Abstract
Aangezien gespecialiseerde mobiele immuuncellen, planten gebruiken hun gelokaliseerd geprogrammeerde celdood en Systemic Acquired Resistance zich te verdedigen tegen de pathogene aanval. De bijdrage van specifieke Arabidopsis gen de gehele installatie immuunreactie kan specifiek en kwantitatief bepalen van het pathogeen groei binnen het geïnfecteerde weefsel geëvalueerd. Voor meer dan drie decennia is de hemibiotrophic bacterie Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) op grote schaal toegepast als het model ziekteverwekker naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de Arabidopsis immuunrespons te onderzoeken. Ziekteverwekkers in het blad weefsel te leveren, hebben meerdere enting methoden is vastgesteld, bijvoorbeeld, spuit infiltratie, dip inenting, spray, vacuüm infiltratie en vloed inenting. Het volgende protocol beschrijft een geoptimaliseerde injectiespuit infiltratie methode om virulente Psm ES4326 leveren in bladeren van volwassenbodem geteelde Arabidopsis planten en nauwkeurig scherm voor verbeterde ziektegevoeligheid (EDS) in de richting van deze ziekteverwekker. Bovendien kan dit protocol worden aangevuld met meerdere pre-behandelingen verder te ontleden specifieke immuun gebreken binnen verschillende lagen van de verdediging van planten, met inbegrip van salicylzuur (SA) -Triggered Immuniteit (STI) en MAMP-Triggered Immunity (MTI).
Introduction
Door hun sessile aard zijn installaties voortdurend bedreigd door een overvloed aan ziekteverwekkers vertonen verschillende leefstijlen en voedingswaarde strategieën 1. Om een eerste benadering, biotrofe ziekteverwekkers behouden hun gastheer in leven om voedingsstoffen te halen, terwijl necrotrofe ziekteverwekkers actief geheim toxines en enzymen aan gastheerweefsel doden en voeden zich met de dode cellen 1. Een andere groep van ziekteverwekkers, genaamd hemibiotrophs begint hun infectie uiteraard met biotrofe podium en verschuift naar de necrotrofe podium op een bepaalde drempel van pathogeen accumulatie 2 bereiken. Om zich te verdedigen tegen deze micro-organismen, planten hebben een ingewikkelde aangeboren immuunsysteem uitgerust met meerdere toezichtmechanismen het pathogeen aanval detecteren en trigger ontwikkeld gelokaliseerde geprogrammeerde celdood 3 en systemische verworven resistentie (SAR) 4. Lopend onderzoek is gericht op het karakteriseren van de essentiële signaling componenten en cross-gesprekken binnen de plant immuunsysteem 5.
Zoals in de "Zig-Zag" model 5 voorgesteld, de eerste laag van de plant aangeboren immuunrespons vereist de aanwezigheid van plasma-gelokaliseerde receptoren Pattern Recognition (PRRS) om de invasie van microben te detecteren. PRRS kunnen Microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs) erkennen en vast MAMP-Triggered Immunity (MTI) 6. Naast het induceren van een transcriptionele opregulatie van genen die coderen voor antimicrobiële PR proteïnen 7, MTI leidt tot een verscheidenheid van gebeurtenissen die de groei van pathogenen, waaronder de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en Reactive stikstofspecies (RNS), afzetting van callose aan de celwand arrestatie alsook de activering van meerdere kinase signaalwegen 8.
Tot nu toe zijn verscheidene MAMPs geïdentificeerd aan MTI veroorzaken bij Arabidopsis, waaronder bacteriële flg22 9 10 (18 aminozuren van de bacteriële vertaling elongatiefactor Tu) en een structureel celwandcomponent Peptidoglycanen 11. Om een succesvolle infectie vast te stellen, hebben een aantal gespecialiseerde pathogenen de mogelijkheid om geheime virulentie effector eiwitten geëvolueerd in de intracellulaire en intercellulaire ruimten, en dus MTI onderdrukken en trigger Effector-Triggered Susceptibility (ETS) 12,13. Zo kan virulentie effectoren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) fosforylatie cascades van MTI inactiveren om de ziekteontwikkeling bij het geïnfecteerd weefsel 14-16 induceren. Tijdens de dynamische co-evolutie tussen gastheren en pathogenen, planten ontwikkelde ook de tegenaanval strategie om de effector-eiwitten herkennen en verzwakken de ziekteverwekker virulentie moleculen 17. Deze directe of indirecte effector erkenning wordt gemedieerd door ziekteresistentie (R) 18 eiwitten. De meeste tboord zijn lid van de NB-LRR (Nucleotide Binding en leucine-rijke herhalingen) gezin 19. De perceptie van een avirulent effector door een R-eiwit lokt een sterkere en bredere immuunrespons gekenmerkt als Effector-Triggered Immunity (ETI) 20. Naast het induceren van de expressie van verdedigingsgenen 21 en de productie van metabolieten verdediging 22, ETI leidt vaak tot een snelle gelokaliseerde geprogrammeerde celdood genoemd overgevoeligheidsreactie (HR) het pathogeen mag niet in het aangrenzende weefsel 3 te beperken.
Naast de gelokaliseerde geprogrammeerde celdood 23 planten zijn in staat tot het initiëren van een langdurige en systeembrede immuunreactie genoemd Systemic Acquired Resistance (SAR) 4. Bij provocatie met biotrofe pathogeen, plantencellen leiden tot de biosynthese en de accumulatie van een endogeen plantenhormoon salicylzuur (SA) en PR proteïnen in zowel lokale en systemische weefsels 24. DezZijn werkwijze wordt een verhoogde staat van paraatheid bereikt de geïnfecteerde bladeren die het mogelijk maakt de montage sneller verdedigingsresponsen bij een volgende infectie door een breed spectrum van pathogenen 24. SA en zijn synthetische analogen zoals benzo- (1,2,3) -thiadiazol-7-carbothiozuur S methyl ester (BTH) en 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) kunnen chemisch induceren salicylzuur (SA) -Triggered Immunity (STI) op externe applicatie 24. Nonexpressor van pathogenese verwante genen 1 (NPR1) wordt voorgesteld als een van de SA receptoren en werkt als een belangrijke transcriptionele regulator during SA-gemedieerde verdediging respons in zowel lokale als systemische weefsels 21,25,26 zijn. Er is overtuigend aangetoond dat NPR1 nodig voor SAR inrichting en het verlies van NPR1 leidt tot dramatische gevoeligheid richting Pseudomonas syringae 25.
Om op grote schaal te karakteriseren van de moleculaire bijdrage van plantaardigecomponenten in de plant-pathogeen interacties, zijn meerdere bioassays ontwikkeld om specifieke afweer gebeurtenissen te meten, met inbegrip van ROS barsten 27, callose afzetting 28, defensie genen expressie en accumulatie van hun eiwitproducten 21. Hoewel deze individuele testen inzicht kunnen geven in een specifieke vorm van de plant immuunrespons, geen ervan zijn echter in staat de volledige afweerreactie op het hele plant niveau te vertegenwoordigen. Omgekeerd kwantificering van pathogene groei na infectie geeft een algemene inschatting van de immuunrespons op het organismale niveau. Daarom is de ontwikkeling en optimalisatie van een nauwkeurige en zeer gestandaardiseerde pathogeen inoculatie test is kritisch voor tanken onderzoek en ontdekkingen op het Arabidopsis immuunreacties.
Pseudomonas syringae, een Gram-negatieve bacterie, werd geïdentificeerd als fytopathogenen kunnen veroorzaken ziekte bij een reeks van plantaardige gastheren Arabidops29 is. Als modelplant-pathogeen-systeem, de Arabidopsis - P. syringae interactie is op grote schaal toegepast om de moleculaire mechanismen te begrijpen onderliggende verdediging van planten reacties 29. Tot nu toe meer dan 50 P. syringae pathovars zijn geïdentificeerd op basis van hun vermogen om verschillende plantensoorten 30 infecteren . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 en P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 zijn de twee meest gebruikte en uitgebreid gekarakteriseerd virulente stammen. Afgezien van wordt erkend door de plant en triggeren de MTI reactie, Pst DC3000 en Psm ES4326 kunnen uitscheiden virulente effector eiwitten aan MTI onderdrukken en leiden ETS aan de pathogeen groei 31,33 bevorderen.
Functioneel ontleden de interactie tussen Arabidopsis en P. syringae, multiple0; pathogeeninfectie werkwijzen zijn ontwikkeld op basis van het pathogeen levering aanpak. Voor-grond geteelde planten, kan pathogeen worden geleverd met een spuit infiltratie, vacuüm infiltratie, dip inenting en spuit inenting 29,34. Onlangs werd seedling vloed inoculatie assay ontwikkeld voor grootschalige schermen voeren op weefselkweekplaten volwassen jonge Arabidopsis planten 35. Spuit infiltratie, als een van de meest gebruikte aanpak levert handmatig organisme in de apoplast via natuurlijke openingen blad genoemd huidmondjes 29. Door deze benadering gelijke hoeveelheden P. syringae kunnen worden geïnfiltreerd in de geïnfecteerde blad en de kracht van planten immuunrespons is omgekeerd gecorreleerd met de pathogeen groei levels. Daarom kwantificering van pathogeen groei dient als een optimale aanpak van het immuunsysteem te evalueren op het hele plant niveau. Bovendien kunnen spuit infiltratie lokale en systemische weefsels te onderscheiden, die be in het karakteriseren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen SAR 36 van toepassing.
In de volgende protocol beschrijven we een geoptimaliseerde spuit infiltratie test met Psm ES4326 tot Arabidopsis mutanten voor verbeterde ziektegevoeligheid (EDS) te screenen. Dit protocol zal twee Arabidopsis genotypen in dienst: een wild-type ecotype Columbia-0 (Col-0) planten (controle) en npr1-1 verlies-van-functie mutanten (hypersusceptible) dat zal worden geïnfecteerd met virulente bacteriële stam Psm ES4326 37. De npr1-1 mutant draagt een puntmutatie in de ankyrine-repeat consensussequentie van NPR1 molecuul, dat de sterk geconserveerde histidine tot tyrosine verandert en maakt het eiwit niet-functioneel 25. Daarnaast is een aantal modificaties van de injectiespuit infiltratie assay beschreven die kwantificering van defecten in specifieke lagen van de immuunrespons, zoals MTI en STI toestaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende tekst beschrijft een stapsgewijze protocol te verrichten geoptimaliseerd Psm ES4326 spuit infiltratie test in Arabidopsis. Bekende procedures voor deze proef zijn weergegeven in een vereenvoudigd stroomdiagram (figuur 1).
1. Plant Groei Voorwaarden
- Sow zaden
- Bereid 2 potten (4 in diameter, 3,75 in lange) losjes gevuld met grond en water potten door ze te weken uit de bodem O / N voor het aftappen van het overtollige water.
- Zaaien 50-100 Arabidopsis zaden wildtype Col-0 of npr1-1 mutant op elke pot met een gevouwen 70 mm gewicht plaat of ander papier.
- Dek de pot met water bespoten transparante koepel de relatieve vochtigheid oplopen tot 80-90% (Figuur 2A).
- Incubeer de pot bij 4 ° C gedurende 72 uur om voor volledige stratificatie en synchrone ontkieming.
- Breng de pot aan de standaard groeicondities (12 uur licht/ 12 uur donker, 21 ° C, lichtintensiteit 100 umol / m2 / sec, relatieve vochtigheid 40%) zodat de zaden ontkiemen. Crack de koepel naar een 2-3 genereren onmiddellijk openen na de overdracht aan de groei ruimte, die zal helpen voorkomen dat condensatie van water.
- Wanneer het eerste echte blad van de grootte van 2-3 mm lengte bereikt, transplantatie de zaailingen uit de pot een 72-putjes vlakke gevuld met grond.
- Gebruik een vinger of een 1 ml pipet een 1-in diepe depressie te creëren in het midden van het bodemoppervlak van de flat.
- Zachtjes scheiden individuele zaailingen met zo weinig wortel schade mogelijk. Pick-up zorgvuldig zaailingen die intact wortels met een pincet te hebben.
- Plaats een enkel gescheiden zaailing samen met de aanhangende grond klomp transplantatie schok te minimaliseren in de depressie en zachtjes langs de omliggende grond om de depressie te vullen. Gooi de extra zaailingen en bodem in biologisch gevaarlijk afval container en afvoeren in overeenstemmingmet de plaatselijke richtlijnen voor afvalverwerking biologisch gevaarlijk afval.
- Zaailingen overgebracht water van boven en bedekken het vlak met een in water gesproeid transparante koepel 80-90% vochtigheidsgraad te handhaven. Houd de koepel voor 3 dagen, dan barst de koepel in de ochtend van dag 4 en volledig te verwijderen aan het einde van die dag.
Opmerking: Zaaien kan ook worden uitgevoerd door stratificatie zaden in 1,5 ml centrifugebuizen met 1 ml 0,1% agar gedurende 48 uur bij 4 ° C, gevolgd door het overbrengen van 2-3 zaden met een glazen pipet naar een 72-putjes vlakke gevuld met grond. Flats moeten worden bedekt met een doorzichtige koepel die een week kan worden verwijderd na het ontkiemen. Extra zaailingen kunnen worden verwijderd om slechts één zaailingen per putje verlaten.
- Waterplanten elke twee dagen door het weken flats in 1 in water gedurende 20 min, laat vervolgens het overtollige water.
Opmerking: Het tijdsinterval voor het besproeien van planten is afhankelijk van de luchtvochtigheid groei kamer en moet vastberaden based op voortdurende observatie van de gebruiker plantengroei faciliteit. Controleer planten dagelijks om ervoor te zorgen dat ze goed bewaterd. Als slechts enkele plekken liggen te drogen, water die planten uit de top met een spuit fles. - Voer pathogeeninfectie testen (stap 3-5) met planten die aan of nabij ontwikkelingsstadium # 3,50 (bij rozet grootte is 50% uiteindelijke grootte), die 3-5 weken oud overeenkomt afhankelijk van de groeiomstandigheden (fotoperiode, temperatuur). Niet planten na bloeiwijze opkomst (fase # 5) te wijten aan het begin van leeftijd gerelateerde weerstand 38,39 infecteren.
2. Voorbereiding van Cultuur Media en Platen
- Maak 1 L B (KB) vloeibaar medium King's. Roer 20 g proteosepepton en 2 g dibasisch kaliumfosfaat trihydraat met een magnetische roerstaaf met 1000 ml gedeïoniseerd H2O tot er geen zichtbare pellet. Aliquot 100 ml in 150 ml glazen flessen en autoclaaf op een 20-min vloeistof cyclus.
- Bereidencultuur platen met KB vast medium.
- Roer 20 g proteosepepton, 2 g dibasisch kaliumfosfaat trihydraat en 15 g Agar met 1000 ml gedeïoniseerd H2O Autoclaaf.
- Afkoelen het medium op een magnetische roerplaat totdat het is cool om aan te raken om toekomstige condensatie minimaliseren en afbraak van antibiotica te voorkomen. Voeg 18 ml steriel 80% glycerol en 5 ml steriel 1 M MgSO4 aan het medium. Aangezien Psm ES4326 draagt resistentie tegen streptomycine, voeg streptomycine in de afgekoelde medium tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug ml - 1.
- Giet de platen. Bereid twee verschillende maten van de KB media platen: 100 mm x 15 mm en 150 mm x 15 mm petrischaaltjes. De kleinere petrischaal met medium dient als de primaire bacterie kweekplaat en het grotere petrischaal dient als bacteriën tellen plaat.
Opmerking: Om de bacteriën te tellen platen, kan rechthoekig gevormde platen worden gebruikt voor het verminderenverbruiksgoederen kosten sinds twee keer zo veel behandelingen per plaat kan worden uitgezet in vergelijking met traditionele ronde platen.- Giet de platen vóór de infectie experiment. WINKEL KB medium platen bij 4 ° C gedurende 2-3 maanden na streptomycinesulfaat geleidelijk verliest de antibiotische activiteit 40.
3. Enhanced ziektegevoeligheid (EDS)
- Dag 1 - Streak bacteriën op de plaat
- Twee dagen voor de EDS-test, streak Psm ES4326 van -80 ° C glycerol voorraad op een KB-Strep bacteriële cultuur plaat en incubeer bij 28 ° C gedurende 24-48 uur.
- Dag 2 - initiëren vloeibare cultuur en waterplanten
- Inleiding van de vloeibare cultuur in een steriele reageerbuis met 4 ml vloeibare KB medium dat 50 ug ml - 1 streptomycine en schudden bij 250 rpm, 28 ° CO / N.
Opmerking: Voor EDS infectie assay, met behulp van 6 planten per genotype is aan te bevelened. Voor STI en MTI assays, zijn 6 planten per genotype per behandeling aanbevolen. Voor de bacterie entmateriaal, wordt aanbevolen een verse vloeibare kweek met een optische dichtheid gebruiken λ 600nm tussen 0,3 en 0,6. - Markeer de bladstelen van bladeren nummer 5 en 6 met een stomp einde waterproof marker voor gemakkelijke identificatie van geïnfecteerde weefsel bij bemonstering (figuur 1). Om de opening van huidmondjes verbeteren en de ingang van pathogeen oplossing in het blad te vergemakkelijken, de planten water goed door het weken de vlakke van de bodem voor 20 min, laat vervolgens het overtollige water.
Let op: U kunt ook betrekking hebben op de flat met een transparante koepel en laat deze in het water voor 2-4 uur op de stomatale opening te verhogen. - Dag 3 - Pathogen verdunning en spuit infiltratie
Opmerking: pathogeeninfectie de ochtend- uren optimaal pathogeen proliferatie en ontwikkeling van de meest uitgesproken ziektesymptomen op gevoelige genotypes. Moeite doen om het infecteren houdenion timing consistent effect van circadiane ritmen en diurnale genregulatie 41,42, hetgeen helpt de variatie tussen experimentele replicaties elimineren.- Pellet de bacteriële kweek in een microcentrifuge 1,5 ml buis bij 9600 xg gedurende 2 min bij RT en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de bacteriële pellet met 1 ml steriel 10 mM MgCl2.
Opmerking: Magnesium kationen kan de beweeglijkheid en de hechting van P. verbeteren syringae 43. Of gebruik MgSO 4 bij dezelfde concentratie. Steriel water een aanvaardbaar alternatief voor het Mg zoutoplossingen. - Verdun de bacteriesuspensie met 9 ml van 10 mM MgCl2 in een 50 ml centrifugebuis en meet de optische dichtheid (OD) van bacteriën met een spectrofotometer bij λ = 600 nm. Verdun de bacteriën met 10 mM MgCl2 tot de uiteindelijke OD 600 nm = 0,0002 voor EDS infectie assay.
- Infiltreren het bladmet 1 ml stomp uiteinde naaldloze injectiespuit (algemeen bekend als de insulinespuit) de verdunde bacteriële oplossing bevat.
- Vul niet de spuit tot de volledige capaciteit. Vullen met 0,5-0,6 ml mogelijk te maken voor een veel betere controle tijdens de infiltratie proces.
- Maak de onderkant van het blad bovenop wijsvinger en vervolgens voorzichtig de bladeren positie met behulp van de duim passen. Plaats de spuit verticaal tegen het bladoppervlak om ervoor te zorgen dat de druk gelijkmatig wordt verdeeld. Probeer de hoofdnerf gebied tijdens de infiltratie te voorkomen blad schade te beperken.
- Duw de zuiger langzaam naar de bacteriële oplossing te infiltreren; vloeistof binnenkomst in de bladmesofylcellen wordt gevisualiseerd zoals aangegeven door de donkere bladkleur. Poging om het gehele oppervlak van het blad infiltreren. Als dit niet wordt bereikt in een enkele poging, kies een andere infiltratie plek en herhaal het bovenstaande totdat het gehele bladoppervlak is bedekt beschreven acties.
- Eenmaal voltooid, voorzichtig deppen het blad met absorberend weefsel om de extra ziekteverwekker oplossing te verwijderen. Inspecteer de geïnfecteerde blad weefsel voor schade.
Opmerking: De ronde spuit beeld niet getoond na de infiltratie is voltooid. - Laat de geïnfiltreerde planten te drogen voor 1-2 uur alvorens terug te keren ze in hun oorspronkelijke groeiomstandigheden. Vervolgens spuit een heldere koepel met water en bedekken de geïnfecteerde planten gedurende 2 uur, daarna barst de koepel te genereren 2-3 openen en laat het op gedurende de rest van de infectie experiment.
Let op: Omdat P. syringae is geen lucht pathogeen, is er geen verspreiding van het infectieuze agens andere planten gekweekt op dezelfde locatie. Echter, als een extra voorzorgsmaatregel, vermijd contact tussen geïnfecteerde planten en andere experimentele installaties in de buurt. Die de flat met een transparante koepel zal de ziekteverwekker virulentie verhogen en te versnellen progressie van de ziekte. Denodig voor deze stap en de optimale duur van de periode bekleding moet worden bepaald op basis van de vochtigheidsgraad van de gebruiker plantengroei faciliteit.
- Pellet de bacteriële kweek in een microcentrifuge 1,5 ml buis bij 9600 xg gedurende 2 min bij RT en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de bacteriële pellet met 1 ml steriel 10 mM MgCl2.
- Dag 5 - Pre-droog de media platen
- Neem de 150 mm x 15 mm KB platen uit de koude opslag eenheid en droog alle reeds bestaande condensatie van water op het bord. Droge platen door ze bij kamertemperatuur ongeveer 24 uur. Om dit proces te versnellen, plaats ze in een laminaire stroming kap met de deksels gebarsten 30-60 min.
Opmerking: Deze stap is essentieel voor de vorming van circulaire druppel op het oppervlak van de plaat in de volgende stap.
- Neem de 150 mm x 15 mm KB platen uit de koude opslag eenheid en droog alle reeds bestaande condensatie van water op het bord. Droge platen door ze bij kamertemperatuur ongeveer 24 uur. Om dit proces te versnellen, plaats ze in een laminaire stroming kap met de deksels gebarsten 30-60 min.
- Dag 6 - Het kwantificeren van de pathogeen groei
Opmerking: De volgende pathogenen kwantificering procedure kan worden uitgevoerd op vroegere tijdstippen na infectie met gelijke hoeveelheden bacteriën worden afgegeven in het blad, vooral wanneer planten bladmorfologie veranderd bevestigen.- Verwerk de geïnfecteerde weefsel na de opkomstchlorose aangegeven door de vergeling van het geïnfecteerde weefsel in de gevoelige genotypes, maar vóór de ontwikkeling van necrotische laesies (figuur 2B).
Opmerking: Voorgestelde bemonsteringstijd drie dagen na de inoculatie pathogeen. Aangezien pathogeen groei is afhankelijk van een aantal omgevingsfactoren, de duur van de incubatie kan variëren binnen een bereik van 2 ½-3 ½ dagen en moet worden bepaald door zorgvuldige observaties van de infectie progressie gebruiker plantengroei faciliteit.- Bereid 6 slijpen buizen voor elk genotype (figuur 1). Plaats een roestvrij staal slijpen bal en voeg 500 ul steriele 10 mM MgCl2 in de elke buis.
- Maak de besmette blad van de plant en punch een blad schijf met een 1-hole papier punch (figuur 1).
Opmerking: Om de sampling error minimaliseren, probeer elk bemonsterd blad punch op dezelfde positie. Bemonstering van het blad schijf uit de topvan het blad wordt aanbevolen. - Willekeurig plaatsen 2 bladschijven (van twee verschillende planten) in elkaar slijpen buis met behulp van een tang.
- Verzegelen de buis en homogeniseren van het weefsel met een high-throughput homogenisator op maximale snelheid (1600 slagen per minuut) gedurende 10 min. Herhaal deze procedure indien nodig totdat het weefsel is goed gehomogeniseerd en de oplossingen die groen te wijten aan chlorofyl vrijlating uit de besmette bladeren.
- Tijdens het wachten op de homogenisering, vul de eerste 6 rijen van een 96-well cultuur plaat met 180 ul 10 mM MgCl2 met behulp van een multi-channel pipet en een pipetteren reservoir.
- Na het malen overdracht 20 ul Ondergrond weefselsuspensie in de eerste rij van de 96-well plaat en meng door herhaaldelijk pipetteren vloeistof en neer. Als kleine fragmenten van weefsel verstoppen de tip, klem hem met 2-3 mm te helpen het juiste volume van de oplossing te verwerven.
- Om voldoende ruimte voor de druppel te verstrekken over de top of de plaat ruimte het weefsel van verschillende genotypen in alternatieve rijen (figuur 1). Om een tien-voudige seriële verdunning te bereiden, overdracht 20 ul vloeistof in de tweede rij en herhaal deze procedure tot de zesde verdunning.
- Overdracht 20 ul van de oplossing uit de 96-well plaat op de 150 mm x 15 mm KB plaat behulp verdeeld pipetpunten (figuur 1). Werkzaamheden van de verdunde suspensie naar de meest geconcentreerde.
Opmerking: Vanuit meest verdund meest geconcentreerde overbodig is pipetpunten tussen de verdunningen wijzigen. Wanneer de plaat goed voorgedroogd, dient de doorgegeven druppel intact bovenop het medium blijven tot geabsorbeerd (gewoonlijk 15-30 minuten). Droogtijd varieert met de RT en vochtigheid. - Droog de plaat bij RT met deksel gebarsten. Zodra geen vloeistof meer kan worden waargenomen op de plaat oppervlak, sluit het deksel, omkeren en incubeer de plaat bij RT of een 28 ° C incubator.
- Incubeer platen voor 40-60 uur totdat de kolonies zichtbaar. Controleer of de groei van de platen geeft de voorspelbare 10-voudige afname van kolonievormende eenheden (cfu) (figuur 2C). Tel de bacteriën voordat ze overwoekeren en kolonies fuseren. Bepaal het aantal bacteriën in de laagste verdunning overlappende kolonies heeft. Gewoonlijk de gewenste verdunning te tellen wordt tussen 10-50 kolonies bevatten.
Opmerking: Variatie aanwezig bij de technische repliceert zijn; derhalve de laagste verdunning van elke duplo afzonderlijk bepaald. - Om de niveaus van bacteriële proliferatie berekenen document het nummer van de regel (R) en het aantal bacteriën in schriftelijk elke technische duplo (T). Bepaal het aantal kolonievormende unit - cfu / bladschijf door de formule: cfu / bladschijf = (T × 10 R / 20) x 500/2
- Typ de gegevens in de volgende spreadsheet sjabloon om produce een grafiek (figuur 1) (voor spreadsheet data-analyse template-bestand, zie tabel 2). Elk gegevenspunt wordt weergegeven als het gemiddelde van zes technische replicaten op een logaritmische schaal. Foutbalken 95% betrouwbaarheidsinterval van het gemiddelde (n = 6).
Opmerking: Het berekenen van 95% betrouwbaarheidsintervallen te worden aangepast aan het aantal technische replicaten.
- Verwerk de geïnfecteerde weefsel na de opkomstchlorose aangegeven door de vergeling van het geïnfecteerde weefsel in de gevoelige genotypes, maar vóór de ontwikkeling van necrotische laesies (figuur 2B).
- Inleiding van de vloeibare cultuur in een steriele reageerbuis met 4 ml vloeibare KB medium dat 50 ug ml - 1 streptomycine en schudden bij 250 rpm, 28 ° CO / N.
4. SA-Triggered Immunity (STI)
- Dag 1: Volg dezelfde procedure zoals beschreven in stap 3.1.
- Dag 2: Naast de planten water en inleiding van de vloeibare bacteriële kweek (stap 3,2), resistentie induceren door externe toepassing van SA derivaat natriumsalicylaat 21.
Opmerking: Pure SA heeft een slechte oplosbaarheid in water en vereist voorafgaande pH aanpassen, dus het is niet aanbevolen voor deze test.- Om SA-gemedieerde verdediging tegen P. induceren syringae en prime de planten voor toekomstige infectie 21,24, spuiten planten met een fijne nevel van 1 mM natriumsalicylaat of H 2 O (als mock) 16-24 uur voordat de ziekteverwekker infectie.
- Dag 3: Bereid ziekteverwekker verdunning tot OD 600 nm = 0.001 en duw de bacteriën in de gehele bladoppervlak door spuit infiltratie (stap 3.3).
- Dag 6: Voor pathogeen kwantificering en telproces, volgt u de procedure zoals beschreven voor de EDS-test (Stappen 3.4 en 3.5). Plaat en tel de H 2 O en natriumsalicylaat - voorbehandelde monsters afzonderlijk. Voor wildtype Arabidopsis, wordt een 1-2 log vermindering pathogeen groei verwacht in het natriumsalicylaat - voorbehandeld planten.
5.-MAMP Triggered Immunity (MTI)
Opmerking: In deze test gebruiken wij Arabidopsis wildtype Col-0 en mutant FLS2 en efr planten. FLS2 en EFR zijn plasma-gelokaliseerde Pattern Recognition Receptoren (PRRS) dat flg22 en elf18 kan herkennen, respectively 9,10. Verlies van elk PRR resulteert in de ongevoeligheid voor het specifieke type MAMP, hetgeen wordt aangegeven door ongewijzigde pathogeen groei van de mutant volgende externe MAMP voorbehandeling en spuit infiltratie PSM ES4326.
- Dag 1 en 2: Volg dezelfde procedure als beschreven in stap 3,1 en 3,2.
- Dag 3: MAMP voorbehandeling en pathogeeninfectie
- Om de MAMP-Triggered immuniteit vast te stellen, voor te bereiden 1 uM oplossing van flagelline epitoop flg22 of EF-Tu epitoop elf18 en spuit-infiltreren het in het gehele bladoppervlak 4 uur voordat de pathogeen infectie (Stappen 3.3.3-3.3.6). Dit zal zorgen voor inductie van MAMP gemedieerde afweer tegen P. syringae en prime de planten voor toekomstige infectie 6,37.
Opmerking: publiek beschikbaar microarray gegevens bleek de maximale transcriptie herprogrammering van MAMP-responsieve genen gebeurt er 4 uur na flg22 of elf18 behandeling 37,44. Aldus 4 uur is aanbevolenduur van de MAMP voorbehandeling die resulteert in het bereiken van een duidelijk verschil in de pathogeen groei tussen MAMP behandeld Col-0 en FLS2 en efr mutanten. - Verwijder de extra MAMP oplossing met absorberend tissue en laat de planten blootgesteld aan de vloeistof absorptieproces in het blad versnellen. Ter compensatie van de verwonding vanaf injectiespuit druk infiltratie, infiltreren H 2 O in de bladeren van controleplanten.
- Bereid pathogeen verdunning tot OD 600 nm = 0,001 en duwen de bacteriën in het totale bladoppervlak van MAMP / H 2 O voorbehandeld leaf injectiespuit infiltratie (stap 3,3).
- Om de MAMP-Triggered immuniteit vast te stellen, voor te bereiden 1 uM oplossing van flagelline epitoop flg22 of EF-Tu epitoop elf18 en spuit-infiltreren het in het gehele bladoppervlak 4 uur voordat de pathogeen infectie (Stappen 3.3.3-3.3.6). Dit zal zorgen voor inductie van MAMP gemedieerde afweer tegen P. syringae en prime de planten voor toekomstige infectie 6,37.
- Dag 6: Voor pathogeen kwantificering en telproces, volgt u de procedure zoals beschreven in stap 3.4 en 3.5. Plaat en tel de H 2 O en MAMP-voorbehandelde monsters afzonderlijk. In wild-type Arabidopsis, een 1-2 log reductie in pathogeen groei wordt verwacht in de MAMP voorbehandeld planten, met ietwat sterkeER vermindering gemedieerd door flg22 vergelijking met elf18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol dat we hier beschrijven vertegenwoordigt een geoptimaliseerde P. syringae spuit infiltratie assay om de immuunrespons in Arabidopsis planten kwantitatief te evalueren. Zoals weergegeven in figuur 1, wordt de injectiespuit infiltratie van Psm ES4326 gevolgd door pathogeen extractie en kwantificering via seriële verdunningen en kolonies enumeration.
Zoals beschreven in stap 3 in het protocol tekst kan Enhanced ziektegevoeligheid (EDS) tegen Psm ES4326 beoordeeld door infectie met een entstof met een OD = 0,0002. Zoals getoond in figuur 3, de zeer gevoelige npr1-1 mutanten ongeveer 2,5 log (300 maal) meer pathogeen groei in vergelijking met het wildtype Col-0 planten. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, kan de npr1-1 planten ondersteunen tot 3,0 log meer bacteriegroei dan Col-0, met de meest voorkomende resultaten binnen het bereik van 1,5-2,5 log. Daarom is deze EDS assay levert een breed venster verschil, waarbij de onderzoekers in staat om hun Arabidopsis mutanten en transgenen plaatsen naar kandidaatgenen mogelijk betrokken zijn bij de installatie immuunrespons te identificeren.
Naast het bepalen van EDS, PSM ES4326 injectiespuit infiltratie assay worden aangepast voor verschillende lagen van de immuunrespons ontleden. Salicylzuur-Triggered immuniteit te evalueren, is externe toepassing van de chemische natriumsalicylaat gebruikt om de immuunrespons, die wordt gekwantificeerd door het pathogeen groei (figuur 4A) activeren. Het verlies van NPR1, die functioneert als SA receptor en de belangrijkste co-transcriptionele regulator van SA-afhankelijke doelgenen, leidt tot ongevoeligheid voor exogene toediening van salicylzuur derivaten. Deze ongevoeligheid voor SA wordt aangetoond door ongewijzigde pathogeen groei van de npr1-1 natriumsalicylaat voorbehandelde planten in tegenstelling tot een duidelijke vermindering van de Col-0 planten (20 maal minder Pathog en op natriumsalicylaat toepassing) (Figuur 4B).
Om de MAMP Triggered Immunity, voorbehandeling karakteriseren flg22 of elf18 werd uitgevoerd zoals getoond in figuur 5A. To-flagelline geactiveerd immuniteit karakteriseren, Col-0 en FLS2 mutante planten worden gebruikt. FLS2, een gelokaliseerde receptor-achtig kinase, herkent flg22 en triggers MTI 9. Zoals getoond in figuur 5B, de-flg22 behandelde Col-0 planten steunde ~ 1 log (10 keer) vermindering van de bacteriële populatie, terwijl de FLS2 mutante planten niet de bacteriegroei beperking effect teweegbrengen. Ook het verlies van EF-Tu receptor EFR in de EFR mutante planten leidt tot ongevoeligheid voor voorbehandeling elf18 zoals aangetoond door ongewijzigde pathogeen groei na de elf18 voorbehandeling (figuur 5B).
iles / ftp_upload / 53.364 / 53364fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van Psm ES4326 spuit infiltratie test op Arabidopsis planten. Takken nummer 5 en 6 van de volwassen-bodem gegroeid Arabidopsis planten zijn gemarkeerd en geïnfecteerd met Psm ES4326 door de spuit infiltratie. Na de opkomst van de symptomen van de ziekte, los te bladeren en oogst bladschijven voor tissue homogenisering. Gunstig gehomogeniseerde weefsel wordt serieel verdund in 96-wells platen alvorens op een plaat te tellen bacteriën. Na kolonies opkomst op de plaat, tel het aantal bacteriën en verwerken van de gegevens naar een grafiek te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger procedures van de EDS-test.(A) De bakken worden bedekt met een water besproeid transparante koepel na zaaien. (B) Representatieve symptomen op Col-0 en npr1-1 bladeren onderworpen aan EDS assay (OD 600 nm = 0,0002) 3 dagen na inoculatie. Opmerking ernstige chlorose op npr1-1 en de bijna normale verschijning van Col-0. (C) Seriële verdunningen van Psm ES4326 groeien op KB (50 ug / ml streptomycine) media bord nadat ~ 45 h incubatie. Vijf verdunningen zichtbaar zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve resultaten van de test EDS Psm ES4326 groei (kolonievormende eenheden -. Cfu / bladschijf, expressed op een log schaal) werd gekwantificeerd in 4 weken oude Col-0 en npr1-1 planten 3 dagen na inenting (OD 600 nm = 0,0002). Fout balken geven 95% betrouwbaarheidsintervallen van de gemiddelde (n = 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve procedure en de resultaten van de assay STI. (A) Schematische weergave van het salicylzuur-Triggered Immunity (STI) assay. (B) salicylzuur-Triggered Immuniteit werd gekwantificeerd op basis van pathogene groei van planten voorbehandeld met 1 mM natriumsalicylaat of H 2 O 16 uur voorafgaand aan Psm ES4326 spuit infiltratie (OD 600 nm = 0,001). Pathogeen groei werd gekwantificeerd 3dagen na inoculatie. Fout balken geven 95% betrouwbaarheidsintervallen van de gemiddelde (n = 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Representatieve procedure en de resultaten van de MTI assay. (A) Schematische weergave van de MAMP-Triggered Immunity (MTI) assay. (B) MTI werd gekwantificeerd door pathogeen groei van planten voorbehandeld met 1 uM oplossing van flg22, elf18 of H 2 O (als controle) 4 uur voorafgaand aan Psm ES4326 spuit infiltratie (OD 600 nm = 0,001). Pathogeen groei werd gekwantificeerd 3 dagen na inenting. Fout balken geven 95% betrouwbaarheidsintervallen van de gemiddelde (n = 6). Klik hijopnieuw voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Probleem | Mogelijke oorzaken | Aanbevolen acties |
| Geen bacteriegroei in het vloeibare medium na O / N kweek | Verminderde bacteriën activiteit | Initiëren vloeibare cultuur van een nieuw weggeschoten plaat |
| Cirkelvormige spuit indruk presenteert op het blad na spuit infiltratie | Te veel druk tijdens infiltratie | Verminder de pressue during infiltratie |
| Gedeeltelijke spuit indruk presenteert op het blad na spuit infiltratie | Ongepaste positionering van de injectiespuit | Stel de spuit verticaal tegen het bladoppervlak worden geplaatst |
| Blad verwelkt wthtin paar uur na infiltratie | Teveel pathogeen oplossing wordt geïnfiltreerd in het blad | Stop infiltrating onmiddellijk na de gehele bladoppervlak wordt donkerder groen van kleur |
| Geen ziektesymptomen drie dagen na infectie | Luchtvochtigheid is te laag voor ziekteverwekker te vermenigvuldigen | Verhoging van de luchtvochtigheid, waar geïnfecteerde planten worden gehandhaafd |
| Pathogeen komt necrotrofe podium op of vóór 3 dpi | Onjuiste concentratie van pathogeen-oplossing | Gebruik OD 600 nm = 0,0002 voor EDS-test; bevestig verdunning met Onafhankelijk spectrofotometer |
| Druppels samen te voegen op de top van bacteriën tellen plaat | Bacteriën tellen plaat is niet goed gedroogd | Pre-droog de plaat O / N voor gebruik |
| Pathogeen verdunning vormt geen 10-voudige reductie | Verdunning wordt niet nauwkeurig uitgevoerd | Gebruik een goed gekalibreerd multi-channel pipet voor het overbrengen van vloeistof; bevestigen dat alle vloeistof afgegeven |
| Pathogeen groei in het wild type dan 8 log kve / bladschijf | Ziekteverwekker overgrew binnen het geïnfecteerde weefsel - steekproeven uitgevoerd te laat | Monster besmet weefsel na het ontstaan van chlorose |
| Grote variatie tussen technische repliceert | Planten zijn niet in hetzelfde ontwikkelingsstadium of geïnfiltreerd blad nummer is inconsistent | Gebruik alleen planten in hetzelfde ontwikkelingsstadium voor infectie. Bevestig synchrone ontkieming. Infecteren consistente aantal bladeren tussen de verschillende planten |
Tabel 1. Problemen oplossen van de spuit infiltratie test.
Klik hier om tabel 2 te bekijken.
Tabel 2. Spreadsheet voor statistische analyse van de ziekteverwekker datagroei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met afnemende beschikbare landbouwgrond en toenemende bevolking, zijn onderzoekers over de hele wereld uitgedaagd met dringende behoeften voor verbetering gewas. De opbrengst kan sterk worden beïnvloed door verschillende biotische en abiotische stress. Onder hen, pathogeeninfectie is een van de belangrijkste oorzaken van gewasopbrengst verminderen, verantwoordelijk voor ongeveer 12% verlies in de VS alleen 45. Om dit probleem op te lossen, heeft enorme onderzoek gedaan in het model Arabidopsis - P. syringae pathosystem om volledig karakteriseren van de componenten en regulerende mechanismen van de plant immuunreacties. Hier presenteren we een geoptimaliseerde P. syringae ES4326 spuit infiltratie test kwantitatief beoordelen van de subtiele verschillen in plantaardige immuunrespons op de hele plant niveau.
Hoewel meerdere pathogeeninfectie assays werden ontwikkeld om de installatie immuunrespons 29,35 karakteriseren de spuit infiltratie voorzieteen goed gecontroleerde systeem waarin gelijke hoeveelheden pathogeen worden toegediend in de geïnfecteerd weefsel. In andere infecties assays, waaronder dip inoculatie en nevel inoculatie, wordt de pathogeen toegepast op het gehele antenne weefsel, zoals zaadlobben en echte bladeren 34. Vermeld is dat zaadlobben van ecotype Landsberg erecta (L re) zijn veel gevoeliger voor de pathogeen in dip inenting assay die de gegevens kan scheef en leiden tot verkeerde conclusies over de totale ziekteresistentie 34. Bovendien beide voornoemde assays vereisen pathogeen het blad binnenkomen via huidmondjes, die wordt bestuurd door verschillende omgevingsfactoren, zoals vocht en licht. Schommelingen van deze factoren draagt bij aan een hogere mate van variatie in de ziektesymptomen opzichte van de spuit 35 infiltratie assay. Voor vacuüm infiltratie, de belangrijkste nadelen omvatten de noodzaak om grote volumes oplossing pathogeen, moeilijkom effectief te infiltreren alle bladeren terwijl voorkomen schade en aanzienlijke arbeidsintensiteit 29. Bovendien planten geïnfecteerd met nevel, dip of vacuum inoculatie minder snel herstellen omdat de gehele zaailing is geïnfecteerd met ziekteverwekker. Gezien de talrijke beperkingen van andere methoden, de spuit infiltratie assay blijft voorkeurswerkwijze uniforme en zeer voorspelbare ziekteprogressie en kwantificatie van de pathogeen te realiseren betrouwbaar karakteriseren de immuunrespons in de echte blad. Daarnaast kan deze test eenvoudig worden aangepast om MAMP-Triggered immuniteit en systemische verworven resistentie karakteriseren. Daarnaast veelbelovende toekomstige toepassingen van de techniek kan worden toegepast voor het testen van effecten van meerdere fytohormonen, chemicaliën of remmers voorbehandelingen gevolgd door pathogeen spuit infiltratie op verschillende lagen van plantaardige immuunsysteem signalering netwerk ontleden of rollen van een bepaalde route te identificeren in de plant immuun respons. Infectie with een verhoogde dosis van het pathogeen (OD 600 nm = 0,001) in de afwezigheid van elke verdediging priming voorbehandelingen, zogenaamde Enhanced Disease Resistance (EDR) test is een andere nuttige modificatie van deze werkwijze die kan worden gebruikt om mutanten te identificeren of transgenen met verhoogde ziekteresistentie.
Opgemerkt wordt dat de spuit infiltratie assay niet voor de karakterisering van pre-invasieve fase van afweerreactie aangezien het pathogeen rechtstreeks in het bladweefsel via huidmondjes wordt geleverd. Stomatale sluiting, die dient als fysieke barrière voor pathogeen ingang, wordt vaak veroorzaakt pathogeen binnenkomst bij de oprichting van MAMP Triggered Immunity 46 te beperken. Daarnaast plantenhormoon abscisinezuur bijdraagt aan stomatale sluiting tijdens de pre-invasieve fase 47. Derhalve kan het sproeien of dompelen methoden voordelig blijken om de stomatal laag van de immuunrespons karakteriseren, ondanks voorbehouden geassocieerdeop vormen van inoculaties hierboven 29 besproken.
Sinds Plant-pathogeen interacties kan worden veranderd door verschillende biotische en abiotische factoren, is het essentieel om zich te concentreren op de onderstaande kritische stappen in het protocol tot succesvolle infectie te bereiken en het verkrijgen van betrouwbare uitgangen:
Plant status en bacteriën activiteit
Arabidopsis-planten kunnen gemakkelijk worden benadrukt door verschillende abiotische factoren, waaronder sub-optimale temperatuur, droogte en osmotische stress, en trigger cellulaire reacties die interfereren met de immuunrespons uitgang 48. Daarom is het cruciaal om planten groeien onder optimale groeiomstandigheden en hen te beschermen tegen de omgevingsinvloeden. Bovendien, omdat het ontwikkelingsstadium van de geïnfecteerde blad tot experimentele resultaat kan veranderen, is het noodzakelijk om consequent te infecteren bladeren nummer 5 en 6 om artefacten te vermijden. Vordert langs ontwikkelingsstadia, verhoogde opnieuwsistance tegen enkele virulente en avirulente pathogenen correleert met de overgang van de vegetatieve fase naar de reproductieve fase van Arabidopsis planten. Deze dynamische weerstand over ontwikkelingsstadium wordt genoemd Age-Related Resistance (ARR) 38. Om de ARR interferentie met de werkelijke immuunrespons te voorkomen, is het essentieel om de infectie te voeren op de juiste ontwikkelingsfase zoals in het protocol en niet over te Infectieproeven na het begin van de reproductieve fase. Bovendien bacteriële fitness en activiteiten substantieel van invloed op de ziekteverwekker proliferatie binnen het geïnfecteerde weefsel. Aldus is het belangrijk om de bacteriële vloeibare kweek initiëren van een vers uitgestreken kweekplaat die niet meer dan 2 dagen oud.
Spuit infiltratie vaardigheid
Tijdens de injectiespuit infiltratie, probeert een fysieke schade aan het blad sinds verwonding te vermijden is bekend interfereren met deplantaardige immuunrespons, vooral via jasmonzuur-zuur-gemedieerde signalering die SA-geactiveerd verdediging kan onderdrukken trajecten 49. Na de infectie, moet een blad dat is geïnfiltreerd volledig te herstellen tot het normale uiterlijk zonder enige zichtbare schade. Voor beginners, is het aangeraden om deze techniek met behulp van niet-experimentele installaties oefenen voordat het uitvoeren van de Psm ES4326 spuit infiltratie test.
Pathogeen extractie en verdunning
Om de pathogeen groei nauwkeurig te meten, is het essentieel om efficiënt te halen ziekteverwekker uit de geïnfecteerde plantenweefsel. Vergeleken met andere extractiemethoden, mechanische homogenisering weefsel door middel van high-throughput homogenisatoren effectief extraheert pathogeen zonder verlies van weefselstaal en kruisbesmetting. Vervolgens monster verdunningen moeten worden nauwkeurig uitgevoerd met een betrouwbaar gekalibreerde multi-channel pipet om het pipetteren fouten te verminderen uitgevoerd.Afwijking slechts ± 1 gl in het verdunningsproces zou vertalen in een verschil ~ 5% in het pathogeen groei kwantificering. Voor meer voorbeelden het oplossen van problemen van de spuit infiltratie assay, zie tabel 1.
Tenslotte beschrijven we de geoptimaliseerde PSM ES4326 spuit infiltratie assay on Arabidopsis kwantitatief en betrouwbaar de plant immuunreactie te evalueren. Met behulp van deze pathosystem zal begrijpen planten-pathogeen interactie worden versneld in het laboratorium en uiteindelijk worden aangevraagd gewasbescherming in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
