Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53364

Abstract

Özel bir mobil bağışıklık hücrelerinin yokluğunda, bitkiler lokalize programlanmış hücre ölümü ve Sisteme Etki Eden Kazanılmış Direnç patojen saldırısına karşı kendilerini savunmak için kullanmaktadır. Genel bitki bağışıklık tepkisinin belirli bir Arabidopsis geni katkısı spesifik olarak ve kantitatif olarak enfekte olmuş doku içinde patojen büyümesinin tahlil ile değerlendirilebilir. Üç yılı aşkın süredir, hemibiotrophic bakteri Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (Psm ES4326) yaygın Arabidopsis bağışıklık tepkisini altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için bir model patojen olarak uygulanmıştır. Yaprak dokusuna patojenleri teslim etmek, birden fazla aşılama yöntemleri kurulmuştur, örneğin, şırınga sızma, daldırma aşılama, sprey, vakum infiltrasyon ve sel aşılama. Aşağıdaki protokol yetişkin yaprakları içine zehirli Psm ES4326 sunmak için optimize edilmiş bir şırınga sızma yöntem açıklanırArabidopsis bitkileri, toprak yetiştirilen ve doğru bu patojenin yönelik artan hastalık yatkınlık (EDS) için ekran. Buna ek olarak, bu protokol daha Salisilik Asit (SA) -Triggered Bağışıklık (STI) ve MAMP-Tetikledi Bağışıklık (MTI) dahil bitki savunma farklı katmanları, içinde belirli bağışıklık kusurları incelemek için birden fazla ön tedaviler ile takviye edilebilir.

Introduction

Nedeniyle sapsız doğası, bitkiler sürekli çeşitli yaşam tarzları ve beslenme stratejileri 1 sergileyen patojenlerin bir bolluk tarafından tehdit edilmektedir. Nekrotrofik patojenler aktif gizli toksinler ve enzimler konak dokusunu öldürmek ve ölü hücreleri 1 beslemek için ise bir ilk yaklaşım için, biotrophic patojenler, besin almak için hayatta onların ev sahibi korumak. Patojenler olarak adlandırılan hemibiotrophs başka bir grup, patojen birikimi 2 belli bir eşik ulaştıktan sonra nekrotrofik sahneye biotrophic sahne ve vardiya ile enfeksiyon kursu başlıyor. Etkili bu mikroorganizmalara karşı kendilerini savunmak amacıyla, bitkiler patojen saldırı tespit ve tetiklemek için birden fazla gözetim mekanizmaları ile donatılmış karmaşık bir doğal bağışıklık sistemini geliştirmişlerdir hücre ölümünü 3 yanı sıra Sistemik Kazanılmış Direnç (SAR) 4 programlanmış lokalize. Mevcut araştırma temel sig karakterize odaklanmıştırnaling bileşenleri ve bitki bağışıklık sistemi 5 içinde çapraz görüşmeler.

"Zik-zak" modeli 5 önerildiği gibi, bitki doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin birinci tabaka bir mikrop istilasına tespit etmek için, plazma membran lokalize bir görüntü tanıma Reseptörler (PRR) varlığını gerektirir. PRR'ler Mikrop İlişkili Moleküler Desenler (MAMPs) tanımak ve MAMP-Tetikledi Dokunulmazlık (MTI) 6 kurabiliyoruz. Antimikrobiyal PR proteinleri 7 kodlayan genlerin transkripsiyonel bir regülasyonunu indükleyici yanı sıra, MTI hücre duvarına reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ve reaktif nitrojen (RNS), kaloz birikimini içeren patojen büyümesini tutuklama etkinlikleri çeşitli yol açar yanı sıra birden fazla kinaz sinyal aktivasyonu 8 yolaklarıyla olarak.

Şimdiye kadar, çok sayıda bakteriyel MAMPs flg22 9 da dahil olmak üzere, Arabidopsis'te MTI tetiklemek için tespit edilmiştir 10 (bakteriyel için uzatma faktörü Tu 18 amino asit), 11 peptidoglikanlar. Başarılı bir enfeksiyon kurmak için, bazı özel patojenler, hücre içi veya hücreler arası boşluklar içine gizli virülans efektör proteinleri yeteneği gelişti ve dolayısıyla MTI bastırmak ve Efektör-Tetikledi Hassasiyetinin (ETS) 12,13 tetikleyebilir var. Örneğin, hastalık oluşturma efektörler enfekte olmuş doku 14-16 içinde hastalık gelişimini azaltmak için TEB Mitojen Aktive Protein Kinaz (MAPK) fosforilasyon kaskadlar etkisiz hale getirebilir. Host ve patojen arasındaki dinamik işbirliği evrimi sırasında, bitkiler de efektör proteinleri tanır ve patojen hastalık oluşturma 17 molekülleri azaltmak için kontra strateji geliştirmiştir. Bu, doğrudan veya dolaylı efektör tanıma hastalık direnci (R) proteinleri 18 aracılık eder. T çoğuetek NB-LRG üyeleri (nükleotid Bağlama ve Lösin Zengin Tekrarlar) ailesi 19 vardır. R proteini tarafından avirulent efektör algısı Efektör-Tetikledi Bağışıklık (ETİ) 20 olarak karakterize güçlü ve daha geniş bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır. Savunma genlerinin 21 ekspresyonunu ve savunma metabolitlerinin 22 üretimini indükleyen yanı sıra, ETİ genellikle komşu doku 3 içine yayılmasını kısıtlamak için patojen Hiperduyarlı Cevap (HR) olarak bilinen bir hızla lokalize programlı hücre ölümüne yol açar.

Programlanmış lokalize hücre ölümü 23 ek olarak, bitkileri (SAR) 4 Sisteme Etki Eden Kazanılmış Direnç olarak adlandırılan uzun süreli ve sistem genelinde bir bağışıklık tepkisi başlatılması yeteneğine sahiptir. Bir biotrophic patojen ile tehditten sonra, bitki hücreleri, lokal ve sistemik dokularda 24 hem de endojen fitohormon salisilik asit (SA) ve PR proteinlerinin sentezini ve birikimini tetikler. T yoluylaHer ne kadar süreç, hazırlık yüksek bir durumu patojenlerin 24, geniş bir spektrum ile daha sonraki bir enfeksiyona karşı savunma davranışlarını sırasında daha hızlı bir montaj sağlar enfekte edilmemiş yaprak elde edilir. SA ve örneğin benzo gibi sentetik analogları (1,2,3) tiadiazol-7-karbotioik asit S-metil ester (BTH) ve 2,6-dikloroizonikotinik asit (INA) kimyasal Salisilik asit uyarabildiğinden (SA) dış uygulama 24 üzerine -Triggered Bağışıklık (STI). Patojenesis-ilgili genler 1 (NPR1) arasında Nonexpressor lokal ve sistemik dokularda 21,25,26 hem de SA aracılı savunma cevabı sırasında büyük bir kopyalama düzenleyicisi SA reseptörleri ve işlevlerinden biri olarak kabul edilmektedir. Bu kesin NPR1 SAR kurulması için gerekli olan ve NPR1 kaybı, Pseudomonas syringae'ye 25 doğru dramatik bir duyarlılığa yol açtığı gösterilmiştir.

Yoğun bitki moleküler katkı karakterize etmek içinbitki-patojen etkileşimlerine bileşenleri, çok sayıda biyo-deneyler, ROS 27 patlama da dahil olmak üzere, belirli bir savunma etkinlikleri ölçmek için protein ürünlerinin 21 kaloz birikimi 28 savunma genleri ekspresyonunu ve birikimini geliştirilmiştir. Bu bireysel deneyler bitki bağışıklık tepkisinin özel bir forma anlayış sağlamak mümkün olmakla birlikte, bunların hiçbiri, ancak, tüm tesis düzeyinde tam bir savunma yanıtı temsil edebiliyoruz. Bunun aksine, enfeksiyondan sonraki patojen büyümesinin miktar organizma seviyesinde bağışıklık tepkisinin genel bir tahmin sağlar. Bu nedenle, kesin ve son derece standart patojen aşılama testinin geliştirilmesi ve optimizasyonu Arabidopsis bağışıklık tepkiler üzerine araştırma ve keşifler kadar yakıt için kritik öneme sahiptir.

Pseudomonas syringae, bir Gram negatif bir bakteridir, Arabidops da dahil olmak üzere bitki hücrelerine bir dizi hastalığa neden olabilen bir fitopatojenin olarak tanımlandı29 olduğunu. P. - Model bitki-patojen sistemi, Arabidopsis gibi syringae etkileşim yaygın moleküler mekanizmaları altında yatan bitki savunma yanıtları 29 anlamak için uygulanmıştır. Şimdiye kadar, üzerinde 50 P. Syringae pathovars farklı bitki türlerinin 30 bulaştırmak için kendi yeteneklerine göre tespit edilmiştir . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 ve P. syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) 32 iki en yaygın olarak kullanılan ve yaygın karakterize öldürücü suşlar vardır. Kenara bitki tarafından tanınan ve MTI yanıtı tetikleyen olmaktan, Pst DC3000 ve Psm ES4326 MTI bastırmak ve patojen büyüme 31,33 lehine ETS tetiklemek için öldürücü efektör proteinleri salgılayan yeteneğine sahiptirler.

Işlevsel Arabidopsis ve P. etkileşimini incelemek syringae, çoklu0; patojen enfeksiyon yöntemleri patojen teslim yaklaşımına dayalı geliştirilmiştir. Toprak yetiştirilen bitkiler için patojen şırınga infiltrasyonu, vakum infiltrasyonu, daldırma aşılama ve sprey aşılamadan 29,34 ile teslim edilebilir. Son zamanlarda, fide sel aşılama tahlil doku kültürü üzerinde büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için geliştirilen genç Arabidopsis bitkiler 35 plakaları yetiştirilen. Şırınga sızma, en sık kullanılan yaklaşım olarak, elle stoma 29 olarak adlandırılan doğal yaprak deliklerden apoplast içine patojeni sunar. P. Bu yaklaşım sayesinde, eşit miktarlarda syringae enfekte kanadı içine sızabilir ve bitki bağışıklık tepkisinin gücü ters patojen artışı seviyeleri ile bağıntılıdır. Bu nedenle, patojen büyümesinin ölçümü bütün bitki düzeyinde bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmek için en uygun yaklaşım olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, şırınga infiltrasyonu lokal ve sistemik doku ayırt edebilirsiniz, hangi olabilir bSAR 36 altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize uygulanabilir e.

Aşağıdaki protokol, artan hastalık yatkınlık (EDS) için Arabidopsis mutantlar ekrana Psm ES4326 ile optimize edilmiş şırınga sızma testi açıklar. Bu protokol, iki Arabidopsis genotipleri istihdam sağlayacak: vahşi tip ekotipinin Columbia-0 (Col-0) bitkileri (kontrol) ve npr1-1 kayıp fonksiyon-mutantlar (hypersusceptible) Bu öldürücü bakteri suşu Psm ES4326 37 ile enfekte olacaktır. Npr1-1 mutant tirozin son derece korunmuş histidin değiştirir ve 25 fonksiyonel olmayan protein işler NPR1 molekülünün ankirin-tekrar konsensüs dizisi içinde bir nokta mutasyonu taşır. Buna ek olarak, şırınga süzme analizinde modifikasyonları bir dizi MTI ve STI da dahil olmak üzere bağışıklık tepkisi, spesifik tabakalar kusurların kantifikasyonuna izin veren bu tarif edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki metni Arabidopsis'de Psm ES4326 şırınga sızma deneyi optimize gerçekleştirmek için adım adım bir protokol açıklar. Bu deneyde başlıca işlemleri basitleştirilmiş bir akış şeması (Figür 1) yer almaktadır.

1. Bitki Büyüme Koşullar

  1. Sow tohumlar
    1. Gevşek alt O onları iliklerine toprak ve su kapları ile doldurulmuş 2 tencere (çapı 4, uzun boylu 3.75) hazırlayın / N fazla suyu boşaltmadan önce.
    2. Levha ya da diğer kağıt ağırlığında katlanmış 70 mm, her saksı, 50-100 Arabidopsis tohumu, yabani-tür Col-0 veya npr1-1 mutant ekmek.
    3. % 80-90 (Şekil 2A) için bağıl nemi arttırmak için su püskürtülür şeffaf bir kubbe ile tencerenin kapağını kapatın.
  2. Tam tabakalaşma ve senkron filizlenmesi için izin vermek için 72 saat boyunca 4 ° C'de pot inkübe.
  3. Standart büyüme koşulları pot aktarın (12 saat ışık/ 12 saat karanlık, 21 ° C, ışık yoğunluğu 100 mol / m 2 / sn, bağıl nem% 40) tohum çimlenme için izin vermek. Su yoğunlaşmasını önlemeye yardımcı olacaktır büyüme odası, transferinden sonra hemen açılması bir 2-3 oluşturmak için kubbeyi Crack.
  4. Ilk gerçek yaprak uzunluğu 2-3 mm boyuta ulaştığında, düz toprak ile doldurulmuş 72 kuyu pot fidan nakli.
    1. Düz toprak yüzeyinin ortasında 1-derin depresyon oluşturmak için parmağınızı veya 1 ml pipet kullanın.
    2. Yavaşça mümkün olduğunca az kök hasarı ile bireysel fidan ayırın. Dikkatle forseps ile sağlam köklere sahip fide pick up.
    3. Depresyon içine nakli şok aza indirmek ve yavaşça depresyon doldurmak için çevredeki toprağı aşağı pat yapışan toprak simler ile birlikte tek ayrılmış fide yerleştirin. Biyolojik tehlikeli atık kabına ilave fide ve toprak atın ve uygun imhaYerel biyolojik tehlike atık kurallarına.
    4. Su üstten fide aktarılır ve tamamen% 80-90 nem korumak için su püskürtülür şeffaf bir kubbe ile düz kapak. Daha sonra 4 gün sabahı kubbesi çatlak ve tamamen o günün sonunda çıkarın, 3 gün boyunca kubbeyi tutun.
      Not: Ekim tohumlar alternatif düz toprakla dolu bir 72-kuyu üzerine bir cam pipet ile 2-3 tohum aktarılması, ardından 4 ° C'de 48 saat boyunca 1 mi,% 0.1 agar ihtiva eden 1.5 ml santrifüj tüplerine katmanlaştırıcı tohumları ile gerçekleştirilebilir. Yassı çimlenme sonrası bir hafta çıkarılabilir şeffaf bir kubbe ile kaplı olması gerekir. İlave fideler oyuk başına sadece bir fide bırakmak için çıkarılabilir.
  5. 20 dakika için 1-su içinde daire ıslatılmasıyla Su bitkileri her iki günde bir, daha sonra fazla suyu tahliye.
    Not: sulama tesisleri için zaman aralığı büyüme odası nem bağlıdır ve kararlı taban olması gerekirKullanıcının bitki büyüme tesisinin sürekli gözlem d. Onlar iyi sulanan emin olmak için her gün bitkileri kontrol edin. Sadece birkaç noktalar, su fışkırtma bir şişe üst gelenler bitkilerin kurutulması durumunda.
  6. Ya da büyüme koşulları (photoperiod, sıcaklık) bağlı olarak 3-5 haftalık karşılık gelişim aşaması # 3.50 (rozet boyutu% 50 bitmiş boyut), yakın bitkiler üzerinde patojen enfeksiyonu tahlilleri (Adım 3-5) gerçekleştirin. Çiçeklenme ortaya çıkması (evre # 5) yaşa bağlı direnç 38,39 başlangıcından sonra bitkiler bulaştırmak etmeyin.

Kültür Medya ve Tabaklar 2. Hazırlık

  1. Kral'ın B (KB) sıvı ortam 1 L olun. Yavaşça 1000 ml görünür pelet yoktur 2 O kadar deiyonize H ile bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak 20 g proteoz pepton ve 2 g potasyum fosfat dibazik trihidrat karıştırın. 20 dakika bir sıvı döngüsü 150 ml'lik bir cam şişe içine kısım 100 ml otoklav.
  2. HazırlamakKB katı ortam ile kültür plakaları.
    1. Yavaşça 20 gr Proteoz peptonlu, 2 gr Potasyum Fosfat Dibazik Trihidrat ve 1000 ml 15 gr Agar deiyonize H 2 O karıştırın Otoklav.
    2. Gelecekteki yoğunlaşmayı en aza indirmek ve antibiyotik bozulmasını önlemek için dokunmak serin kadar bir manyetik karıştırıcı plaka üzerinde orta soğutun. Ortam 1 ​​M MgSO 4 steril 18 ml steril% 80 Gliserol ve 5 ml. Psm ES4326 50 ug ml bir son konsantrasyona kadar soğutuldu ortamı içine streptomisin ekleyin streptomisin karşı direnç taşıdığı göz önünde - 1.
    3. Plakaları dökün. 100 mm x 15 mm ve 150 mm x 15 mm Petri kapları: KB medya plakaları iki farklı boyutta hazırlayın. Daha küçük Petri içeren ortam birincil bakteri kültürü plakası olarak hizmet verir ve bakteri plaka sayma gibi büyük Petri kabı vermektedir.
      Not: plakaları sayma bakteriler için, dikdörtgen şekilli plakalar azaltmak için kullanılabiliriki katı kadar tedaviler geleneksel yuvarlak plakalara göre plaka başına çizilebilir beri sarf maliyet.
      1. Enfeksiyon deney öncesinde plakaları dökün. Streptomisin sülfat yana kadar 3/2 ay 4 ° C'de saklayın KB aracı madde içinde plakaları kademeli antibiyotik aktiviteye 40 kaybeder.

3. Gelişmiş Hastalık Duyarlılık (EDS)

  1. 1. Gün - plaka üzerinde Streak bakteri
    1. İki gün EDS analizden önce, çizgi Psm ES4326 den -80 ° C gliserol stoğundan ° BB-Strep bakteriyel kültür levhası ve 24-48 saat süre ile 28 ° C'de inkübe edin.
  2. 2. Gün - sıvı kültür ve su bitkileri başlatmak
    1. , 28 ° CO / N 1 streptomisin ve 250 rpm'de sallamak - 50 ug ml içeren 4 ml sıvı KB ortamı ile steril bir test tüpünde, sıvı kültürü başlatmak.
      Not: EDS enfeksiyonu testi için, genotip tavsiye edilir başına 6 bitkileri kullanaraked. STI ve MTI testlerde, tedavi başına genotip başına 6 bitki tavsiye edilmektedir. Bakteri inokulum için, 0.3 ve 0.6 arasında λ 600Nm optik yoğunluk ile taze sıvı bir kültürün kullanımı tavsiye edilir.
    2. Mark örnekleme enfekte doku kolay tanımlama için bir künt uçlu su geçirmez işaretleyici ile yaprakları sayısı 5 ve 6 sapı (Şekil 1). Stoma açılmasını geliştirmek ve yaprak haline patojen çözümün girişini kolaylaştırmak, 20 dakika boyunca alttan düz iliklerine iyi bitkileri sulamak için, daha sonra aşırı suyu boşaltın.
      Not: Alternatif olarak, şeffaf bir kubbe ile düz kapak ve stoma açıklığı arttırmak için 2-4 saat boyunca suya daldırın.
    3. 3. Gün - Patojen seyreltme ve şırınga infiltrasyonu
      Not: Sabah saatlerinde Patojen enfeksiyon duyarlı genotiplerin en belirgin hastalık belirtilerinin patojen çoğalması ve gelişmesi için en uygunudur. Infect tutmak için her türlü çabayıTutarlı iyon zamanlama deneysel tekrarlamalı arasında varyasyon azaltmaya yardımcı olur sirkadiyen ritimler ve gündüz gen regülasyonu 41,42 etkisini ortadan kaldırmak için.
      1. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 9600 x g'de mikrosantrifüj tüpü içinde 1.5 ml bakteri kültürü Pelet ve supernatant atın. Steril 10 1 ml mM MgCl2 ile bakteri pelletini.
        Not: Magnezyum katyonları P. motilitesini ve yapışma artırabilir Syringae 43.. Alternatif olarak, aynı konsantrasyonda MgSO 4 kullanın. Steril su Mg tuz çözeltileri için kabul edilebilir bir alternatiftir.
      2. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 10 mM MgCl2 9 ml bakteri süspansiyonu seyreltilir ve λ = 600 nm bir spektrofotometre ile bakteri optik yoğunluk (OD) ölçün. Nihai OD 600Nm 10 mM MgCl2 = EDS enfeksiyonu tahlili için 0.0002 ile bakteri ile seyreltilir.
      3. Yaprak InfiltrateSeyreltilmiş bir bakteri çözeltisi ihtiva eder (genel olarak insülin şırınga olarak da bilinir) bir 1 ml'lik kör uç iğnesiz şırınga.
      4. Tam kapasite ile şırınga kadar doldurmayın. Sızma işlemi sırasında çok daha iyi bir kontrol sağlamak için 0.5-0.6 ml ile doldurun.
      5. Işaret parmağı üstünde yaprak alt yüzeyini Açığa, yavaşça başparmak yardımıyla yaprak konumunu ayarlamak. Bu basınç eşit dağıtılmış sağlamak için yaprak yüzeyine dik şırınga yerleştirin. Yaprak hasarı azaltmak için sızma sırasında yaprak orta damarı alanı önlemek için deneyin.
      6. Yavaşça bakteriyel çözüm sızmaya pistonu itmek; koyu renkli bir yaprak rengi ile gösterildiği gibi yaprak mezofil sıvı girişi görselleştirilecektir. Yaprağın tüm yüzeyini sızmak deneyin. Bu, tek bir girişimde başarılı değilse, başka bir infiltrasyon nokta seçin ve tüm yaprak yüzey kaplı kadar yukarıda açıklanan işlemleri tekrarlayın.
      7. Tamamlandığında, yavaşça ilave patojen çözüm kaldırmak için emici dokusu ile yaprak leke. Görme hasar için enfekte yaprak dokusu inceleyin.
        Not: sızma tamamlandıktan sonra dairesel şırınga izlenim görünür olmamalıdır.
      8. Orijinal büyüme koşulları içine dönmeden önce 1-2 saat kurumaya sızmış bitkiler bırakın. Sonraki su ile net bir kubbe sprey ve kapağı enfekte bitkiler 2 saat sonra açılış bir 2-3 üretmek ve enfeksiyon deney geri kalanı boyunca bunu bırakmak kubbeyi çatlak.
        Not: P. yana Syringae aynı tesiste yetiştirilen diğer bitkilere enfeksiyöz ajanı yayılma riski yoktur, bir havadan patojen değildir. Ancak, ilave bir önlem olarak, yakınlarda bulunan virüslü bitkiler ve diğer deneysel bitkiler arasındaki fiziksel temastan kaçının. Şeffaf bir kubbe ile düz Kaplama patojen virülansını artırmak ve hastalığın ilerlemesini hızlandırır.kaplama dönem bu adımı ve optimal süresi, kullanıcının bitki büyüme tesisinin nem koşullarına göre tespit edilmesi gerekmektedir ihtiyacı.
    4. 5. Gün - medya plakaları ön kurutmaya
      1. Soğuk depolama biriminin dışına 150 mm x 15 mm KB plakalarını alın ve plaka üzerinde herhangi bir ön mevcut su yoğunlaşmasını kurulayın. Yaklaşık 24 saat boyunca oda sıcaklığında tutularak kuru tabaklar. Bu işlemi hızlandırmak için, 30-60 dakika boyunca kırık onların kapaklı bir laminer akış kaputu koyun.
        Not: Bu adım, bir sonraki aşamada plaka yüzeyinde dairesel bir damlacık oluşumu için kritik önem taşır.
    5. Gün 6 - patojen büyümesini nicel
      Not: Aşağıdaki patojen miktar prosedür bakterilerin eşit miktarda bitkiler yaprak morfolojisi değiştirmiştir, özellikle yaprak halinde teslim edilmektedir teyit etmek için enfeksiyondan sonra erken zaman noktalarında gerçekleştirilebilir.
      1. Ortaya çıkmasının ardından enfekte doku işleyinkloroz duyarlı genotiplerde enfekte dokuların sararma ile gösterilen ancak nekrotik lezyonlar gelişimi (Şekil 2B) daha önce.
        Not: Önerilen örnekleme süresi üç gün patojen aşılamadan sonra olduğunu. Patojen büyüme çevresel bir dizi faktöre bağlı olduğu, ancak, inkübasyon süresi 2 ½ 3 ½ günlük bir aralık içinde değişebilir ve kullanıcının bitki büyüme imkan enfeksiyon ilerlemesinin dikkat gözlemlerle tespit edilmesi gerekmektedir olabilir.
        1. Her genotip (Şekil 1) 6 taşlama tüpleri hazırlayın. Bir paslanmaz çelik öğütme topu yerleştirin ve her bir tüpe 10 mM MgCl2, steril 500 ul ilave edin.
        2. Bitki enfekte yaprak ayırın ve 1 delikli kağıt zımba (Şekil 1) ile bir yaprak diski yumruk.
          Not: örnekleme hatasını en aza indirmek, aynı pozisyonda her örneklenmiş yaprak yumruk deneyin. Üst yaprak diskinin Örneklemeyaprağın tavsiye edilir.
        3. Rasgele forseps kullanarak her öğütme tüpe (iki farklı bitkilerden) 2 yaprak diskleri yerleştirin.
        4. Tüp kapatın ve 10 dakika süreyle maksimum hızda yüksek verimli bir homojenleştirici (dakikada 1600 vuruş) ile doku homojen hale getirilir. Doku iyi homojenize ve çözümleri nedeniyle enfekte yapraklardan klorofil sürümüne yeşile kadar gerekirse bu işlemi tekrarlayın.
      2. Homojenizasyon için beklerken, çok kanallı bir pipet ve pipetleme rezervuarı kullanarak 180 ul 10 mM MgCl2, 96 oyuklu bir kültür plakasına ilk 6 satır doldurun.
      3. Öğütme işleminden sonra, 96-kuyulu plakanın ilk sıraya temel doku süspansiyonu 20 ul transfer ve sıvı yukarı ve aşağı pipetleme tekrar karıştırılır. Küçük doku parçaları ucu yapışmasına neden olursa, çözümün doğru hacmini edinmelerine yardımcı 2-3 mm tutturun.
        1. Üst o üzerinde damlacık için yeterli alan sağlamaklevha, uzay alternatif sıralardaki farklı genotipleri doku (Şekil 1) f. On kat seri seyreltme hazırlamak için, ikinci satıra 20 ul sıvı transferi ve altıncı seyreltme kadar bu işlemi tekrarlayın.
      4. Aktarım ayrılır pipet uçları (Şekil 1) kullanılarak 150 mm x 15 mm KB plaka üzerine 96-yuvalı plaka çözeltisi 20 ul. En yoğun en inceltilmiş süspansiyon çalışın.
        Not: En konsantre seyreltilmiş çoğu hareketle gereksiz seyreltilerde arasındaki pipet uçları değiştirmek için yapar. Plaka de önceden kurutulmuş ise (genellikle 15-30 dakika) absorbe kadar aktarılan damlacık ortamı üstünde sağlam kalmalıdır. Kuruma süresi, oda sıcaklığında ve nem ile değişir.
      5. Kapak kırık ile oda sıcaklığında plaka kurulayın. Artık sıvı plaka yüzeyinde görülebilir kez kapak, ters kapatın ve oda sıcaklığında plaka ya da 28 ° C inkübatör inkübe.
      6. Koloniler görünür hale gelene kadar 40-60 saat inkübe. Tabakalarına büyüme oluşturan üniteler (cfu) oluşturan koloni öngörülebilir 10 misli bir düşüş (Şekil 2C) yansıttığını teyit edin. Onlar büyümek ve koloniler sigorta önce bakteri sayın. Örtüşen kolonileri yok düşük sulandırma bakteri sayısını belirler. Genellikle tercih edilen seyreltme 10-50 koloniler arasında içerecektir sayılacak.
        Not: Varyasyon teknik çoğaltır arasında mevcut olabilir; Bu nedenle, her bir deney için düşük seyreltme ayrı belirlenmelidir.
      7. Bakteriyel çoğalma seviyelerini hesaplamak için, üst üste (R) yanı sıra, yazılı olarak, her teknik tekrarında (T) içindeki bakteri sayısı sayısı belge. Koloni oluşturan birim sayısını belirler - formülü ile kob / yaprak disk: kob / yaprak disk = (T × 10 R / 20) 500/2 ×
      8. Süreden için aşağıdaki elektronik tablo şablonda verileri yazınbir grafik (Şekil 1) ce (elektronik tablo veri analizi şablon dosyası için, Tablo 2). Her veri noktası, logaritmik ölçekte altı teknik kez tekrarlanan deneyin ortalaması olarak ifade edilir. Hata çubukları, ortalamanın% 95 güven aralığını temsil eder (n = 6).
        Not:% 95 güven aralıkları hesaplanması teknik çoğaltır sayısına göre ayarlanması gerekir.

4. SA-Tetikledi Bağışıklık (STI)

  1. 1. Gün: Adım 3.1 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayın.
  2. Gün 2: Sıvı bakteri kültürü (Aşama 3.2) bitkiler sulama ve başlatılması yanı sıra, SA türevi sodyum salisilat 21 dış uygulama tarafından direnci sağladığım göstermektedir.
    Not: Saf SA zayıf suda çözünürlüğe sahiptir ve daha önceki pH ayarlama gerektiren, böylece, bu tahlil için tavsiye edilmez.
    1. P. karşı SA aracılı savunma indüklemek için syringae ve gelecekteki enfeksiyon 21 için prime bitkiler,(Sahte gibi) iyi bir 1 mM sodyum salisilat buğu veya H2O ile 24, püskürtme bitkileri patojen enfeksiyonundan önce 16-24 saat.
  3. 3. Gün: = OD 600Nm için 0.001 patojen seyreltme hazırlayın ve şırınga infiltrasyon (Adım 3.3) ile tüm yaprak yüzeyine bakteri itin.
  4. 6. Gün: EDS tahlili (Adımlar 3.4 ve 3.5) için tarif edildiği gibi patojen ölçümü ve sayım işlemi için, prosedürü izleyin. Plaka ve saymak H 2 O ve Sodyum Salisilat - ayrı ön işlem örnekleri. Ön-muamele sistemleri - vahşi tür Arabidopsis thaliana için patojen büyümesinde 1-2 log azalma Sodyum Salisilat beklenmektedir.

5. MAMP-Tetikledi Bağışıklık (MTI)

Not: Bu deneme içinde, bizler, vahşi tip Arabidopsis Col-0 ve mutant fls2 ve efr kullanılan bitkiler. FLS2 ve EFR plazma membran lokalize Örüntü Tanıma Reseptörler (PRR) flg22 ve elf18 tanıyabilir, respe vardırctively 9,10. Psm ES4326 dış MAMP tedavi öncesi ve şırınga infiltrasyonu, aşağıdaki mutant değişmeden patojen büyümesinin ile gösterilir MAMP, spesifik tipte bir duyarsızlık her PRR sonuçları kaybı.

  1. Gün 1 ve 2: Adım 3.1 ve 3.2 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayın.
  2. 3. Gün: MAMP, tedavi öncesi ve patojen enfeksiyonu
    1. , MAMP-Tetiklemeli Dokunulmazlık kurmak flagellin epitop flg22 veya EF-Tu epitop elf18 ve 1 mcM solüsyonu hazırlamak için patojen enfeksiyonu (Adımlar 3.3.3-3.3.6) önce tüm yaprak yüzey 4 saat içine şırınga-sızmak. Bu P. karşı MAMP aracılı savunma indüksiyonu için sağlayacak syringae ve başbakan gelecek enfeksiyonu 6,37 için tesisler.
      Not: Kamuya açık mikrodizi verileri flg22 ya elf18 tedavi 37.44'ü sonra 4 saat olur MAMP duyarlı genlerin yüksek transkripsiyon yeniden programlanması saptandı. Bu durumda, 4 saatlik önerilirCol-0 MAMP ile muamele edilmiş ve fls2 ve efr mutantlar arasında patojen büyümesinin açık bir fark elde sonuçlanır MAMP ön işlem süresi.
    2. Emici doku ile ekstra MAMP çözüm çıkarın ve yaprak içindeki sıvı emme sürecini hızlandırmak için ortaya bitkiler bırakın. Şırınga basınç infiltrasyonu yaraladı etkisi hesaba katmak için, kontrol bitkilerinin yaprakları içine H 2 O sızmak.
    3. OD 600 nm için patojen seyreltme hazırlayın = 0,001 MAMP / H2O ile önceden işlemden geçirilmiş bir şırınga infiltrasyonu ile yaprak (Aşama 3.3) tüm yaprak yüzeyine bakteri itin.
  3. 6. Gün: Adım 3.4 ve 3.5 de tarif edildiği gibi patojen ölçümü ve sayım işlemi için, prosedürü izleyin. Plaka ve ayrı ayrı H 2 O ve MAMP-ön tedavi örnekleri sayılır. Yabani tip Arabidopsis, patojen büyümesinde 1-2 log azalma kısmen güçlü olan, MAMP ön tedavisi yapılmış bitkilerde beklenmektedirflg22 aracılık ettiği er redüksiyon elf18 için karşılaştırıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklamak protokol optimize edilmiş P. temsil syringae şırınga sızma deneyi nicel Arabidopsis bitkilerde bağışıklık tepkisini değerlendirmek için. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, Psm ES4326 şırınga infiltrasyonu sulandırılmış hali ve koloniler numaralandırma ile patojen ekstre edilmek ve nicelendirilmek izlemektedir.

Protokol metin içinde Aşama 3'de tarif edildiği gibi, Psm ES4326 karşı Geliştirilmiş Hastalık Duyarlılığı (EDS) OD = 0,0002 olan bir inokulum ile enfeksiyon ile değerlendirilebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, yüksek ölçüde hassas npr1-1 mutantlar vahşi tip Col-0 bitki ile karşılaştırıldığında, yaklaşık 2,5 log (300 kere) daha fazla patojen bir büyüme bulunmaktadır. Deneysel koşullara göre, npr1-1 bitkiler 1.5-2.5 log aralığında en yaygın sonuçları, Col-0 den 3,0 günlüğüne daha fazla bakteri büyümesini destekleyebilir. Bu nedenle, bu EDS eşekay araştırmacılar potansiyel bitki bağışıklık tepkisi katılan aday genleri tanımlamak için onların Arabidopsis mutantlar ve transgeniklerle yerleştirmek mümkün olabilir ki farkı çok geniş bir pencere sağlar.

EDS belirlemeye ek olarak, Psm ES4326 şırınga infiltrasyon deney bağışıklık tepkisinin farklı katmanları incelemek için modifiye edilebilir. Salisilik asit-tetikli Bağışıklık değerlendirmek için, kimyasal Sodyum salisilat dış uygulama patojen büyüme (Şekil 4A) ile belirlenir bağışıklık tepkisini tetiklemek için kullanılır. SA-bağımlı hedef genlerinin SA reseptörü ve ana transkripsiyonel ko-düzenleyici olarak işlev NPR1 kaybı, salisilik asit türevinin egzojen uygulaması duyarsızlık yol açar. SA Bu duyarsızlık Col-0 bitkilerinde belirgin bir azalma aksine npr1-1 Sodyum Salisilat önceden muamele edilmiş bitkilerde değiştirilmemiş patojen artışı (20 kat daha az Pathog ile gösterilmiştir Sodyum Salisilat uygulanması üzerine en) (Şekil 4B).

Şekil 5A'da gösterildiği gibi flg22 ya elf18 ile MAMP-tetikli Immunity, ön işleme karakterize etmek için yapıldı. Flagellin tetiklenen bağışıklık karakterize etmek için, Col-0 ve fls2 mutant bitkiler kullanılmaktadır. FLS2, bir zar-lokalize reseptör benzeri kinaz, flg22 tanır ve MTI 9 tetikler. Şekil 5B 'de gösterildiği gibi fls2 mutant bitkilerin bakteriyel gelişme yetersizliği etkisi tetiklemek için başarısız ise, flg22 ile muamele Col-0 bitki, bir p 1 log (10 kez) bakteriyel popülasyonunda bir azalma desteklenir. Benzer şekilde, EFR mutant bitkilerde EF-Tu reseptörü EFR kaybı elf18 ön tedavi (Şekil 5B), aşağıdaki değiştirilmemiş patojen büyümesinin ile gösterildiği gibi ön işleme elf18 duyarsızlık yol açar.

iles / ftp_upload / 53364 / 53364fig1.jpg "/>
Arabidopsis bitkilerinde Psm ES4326 şırınga sızma deneyi Şekil 1. şematik gösterimi. Sayı 5 ve yetişkin toprak yetiştirilen Arabidopsis bitkilerinin 6 işaretlenmiş ve şırınga infiltrasyonu ile Psm ES4326 ile enfekte bırakır. Hastalık belirtilerinin ortaya çıkması sonrasında, doku homojenizasyon için yaprakları ve hasat yaprak diskleri çıkarın. İyi homojenize doku seri plaka sayımı, bir bakteri üzerine transferinden önce 96 oyuklu plakalar içinde seyreltilir. Plaka üzerinde koloniler ortaya çıkması sonrasında, bakteri sayısını ve bir grafik oluşturmak için verileri işlemek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
EDS tahlilinde 2. Örnek prosedürler Şekil.(A) saksılar tohumların ekimi sonra su püskürtülür şeffaf bir kubbe ile kaplanmıştır. (B) Örnek semptomları Col-0 ve EDS analizine tabi npr1-1 yaprak (OD 600 nm = 0,0002) ile 3 gün aşılamadan. Npr1-1 şiddetli kloroz ve Col-0 hemen hemen normal görünümünü unutmayın. (C) KB büyüyen Psm ES4326 Seri dilüsyonları medya plaka (/ ml streptomisin 50 mg) sonra ~ inkübasyon 45 Hr. Beş dilüsyonları görebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
EDS testinin Şekil 3. Temsilcisi sonuçları Psm ES4326 büyüme (koloni oluşturan birim -. Cfu / yaprak disk, expBir günlük ölçeğinde sıkıştırıldı) 4 haftalık Col-0 ve npr1-1 bitkilerde ölçüldü 3 gün) OD 600Nm = 0.0002 (aşılama sonrası. Hata çubukları, ortalamanın% 95 güven aralıkları temsil (n = 6). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Örnek prosedürü ve STI tahlilinin sonuçları (A). Salisilik Asit-tetikli Immunity şematik temsili (STI) deneyi. (B) Salisilik Asit-tetikli Bağışıklık bitkilerde patojen artışı ile nicelleştirilmiştir 1 mM ile önceden tedavi Sodyum Salisilat ya H2O 16 saat önce PSM ES4326 şırınga infiltrasyon (OD 600 nm = 0.001). Patojen büyümesi 3 ölçüldügün aşılama sonrası. Hata çubukları, ortalamanın% 95 güven aralıkları temsil (n = 6). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Resim 5. Temsilcisi prosedürü ve MTI tahlil sonuçları. (A) MAMP-tetikli Bağışıklık şematik gösterimi (MTI) deneyi. (B) MTI bitkiler 2 O 4 saat (kontrol olarak) önceden PSM flg22, elf18, H 1 uM çözeltisi ile önceden tedavi edilen patojen büyümesinin nicelleştirilmiştir ES4326 şırınga infiltrasyon (OD 600 nm = 0.001). Patojen büyümesi 3 gün aşılamadan nicelleştirilmiştir. Hata çubukları (n = 6). Ortalamanın% 95 güven aralıkları temsil he tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için yeniden.

Konu Olası nedenler Önerilen Eylemler
O / N kültürden sonra sıvı ortam içinde Bakteri büyümesi Azaltılmış bakteri aktivitesi Yeni boyanmış bir plakaya ait sıvı bir kültürün başlatın
Dairesel şırınga izlenim şırınga sızması sonrasında yaprak hediyelerini Sızma sırasında çok fazla baskı Sızma sırasında pressue azaltın
Kısmi şırınga izlenim şırınga sızması sonrasında yaprak hediyelerini Şırınga uygun olmayan konumlandırma Şırınga ayarlayın yaprak yüzeyine karşı dik konumlandırılmış olması
Yaprak wilts infiltrasyon sonra birkaç saat wthtin Çok fazla patojen çözüm yaprak içine sızmış olan Dur enfTüm yaprak yüzeyinin hemen sonra iltrating koyu renkli yeşil dönüyor
Resim hastalık semptomları, üç gün sonra enfeksiyon Patojen çoğalmaya için nem çok düşük Enfekte bitkiler korunur nem artırın
Patojen veya 3 dpi önce nekrotrofik sahne girer Patojen çözeltisinin yanlış konsantrasyonu Kullanım OD 600nm = EDS deneyi için 0.0002; indepedent spektrofotometre kullanılarak seyreltme onaylamak
Damlacıklar plaka sayma bakterilerin üstünde birleştirme Plaka sayma Bakteriler uygun kurutulmuş değil Ön kuru plakalı O / N kullanımdan önce
Patojen seyreltme 10 kat bir azalma temsil etmez Sulandırma doğru yapılmaması Sıvı aktarımı için iyi ayarlanmış çok kanallı pipet kullanın; Tüm sıvı dağıtılır onaylamak
Yabani tip Patojen büyümesi 8 log kob / yaprak diski aştığında Enfekte doku içinde Patojen overgrew - çok geç gerçekleştirilen örneklemeyi Örnek kloroz ortaya çıkmasının ardından doku enfekte
Teknik çoğaltır arasında büyük varyasyon Bitkiler aynı gelişim aşamasında olmayan veya sızmış yaprak sayısı tutarsız Sadece enfeksiyonu için aynı gelişim aşamasında olan bitkiler kullanmak. Senkron çimlenme doğrulayın. Farklı bitkiler arasında tutarlı yaprak numarasını bulaştırmak

Şırınga sızma testinin Tablo 1. Sorun.

Tablo 2 görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Patojen büyüme verilerinin istatistiksel analizi için Tablo 2. Çizelge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nüfusu mevcut arazileri azalan ve artan dünyada araştırmacılar ekin iyileştirilmesi için acil ihtiyaçları zorlanmaktadır. Verim büyük ölçüde çeşitli biyotik ve abiyotik streslere etkilenebilir. Bunlar arasında, patojen enfeksiyonu tek başına 45 ABD'de yaklaşık% 12 kayıp sorumlu mahsul verim azalmasına önde gelen nedenlerinden biridir. Bu sorunu gidermek için, masif araştırma modeli Arabidopsis'de yapılmıştır - P. syringae pathosystem kapsamlı bileşenleri ve bitki bağışıklık tepkilerinin düzenleyici mekanizmaların karakterize etmek. Burada, optimize edilmiş bir P. sunmak Syringae ES4326 şırınga sızma deneyi kantitatif bütün bitki düzeyinde bitki bağışıklık tepkisi ince farklılıkları değerlendirmek için.

Birden fazla patojen enfeksiyon deneyleri, bitki bağışıklık tepkisini 29,35 karakterize etmek için geliştirilmiş olsa da, bir şırınga sağlar infiltrasyonupatojenin eşit miktarlarda enfekte doku içine uygulanır iyi kontrollü sistem. Daldırma aşılama ve aşılamadan püskürtme dahil olmak üzere, diğer enfeksiyon tahlilleri, patojen kotiledonlar dahil olmak üzere tüm hava dokusuna uygulanır yanı sıra gerçek 34 bırakır. Bu ekotip Landsberg erecta (L er) gelen kotiledonlar çok daha duyarlı verileri çarpık ve genel hastalık direnci 34 yanlış sonuçlara yol açabilir daldırma aşılama tahlil sırasında patojen için olduğu rapor edilmiştir. Buna ek olarak, iki Anılan deneyler nem ve ışık gibi çeşitli çevresel faktörlerin tarafından kontrol edilir stoma yoluyla yaprak girmek için patojen gerektirir. Bu faktörlerin Dalgalanma şırınga süzme analizinde 35 kıyasla hastalık semptomlarının varyasyon daha yüksek bir seviyesine katkıda bulunmaktadır. Vakum infiltrasyon için, ana sakıncaları patojen çözüm zorluk büyük hacimlerde ihtiyacını içeriretkin bir şekilde zarar görmemesi ise tüm yaprakları sızmak ve önemli işgücü yoğunluğu 29. Ayrıca, sprey, daldırma veya vakumlu aşılamadan ile enfekte bitkiler bütün fide patojenin ile enfekte olduğundan kurtarmak için daha az olasıdır. Diğer yöntemler, çok sayıda sınırlılıkları gözönüne alındığında, şırınga infiltrasyon deney güvenilir gerçek yaprak olan bağışıklık tepkisini karakterize etmek için tek tip ve yüksek ölçüde öngörülebilir hastalık ilerlemesi ve patojenin hassas miktar tayinine elde etmek için tercih edilen bir yöntem olmaya devam etmektedir. Buna ek olarak, bu deney, kolayca MAMP-tetikli Bağışıklık ve sistemik elde edilmiş direnç karakterize etmek için modifiye edilebilir. Bunun yanı sıra, tekniğe gelecek vaat eden uygulamalar, bitki bağışıklık sinyalleşme ağının farklı katmanlarını incelemek veya immün bitki özel bir yolun rollerini ortaya patojen şırınga infiltrasyonun birden hormonlarının, kimyasal madde ya da inhibitörlerin ön işlemler test etkileri için uygulanabilecek yanıtı. Enfeksiyon wiGeliştirilmiş Hastalık Direnci (EDR) testi olarak bilinen bir ön-tedavi, astarlama herhangi bir savunma yokluğunda patojen (OD 600 nm = 0.001) artış doz th, mutantlann tespit edilmesi için de kullanılabilir ya da bu yöntemin diğer bir faydalı modifikasyondur hastalık direnci olan transgenik.

Bu patojen stoma aracılığı ile, yaprak doku içine doğrudan teslim edilir çünkü şırınga infiltrasyon deney savunma cevabı ön invazif aşamada karakterizasyonu için geçerli değildir dikkat edilmelidir. Patojen giriş için fiziksel bariyer görevi görür stoma kapanması, sık sık MAMP-Tetikledi Bağışıklık 46 kurulması üzerine patojen girişini kısıtlamak için tetiklenir. Buna ek olarak, fitohormondur Absisik asit pre-invaziv evre 47 sırasında stoma kapanması katkıda bulunur. Bu nedenle, püskürtme veya daldırma yöntemleri ilişkili uyarılar rağmen bağışıklık tepkisinin stoma tabakası karakterize etmek avantajlı olabiliraşılar bu tipleri ile, 29 yukarıda tartışıldığı.

Bitki-patojen etkileşimleri, çeşitli biyotik ve abiyotik faktörler tarafından değiştirilebilir olduğundan, başarılı enfeksiyon ulaşmak ve güvenilir çıktılar elde etmek için protokolde aşağıda listelenen kritik adımlardan odaklanmak önemlidir:

Bitki durumu ve bakteri faaliyetleri

Arabidopsis bitkileri kolaylıkla sub-optimal sıcaklık, kuraklık ve ozmotik stres gibi çeşitli abiyotik faktörler tarafından vurguladı ve bağışıklık çıkışı 48 müdahale hücresel yanıtları tetikleyebilir edilebilir. Bu nedenle, optimal gelişim koşulları altında, bitki büyümesi ve çevre etkilerine karşı korumak için çok önemlidir. Enfekte yaprak gelişim aşaması, aynı zamanda, deneysel sonuç değiştirebilir İlave olarak, bu sürekli bozulmaları önlemek için yaprak sayısı 5 ve 6, enfekte gereklidir. Gelişim evreleri boyunca ilerliyor, yüksek reBazı düşmanca ve avirulent patojenlere karşı direncin Arabidopsis bitkilerin üreme aşamasına vejetatif aşamada geçiş ile ilişkilidir. Gelişimsel aşamada üzerinde bu dinamik direnci (ARR) 38 Yaşa Bağlı Direnç olarak adlandırılır. Gerçek bağışıklık tepkisi ile ARR girişimi önlemek için, protokolde belirtildiği gibi doğru gelişim aşamasında enfeksiyon gerçekleştirmek ve üreme aşamanın başlangıcından sonra enfeksiyon deneyleri denemeden imtina için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, bakteri spor ve aktivite önemli ölçüde enfekte doku içinde patojen çoğalmasını etkiler. Bu yüzden, en fazla 2 gün eski yeni boyanmış bir kültür plakasına bakteriyel sıvı bir kültürün başlatmak için önemlidir.

Şırınga sızma beceri

Şırınga infiltrasyonu sırasında, iyi müdahale bilinen etkisi yaralama beri yaprak herhangi bir fiziksel zarar görmemesi için denemekSA-tetiklenen savunma bastırmak esas Jasmonik asit aracılı sinyalizasyonu ile bitki bağışıklık tepkisi, 49 yolaklarıyla. Enfeksiyondan sonra, infiltre bir yaprak tamamen herhangi bir görsel zarar vermeden normal fiziksel görünüme kurtarmak gerekir. Yeni başlayanlar için, ilk Psm ES4326 şırınga sızma testi yapmadan önce olmayan deneysel bitkileri kullanarak bu tekniği uygulamak için tavsiye edilir.

Patojen çıkarma ve seyreltme

Doğru patojen büyümesini ölçmek için, verimli enfekte bitki dokusunun dışına patojenin ayıklamak için hayati önem taşımaktadır. Diğer ekstraksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, yüksek verimli homojenizatör ile mekanik doku homojenizasyon etkili bir doku örneği ve çapraz kontaminasyon kaybı olmadan patojeni ayıklar. Daha sonra, örnek seyreltme hassas pipetleme hatasını azaltmak için güvenilir bir şekilde kalibre edilmiş çok kanallı pipet ile yapılmalıdır.Seyreltme işleminde ± 1 ul patojen büyüme miktarının bir ~ 5% fark çevirmek istiyorsunuz olduğunca az sapma. Şırınga sızma testinin daha fazla sorun giderme örnekleri için Tablo 1 bakınız.

Sonuç olarak, sayısal olarak ve güvenli bir tesisi immün tepkisini değerlendirmek için Arabidopsis optimize Psm ES4326 şırınga infiltrasyon analizi tarif etmektedir. Bu pathosystem yardımı ile, bitki-patojen etkilerinin daha iyi anlaşılması laboratuarda hızlandırılacaktır ve sonunda arazide ekin korunması için uygulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MetroMix 360  Grosouth SNGMM360
Large pots Grosouth TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts Grosouth LM1206
11x 21 Flats with no holes Grosouth LM1020
11x 21 Flats with holes Grosouth LM1020H
Vinyl propagation domes Grosouth CW-221
Proteose Peptone Fisher Scientific DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate  MP Biomedicals 151946
Agar  Fisher Scientific A360-500
Streptomycin sulfate Bio Basic Inc SB0494
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific R80150
Rectangular plate Fisher Scientific 12-565-450 
MgCl2 Hexahydrate Bio Basic Inc MB0328
Glycerol Bio Basic Inc GB0232
MgSO Bio Basic Inc MN1988
1 ml syringe Fisher Scientific NC9992493 
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-A
Grinding tubes  Denville Scientific B1257
Caps for grinding tubes Denville Scientific B1254
Stainless steel grinding ball Fisher Scientific 2150
96-well plate  Fisher Scientific 12-556-008
Sodium Salicylate Sigma Aldrich s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) Genescript Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) Genescript Made to order
Hole puncher Staples 146308
Biophotometer plus Eppendorf 952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer Fisher Scientific 02-215-503
Accu spin micro centrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl) Eppendorf 3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl) Eppendorf 3122 000.060
Pipette (20µl) Eppendorf 3120 000.038
Pipette tips Fisher Scientific 3552-HR
Sharpie permanent marker Staples 507130
1.5 ml tube Eppendorf 22363204
Forceps Fisher Scientific 08-890

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
  3. Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
  4. Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
  5. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
  6. Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
  7. Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
  8. Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
  9. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
  10. Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
  11. Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
  12. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
  13. Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
  14. He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
  15. Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
  16. Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
  17. Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
  18. Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
  19. Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
  20. Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
  21. Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
  22. Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
  23. Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
  24. Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
  25. Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
  26. Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
  27. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
  28. Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
  29. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
  30. Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
  31. Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
  32. Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
  33. Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
  34. Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
  35. Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
  36. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
  37. Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
  38. Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
  39. Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
  40. Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
  41. Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
  42. Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
  43. Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
  44. Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
  45. Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
  46. Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
  47. Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
  48. Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
  49. León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).

Tags

Enfeksiyon Sayı 104, Sistemik Kazanılmış Direnç Mikrop İlişkili Moleküler Desenler (MAMPs) Gelişmiş> ES4326 enfeksiyon şırınga sızma bitki bağışıklık salisilik asit (SA) MAMP-Tetiklemeli Bağışıklık SA-Tetiklemeli Bağışıklık
Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C.More

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter