Abstract
При отсутствии специализированных мобильных иммунных клеток, растения используют их локализованы запрограммированная смерть клеток и системной приобретенной устойчивости, чтобы защитить себя от атаки патогена. Вклад конкретного гена из Arabidopsis в целом растений иммунного ответа может быть специально и количественную оценку путем анализа роста патогенных микроорганизмов в пределах инфицированной ткани. На протяжении более трех десятилетий, hemibiotrophic бактерия Pseudomonas syringae ру. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) широко применяется в качестве модели для исследования возбудителя молекулярные механизмы, лежащие в основе иммунного ответа Arabidopsis. Чтобы доставить болезнетворных микроорганизмов в ткань листьев, несколько методов прививки были созданы, например, шприц инфильтрация, падение прививки, спрей, вакуумной пропитки, и наводнение прививка. Следующий протокол описывает метод оптимизированный шприц инфильтрации доставить яростную PSM ES4326 в листьях взрослыхПочва выращенных растений Arabidopsis и точно экран для повышения восприимчивости болезни (EDS) к этим патогеном. Кроме того, этот протокол может быть дополнен несколькими предварительной обработки для дальнейшего рассекать специфические иммунные дефекты в разных слоях оборонного завода, в том числе салициловой кислоты (SA) -Triggered иммунитета (ИППП) и MAMP запускаемые иммунитета (MTI).
Introduction
Из-за их природы сидячие, растения постоянно угрожает множество возбудителей, обладающих различные образ жизни и пищевые стратегии 1. В первом приближении биотрофных патогены поддерживать своего хозяина живым, чтобы получить питательные вещества, в то время как некротрофным патогенов активно тайные токсины и ферменты, чтобы убить ткани хозяина и питаются мертвыми клетками 1. Другая группа возбудителей, называемых hemibiotrophs, начинается их заражения курс с биотрофных этапе и сдвигов в некротрофным этапе при достижении определенного порога накоплению возбудителя 2. Для того чтобы эффективно защитить себя от этих микроорганизмов, растений развились сложный врожденной иммунной системы оснащена несколькими механизмами наблюдения для обнаружения атаки патогена и вызвать локализованного запрограммирован гибель клеток 3, а также системной приобретенной устойчивости (SAR) 4. Текущее исследование сосредоточено на характеризующий существенную сиговыхnaling компоненты и кросс-переговоры в растительной иммунной системы. 5
Как предлагается в "зигзагообразный" модели 5, первый слой растительного врожденного иммунного ответа требуется наличие плазматической мембраны локализованные распознавание образов рецепторы (РРСС) для обнаружения вторжения микроба. PRRs способны распознавать Микроб-Ассошиэйтед молекулярные модели (MAMPs) и установить MAMP запускаемые иммунитет (MTI) 6. Кроме того, вызывая транскрипции активацию генов, кодирующих антимикробные PR белки 7, MTI приводит к различным событиям, что арест рост патогенных микроорганизмов, в том числе производства реактивных форм кислорода (ROS), и химически активного азота видам (RNS), осаждения каллозы к клеточной стенке а также активацию киназы множественных сигналов дорожками 8.
До сих пор, несколько MAMPs не были определены для запуска MTI в Arabidopsis, в том числе бактериальной flg22 9 10 (18 аминокислот из бактериального фактора элонгации трансляции ТУ) и структурного компонента клеточной стенки Пептидогликаны 11. Для создать успешный инфекции, некоторые специализированные патогены развили способность к секретным белков вирулентности эффекторных в внутриклеточные или межклеточных пространствах, и, следовательно, подавлять MTI и вызвать Эффектор запускаемые восприимчивости (ETS) 12,13. Например, вирулентности эффекторы могут инактивировать митогеном активируемой протеинкиназы (МАРК) фосфорилирования каскады MTI, чтобы вызвать развитие заболевания в инфицированной ткани 14-16. Во время динамического коэволюции между хостами и патогенов, растения также разработали стратегию ответных признать эффекторные белки и ослабления вирулентности патогена молекул 17. Это прямое или косвенное признание эффектор опосредуется болезнеустойчивости (R) белков 18. Большинство тподол являются членами NB-LRR (нуклеотидов Переплет и лейцин-богатый повторов) семьи 19. Восприятие авирулентный эффектора с помощью R белка вызывает более сильное и широкое иммунный ответ характеризуется как эффектор-Срабатывает иммунитет (ETI) 20. Кроме индукции экспрессии генов 21 оборонных и производство оборонной метаболитов 22, ВЦ часто приводит к быстрому локализованной запрограммированной гибели клеток, известной как реакции гиперчувствительности (HR), чтобы ограничить распространение возбудителя из в соседнюю ткань 3.
В дополнение к локализованным запрограммированной клеточной смерти 23 заводов способны инициировать долгосрочные и общесистемного иммунный ответ называют системной приобретенной устойчивости (SAR) 4. При стимуляции с биотрофных патогена, клетки растений вызвать биосинтез и накопление эндогенного фитогормонов салициловой кислоты (SA) и PR белков в обеих местных и системных тканях 24. Через тего процесс, состояние повышенной готовности достигается в неинфицированных листьях, что позволяет для монтажа быстрее ответов обороны во время последующей инфекции широкого спектра возбудителей 24. С. и его синтетические аналоги, такие как бензо- (1,2,3) тиадиазол-7-тиокарбоновой кислоты метиловый эфир уксусной кислоты S (BTH) и 2,6-дихлоризоникотиновая кислоты (INA) способны индуцировать химически салициловой кислоты (СК) -Triggered Иммунитет (ИППП) по внешним приложением 24. Nonexpressor патогенеза-родственные гены (1) NPR1 предлагается один из рецепторов SA и функций в качестве основного регулятора транскрипции во SA-опосредованной реакции обороны в местных и системных тканях 21,25,26. Было убедительно показано, что NPR1 требуется для создания SAR и потеря NPR1 приводит к драматическим восприимчивости по отношению к Pseudomonas syringae 25.
Для широко характеризуют молекулярный вклад заводакомпоненты растительных патогенов взаимодействий, несколько биопробы были разработаны для измерения конкретных оборонных мероприятий, в том числе АФК взрыв 27 каллозы осаждения 28, выражение генов обороны и накопление их белковых продуктов 21. В то время как эти отдельные тесты могут дать представление конкретной форме растительной иммунного ответа, ни один из них, однако, не в состоянии представлять полный ответ обороны на уровне всего предприятия. Наоборот, количественная оценка роста патогенных микроорганизмов после заражения дает общую оценку иммунного ответа на организменном уровне. Таким образом, разработка и оптимизация точной и высоко стандартизированной возбудитель прививки анализе важно, чтобы питать до исследования и открытия на иммунных ответов Arabidopsis.
Pseudomonas syringae, грамотрицательная бактерия, был идентифицирован как фитопатогенов, способных вызвать заболевание в диапазоне растений-хозяев, включая Arabidopsсоставляет 29. В качестве модели растений патогена системы, Arabidopsis - P. syringae взаимодействие широко применяется, чтобы понять молекулярные механизмы лежащие в основе растительных обороны ответов 29. До сих пор, более 50 П. syringae pathovars были определены на основе их способности инфицировать различные виды растений 30 . П. syringae ру. помидор DC3000 (PST DC3000) 31 и П. syringae ру. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 являются двумя наиболее широко используемых и широко отличающиеся вирулентные штаммы. Помимо того, что признается завода и запуск ответ MTI, Pst DC3000 и Psm ES4326 способны секретировать вирулентных эффекторных белков, чтобы подавить MTI и вызвать ETS в пользу роста 31,33 патоген.
Функционально анализировать взаимодействие между Arabidopsis и P. syringae, несколько0; патогенных методы инфекции были разработаны на основании подхода доставки патоген. Для почвенных выращенных растений, возбудитель может быть доставлен с помощью шприца инфильтрации, вакуумной инфильтрацией, погруженной прививки и прививки распыления 29,34. Недавно рассады наводнения прививка был разработан анализ для выполнения крупномасштабных экраны на планшеты для тканевых культур, выращенных молодых растений Arabidopsis 35. Шприц инфильтрация, в качестве одного из наиболее часто используемых подходом, вручную подает возбудителя в апопласт через естественный листьев отверстий, называемых устьиц 29. Благодаря такому подходу, равные количества P. syringae может быть проникли зараженного листа и сила растений иммунного ответа обратно пропорциональна уровней роста патогена. Таким образом, количественная оценка роста патогенных микроорганизмов служит в качестве оптимального подхода для оценки иммунной функции у уровне целого растени. Кроме того, шприц инфильтрации можно выделить местных и системных ткани, которые могут бе применяется для характеристики молекулярных механизмов, лежащих в основе 36 SAR.
В следующем протоколе мы опишем оптимизированный шприц инфильтрации анализа с PSM ES4326 на экран Arabidopsis мутантов для повышения восприимчивости болезни (EDS). Этот протокол будет использовать два Arabidopsis генотипов: дикого типа экотип Колумбия-0 (Col-0) растения (контроль) и npr1-1 потери из-мутанты функции (hypersusceptible) что будет заражен вирулентных бактериального штамма PSM ES4326 37. Npr1-1 мутант несет точечную мутацию в пределах анкириновых повтора консенсусной последовательности молекулы NPR1, который изменяет высоко законсервированный гистидин в тирозин и оказывает белок нефункциональные 25. Кроме того, ряд модификаций шприц инфильтрации анализа описаны, что позволяет количественно определить дефекты в конкретных слоев иммунного ответа, в том числе MTI и ИППП.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий текст описывает ступенчатое протокол выполняют оптимизированный Psm ES4326 шприц инфильтрации анализа в Arabidopsis. Основные процедуры этого анализа представлены в упрощенном блок-схемы (рис 1).
1. Условия выращивания растений
- Сеять семена
- Подготовьте 2 кастрюли (4 в диаметре, 3,75 в высоту) слабо наполненные почвенных и водных горшков путем замачивания их от нижней O / N перед сливом избытка воды.
- Сейте семена Arabidopsis 50-100, дикого типа Col-0 или npr1-1 мутантные, на каждый горшок со сложенным 70 мм весом лист или другой документ.
- Накройте кастрюлю с водой опрыскивали прозрачным куполом, чтобы увеличить относительную влажность 80-90% (рис 2А).
- Инкубируют горшок при 4 ° С в течение 72 ч, чтобы обеспечить полное расслоение и синхронного прорастания.
- Перенести кастрюлю к стандартным условиям роста (12 ч света/ 12 ч темноты, 21 ° С, интенсивность света 100 мкмоль / м 2 / с, относительная влажность 40%), чтобы позволить семенам прорасти. Трещина купол для создания 2-3 в открытии сразу после передачи в комнату роста, который поможет избежать конденсации влаги.
- Когда первый настоящий лист достигает размера 2-3 мм в длину, пересадить рассаду из горшка до 72 скважин с плоским заполненные почвой.
- Использование пальцем или кончиком пипетки 1 мл создать 1-в глубокой депрессии в середине поверхности почвы на плоской.
- Аккуратно отделить отдельные саженцы с минимальными повреждения корней, как это возможно. Тщательно подобрать саженцы, которые имеют неповрежденные корни с щипцами.
- Поместите один отделенный рассады вместе с прилипшей почвы скопления, чтобы минимизировать шок трансплантации в депрессию и мягко погладить вниз почву, окружающую заполнить депрессии. Откажитесь от лишних саженцев и почвы в контейнер для биологически опасных отходов и утилизировать в соответствиис местными правилами утилизации биологически опасных отходов.
- Вода переданы саженцы из верхней и полностью покрыть квартиру с водой опрыскивали прозрачным куполом для поддержания 80-90% влажности. Держите купол в течение 3 дней, затем взломать купола утром 4 дня и полностью удалить его в конце этого дня.
Примечание: посева семян может быть альтернативно выполнена путем стратификации семян в 1,5 мл центрифужные пробирки, содержащие 1 мл 0,1% агара в течение 48 ч при 4 ° С с последующим переносом 2-3 семян с стеклянной пипетки на 72-лунок с плоским заполненные почвой. Квартиры должны быть покрыты прозрачным куполом, который может быть удален через одну неделю после всходов. Дополнительные саженцы могут быть удалены, чтобы оставить только один саженец на лунку.
- Водные растения каждые два дня по замачивания квартиры в 1-в воде в течение 20 мин, затем сливают избыток воды.
Примечание: Интервал времени для полива растений зависит от влажности в помещении рост и должна быть определена базоваяд на непрерывное наблюдение объекта роста растений пользователя. Проверьте растения в день, чтобы убедиться, что они хорошо поливают. Если только несколько пятна сушки, воды эти растения сверху с бутылкой шприца. - Выполнение патогенной инфекции анализы (шаг 3-5) от растений, которые на или вблизи стадии развития # 3,50 (при размере розетка 50% конечного размера), что соответствует 3-5 недель в зависимости от условий роста (фотопериод, температура). Не заражать растения после появления соцветий (этап № 5) в связи с наступлением возрастного сопротивления 38,39.
2. Подготовка питательных сред и пластин
- Сделать 1 л короля B (KB) жидкой среде. Аккуратно перемешать 20 г пептона и протеоза 2 г двухосновного фосфата калия тригидрат, используя магнитную мешалку с 1000 мл деионизированной H 2 O, пока не видно осадок. Аликвоты 100 мл в 150 мл стеклянные бутылки и автоклав на 20-мин жидкого цикла.
- Подготовитькультуральные планшеты с КБ твердой среде.
- Аккуратно перемешать 20 г Протеаза Пептон, 2 г калия Двухосновный тригидрат и 15 г агар с 1000 мл деионизированной H 2 O. Автоклав.
- Охладить среду на магнитной мешалки до тех пор, пока прохладно прикоснуться к минимуму будущую конденсата и предотвращения деградации антибиотиков. Добавить 18 мл стерильной 80% глицерина и 5 мл стерильной 1 М MgSO 4 в среду. Учитывая, что Psm ES4326 несет сопротивление стрептомицина, добавить стрептомицин в охлажденный сред до конечной концентрации 50 мкг мл - 1.
- Налейте пластин. Приготовьте два различных размеров KB СМИ пластин: 100 мм х 15 мм и 150 мм х 15 мм чашки Петри. Чем меньше чашку Петри, содержащую среда служит в качестве основного бактерий культурального планшета, и чем больше чашку Петри служит бактерии подсчета пластину.
Примечание: для бактерий в расчете пластин, прямоугольной формы пластины могут быть использованы для уменьшениярасходные материалы стоят так вдвое больше процедуры могут быть нанесены на планшет по сравнению с традиционными круглыми пластинами.- Налейте пластин до эксперимента инфекции. Храните Кб средних пластин при 4 ° С в течение до 2-3 месяцев с момента стрептомицина сульфата постепенно теряет антибиотической активностью 40.
3. Улучшение болезни Восприимчивость (ЭЦП)
- День 1 - бактерии подряд на тарелку
- Два дня перед анализом EDS, полоса Psm ES4326 от -80 ° С глицерина на складе KB-Strep бактериальной культуры планшета и инкубируют при 28 ° С в течение 24-48 ч.
- День 2 - инициировать жидкие культуры и водных растений
- Инициирование жидкой культуры в стерильную пробирку с 4 мл жидкой среды KB, содержащей 50 мкг мл - 1 стрептомицина и встряхивают при 250 оборотах в минуту, 28 ° CO / N.
Примечание: Для EDS инфекции анализе с использованием 6 растений на генотип рекомендуемредактор Для ИППП и MTI анализов, 6 растений на генотип в лечении рекомендуется. Для бактерий инокулята, рекомендуется использовать свежую жидкую культуру с оптической плотностью при длине волны 600 нм от 0,3 до 0,6. - Отметить черешки листьев числа 5 и 6 с тупым концом водонепроницаемого маркера для легкой идентификации зараженной ткани в выборке (рисунок 1). Для повышения открытие устьиц и облегчить вход патогена раствора в лист, воду растений и путем замачивания плоская снизу в течение 20 мин, затем сливают избыток воды.
Примечание: В качестве альтернативы, охватывают квартира с прозрачным куполом и замочить его в воде в течение 2-4 ч, чтобы увеличить открытие устьиц. - День 3 - Возбудитель разведение и шприцев инфильтрация
Примечание: Возбудитель инфекции в утренние часы является оптимальным для распространения возбудителя и развития наиболее ярких симптомов заболевания на восприимчивых генотипов. Сделайте все возможное, чтобы сохранить Infectионная времени соответствует устранить эффект циркадных ритмов и суточной регуляции генов 41,42, который помогает уменьшить разброс между экспериментальными репликаций.- Гранул бактериальной культуры в микроцентрифужных трубки 1,5 мл на 9600 мкг в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Ресуспендируют бактериальных гранул с 1 мл стерильной 10 мм MgCl 2.
Примечание: катионов магния может повышать перистальтику и адгезию P. syringae 43. Кроме того, использование MgSO 4 при той же концентрации. Стерильная вода является приемлемой заменой для солевых растворов Mg. - Разбавления суспензии бактерий с 9 мл 10 мМ MgCl 2 в 50 мл центрифужную пробирку и измерения оптической плотности (OD) бактерий с помощью спектрофотометра при λ = 600 нм. Развести 10 бактерии мМ MgCl 2 до конечной OD 600 нм = 0,0002 для EDS инфекции анализа.
- Проникнуть листс 1 мл тупых концов безыгольного шприца (обычно известный как инсулиновый шприц), который содержит разведенный бактериального раствора.
- Не заполняйте шприца до полной емкости. Заполните его с 0,5-0,6 мл, чтобы в течение гораздо лучшего контроля в процессе инфильтрации.
- Защиту нижнюю поверхность листа на верхней части указательного пальца, а затем осторожно регулировать положение листа с помощью большого пальца. Поместите шприц вертикально по отношению к поверхности листа, чтобы обеспечить давление равномерно распределяется. Старайтесь избегать область жилки во время инфильтрации, чтобы уменьшить ущерб листа.
- Медленно надавите на поршень, чтобы проникнуть бактериального раствора; Жидкость вход в мезофилла листа будет визуализировать как указано в темный цвет листа. Попытка проникнуть на всю поверхность листа. Если это не достигается в одном попытки выбрать другой инфильтрации место и повторите действия, описанные выше, пока вся поверхность листьев не покрыт.
- После завершения, мягко промокните лист с впитывающей ткани, чтобы удалить лишнюю решение патогена. Осмотрите зараженную ткань листа на наличие повреждений.
Примечание: круговая шприц впечатление не должны быть видны после того, как инфильтрация завершена. - Оставьте проникли растений высохнуть в течение 1-2 часов, прежде чем вернуться в их исходные условия роста. Далее, спрей прозрачный купол с водой и покрывают зараженных растений в течение 2 ч, а затем взломать купола, чтобы генерировать 2-3 в отверстие и оставить его на протяжении оставшейся части эксперимента инфекции.
Примечание: Поскольку P. syringae не передается воздушно-капельным патоген, нет никакого риска распространения инфекционного агента в других растений, выращенных в том же учреждении. Тем не менее, в качестве дополнительной меры предосторожности, избегать физического контакта между зараженных растений и других экспериментальных установок, расположенных поблизости. Покрытие плоской с прозрачным куполом позволит увеличить патогена вирулентность и ускорить прогрессирование болезни.для этого нужно шаг, и оптимальная продолжительность периода сопроводительным должна быть определена исходя из условий влажности в объекте роста растений пользователя.
- Гранул бактериальной культуры в микроцентрифужных трубки 1,5 мл на 9600 мкг в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Ресуспендируют бактериальных гранул с 1 мл стерильной 10 мм MgCl 2.
- День 5 - Предварительная сухой медиа пластины
- Возьмите 150 мм х 15 мм KB пластины из холодной единица хранения и высушить любого существующего конденсации воды на тарелку. Сухие пластины по поддержанию их в комнатной температуре в течение примерно 24 часов. Чтобы ускорить этот процесс, поместите их в поток капотом ламинарного с крышками трещинами в течение 30-60 мин.
Примечание: Этот шаг является критическим для формирования круговой капли на поверхности пластины на следующей стадии.
- Возьмите 150 мм х 15 мм KB пластины из холодной единица хранения и высушить любого существующего конденсации воды на тарелку. Сухие пластины по поддержанию их в комнатной температуре в течение примерно 24 часов. Чтобы ускорить этот процесс, поместите их в поток капотом ламинарного с крышками трещинами в течение 30-60 мин.
- День 6 - Количественная рост болезнетворных микроорганизмов
Примечание: Следующая процедура количественное патоген может быть выполнена на более ранних моментов времени после заражения, чтобы подтвердить равные количества бактерий доставляются в лист, особенно когда растения изменили морфологии листьев.- Процесс инфицированной ткани после появленияхлороза указывает пожелтение инфицированной ткани в восприимчивых генотипов, но до развития некротических повреждений (Фигура 2В).
Примечание: Предлагаемые выборки время через три дня после прививки возбудителя. Однако, поскольку рост патоген, зависит от ряда факторов окружающей среды, длина инкубации может варьировать в пределах от 2 с половиной-3 с половиной дней, а должен быть определен тщательных наблюдений за прогрессирования инфекции в объекте роста растений пользователя.- Подготовка 6 шлифовальные трубы для каждого генотипа (рисунок 1). Разместите один из нержавеющей стали шлифование мяч и добавить 500 мкл стерильной 10 мМ MgCl 2 в каждую пробирку.
- Снять зараженную лист с завода и пробить лист диска с 1-луночное бумаги удар (рис 1).
Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму ошибку выборки, попробуйте ударить каждый сэмпл лист в той же позиции. Отбор проб диск листа сверхулиста рекомендуется. - Случайно разместить 2 дисков листьев (из двух разных растений) в каждой шлифовальной трубки, используя пинцет.
- Уплотнение трубки и гомогенизации ткани с высокой пропускной гомогенизаторе при максимальной скорости (1600 ходов в минуту) в течение 10 мин. Повторите этот процесс, если необходимо, пока ткань не хорошо гомогенизируют и решения зеленеть из-за хлорофилла освобождении от зараженных листьев.
- В ожидании гомогенизации, заполнить первые 6 строк культуры 96-луночного планшета с 180 мкл 10 мМ MgCl 2 с помощью пипетки многоканальный и пипетирующее резервуар.
- После измельчения передачи 20 мкл тканевой суспензии первом в первой строке 96-луночного планшета и смешивать повторным пипетированием жидкости вверх и вниз. Если небольшие фрагменты ткани забивают наконечник, закрепить его на 2-3 мм, чтобы помочь получить правильный объем раствора.
- Для обеспечения достаточного пространства для капли на верхнем Oе пластины, космической ткани из разных генотипов в альтернативных строк (Рисунок 1). Для подготовки десятикратное разбавление серийный, трансфер 20 мкл жидкости во второй ряд и не повторять эту процедуру до тех пор, шестой разбавления.
- Передача 20 мкл раствора из 96-луночного планшета на 150 мм х 15 мм KB пластине с помощью разделенных наконечники (рис 1). Работа с наиболее разбавленной суспензии в наиболее концентрированной.
Примечание: Исходя из наиболее разбавляют до наиболее концентрированным делает ненужным изменить наконечники между разведениями. Если пластина также предварительно сушат, переданный капель должны оставаться нетронутыми на верхней части среды до полного впитывания (обычно 15-30 мин). Время высыхания зависит от РТ и влажности. - Высушите пластины при комнатной температуре с крышкой трещины. После того, как больше не жидкость можно наблюдать на поверхности пластины, закрыть крышку, переверните и инкубировать пластину при КТ или 28 ° C инкубатор.
- Планшеты инкубируют 40-60 ч для пока колонии не становятся видимыми. Подтвердите, что рост на пластинах отражает прогнозируемую падение 10-кратное колониеобразующих единиц (КОЕ) (рис 2С). Граф бактерии, прежде чем они зарастают и колонии предохранитель. Определите количество бактерий в разведении низкой, не имеющих перекрытия колонии. Как правило, при предпочтительном разбавлении для подсчета будет содержать 10-50 колоний.
Примечание: Изменение может присутствовать среди технических повторов; Поэтому, самый низкий разбавления каждой повторности должна быть определена отдельно. - Для расчета уровней пролиферации бактерий, документировать номер строки (R), а также от количества бактерий в течение каждого технического репликации (Т) в письменном виде. Определить количество формирующего устройства колоний - КОЕ / лист диска через формулу: КОЕ / лист диска = (T × 10 R / 20) × 500/2
- Введите данные в следующем шаблоне электронной таблицы для произвосе график (рисунок 1) (для анализа данных электронных таблиц в файл шаблона, смотри таблицу 2). Каждая точка данных представлена как среднее шести повторов технических в логарифмической шкале. Усы представляют 95% доверительный интервал среднего (п = 6).
Примечание: Расчет 95% доверительного интервала должна быть скорректирована в зависимости от количества технических повторностях.
- Процесс инфицированной ткани после появленияхлороза указывает пожелтение инфицированной ткани в восприимчивых генотипов, но до развития некротических повреждений (Фигура 2В).
- Инициирование жидкой культуры в стерильную пробирку с 4 мл жидкой среды KB, содержащей 50 мкг мл - 1 стрептомицина и встряхивают при 250 оборотах в минуту, 28 ° CO / N.
4. С. запускаемых Иммунитет (ИППП)
- День 1: Выполните ту же процедуру, как описано в шаге 3.1.
- День 2: В дополнение к полива растений и начала жидкого бактериальной культуры (этап 3.2), индуцируют сопротивление наружного применения SA производной натрия салицилат 21.
Примечание: Чистый SA имеет плохую растворимость в воде и требует предварительного доведения рН, таким образом, это не рекомендуется для этого анализа.- Для индукции SA-опосредованных оборону против P. syringae и премьер растения для будущей инфекции 21,24, аэрозольные установки с тумана 1 мМ натрия салицилат или H 2 O (как макет) 16-24 ч до возбудителя инфекции.
- День 3: Подготовка разведения возбудителя OD 600 нм = 0,001 и нажмите бактерии в всей поверхности листа с помощью шприца инфильтрации (этап 3.3).
- День 6: Для возбудителя количественного и процесса подсчета, выполните процедуру, как описано для анализа EDS (шаги 3.4 и 3.5). Пластинчатые и подсчитать H 2 O и натрия салицилат - предварительно образцы отдельно. Для дикого типа Arabidopsis, снижение на 1-2 журнала в росте возбудителя, как ожидается, в натрия салицилат - предварительно обработанных растений.
5. MAMP запускаемых Иммунитет (MTI)
Примечание: В этом анализе мы используем Arabidopsis дикого типа Col-0 и мутантные FLS2 и EFR растения. FLS2 и EFR есть плазменный мембрана локализованные распознавание образов рецепторы (РРСС), что может распознать flg22 и elf18, respectively 9,10. Потеря каждого PRR результатов в нечувствительности к определенному типу MAMP, который указан в неизмененном роста патогенных микроорганизмов в мутанта следующей внешнего MAMP предварительной обработки и шприцев инфильтрации с PSM ES4326.
- День 1 и 2: Выполните ту же процедуру, как описано в шаге 3.1 и 3.2.
- День 3: MAMP предварительной обработки и Возбудитель инфекции
- Чтобы установить MAMP запускаемые иммунитет, готовить 1 мкМ раствор флагеллин эпитопной flg22 или EF-Tu эпитопной elf18 и шприц-проникнуть в его всей поверхности листьев 4 ч до инфицирования патогеном (шаги 3.3.3-3.3.6). Это позволит индукции MAMP-опосредованной защиты от P. syringae и премьер растения на будущей инфекции 6,37.
Примечание: Публично доступных данных микрочипов показал максимальный транскрипции перепрограммирование MAMP проблематики генов происходит через 4 часа после или flg22 elf18 обработки 37,44. Таким образом, 4 часа является рекомендуемымПродолжительность MAMP предварительной обработки, что приводит к достижению четкое различие в росте возбудителя между MAMP обработанных Col-0 и FLS2 и EFR мутантов. - Удалить дополнительное решение MAMP впитывающей ткани и оставить растения раскрыли, чтобы ускорить процесс абсорбции жидкости внутри листа. Для учета эффекта от ранив инфильтрации давления шприца, 2 проникнуть O H в листьях контрольных растениях.
- Подготовьте разведение возбудителя OD 600 нм = 0,001 и нажмите бактерии в целом листовой поверхности в MAMP / H 2 O, предварительно обработанные листья с помощью шприца инфильтрации (шаг 3.3).
- Чтобы установить MAMP запускаемые иммунитет, готовить 1 мкМ раствор флагеллин эпитопной flg22 или EF-Tu эпитопной elf18 и шприц-проникнуть в его всей поверхности листьев 4 ч до инфицирования патогеном (шаги 3.3.3-3.3.6). Это позволит индукции MAMP-опосредованной защиты от P. syringae и премьер растения на будущей инфекции 6,37.
- День 6: Для возбудителя количественной оценке и процессе подсчета, выполните процедуру, как описано в шаге 3.4 и 3.5. Плиты и подсчитать H 2 O и MAMP предварительно обработанных образцов отдельно. В дикого типа Arabidopsis, снижение на 1-2 журнала в росте возбудителя, как ожидается, в MAMP-предварительно растений, с несколько сильнаяСнижение э посредничестве flg22 сравнению с elf18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол мы опишем здесь представляет собой оптимизированный P. syringae шприц инфильтрации анализа для количественной оценки иммунного ответа в Arabidopsis растений. Как показано на Рисунке 1, шприц инфильтрация PSM ES4326 следует извлечения патогена и количественного через серийные разведения и колоний перечисления.
Как описано в шаге 3 в тексте протокола, Enhanced болезни Восприимчивость (EDS) против PSM ES4326 может быть оценена путем инфицирования с посевного с ОД = 0,0002. Как показано на рисунке 3, высоко восприимчивых npr1-1 мутанты имеют примерно 2,5 бревно (300 раз) больше роста патогенных микроорганизмов по сравнению с диким типом Col-0 растения. В зависимости от условий эксперимента, в npr1-1 растения могут поддерживать до 3.0 журнале более бактериального роста, чем Col-0, с большинством распространенных результатов в диапазоне 1,5-2,5 журнале. Таким образом, этот EDS задницуай обеспечивает широкое окно разницы, в котором исследователи могут быть в состоянии размещать свои Arabidopsis мутантов и трансгенных для идентификации генов-кандидатов, участвующих в потенциально завода иммунного ответа.
В дополнение к определению EDS, Psm ES4326 шприц инфильтрации анализ может быть изменен, чтобы рассекать различные слои иммунного ответа. Чтобы оценить Салициловая кислота запускаемые иммунитет, наружное применение химического салицилат натрия используется, чтобы вызвать иммунный ответ, который количественно ростом патогена (рис 4а). Потеря NPR1, который функционирует как рецептор SA и крупного транскрипции сотрудничества регулятора SA-зависимых генов-мишеней, приводит к нечувствительности к экзогенной применения производной салициловой кислоты. Это нечувствительность к SA демонстрируется неизмененном роста патогенных микроорганизмов в npr1-1 натрия салицилат предварительно обработанных растений в отличие от заметному снижению Кол-0 растения (в 20 раз меньше pathog ан по натрия салицилат применения) (4В).
Чтобы охарактеризовать MAMP запускаемых иммунитет, предварительную обработку с flg22 или elf18 была выполнена, как показано на рисунке 5А. Чтобы охарактеризовать Флагеллин срабатывает иммунитет, Col-0 и FLS2 мутантные растения используются. FLS2, рецептор-киназы, как мембрана локализованные, признает flg22 и запускает MTI 9. Как показано на рисунке 5В, то flg22 обработке Кол-0 растения поддержал ~ 1 журнал (10 раз) снижение бактериальной популяции, в то время как FLS2 мутантные растения не смогли вызвать бактериальный эффект ограничения роста. Аналогичным образом, потеря EF-Ту рецептора EFR в EFR мутантных растений приводит к нечувствительности к elf18 предварительной обработки, как показано на неизменном роста патогенных микроорганизмов после elf18 предварительной обработки (фиг.5В).
Иль / ftp_upload / 53364 / 53364fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схематическое представление Psm ES4326 шприц инфильтрации анализа на Arabidopsis растений. Листья количество 5 и 6 взрослых почвы выращенных растений арабидопсиса отмечены и инфицированных PSM ES4326 через шприц инфильтрации. После появления симптомов заболевания, снять листья и урожай листьев диски для ткани гомогенизации. Хорошо гомогенизируют ткань серийно разводили в 96-луночных планшетах до передачи на бактерии в расчете пластины. После появления колоний на пластине, подсчитать количество бактерий и обрабатывать данные для создания графика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель процедуры анализа EDS.(A) Горшки покрыты водой опрыскивали после прозрачный купол посева семян. (B) Представитель симптомы на Col-0 и npr1-1 листьев, подвергнутых анализа EDS (OD 600 нм = 0,0002) 3 дня после инокуляции. Примечание тяжелой хлороз на npr1-1 и почти нормальный вид Col-0. (C) серийных разведений PSM ES4326, растущие на КБ (50 мкг / мл стрептомицина) носитель пластины после ~ 45 ч инкубации. Пять разведения видны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель результаты анализа EDS рост Psm ES4326 (колониеобразующих единиц - КОЕ. / Лист дисковые, ехрволосы погладила по логарифмической шкале) количественно в 4-недельных Col-0 и npr1-1 растений 3 дня после инокуляции (OD 600 нм = 0,0002). Усы представляют 95% доверительных интервалов среднего (п = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Процедура представитель и результаты анализа STI. (А) Схематическое представление Салициловая кислота срабатывает иммунитет (STI) анализа. (Б) салициловой кислоты, запускаемые Иммунитет количественно основанный на росте растений патогена в предварительно обрабатывали 1 мМ салицилат натрия или H 2 O 16 ч до PSM ES4326 шприц инфильтрации (ОД 600 нм = 0,001). Рост Возбудитель количественно 3дней после прививки. Усы представляют 95% доверительных интервалов среднего (п = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Порядок представитель и результаты анализа MTI. (А) Схематическое представление MAMP срабатывает иммунитет (MTI) анализа. (Б) MTI количественно ростом патогена растений, предварительно обработанных 1 мкМ раствора flg22, elf18 или H 2 O (в качестве контроля) 4 ч до PSM ES4326 шприц инфильтрации (ОД 600 нм = 0,001). Рост Возбудитель количественно 3 дней после прививки. Усы представляют 95% доверительных интервалов среднего (п = 6). Пожалуйста, нажмите онповторно, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Проблема | Возможные причины | Рекомендуемые действия |
| Нет рост бактерий в жидкой среде после того, как O / N культуры | Снижение активности бактерий | Инициировать жидкой культуры с недавно мелированных пластины |
| Циркуляр шприц впечатление представляет на листе после шприца инфильтрации | Слишком большое давление во время проникновения | Уменьшите pressue во инфильтрации |
| Частичное шприц впечатление представляет на листе после шприца инфильтрации | Пожаловаться позиционирования шприца | Регулировка шприца должен быть расположен вертикальный на поверхность листа |
| Листовые слабеет wthtin несколько часов после проникновения | Слишком много патогенов решение проникли в лист | Стоп инфiltrating сразу после всей поверхности листа оказывается темнее зеленый цвет |
| Нет симптомов заболевания через три дня после заражения | Влажность является слишком низким для возбудитель размножаться | Увеличьте влажность, где зараженные растения поддерживается |
| Возбудитель проникает некротрофным этап в или до 3 точек на дюйм | Неправильное концентрация возбудителя решения | Использование ОД 600 нм = 0,0002 для EDS анализе; подтвердить разбавления с помощью спектрофотометра indepedent |
| Капельки объединить в верхней части пластины бактерий в расчете | Бактерии считая тарелку не соответствующим сушат | Предварительно сухой плиты O / N перед использованием |
| Разведение Возбудитель не представляют 10-кратное снижение | Разведение не выполняется точно | Используйте хорошо калиброванный пипетки многоканальный для перемещения жидкости; подтвердить, что вся жидкость распределяется |
| Рост Возбудитель в дикого типа превышает 8 журнала КОЕ / лист диска | Возбудитель переросла в инфицированной ткани - отбор проб производится слишком поздно | Образец ткани инфицированных после появления хлороза |
| Большое изменение среди технических повторов | Растения не на той же стадии развития или проникли номер листа не соответствует | Использовать только растения в той же стадии развития инфекции. Подтвердите синхронный всхожесть. Инфекция последовательное число листьев различных растений среди |
Таблица 1. Поиск и устранение неисправностей в шприц инфильтрации анализа.
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть таблицу 2.
Таблица 2. Электронная таблица для статистического анализа данных роста патогена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С уменьшением доступного сельхозугодий и ростом численности населения, исследователи во всем мире сталкиваются с проблемой насущных потребностей для улучшения сельскохозяйственных культур. Выход может быть значительной степени зависит от различных биотических и абиотических стрессов. Среди них, возбудитель инфекции является одним из ведущих причин снижения урожайности, ответственный за примерно 12% потерь в одних только США 45. Чтобы решить эту проблему, массивные исследование было проведено в модели Arabidopsis - П. syringae pathosystem всесторонне характеризуют компоненты и регулирующих механизмов завода иммунных реакций. Здесь мы представляем оптимизированную P. syringae ES4326 шприц инфильтрация анализ, чтобы количественно оценить тонкие различия в иммунной реакции растений на уровне всего предприятия.
Хотя несколькими патогенной инфекции анализы были разработаны для характеристики растений иммунный ответ 29,35, шприц инфильтрации обеспечиваетхорошо управляемая система, где равные количества возбудителя вводят в инфицированной ткани. В других анализах инфекции, в том числе погружением прививки и распылительной прививки, патоген применяется ко всей воздушной ткани, в том числе семядоли, а также верно листьев 34. Сообщалось, что семядоли из экотипа Landsberg Erecta (L эр) намного более восприимчивы к возбудителю в течение погружения инокуляции анализа, которые могут исказить данные, и привести к ошибочным выводам на общую устойчивость к болезням 34. Кроме того, два вышеупомянутых анализы требуют патоген, чтобы войти в лист через устьица, которая контролируется различными факторами окружающей среды, в том числе влажности и света. Колебание этих факторов способствует более высокому уровню изменения симптомов заболевания по сравнению с шприца инфильтрации анализа 35. Для вакуумной инфильтрации, основные недостатки включают необходимость больших объемов раствора, возбудитель сложностиэффективно проникать все листья, а во избежание повреждения, и значительная трудоемкость 29. Кроме того, растения, зараженные распылением, погружением или вакуумной прививки, менее вероятно, чтобы восстановить так как вся рассада инфицированы патогеном. Учитывая многочисленные недостатки других методов, шприц инфильтрации анализа остается методом выбора для достижения однородного и очень предсказуемый прогрессирования заболевания и точную количественную оценку возбудителя надежно характеризуют иммунную реакцию в пределах настоящего листа. Кроме того, этот анализ может быть легко изменена, чтобы охарактеризовать MAMP запускаемые иммунитет и системной приобретенной устойчивости. Кроме того, перспективным будущим применения техники могут быть применены для тестирования воздействия нескольких фитогормонов, химических веществ или ингибиторов предварительной обработки с последующим патогена шприцев инфильтрации препарировать различные слои завода иммунной сети сигнализации или идентификации роли конкретного пути на заводе иммунной ответ. Заражение Wiго повышенную дозу патогена (OD 600 нм = 0,001) в отсутствие какого-либо защиты грунтовка предварительной обработки, известные как тест на повышенную устойчивость заболевания (МЭД), это еще один полезный модификация этого метода, которые могут быть использованы для идентификации мутантов или трансгены с повышенной устойчивостью к болезням.
Следует отметить, что шприц инфильтрации анализа не применяется к характеристике преинвазивным этапе защитной реакции, так как возбудитель поступает непосредственно в ткань листьев с помощью устьиц. Закрытие Устьичная, который служит в качестве физического барьера для входа патогена, часто срабатывает, чтобы ограничить въезд патогенов при установлении MAMP запускаемых иммунитета 46. Кроме того, фитогормонов АБК способствует закрытию устьиц в ходе предварительного этапа инвазивного 47. Таким образом, распылением или погружением методы могут оказаться выгодным, чтобы характеризовать устьичного слой иммунного ответа, несмотря оговорками, связанныхс этими типами прививок, обсуждали выше 29.
С завода-патогенных взаимодействия могут быть изменены с помощью различных биотических и абиотических факторов, важно, чтобы сосредоточиться на перечисленных ниже критических шагов в протоколе для достижения успешного заражения и получения надежных результатов:
Деятельность положение завода и бактерий
Arabidopsis растения могут быть легко подчеркнул различных абиотических факторов, в том числе к югу от оптимальной температуры, засухи и осмотического стресса, и вызвать клеточные ответы, которые мешают иммунной выходе 48. Поэтому, очень важно, чтобы выращивать растения в оптимальных условиях роста и защитить их от экологических стрессоров. Кроме того, поскольку стадия развития зараженного листа может также изменить экспериментальный результат, необходимо постоянно заражают листья номер 5 и 6, чтобы избежать артефактов. Прогрессирующая вместе стадиях развития, повышенная повторнотивление против некоторых сильнодействующих и авирулентных патогенов коррелирует с переходом от вегетативной стадии репродуктивного этапа Arabidopsis растений. Это динамическое сопротивление более стадии развития называется, связанных с возрастом сопротивление (ARR) 38. Чтобы избежать помех ARR с истинной иммунной реакции, важно, чтобы выполнить инфекции при правильном стадии развития, как указано в протоколе, и не пытаться инфекции эксперименты после начала половой стадии. Кроме того, бактериальные фитнес и активность существенно повлиять на распространение патогена внутри инфицированных тканей. Таким образом, важно, чтобы инициировать бактериальной культуры от жидкого свежеприготовленного прожилками культурального планшета, что это не более чем 2 дней.
Шприц инфильтрация умение
Во шприца инфильтрации, стараются избегать любого физического повреждения листа, так как ранив эффект хорошо известен вмешиваться вЗавод иммунный ответ, в основном с помощью сигнализации жасмоновой кислоты опосредованной, которые могут подавить SA-срабатывает защита дорожками 49. После заражения, лист, который был проникли должны полностью восстановиться к нормальному внешности без видимых повреждений. Для начинающих, рекомендуется практиковать эту технику, используя не-экспериментальных заводов, прежде чем выполнять УЗС ES4326 шприц инфильтрации анализа.
Добыча Возбудитель и разбавление
Для точного измерения роста патогенных микроорганизмов, важно, чтобы эффективно извлекать возбудителя из зараженного растительной ткани. По сравнению с другими методами экстракции, механическая гомогенизации тканей с помощью высокой пропускной гомогенизаторов эффективно извлекает возбудителя без потери образца ткани и перекрестного загрязнения. Впоследствии разбавлений образца должны быть четко проведена с надежно калиброванного многоканального дозатора, чтобы уменьшить ошибку пипетки.Отклонение всего лишь ± 1 мкл в процессе разведения обернется разницы в количественной роста патогенов в ~ 5%. Дополнительные примеры устранения неполадок в шприц инфильтрации анализа, см таблицу 1.
В заключение, мы опишем оптимизированный ПСМ ES4326 шприц инфильтрации анализа на Arabidopsis количественно и надежно оценить завод иммунный ответ. С помощью этого pathosystem, понимание растений патогена взаимодействия будет ускоряться в лаборатории и в конечном итоге быть применены для защиты сельскохозяйственных культур в области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
