrophs تسميته، ويبدأ مسار العدوى مع المرحلة biotrophic والتحول إلى مرحلة necrotrophic عند بلوغ عتبة معينة من تراكم الممرض 2. من أجل الدفاع عن أنفسهم بشكل فعال ضد هذه الكائنات الدقيقة، تطورت النباتات نظام المناعة الفطري معقدة مجهزة آليات المراقبة متعددة للكشف عن مهاجمة مسببات الأمراض ويؤدي المترجمة موت الخلايا المبرمج 3 وكذلك الجهازية المكتسبة المقاومة (SAR) 4. وتركز الأبحاث الحالية على تميز سيج أساسيnaling مكونات والمحادثات عبر في جهاز المناعة النباتية 5.

كما هو مقترح في نموذج "التعرج" 5، والطبقة الأولى من محطة الاستجابة المناعية الفطرية تتطلب وجود البلازما المترجمة الغشاء التعرف على الأنماط مستقبلات (PRRs) للكشف عن غزو الميكروب. PRRs قادرة على التعرف على الأنماط ميكروب-أسوشيتد الجزيئية (MAMPs) وإقامة الحصانة MAMP الحفز (MTI) 6. وعلاوة على ذلك الأمر الذي أدى إلى upregulation النسخي من جينات ترميز البروتينات PR المضادة للميكروبات 7، MTI يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأحداث التي توقيف نمو العوامل المسببة للأمراض، بما في ذلك إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) ورد الفعل الأنواع النيتروجين (RNS)، ترسب callose لجدار الخلية فضلا عن تفعيل العديد من الإشارات كيناز مسارات 8.

وحتى الآن، وقد تم تحديد عدة MAMPs لتحريك MTI نبات الأرابيدوبسيس في، بما في ذلك flg22 بكتيريا 9 10 (18 الأحماض الأمينية من بكتيريا عامل ترجمة استطالة تو) ومكون جدار الخلية الهيكلي peptidoglycans 11. لإنشاء عدوى النجاح، وقد تطورت بعض مسببات الأمراض المتخصصة القدرة على سرية البروتينات الفوعة المستجيب في المساحات داخل الخلايا أو بين الخلايا، وبالتالي قمع MTI ويثير حساسية المستجيب الحفز (ETS) 12،13. على سبيل المثال، يمكن للمؤثرات الفوعة وقف نشاط البروتين Mitogen المنشط شلالات كيناز (MAPK) الفسفرة من MTI للحث على تطور المرض داخل الأنسجة المصابة 14-16. خلال دينامية التطور المشترك بين المضيفين ومسببات الأمراض، وضعت النباتات أيضا استراتيجية الهجوم المضاد على التعرف على البروتينات المستجيب والتخفيف من الفوعة الممرض جزيئات 17. وتتوسط هذا الاعتراف المباشر أو غير المباشر من قبل المستجيب مقاومة الأمراض (R) البروتينات 18. أكثر من طنتنحنح أعضاء في NB-LRR (النيوكليوتيدات وتجليد ويكرر يسين الغنية) الأسرة 19. تصور من المستجيب الفوعة من قبل البروتين R يثير استجابة مناعية أقوى وأوسع نطاقا وصفها بأنها الحصانة المستجيب الحفز (ETI) 20. إلى جانب إحداث التعبير عن الجينات الدفاع 21 وإنتاج نواتج الدفاع 22، ETI غالبا ما يؤدي إلى مترجم موت الخلية المبرمج السريع المعروف باسم الاستجابة شديد الحساسية (HR) للحد من مسببات المرض من الانتشار إلى الأنسجة المجاورة 3.

بالإضافة إلى مترجم موت الخلايا المبرمج 23، النباتات قادرة على الشروع في المدى الطويل والاستجابة المناعية على نطاق المنظومة وصف الجهازية المكتسبة المقاومة (SAR) 4. على التحدي مع الممرض biotrophic، الخلايا النباتية تؤدي الحيوي وتراكم من هرمون نباتي الذاتية حمض الصفصاف (SA) والبروتينات PR في كل الأنسجة وجهازية 24. من خلال رعملية له، ويتحقق اشتداد حالة التأهب في الأوراق غير المصابة التي تسمح لتركيب الردود الدفاع أسرع خلال عدوى لاحقة من قبل طيف واسع من مسببات الأمراض 24. SA والنظير الاصطناعية مثل benzo- (1،2،3) -thiadiazole-7-carbothioic حمض S -methyl استر (BTH) وحمض 2،6-dichloroisonicotinic (INA) قادرة على حمل كيميائيا حمض الصفصاف (SA) الحصانة -Triggered (STI) بناء على طلب الخارجي 24. ويقترح Nonexpressor من المتصلة إمراض الجينات 1 (NPR1) ليكون واحدا من المستقبلات SA وظائف كمنظم النسخي كبير خلال استجابة الدفاع SA بوساطة في كل الأنسجة وجهازية 21،25،26. وقد أثبتت بشكل قاطع أن NPR1 مطلوب للSAR إنشاء وفقدان NPR1 يؤدي إلى قابلية مثيرة نحو الزائفة syringae 25.

تميز على نطاق واسع مساهمة الجزيئية النباتيةالمكونات في تفاعلات بين النبات والممرض، وقد وضعت اختبارات بيولوجية متعددة لقياس الأحداث دفاع محددة، بما في ذلك ROS انفجار 27، ترسب callose 28، الجينات الدفاع التعبير وتراكم المنتجات البروتين 21. في حين أن هذه المقايسات الفردية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة شكل محدد من أشكال الاستجابة المناعية مصنع، فإن أيا منها، ومع ذلك، تكون قادرة على تمثيل استجابة الدفاع كاملة على مستوى المصنع بأكمله. على العكس من ذلك، وتحديد حجم النمو الممرض بعد الإصابة يوفر التقدير الكلي للاستجابة المناعية على المستوى العضوي. ولذلك، فإن التنمية والاستغلال الأمثل للمقايسة الممرض التلقيح دقيق وموحد للغاية أمر بالغ الأهمية لتغذية يصل البحوث والاكتشافات على الاستجابات المناعية نبات الأرابيدوبسيس.

الزائفة syringae، وهي بكتيريا سلبية الغرام، عرف بأنه phytopathogen قادرة على التسبب في المرض في مجموعة من المضيفين النبات بما في ذلك Arabidopsهو 29. كما نموذج النظام النبات الممرض، ونبات الأرابيدوبسيس - P. تم تطبيقه على نطاق واسع التفاعل syringae لفهم الآليات الجزيئية الكامنة الردود دفاع مصنع 29. حتى الآن، أكثر من 50 P. وقد تم تحديد pathovars syringae على أساس قدرتها على إصابة الأنواع النباتية المختلفة 30 . P. syringae الكهروضوئية. DC3000 الطماطم (PST DC3000) 31 و P. syringae الكهروضوئية. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 هي الأكثر استخداما على نطاق واسع، وتميزت على نطاق واسع اثنين من سلالات خبيثة. بصرف النظر عن كونها معترف بها من قبل المصنع والتسبب في رد MTI، PST DC3000 وPSM ES4326 قادرة على إفراز البروتينات المستجيب خبيثة لقمع MTI ويؤدي ETS لصالح 31،33 نمو العوامل المسببة للأمراض.

لتشريح وظيفيا التفاعل بين نبات الأرابيدوبسيس وP. syringae، متعددةوقد تم تطوير طرق العدوى الممرض استنادا إلى نهج تسليم العامل الممرض؛ 0. للنباتات تزرع التربة، يمكن أن يتم تسليم الممرض تسلل حقنة، فراغ تسلل، وتراجع التلقيح والرش التلقيح 29،34. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت الشتلات الفيضانات التلقيح فحص لأداء الشاشات على نطاق واسع في زراعة الأنسجة لوحات نمت النباتات نبات الأرابيدوبسيس الشباب 35. حقنة تسلل، باعتبارها واحدة من أكثر الطرق شيوعا، يدويا يسلم الممرض في الممر الخلوي الغشائي من خلال الفتحات الطبيعية ورقة تسمى الثغور 29. من خلال هذا النهج، كميات متساوية من P. syringae يمكن تسللت إلى ورقة المصابة ويرتبط قوة الاستجابة المناعية مصنع عكسيا مع مستويات النمو الممرض. لذلك، وتحديد حجم النمو الممرض بمثابة النهج الأمثل لتقييم الوظيفة المناعية على مستوى المصنع بأكمله. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للحقنة تسلل تمييز الأنسجة المحلية والنظامية، والتي يمكن بالبريد المطبق في وصف الآليات الجزيئية الكامنة وراء SAR 36.

في بروتوكول التالية، وصفنا حقنة الأمثل تسلل مقايسة مع PSM ES4326 لفحص المسوخ نبات الأرابيدوبسيس لتعزيز قابلية المرض (EDS). وهذا البروتوكول توظيف اثنين من المورثات نبات الأرابيدوبسيس: البرية من نوع نوع إيكولوجي كولومبيا-0 (كو-0) النباتات (السيطرة) وnpr1-1 الخسارة من وظيفة المسوخ (hypersusceptible) التي من شأنها أن تكون مصابة السلالة البكتيرية ضراوة PSM ES4326 37. متحولة npr1-1 يحمل طفرة نقطة في تسلسل توافق في الآراء ankyrin تكرار للجزيء NPR1، الذي يغير الحامض الاميني الحفظ جدا لالتيروزين ويجعل البروتين غير وظيفية 25. بالإضافة إلى ذلك، وصف عدد من التعديلات للمقايسة حقنة التسلل التي تسمح الكمي من العيوب في طبقات معينة من الاستجابة المناعية، بما في ذلك MTI وSTI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويصف النص التالي بروتوكول تدريجي عن الأداء الأمثل PSM ES4326 حقنة تسلل فحص في نبات الأرابيدوبسيس. وتتمثل الإجراءات الرئيسية لهذا الاختبار في مخطط مبسط (الشكل 1).

1. مصنع ظروف النمو

  1. بذور بذر
    1. إعداد 2 الأواني (4 في القطر، 3.75 في طويل القامة) مليئة فضفاضة مع التربة والمياه والأواني التي نقع عليها من أسفل O / N قبل استنزاف المياه الزائدة.
    2. زرع بذور نبات الأرابيدوبسيس 50-100، من النوع البري العقيد-0 أو npr1-1 متحولة، في كل وعاء مع مطوية 70 مم وزنها ورقة أو ورقة أخرى.
    3. تغطية وعاء مع قبة رش المياه شفافة لزيادة الرطوبة النسبية إلى 80-90٪ (الشكل 2A).
  2. احتضان وعاء عند 4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة للسماح الطبقات كاملة وإنبات متزامن.
  3. نقل وعاء لظروف النمو القياسية (12 ساعة ضوء/ 12 ساعة الظلام، 21 ° C، وشدة الضوء 100 ميكرومول / م 2 / ثانية، والرطوبة النسبية 40٪) للسماح البذور لتنبت. الكراك القبة لتوليد 2-3 في افتتاح مباشرة بعد نقلها إلى غرفة النمو، والتي سوف تساعد على تجنب تكثيف الماء.
  4. عند وصول أول ورقة حقيقية حجم 2-3 ملم في الطول، وزرع الشتلات من وعاء إلى 72 بئرا شغل في شقة مع التربة.
    1. استخدام الاصبع أو ماصة 1 مل لخلق-1 في الاكتئاب العميق في منتصف سطح التربة على شقة.
    2. فصل بلطف الشتلات الفردية مع الضرر الجذر أقل قدر ممكن. اختيار بعناية الشتلات التي لها جذور سليمة مع ملقط.
    3. وضع الشتلات واحدة فصل جنبا إلى جنب مع أجمة التربة الانضمام للحد من صدمة زرع في الاكتئاب ويربت بلطف أسفل التربة المحيطة بها لملء الاكتئاب. تجاهل الشتلات اضافية والتربة في حاوية نفايات بيولوجية والتصرف وفقامع المبادئ التوجيهية للتخلص من النفايات واقية المحلية.
    4. المياه نقل الشتلات من أعلى وتغطي كامل الشقة مع قبة رش المياه شفافة للحفاظ على 80-90٪ الرطوبة. الحفاظ على القبة لمدة 3 أيام، ثم كسر القبة في صباح يوم 4 و تماما إزالته بحلول نهاية ذلك اليوم.
      ملاحظة: بذور بذر يمكن القيام بدلا من ذلك عن طريق البذور تقسيمها في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على 1 مل 0.1٪ أجار لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية تليها نقل 2-3 البذور مع ماصة الزجاج على 72 آبار شغل في شقة مع التربة. تحتاج الشقق لتكون مغطاة بقبة شفافة يمكن إزالتها بعد أسبوع من الإنبات. ويمكن إزالة الشتلات اضافية لترك الشتلات واحد فقط لكل بئر.
  5. محطات المياه كل يومين عن طريق نقع الشقق في 1 في الماء لمدة 20 دقيقة، ثم تصفى من الماء الزائد.
    ملاحظة: الفاصل الزمني لسقي النباتات يعتمد على نسبة الرطوبة غرفة النمو ويحتاج إلى قاعدة العزمد على المراقبة المستمرة للمنشأة نمو النبات المستخدم. تحقق من النباتات يوميا للتأكد من أنها هي الماء جيدا. إذا بقع قليلة فقط هي تجفيف المياه تلك النباتات من أعلى مع زجاجة بخ.
  6. أداء فحوصات العدوى الممرض (الخطوة 3-5) على النباتات التي هي في أو بالقرب التنموي مرحلة # 3.50 (عند حجم ردة 50٪ الحجم النهائي)، وهو ما يعادل 3-5 أسابيع من العمر تبعا لظروف النمو (الضوئية، ودرجة الحرارة). لا تصيب النباتات بعد ظهور النورة (المرحلة رقم 5) نظرا لظهور المقاومة المرتبطة بالعمر 38،39.

2. إعداد الثقافة وسائل الإعلام ومركبات

  1. جعل 1 L من الملك B (KB) وسط سائل. يحرك بلطف 20 غراما بروتيوز ببتون و 2 ز فوسفات البوتاسيوم هيدرات ثنائي القاعدة باستخدام شريط مغناطيسي مع 1000 مل H 2 O منزوع الأيونات حتى لا يكون هناك بيليه مرئية. قسامة 100 مل إلى 150 مل الزجاجات الزجاج والأوتوكلاف على دورة السائلة 20 دقيقة.
  2. إعدادلوحات الثقافة مع KB وسط صلب.
    1. يحرك بلطف H 20 ز البروتيوز ببتون، 2 غ فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة هيدرات و 15 ز آجار مع 1000 مل منزوع الأيونات 2 O. الأوتوكلاف.
    2. تهدئة المتوسطة على لوحة تحريك مغناطيسي حتى أنها باردة لمسة لتقليل التكثيف في المستقبل، وتجنب تدهور المضادات الحيوية. إضافة 18 مل العقيمة 80٪ الجلسرين و 5 مل العقيمة 1 M MgSO 4 إلى المتوسطة. وبالنظر إلى أن PSM ES4326 يحمل مقاومة ضد الستربتومايسين، إضافة الستربتومايسين في وسائل الإعلام تبريده الى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام مل - 1.
    3. صب لوحات. إعداد اثنين من أحجام مختلفة من لوحات KB وسائل الإعلام: 100 مم × 15 مم و 150 مم × 15 مم أطباق بتري. في طبق بتري تحتوي على المتوسط ​​أصغر بمثابة البكتيريا الأولية لوحة الثقافة، ويخدم طبق بتري أكبر كما البكتيريا العد لوحة.
      ملاحظة: للحصول على البكتيريا عد لوحات، لوحات مستطيلة الشكل يمكن استخدامها للحد منتكلفة المواد الاستهلاكية منذ مرتين العديد من العلاجات يمكن رسم في لوحة بالمقارنة مع لوحات الجولة التقليدية.
      1. صب لوحات قبل التجربة العدوى. متجر لوحات KB المتوسطة في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2-3 أشهر منذ ستربتومايسين سلفات يفقد تدريجيا النشاط المضاد الحيوي 40.

3. تعزيز أمراض الحساسية (EDS)

  1. يوم 1 - بكتيريا الإنتصارات على لوحة
    1. قبل يومين من الفحص EDS، خط PSM ES4326 من -80 ° C الأسهم الجلسرين على KB-بكتيريا لوحة الثقافة البكتيرية واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
  2. اليوم 2 - الشروع في محطات ثقافة والمياه السائلة
    1. الشروع في الثقافة السائل في أنبوب اختبار العقيمة مع 4 مل السائل KB المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام مل - 1 الستربتومايسين ويهز في 250 دورة في الدقيقة، 28 ° CO / N.
      ملاحظة: للحصول على EDS العدوى الفحص، وذلك باستخدام 6 محطات في التركيب الوراثي هو التوصيةأد. لSTI وMTI المقايسات، ينصح 6 محطات في التركيب الوراثي في ​​العلاج. لقيحة البكتيريا، فمن المستحسن استخدام ثقافة السائلة الطازجة مع الكثافة البصرية في λ ل 600Nm بين 0.3 و 0.6.
    2. علامة أعناق الأوراق رقم 5 و 6 مع علامة ماء حادة نهاية لسهولة تحديد الأنسجة المصابة في أخذ العينات (الشكل 1). لتعزيز فتح الثغور وتسهيل مدخل حل الممرض في ورقة، والماء والنباتات بشكل جيد عن طريق نقع شقة من أسفل لمدة 20 دقيقة، ثم تصفى من الماء الزائد.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، تغطية شقة بقبة شفافة وينقع في الماء لمدة 2-4 ساعة لزيادة فتح الثغور.
    3. اليوم 3 - تخفيف الممرض والمحاقن تسلل
      ملاحظة: إصابة الممرض خلال ساعات الصباح هو الأمثل لانتشار مسببات الأمراض وتطوير أعراض المرض الأكثر وضوحا على المورثات عرضة للإصابة. بذل كل جهد ممكن للحفاظ على تصيبتوقيت أيون ثابت للقضاء على تأثير إيقاعات الساعة البيولوجية وتنظيم الجينات نهاري 41،42، مما يساعد على تقليل التباين بين مكررات التجريبية.
      1. بيليه ثقافة البكتيرية في microcentrifuge أنبوب 1.5 مل في 9600 x ج لمدة 2 دقيقة في RT وتجاهل طاف. resuspend الكرية الجرثومي مع 1 مل من معقم 10 ملي MgCl 2.
        ملاحظة: يمكن الكاتيونات المغنيسيوم تعزيز الحركة والتصاق P. syringae 43. بدلا من ذلك، استخدم MgSO 4 في نفس التركيز. الماء المعقم هو بديلا مقبولا للحلول الملح المغنيسيوم.
      2. تمييع تعليق البكتيريا مع 9 مل من 10 ملي MgCl 2 في أنبوب الطرد المركزي 50 مل وقياس الكثافة الضوئية (OD) من البكتيريا مع طيفي في λ = 600 نانومتر. تمييع البكتيريا مع 10 ملي MgCl 2 لل 600Nm OD النهائية = 0.0002 لEDS العدوى الفحص.
      3. التسلل ورقةمع 1 مل نهاية حادة حقنة needleless (المعروف باسم حقنة الأنسولين) الذي يحتوي على محلول مخفف البكتيرية.
      4. لا تملأ حقنة تصل إلى كامل طاقتها. ملئه حتى مع 0،5-0،6 مل للسماح للسيطرة أفضل بكثير خلال عملية تسلل.
      5. فضح السطح السفلي من ورقة على رأس السبابة، ثم ضبط بلطف ورقة موقف مع مساعدة من الإبهام. وضع حقنة عموديا على سطح الورقة للتأكد من أن الضغط يتوزع بشكل متساو. في محاولة لتجنب منطقة الضلع الأوسط خلال التسلل للحد من الأضرار ورقة.
      6. دفع ببطء الغطاس التسلل إلى حل البكتيرية. سيتم تصور دخول السائل في ورقة للورقة كما يتضح من قتامة لون ورقة. محاولة التسلل كامل سطح الورقة. إذا لم يكن هذا المنجز في محاولة واحدة، واختيار بقعة تسلل أخرى وكرر الإجراءات المذكورة أعلاه حتى يتم تغطية سطح الورقة بأكمله.
      7. عند الانتهاء، وصمة عار بلطف ورقة مع الأنسجة الماصة لإزالة الحل الممرض إضافية. تفقد البصر ورقة الأنسجة المصابة عن الضرر.
        ملاحظة: يجب أن الانطباع حقنة دائري لا تكون مرئية بعد تسلل كاملة.
      8. ترك النباتات تسلل لتجف لمدة 1-2 ساعة قبل أن تعود لهم في ظروف النمو الأصلية. المقبل، رش القبة واضحة بالماء وتغطية النباتات المصابة لمدة 2 ساعة، ثم كسر القبة لتوليد 2-3 في افتتاح وترك الأمر على طوال الفترة المتبقية من التجربة العدوى.
        ملاحظة: منذ P. syringae ليس الممرض المحمولة جوا، وليس هناك خطر من انتشار جراثيم إلى غيرها من النباتات التي تزرع في نفس المرفق. ومع ذلك، من باب الوقاية، وتجنب الاتصال الجسدي بين النباتات المصابة والنباتات تجريبية أخرى في مكان قريب. سوف تغطي شقة بقبة شفافة زيادة الفوعة الممرض وتسريع تطور المرض. التحتاج لهذه الخطوة والمدة المثلى للفترة تغطية الاحتياجات تحدد على أساس ظروف الرطوبة مرفق نمو النبات المستخدم.
    4. اليوم 5 - قبل تجفيف لوحات وسائل الإعلام
      1. خذ 150 مم × 15 مم KB لوحات من وحدة التخزين الباردة والجافة أي موجودة قبل تكثيف الماء على لوحة. لوحات الجافة من خلال ابقائها في RT لنحو 24 ساعة. لتسريع هذه العملية، ووضعها في تدفق الصفحي هود مع أغطيتها متصدع لمدة 30-60 دقيقة.
        ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لتشكيل قطرة دائرية على سطح لوحة في الخطوة التالية.
    5. اليوم 6 - تحديد مقدار نمو الممرض
      ملاحظة: قد يتم تنفيذ الإجراء الكمي الممرض التالية في نقطة زمنية سابقة بعد الإصابة لتأكيد كميات متساوية من البكتيريا يتم تسليمها إلى ورقة، وخصوصا عندما غيرت النباتات ورقة التشكل.
      1. معالجة الأنسجة المصابة بعد ظهورمن الاخضرار التي أشار إليها اصفرار الأنسجة المصابة في المورثات عرضة، ولكن قبل وضع الآفات الميتة (الشكل 2B).
        ملاحظة: اقترح الوقت أخذ العينات بعد ثلاثة أيام من التلقيح الممرض. ومع ذلك، منذ نمو الممرض يعتمد على عدد من العوامل البيئية، وطول الحضانة قد تختلف في نطاق من 2 ½ 3 ½ أيام ويحتاج إلى يحدده الملاحظات الدقيقة من تطور العدوى في منشأة نمو النبات المستخدم.
        1. إعداد 6 أنابيب لطحن كل الوراثي (الشكل 1). ضع الفولاذ المقاوم للصدأ واحد طحن الكرة وإضافة 500 ميكرولتر العقيمة 10 ملم MgCl 2 في كل أنبوب.
        2. فصل ورقة المصابة من النبات وكمة قرص ورقة ورقة لكمة 1 حفرة (الشكل 1).
          ملاحظة: لتقليل هامش الخطأ، في محاولة لكمة كل ورقة عينات في نفس الموقف. أخذ عينات من القرص ورقة من أعلىمن ورقة ويوصى.
        3. وضع عشوائيا 2 أسطوانة ورقة (من محطتين مختلفة) في كل أنبوب طحن باستخدام ملقط.
        4. ختم الأنبوب وتجانس الأنسجة مع الخالط الإنتاجية العالية في أقصى سرعة (1600 ضربات في الدقيقة الواحدة) لمدة 10 دقيقة. تكرار هذه العملية إذا لزم الأمر حتى الأنسجة متجانسة بشكل جيد والحلول يتحول إلى اللون الأخضر بسبب إطلاق الكلوروفيل من الأوراق المصابة.
      2. في انتظار التجانس، وملء الصفوف 6 الأولى من لوحة الثقافة 96-جيدا مع 180 ميكرولتر 10 ملي MgCl 2 باستخدام ماصة متعدد القنوات وخزان pipetting ل.
      3. بعد طحن، ونقل 20 ميكرولتر من الأنسجة تعليق الأرض في الصف الأول من لوحة 96-جيدا وتخلط بواسطة pipetting لتكرار ما يصل السائل وهبوطا. إذا شظايا صغيرة من الأنسجة تسد طرف، مقطع من قبل 2-3 ملم للمساعدة في الحصول على حجم الصحيح من الحل.
        1. لتوفير مساحة كافية لالحبرية على س الأعلىو لوحة، الفضاء الأنسجة من المورثات مختلفة في صفوف بديلة (الشكل 1). لإعداد عشرة أضعاف التخفيف المتسلسل، ونقل 20 ميكرولتر السائل في الصف الثاني وكرر هذا الإجراء حتى التخفيف السادس.
      4. نقل 20 ميكرولتر من الحل من لوحة 96-جيدا على 150 ملم × 15 ملم KB وحة باستخدام نصائح ماصة تقسيم (الشكل 1). العمل من تعليق معظم المخفف لأكثر تركيزا.
        ملاحظة: انطلاقا من معظم المخفف لأكبر مناطق يجعل من غير الضروري تغيير نصائح ماصة بين التخفيفات. إذا كان كذلك قبل المجففة لوحة، يجب الحبرية نقل البقاء متماسكا على الجزء العلوي من المتوسطة حتى استوعبت (عادة 15-30 دقيقة). تجفيف الوقت يختلف مع RT والرطوبة.
      5. تجف لوحة في RT مع غطاء تصدع. مرة واحدة ويمكن ملاحظة لا أكثر السائل على سطح لوحة، وإغلاق الغطاء، قلب واحتضان لوحة عند RT أو 28 درجة مئوية الحاضنة.
      6. احتضان لوحات ل40-60 ساعة حتى تصبح المستعمرات مرئية. تأكد من أن النمو على لوحات يعكس قابلية للتنبؤ انخفاض بنسبة 10 أضعاف في مستعمرة (كفو) (الشكل 2C). عد البكتيريا قبل أن كسا الأرض والمستعمرات الصمامات. تحديد عدد البكتيريا في أدنى تخفيف ليس لديها مستعمرات متداخلة. عادة، والتخفيف يفضل أن تحسب سوف تحتوي على ما بين 10-50 المستعمرات.
        ملاحظة: قد يكون الاختلاف الحالي بين مكررات التقنية؛ لذا، ينبغي تحديد أدنى التخفيف عن كل تكرار بشكل منفصل.
      7. لحساب مستويات انتشار بكتيريا، وتوثيق عدد من الصف (R) فضلا عن عدد من البكتيريا في كل تكرار الفني (T) في الكتابة. تحديد عدد مستعمرة حدة تشكيل - وت م / القرص ورقة من خلال المعادلة التالية: قرص وت م / ورقة = (T × 10 R / 20) × 500/2
      8. اكتب البيانات في قالب جدول التالي للالم ÙCE رسم بياني (الشكل 1) (لملف القالب تحليل البيانات جداول البيانات، انظر الجدول 2). يتم تمثيل كل نقطة بيانات كمتوسط ​​ستة مكررات التقنية على مقياس لوغاريتمي. أشرطة الخطأ تمثل فاصل الثقة 95٪ من متوسط ​​(ن = 6).
        ملاحظة: حساب فترات الثقة 95٪ بحاجة إلى تعديل استنادا إلى عدد من مكررات التقنية.

4. الحصانة SA الحفز (STI)

  1. اليوم 1: اتبع نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  2. يوم 2: بالإضافة إلى سقي النباتات والشروع في الثقافة البكتيرية السائلة (الخطوة 3.2)، لحث المقاومة من خلال تطبيق خارجي SA مشتقات الساليسيلات الصوديوم 21.
    ملاحظة: الصرفة SA ديه الفقراء للذوبان في الماء، ويتطلب ضبط درجة الحموضة مسبق، وبالتالي ليست المستحسن لهذا الاختبار.
    1. للحث على دفاعات SA بوساطة ضد P. syringae ورئيس النباتات للإصابة في المستقبل 2124 والنباتات رذاذ مع رذاذ خفيف من 1 ملي الصوديوم ساليسيلات أو H 2 O (كما وهمية) 16-24 ساعة قبل العدوى الممرض.
  3. يوم 3: إعداد الممرض التخفيف إلى OD ل 600Nm = 0.001 ودفع البكتيريا إلى سطح الورقة بالكامل عن طريق التسلل حقنة (الخطوة 3.3).
  4. اليوم 6: للحصول على القياس الكمي الممرض وعملية فرز الأصوات، اتبع الإجراء كما هو موضح في فحص EDS (خطوات 3.4 و 3.5). لوحة والاعتماد على H 2 O وساليسيلات الصوديوم - سابقة التجهيز العينات بشكل منفصل. لمن النوع البري نبات الأرابيدوبسيس، ومن المتوقع في الساليسيلات الصوديوم تخفيض 1-2 سجل في نمو العوامل المسببة للأمراض - محطات سابقة التجهيز.

5. أثارت MAMP الحصانة (MTI)

ملاحظة: في هذا الاختبار، ونحن نستخدم نبات الأرابيدوبسيس من النوع البري العقيد-0 ومتحولة fls2 ويفر النباتات. FLS2 وEFR هي البلازما المترجمة الغشاء التعرف على الأنماط مستقبلات (PRRs) التي يمكن التعرف flg22 وelf18، respectively 9،10. فقدان كل النتائج PRR في الحساسية لنوع معين من MAMP، والذي يدل على ذلك النمو الممرض دون تغيير في متحولة التالية الخارجية MAMP ما قبل المعالجة والمحاقن تسلل مع PSM ES4326.

  1. يوم 1 و 2: اتبع نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوة 3.1 و 3.2.
  2. يوم 3: MAMP ما قبل المعالجة وإصابة الممرض
    1. لإنشاء الحصانة MAMP الحفز، إعداد 1 ميكرومتر حل flg22 فلاجيلين حاتمة أو EF-تو حاتمة elf18 وحقنة التسلل عليه في كامل سطح الورقة 4 ساعات قبل الإصابة الممرض (خطوات 3.3.3-3.3.6). وهذا سوف يسمح لتحريض الدفاعات بوساطة MAMP ضد P. syringae ورئيس النباتات للإصابة في المستقبل 6،37.
      ملاحظة: كشفت بيانات ميكروأري متاحة للجمهور الحد الأقصى للبرمجة النسخي الجينات MAMP متجاوبة يحدث 4 ساعات بعد flg22 أو elf18 العلاج 37،44. وهكذا، 4 ساعة هي أوصتمدة MAMP المعالجة المسبقة التي تؤدي إلى تحقيق فرق واضح في نمو الممرض بين MAMP المعالجة العقيد-0 وfls2 ويفر المسوخ.
    2. إزالة الحل اضافية MAMP مع الأنسجة الماصة وترك النباتات كشفت لتسريع عملية امتصاص السائل داخل ورقة. لحساب تأثير إصابة من حقنة الضغط تسلل، التسلل H 2 O في أوراق النباتات السيطرة.
    3. إعداد الممرض التخفيف إلى OD ل 600Nm = 0.001 ودفع البكتيريا إلى السطح ورقة كاملة من MAMP / H 2 O قبل المعالجة ورقة بواسطة حقنة تسلل (الخطوة 3.3).
  3. اليوم 6: للحصول على القياس الكمي الممرض وعملية فرز الأصوات، اتبع الإجراء كما هو موضح في الخطوة 3.4 و 3.5. لوحة والاعتماد على O H 2 وعينات MAMP سابقة التجهيز على حدة. في البرية من نوع نبات الأرابيدوبسيس، ومن المتوقع انخفاض 1-2 سجل في النمو الممرض في محطات سابقة التجهيز MAMP، مع قوي إلى حد ماتخفيض إيه بوساطة flg22 مقارنة elf18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتوكول وصفنا هنا يمثل P. الأمثل syringae حقنة تسلل الاختبار لتقييم كمي لاستجابة جهاز المناعة في النباتات نبات الأرابيدوبسيس. كما هو موضح في الشكل رقم 1، ويتبع تسلل حقنة من PSM ES4326 عن طريق استخراج الممرض وتقدير عبر التخفيفات المتسلسلة والمستعمرات التعداد.

كما هو موضح في الخطوة 3 في نص البروتوكول، المحسن أمراض الحساسية (EDS) ضد PSM ES4326 يمكن تقييمها عن طريق العدوى مع اللقاح مع OD = 0.0002. كما هو مبين في الشكل (3)، والمسوخ npr1-1 عرضة لديها ما يقرب من 2.5 السجل (300 مرة) المزيد من النمو الممرض بالمقارنة مع من النوع البري العقيد-0 النباتات. تبعا لظروف تجريبية، يمكن أن تدعم النباتات npr1-1 تصل إلى 3.0 سجل النمو البكتيري أكثر من العقيد-0، مع معظم النتائج المشتركة ضمن مجموعة من 1،5-2،5 السجل. لذلك، هذا الحمار EDSعبد المنعم يوسف يوفر نافذة واسعة من الفرق، والتي قد يكون الباحثون قادرين على وضع المسوخ نبات الأرابيدوبسيس ونقل الجينات لتحديد الجينات مرشح يحتمل أن تشارك في الاستجابة المناعية المصنع.

بالإضافة إلى تحديد EDS، PSM ES4326 حقنة تسلل الفحص يمكن تعديلها لتشريح طبقات مختلفة من الاستجابة المناعية. لتقييم الحصانة الصفصاف حمض الحفز، يستخدم التطبيق الخارجي للساليسيلات الصوديوم الكيميائية لتحريك الاستجابة المناعية، التي وكميا من خلال نمو العوامل المسببة للأمراض (الشكل 4A). فقدان NPR1، التي تعمل باسم SA مستقبلات وكبير النسخي شارك في تنظيم الجينات المستهدفة SA-تعتمد، يؤدي إلى عدم الاكتراث لتطبيق خارجي من مشتقات حمض الصفصاف. ويتجلى هذا عدم الاكتراث لSA من النمو دون تغيير الممرض في محطات المعالجة قبل ساليسيلات الصوديوم npr1-1 في المقابل إلى انخفاض ملحوظ في العقيد-0 النباتات (20 مرات أقل pathog EN على الصوديوم تطبيق الساليسيلات) (الشكل 4B).

لتوصيف الحصانة، قبل المعاملة أثارت MAMP مع flg22 أو elf18 تم تنفيذ كما هو موضح في الشكل 5A. لتوصيف الحصانة عن العوامل فلاجيلين، وتستخدم العقيد-0 والنباتات متحولة fls2. FLS2، وهو مثل مستقبلات كيناز المترجمة الغشاء، يعترف flg22 ويطلق MTI 9. كما هو موضح في الشكل 5B، دعمت المعالجة flg22 العقيد-0 النباتات و~ 1 سجل (10 مرات) انخفاض في عدد السكان البكتيرية، في حين فشلت النباتات متحولة fls2 لتحريك البكتيرية تأثير تقييد النمو. وبالمثل، فإن فقدان EF-تو مستقبلات EFR في مصانع متحولة يفر يؤدي إلى عدم الاكتراث لelf18 ما قبل المعالجة كما يدل على ذلك النمو الممرض دون تغيير بعد elf18 ما قبل المعالجة (الشكل 5B).

ديزيل / ftp_upload / 53364 / 53364fig1.jpg "/>
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للPSM ES4326 حقنة تسلل فحص على النباتات نبات الأرابيدوبسيس. يترك يتم وضع علامة رقم 5 و 6 من النباتات التي تزرع التربة الكبار نبات الأرابيدوبسيس والمصابين PSM ES4326 من خلال حقنة التسلل. بعد ظهور أعراض المرض، فصل الأوراق والأقراص ورقة الحصاد لتجانس الأنسجة. وتضعف النسيج المتجانس جيدا بشكل متسلسل في لوحات 96-جيدا قبل أن ينتقل إلى نوع من البكتيريا عد لوحة. بعد ظهور المستعمرات على لوحة، والاعتماد على عدد من البكتيريا ومعالجة البيانات لإنشاء الرسم البياني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. إجراءات التمثيلية للفحص EDS.وتغطي (A) الاواني بقبة شفافة رش الماء بعد زرع بذور. (B) أعراض التمثيلية على العقيد-0 والأوراق npr1-1 تخضع لفحص EDS (OD ل 600Nm = 0.0002) 3 أيام بعد التلقيح. ملاحظة الاخضرار شديد على npr1-1 ومظهر طبيعي تقريبا من العقيد-0. (C) التخفيفات المسلسل من PSM ES4326 المتزايد على KB (50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) وسائل الاعلام لوحة بعد ~ 45 ساعة من الحضانة. خمسة التخفيفات واضحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. ممثل النتائج للمقايسة EDS النمو PSM ES4326 (وحدات تشكيل مستعمرة - وت م / قرص رقة، إكسبressed على نطاق وسجل) وكان كميا في العمر 4 أسابيع كولونيل-0 وnpr1-1 النباتات 3 أيام بعد التلقيح (OD ل 600Nm = 0.0002). تمثل أشرطة الخطأ 95٪ فترات الثقة للمتوسط ​​(ن = 6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل الداخلي 4. ممثل ونتائج الفحص STI. (A) تمثيل تخطيطي للالحصانة الصفصاف حمض الحفز (STI) فحص. وكان كميا الحصانة (B) الصفصاف حمض الحفز على أساس النمو الممرض في محطات المعالجة مسبقا مع 1MM ساليسيلات الصوديوم أو H 2 O 16 ساعة قبل PSM ES4326 حقنة تسلل (OD ل 600Nm = 0.001). وكان كميا النمو الممرض 3أيام بعد التلقيح. تمثل أشرطة الخطأ 95٪ فترات الثقة للمتوسط ​​(ن = 6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. إجراء الممثل ونتائج الفحص MTI. (A) تمثيل تخطيطي للالحصانة MAMP الحفز (MTI) مقايسة. (B) وكان كميا MTI النمو الممرض في محطات المعالجة مسبقا مع حل 1μM من flg22، elf18 أو H 2 O (كما السيطرة) 4 ساعة قبل إدارة المشتريات والتوريدات ES4326 حقنة تسلل (OD 600 نانومتر = 0.001). وكان كميا النمو الممرض 3 أيام بعد التلقيح. تمثل أشرطة الخطأ 95٪ فترات الثقة للمتوسط ​​(ن = 6). يرجى النقر انهإعادة لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

القضية الأسباب المحتملة الإجراءات الموصى بها
أي نمو البكتيريا في الوسط السائل بعد O / N الثقافة انخفاض نشاط البكتيريا الشروع في ثقافة السائل من لوحة يشوبه حديثا
يعرض دائري الانطباع حقنة على ورقة بعد حقنة تسلل الكثير من الضغوط خلال تسلل تقليل pressue خلال تسلل
يعرض الجزئي الانطباع حقنة على ورقة بعد حقنة تسلل المواقع غير مناسب للحقنة ضبط حقنة لوضعه العمودي على سطح الورقة
يذبل ورقة wthtin بعد ساعات قليلة من تسلل أيضا هو تسلل حل الكثير من مسببات المرض إلى ورقة محطة الوقود النووي المشعiltrating فور سطح الورقة بالكامل اللون الأخضر أكثر قتامة في اللون
أي أعراض المرض بعد ثلاثة أيام من العدوى الرطوبة منخفضة جدا لالممرض لتتكاثر زيادة الرطوبة حيث يتم الاحتفاظ النباتات المصابة
الممرض يدخل مرحلة necrotrophic في أو قبل 3 نقطة في البوصة تركيز غير صحيح من حل الممرض استخدام OD ل 600Nm = 0.0002 لEDS فحص. تأكيد تخفيف باستخدام معمل مستقل عن
دمج قطرات على رأس البكتيريا عد لوحة البكتيريا عد لوحة لا يجف بشكل مناسب قبل الجاف لوحة O / N قبل الاستخدام
لا تمثل الممرض تخفيف تخفيض بنسبة 10 أضعاف لم يتم تنفيذ التخفيف بدقة استخدام ماصة متعدد القنوات محسوبة بدقة لنقل السائل. تأكد من أن يتم الاستغناء عن السائل
نمو الممرض في النوع البري يتجاوز 8 سجل وت م / ورقة القرص overgrew الممرض داخل الأنسجة المصابة - اخذ عينات أداء فوات الأوان إصابة عينة الأنسجة بعد ظهور الاخضرار
تباين كبير بين مكررات التقنية النباتات ليست في هذه المرحلة التنموية نفسها أو تسلل عدد الأوراق غير متناسقة فقط استخدام النباتات ضمن المرحلة التنموية نفسها للعدوى. تأكيد إنبات متزامن. إصابة عدد أوراق متسقة بين النباتات المختلفة

الجدول 1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمقايسة حقنة التسلل.

الرجاء الضغط هنا لمشاهدة الجدول 2.

الجدول 2. جدول للتحليل الإحصائي لبيانات النمو الممرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مع تناقص الأراضي الزراعية المتاحة وزيادة عدد السكان، وتحدى الباحثين في جميع أنحاء العالم مع الاحتياجات الملحة لتحسين المحاصيل. العائد يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل مختلف الضغوط الحيوية وغير الحيوية. من بينها، إصابة الممرض هي واحدة من الأسباب الرئيسية لانخفاض غلة المحاصيل، مسؤولة عن ما يقرب من 12٪ من الخسائر في الولايات المتحدة وحدها 45. لحل هذه المشكلة، وقد أجريت بحوث واسعة النطاق في نبات الأرابيدوبسيس نموذج - P. syringae pathosystem لتوصيف شامل لمكونات وآليات تنظيمية من الاستجابات المناعية المصنع. هنا، فإننا نقدم لP. الأمثل syringae ES4326 حقنة تسلل الاختبار لتقييم كمي الاختلافات الطفيفة في الاستجابة المناعية مصنع على مستوى المصنع بأكمله.

على الرغم من وضعت الممرض عدة فحوصات العدوى لوصف استجابة نبات المناعة 29،35، ويوفر تسلل حقنةنظام تسيطر عليها بشكل جيد، حيث تدار كميات متساوية من العوامل المسببة للأمراض في الأنسجة المصابة. في المقايسات عدوى أخرى، بما في ذلك التلقيح تراجع ورذاذ التلقيح، يتم تطبيق الممرض إلى الأنسجة جوية بأكملها، بما في ذلك النبتات فضلا صحيح يترك 34. وقد أفيد أن النبتات من المقف نوع إيكولوجي ندسبرغ (L إيه) هي أكثر عرضة بكثير لمسببات المرض خلال تراجع التلقيح فحص، والتي قد تحرف البيانات وتقود إلى استنتاجات خاطئة على مقاومتها للأمراض الكلي 34. بالإضافة إلى ذلك، اثنين من المقايسات المذكورة أعلاه تتطلب الممرض للدخول ورقة من خلال الثغور التي تسيطر عليها عوامل البيئية المختلفة، بما في ذلك الرطوبة والضوء. تذبذب هذه العوامل تساهم في مستوى أعلى من التباين في أعراض المرض بالمقارنة مع حقنة تسلل فحص 35. لفراغ تسلل، وتشمل العوائق الرئيسية في الحاجة إلى كميات كبيرة من محلول الممرض، وصعوبةالتسلل بشكل فعال جميع الأوراق في حين تجنب الضرر، وكثافة اليد العاملة الكبيرة 29. وعلاوة على ذلك، النباتات المصابة مع الرش، وتراجع أو فراغ التلقيح هم أقل عرضة للتعافي منذ إصابة الشتلات كاملة مع الممرض. ونظرا للقيود عديدة من طرق أخرى، يبقى فحص حقنة تسلل الأسلوب المفضل لتحقيق موحد ويمكن التنبؤ به إلى حد كبير تطور المرض وتقدير دقيق لمسببات المرض لتوصيف موثوق الاستجابة المناعية داخل الورقة الحقيقية. بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار يمكن تعديلها بسهولة لتوصيف الحصانة MAMP الحفز والجهازية المكتسبة المقاومة. وبالاضافة الى ذلك، واعدا التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية يمكن تطبيقها للآثار اختبار الهرمونات النباتية متعددة، والمواد الكيميائية أو مثبطات قبل العلاج، تليها الممرض حقنة تسلل لتشريح طبقات مختلفة من النبات شبكة الإشارات المناعية أو تحديد أدوار مسار معين في مصنع المناعة استجابة. عدوى وايث جرعة زيادة من (ل 600Nm OD = 0.001) الممرض في غياب أي دفاع فتيلة العلاج قبل، والمعروفة باسم مقاومة الأمراض الاختبار (EDR) المحسن، هو تعديل مفيد آخر من هذه الطريقة التي يمكن أن تستخدم لتحديد طفرات أو الجينات مع تعزيز مقاومة المرض.

وتجدر الإشارة إلى أن حقنة تسلل فحص لا ينطبق على توصيف مرحلة ما قبل الغازية الاستجابة الدفاع منذ يتم تسليم الممرض مباشرة في الأنسجة ورقة عن طريق الثغور. إغلاق الثغور، والتي هي بمثابة حاجز مادي لدخول العوامل المسببة للأمراض، وغالبا ما يتم تشغيل لتقييد دخول الممرض على إنشاء نظام الحفز MAMP الحصانة 46. بالإضافة إلى ذلك، يساهم هرمون نباتي حمض التسقيط لإغلاق الثغور خلال مرحلة ما قبل الغازية 47. لذلك، قد الرش أو غمس طرق تثبت فائدة لتميز طبقة الثغور من الاستجابة المناعية، رغم المحاذير المرتبطةمع هذه الأنواع من التطعيمات، التي نوقشت أعلاه 29.

منذ التفاعلات مصنع الممرض يمكن تغييرها من قبل مختلف العوامل الحيوية وغير الحيوية، فمن الأهمية بمكان التركيز على الخطوات الهامة المدرجة أدناه في بروتوكول لتحقيق نجاح الإصابة والحصول على مخرجات موثوقة:

وضع النباتات والبكتيريا النشاط

النباتات نبات الأرابيدوبسيس يمكن التأكيد بسهولة عن طريق مختلف العوامل غير الحيوية، بما في ذلك درجة الحرارة دون المستوى الأمثل والجفاف والإجهاد ناضح، وتؤدي الاستجابات الخلوية التي تتداخل مع الإخراج المناعي 48. لذا، فمن الأهمية بمكان لنمو النباتات تحت ظروف النمو الأمثل وحمايتها من الضغوطات البيئية. بالإضافة إلى ذلك، منذ المرحلة التنموية للأوراق المصابة ويمكن أيضا تغيير النتيجة التجريبية، فمن الضروري أن تصيب باستمرار أوراق رقم 5 و 6 لتجنب القطع الأثرية. تتقدم على طول مراحل النمو، وإعادة مرتفعةاملساعدات ضد بعض مسببات الأمراض الخبيثة وعديم الفوعة يرتبط مع الانتقال من مرحلة إلى مرحلة التكاثر الخضري للنباتات نبات الأرابيدوبسيس. ويطلق على هذه المقاومة الديناميكية على مرحلة تنموية العمر، ذات المقاومة (ARR) 38. لتجنب التدخل ARR مع الاستجابة المناعية الحقيقية، فمن الأهمية بمكان أن تؤدي العدوى في هذه المرحلة التنموية الصحيحة كما هو مبين في البروتوكول والامتناع عن محاولة التجارب الإصابة بعد بداية المرحلة الإنجابية. وعلاوة على ذلك، واللياقة البدنية البكتيرية والنشاط يؤثر بشكل كبير من انتشار مسببات المرض داخل الأنسجة المصابة. وبالتالي، فمن المهم للشروع في الثقافة السائل البكتيرية من لوحة الثقافة يشوبه الطازج الذي لا يزيد عن 2 يوما من العمر.

مهارة تسلل حقنة

خلال تسلل حقنة، في محاولة لتجنب أي ضرر مادي على ورقة منذ اصابة التأثير المعروف للتدخل فيالاستجابة المناعية مصنع، وذلك أساسا عن طريق الجاسمونك الإشارات بوساطة حمض التي يمكن أن قمع الدفاع أثار SA-49 مسارات. بعد الإصابة، ينبغي ورقة التي كانت مخترقة يتعافى تماما إلى المظهر الجسدي العادي دون أي ضرر البصرية. للمبتدئين، ينصح بممارسة هذه التقنية باستخدام النباتات غير التجريبية أولا قبل تنفيذ PSM ES4326 حقنة تسلل الفحص.

استخراج الممرض والتخفيف

إلى قياس دقيق لنمو العوامل المسببة للأمراض، من المهم جدا لاستخراج الممرض بكفاءة من الأنسجة النباتية المصابة. مقارنة مع أساليب الاستخراج أخرى، تجانس النسيج الميكانيكية من خلال المجانسة الإنتاجية العالية المستخلصات فعالية الممرض دون فقدان عينة الأنسجة والتلوث المتبادل. وفي وقت لاحق، التخفيفات عينة ينبغي أن يتم على وجه التحديد خارجا مع معايرة موثوق ماصة متعدد القنوات لتقليل الخطأ pipetting ل.الانحراف أقل قدر ± 1 ميكرولتر في عملية التخفيف من شأنه أن يترجم إلى فرق ~ 5٪ في القياس الكمي نمو العوامل المسببة للأمراض. لمزيد من الأمثلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمقايسة حقنة تسلل، يرجى انظر الجدول 1.

في الختام، نحن تصف الأمثل PSM ES4326 حقنة تسلل فحص على نبات الأرابيدوبسيس كميا وموثوق بها لتقييم الاستجابة المناعية المصنع. مع مساعدة من هذا pathosystem، وسيتم تسريع فهم التفاعل مصنع الممرض في المختبر، وفي نهاية المطاف يتم تطبيقها لحماية المحاصيل في الحقول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MetroMix 360  Grosouth SNGMM360
Large pots Grosouth TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts Grosouth LM1206
11x 21 Flats with no holes Grosouth LM1020
11x 21 Flats with holes Grosouth LM1020H
Vinyl propagation domes Grosouth CW-221
Proteose Peptone Fisher Scientific DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate  MP Biomedicals 151946
Agar  Fisher Scientific A360-500
Streptomycin sulfate Bio Basic Inc SB0494
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific R80150
Rectangular plate Fisher Scientific 12-565-450 
MgCl2 Hexahydrate Bio Basic Inc MB0328
Glycerol Bio Basic Inc GB0232
MgSO4  Bio Basic Inc MN1988
1 ml syringe Fisher Scientific NC9992493 
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-A
Grinding tubes  Denville Scientific B1257
Caps for grinding tubes Denville Scientific B1254
Stainless steel grinding ball Fisher Scientific 2150
96-well plate  Fisher Scientific 12-556-008
Sodium Salicylate Sigma Aldrich s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) Genescript Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) Genescript Made to order
Hole puncher Staples 146308
Biophotometer plus Eppendorf 952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer Fisher Scientific 02-215-503
Accu spin micro centrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl) Eppendorf 3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl) Eppendorf 3122 000.060
Pipette (20µl) Eppendorf 3120 000.038
Pipette tips Fisher Scientific 3552-HR
Sharpie permanent marker Staples 507130
1.5 ml tube Eppendorf 22363204
Forceps Fisher Scientific 08-890

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
  3. Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
  4. Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
  5. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
  6. Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
  7. Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
  8. Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
  9. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
  10. Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
  11. Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
  12. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
  13. Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
  14. He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
  15. Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
  16. Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
  17. Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
  18. Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
  19. Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
  20. Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
  21. Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
  22. Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
  23. Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
  24. Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
  25. Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
  26. Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
  27. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
  28. Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
  29. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
  30. Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
  31. Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
  32. Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
  33. Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
  34. Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
  35. Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
  36. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
  37. Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
  38. Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
  39. Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
  40. Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
  41. Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
  42. Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
  43. Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
  44. Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
  45. Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
  46. Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
  47. Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
  48. Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
  49. León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).

Tags

العدوى، العدد 104،
بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana-الزائفة syringae</em&gt; Pathosystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C.… More

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter