Summary
هذا البروتوكول يستخدم تقنيات التصوير والتحليل (3D) ثلاثي الأبعاد لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا العصب على حدة. التقنيات قابلة للتطبيق على حالات أخرى حيث يتم استخدام إشارة الفلورسنت واحدة لعزل مجموعة فرعية بيانات من آخر إشارة الفلورسنت.
Abstract
والهدف من هذا البروتوكول دراسة الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال. ولذلك، تم تطوير تقنيات تصوير وتحليل 3D لعزل الميتوكوندريا العصب على حدة وتقييم التعديلات التي يسببها مرض الميتوكوندريا في تلميح القاصي من الأعصاب الحسية. يجمع البروتوكول immunohistochemistry الأسفار والفحص المجهري [كنفوكل] وتقنيات تحليل الصور الثلاثية الأبعاد لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا العصب على حدة. يتم تعريف المعلمات مفصلة طوال الإجراءات بغية تقديم مثالاً ملموسا على كيفية استخدام هذه التقنيات لعزل الميتوكوندريا العصب على حدة. الأجسام المضادة استخدمت لتسمية العصب وإشارات المتقدرية داخل أقسام الأنسجة الجلد لكمه الخزعات، الذي أعقب الفلورة غير المباشرة وضع تصور للأعصاب والميتوكوندريا مع إشارة فلورية الخضراء والحمراء على التوالي. الصور ض سلسلة تم الحصول عليها مع الفحص المجهري [كنفوكل] وتم استخدام برمجيات التحليل ثلاثي الأبعاد لمعالجة وتحليل الإشارات. فإنه ليس من الضروري لمتابعة المعلمات المحدد وصف داخل، ولكن من المهم أن تكون متسقة مع تلك التي اختارت في جميع أنحاء تلطيخ، اقتناء وتحليل الخطوات. أن قوة هذا البروتوكول هو أنها تنطبق على مجموعة متنوعة من الظروف حيث يتم استخدام إشارة الفلورسنت واحدة لعزل الإشارات الأخرى التي وإلا سيكون من المستحيل لدراسة وحدها.
Introduction
الميتوكوندريا تخدم الوظائف الخلوية الحيوية التي تشمل إنتاج طاقة الخلية، التخزين المؤقت الكالسيوم، وتنظم نخرية و apoptotic خلية الموت1،،من23. الجهاز العصبي، ارتفاع معدل الأيض مقارنة ب الجسم4 ، مما يوحي بأن الخلايا العصبية تولد درجة عالية من الطاقة الخلوية في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق التنفس المتقدرية. هناك كثير من وثائق الإثبات أن وظائف الخلايا العصبية تعتمد على ATP5، لا سيما في نهايات6. ولذلك، من المهم توزيع الميتوكوندريا في الخلايا العصبية.
الغاية ينظم على مدى السنوات العشر الماضية كثير من المعلومات قد أظهرت أن الاتجار بالأشخاص والتحام الخلايا العصبية الميتوكوندريا. وتشارك البروتينات موتور في توزيع الميتوكوندريا إلى مقصورات الهاتف الخلوي محددة في جميع أنحاء العصبية. الاتجار في الميتوكوندريا بأهمية خاصة نظراً لأن الخلايا العصبية المشروع محاور عصبية و dendrites بعيداً عن سوما. المقام الأول المباشر البروتينات موتور Kinesin anterograde (بعيداً عن سوما) الاتجار في الميتوكوندريا على طول microtubules بينما دينين البروتينات موتور الحركة الرجعية (نحو سوما) مباشرة7،8،9 , 10-وهناك الإشارات الخلوية هذا غشاء الميتوكوندريا المحتملة والتوصيل الاندفاع التي تؤثر على وجود واتجاه المتقدرية الاتجار11،،من1213.
بالإضافة إلى نقل الميتوكوندريا، هناك بروتينات متخصصة لتعريب الميتوكوندريا إلى مقصورات الهاتف الخلوي محددة التي لها مطالب الطاقة العالية، مثل رانفييه للعقد ونهايات8،14، 17-والواقع أن أغلبية الميتوكوندريا ضمن محاور عصبية من غير متحركة9،،من1318. البروتينات المتخصصة مثل الميتوكوندريا مرساة سينتافيلين إلى ميكروتوبوليس على طول محاور عصبية بينما البروتينات الأخرى الارتساء الميتوكوندريا أكتين سيتوسكيليتون19–21. أبلغ عوامل النمو والايونات مثل الكالسيوم لدعم وقف حركة الميتوكوندريا إلى ترجمة لها إلى المناطق التي تكون فيها الحاجة إليها21،،من2223.
مجتمعة، بالاتجار بالبشر والارساء من الميتوكوندريا حيوية بالنسبة لوظيفة مناسبة للخلايا العصبية. ودعما لهذه الاضطراب في الاتجار المتقدرية ارتبط مع ظروف عصبية عدة بما في ذلك مرض الزهايمر، التصلب العضلي الجانبي، شاركو-ماري الأسنان المرض، ومرض هنتنغتون، وراثية التشنجي خزل سفلي، وضمور الألياف البصرية15،،من2425،،من2627. ركزت الدراسات التي أجريت مؤخرا على خلل mitochondrial وعلم الأمراض كآلية محتملة لاعتلال الأعصاب السكري، فقدان الحواس المرتبطة بمرض السكري28،،من2930،31 ،،من3233. الافتراض أن مرض السكري يغير توزيع الميتوكوندريا ضمن إسقاطات حسية تنتهي الأعصاب الجلدي. ولذلك، تم تطوير تقنية لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال (إيينفس)، نصائح القاصي من العقدة الجذر الظهرية أفيرينتس الحسية. الأسلوب الذي يجمع بين immunohistochemistry الأسفار الخاصة mitochondrial وتسميات الألياف العصبية مجهرية [كنفوكل] اقتناء ض سلسلة من الإشارات مع برمجيات التحليل صورة 3D قوية لقياس توزيع العصب على حدة الميتوكوندريا من خزعات لكمه الجلدية البشرية لتحقيق هذا الهدف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على خزعات الجلد لكمه من المواضيع التي تم تجنيدهم من شبكة كبيرة من رعاية الأولية المستندة إلى المجتمع المحلي في مركز السكري جامعة يوتا (سولت لايك سيتي، يوتا). هذه الدراسة التي وافق عليها مجلس جامعة ميشيغان الاستعراض المؤسسي والامتثال لمبادئ "إعلان هلسنكي". كتب تم الحصول على الموافقة المستنيرة من كل موضوع قبل اختبار-
1. إيمونوهيستوتشيميستري fluorescence
- تحضير لكمه خزعات للألياف العصب إينترايبيديرمال إيمونوهيستوتشيميستري:
- الجلد 3 مم إجراء خزعات بالطب للموظفين ووضع خزعة كله في 1.5 مل Zamboni ' s الحل مثبت (بارافورمالدهيد 2%، حامض البكريك 0.3% المشبعة بالفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الرقم الهيدروجيني 7.4) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- شطف عينات بمحلول السكروز 30% في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لح 16-24 أو حتى المصارف العينة-
- Embed العينات في درجة حرارة القطع الأمثل مجمع (OCT) استخدام كريومولد. تجري خزعة كله 3 مم بالبشرة أسفل في القالب وملء القالب مع حوالي 2 مل من أكتوبر الجاري تجميد العفن في سحق الثلج الجاف. مخزن في-80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام-
- قطع 50 ميكرومتر سميكة من كريوستات باستخدام المقاطع العرضية وتخزينها في الآبار الفردية من صفيحة 96-كذلك استخدام حل تخزين المذيب ميليلتر 180 لكل بئر (30% جليكول، والغليسيرول 30% في برنامج تلفزيوني). الإرشادات التالية من أجل 8 آبار للوحة جيدا 96. وصمة عار المقاطع من كل موقع خزعة 200-300 ميكرون بعيداً عن بعضها البعض.
يوم 1:
- آرو وسم غير محددة من الطبقة القرنية:
- لوحة التسمية 96-جيدا كما هو مبين في الشكل 1.
- بيبيت 150 ميليلتر من إشارة الأسهم محسن الحل للحد من الربط غير محدد من الأجسام المضادة الثانوية 34 ، 35 في كل بئر. تحويل الأقسام إلى إشارة محسن الحل باستخدام حلقة إينوكولاتينج.
ملاحظة: العناية أثناء العمل مع الأنسجة لتجنب إتلاف أو تمزيق أقسام الأنسجة. يبقى في حل إشارة محسن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في شقة الروك. - شطف تحضير الآبار في الصفوف 2 و 3 من لوحة 96-جيدا بإضافة 150 ميليلتر من 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في كل بئر-
- نقل المقاطع بعناية في الصف 2 والشطف في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- الشطف مرة ثانية في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (صف 3)-
- إعداد 5% البقري ألبومين المصل (BSA) عرقلة الحل:
- إعداد 5% إعاقة الحل الذي يحتوي على 5% جيش صرب البوسنة و 0.3% X تريتون هي تفرخ 100 (تكساس-100) في 0.1 M برنامج تلفزيوني (انظر الجدول 1) بينما المقاطع في إشارة محسن الحل. جيش صرب البوسنة لا يذهب إلى الحل بسهولة. الحل دوامة حتى جيش صرب البوسنة تماما يذوب.
- إعداد الآبار حظر في صف 4 من لوحة 96-جيدا بإضافة 150 ميليلتر من عرقلة الحل في كل بئر جيش صرب البوسنة 5 ٪.
- تحويل الأقسام إلى الآبار الفردية لعرقلة حل جيش صرب البوسنة 5% واحتضان الأقسام في عرقلة الحل ح 1-2 في درجة حرارة الغرفة في شقة الروك جيش صرب البوسنة 5 ٪.
- إعداد جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل وتمييع الأجسام الأولية:
- أقسام TX-100 في 0.1 M برنامج تلفزيوني (انظر الجدول 2) أثناء تحضير 1% الشطف الحل الذي يحتوي على جيش صرب البوسنة 1% و 0.3% هي حضانة في حل حظر جيش صرب البوسنة 5%. جيش صرب البوسنة لا يذهب إلى الحل بسهولة. الحل دوامة حتى جيش صرب البوسنة تماما يذوب.
- تمييع الأجسام الأولية في محلول الشطف جيش صرب البوسنة 1% بينما هي تفرخ المقاطع في حل حظر جيش صرب البوسنة 5%.
- 1,500 ميليلتر من حل جسم الأولية وإضافة إلى كل جيدا في الصف 5.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية: استخدام التسمية الخاصة بالاعصاب، أرنب [بولكلونل] الجينات المضادة البروتين المنتج 9.5 (PGP9.5) في 1:1، 000. استخدم التسمية المحددة الميتوكوندريا، الماوس [مونوكلونل] بيروفات المضادة نازعة E2/E3bp جسم (PDH) في 1: 100 في جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل.
- جسم الابتدائي تحضير:
- بيبيت 150 ميليلتر من جسم الأولية في كل صف أيضا في 5 لوحة 96-جيدا-
- باستخدام أداة التكرار الحلقي، نقل أقسام من عرقلة الحل (صف 4) في الصف 5 تحتوي على جسم الأولية.
- التفاف لوحة محكم مع بارافيلم الحفاظ عليه من الجفاف.
- وضع العينات في الروك المسطحة في درجة حرارة الغرفة ح 1، وثم احتضان عينات من 4 درجة مئوية في الروك شقة بين عشية وضحاها.
يوم 2:
- شطف العينات:
- تحضير شطف الآبار في الصفوف 6 و 7 و 8 من لوحة 96-جيدا بإضافة 150 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل في كل بئر- تحويل الأقسام إلى جيش صرب البوسنة 1% الأول محلول الشطف (الصف 6)
- واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. كرر يشطف أكثر من مرتين خلال حضانة المقاطع في جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل في الصفوف 7 و 8 لكل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة-
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية في جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل:
- ميليلتر 1,500 تجعل من حل جسم الثانوية بينما هي تفرخ المقاطع في الشطف الأخير لجيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل (صف 8)-
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية: ل PGP9.5 (جسم الأرنب المضادة الماعز مترافق الفلورية الخضراء، 1: 1000) ل PDH (الماعز مترافق الأحمر نيون المضادة الماوس، 1:1، 000) في جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل.
- جسم تحضير الثانوي:
- بيبيت 150 ميليلتر من جسم الثانوية في الصف 9 من لوحة 96-جيدا-
- بلطف نقل الأقسام من جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل (صف 8) في آبار جسم الثانوي (الصف 9)-
- استخدام بارافيلم، التفاف لوحة محكم الحفاظ عليه من الجفاف. وتغطي برقائق الألومنيوم. وضع العينات في الروك المسطحة في درجة حرارة الغرفة ح 1، وثم احتضان عينات ˚C 4 في الروك مسطحة بين عشية وضحاها.
يوم 3:
- تحضير تنظيف 1 x PBS بعملية التصفية من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر:
- بيبيت 150 ميليلتر من تصفية 1 x PBS إلى الصف 10 و 11 و 12- نقل العينات إلى الصف 10
- وشطف في برنامج تلفزيوني x 1 ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغطية لوحة 96-جيدا مع رقائق الألومنيوم ومكان في شقة الروك أثناء الشطف. تكرار بتصفية 1 × شطف PBS اثنين مرات أكثر 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في صفوف 11 و 12-
- إعداد شرائح المجهر لتركيب أبواب الأنسجة:
- ميليلتر 50 مكان لتصفية PBS x 1 على شريحة. إسقاط
- نقل قسم من س 1 برنامج تلفزيوني (الصف 12) إلى 50 ميليلتر. بعناية ضع المقطع في الإسقاط لبرنامج تلفزيوني التي تتكشف في الأنسجة والتسوية بلطف على شريحة الزجاج. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة مع ماصة زجاجية لتجنب إضعاف الكاشف المتصاعدة. لا تلمس الأبواب مع لمبة زجاجية.
- بيبيت 1-2 قطرات من كاشف المتصاعدة التي تتضمن DAPI مباشرة على رأس الفرع المتعلق باستخدام شريحة مجهر الرعاية أن لا تخل بالتوجه للقسم. بلطف ضع ساترة زجاجية مجهر 50 مم x 24 مم #1.5 على المقطع. مسح أي فقاعات الهواء التي تشكلت أثناء وضع ساترة
- ومسح السائل الزائدة قبالة حواف ساترة. إعداد شريحة جديدة، ثم كرر تصاعد العلاقات العامةأوسيس لكل مقطع.
- علاج جاف وسائل الإعلام المتزايدة بوضع الشرائح في ليل مظلم في درجة حرارة الغرفة. نقل الشرائح إلى 4 درجة مئوية لفترات قصيرة (1-2 أسابيع) أو-20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل (أكثر من أسبوعين)-
ملاحظة: عناصر سلبية حذف الأجسام الأولية ل PGP9.5 أو PDH في خطوة 1.4.2.2 وعرض لا تسمية مميزة للأعصاب أو الميتوكوندريا في البشرة. نفذت عناصر إيجابية PDH الضد لإثبات أنها تسميات جميع الميتوكوندريا (البيانات لا تظهر). عناصر إيجابية وأجريت على الماوس الأساسي مثقف الجذرية الظهرية العقدة العصبية التي ترانسدوسيد مع باكولوفيروس إلى الميتوكوندريا التسمية مع إشارة أخضر نيون بروتين (بروتينات فلورية خضراء) وثم الثابتة وملطخة بجسم PDH والأحمر نيون الجسم المضاد الثانوي. كانت جميع الميتوكوندريا التي تم الإعراب عن التجارة والنقل المشترك المسمى مع العلامة الحمراء ل PDH immunohistochemistry (البيانات لا تظهر).
2. تصوير [كنفوكل]
- إجراء تصوير [كنفوكل]:
- جمع الصور باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] مع 40 × الهدف النفط-الغمر (1.25 الفتحة العددية (السلطة الوطنية)) المتعلق مجهر مقلوب.
- في كل المستوى البؤري تسلسلياً الحصول على إشارات الفلورسنت:
الأنوية: λ الإثارة = 405 nm, λ تصفية الانبعاثات الطيفية = 420-480 نانومتر
الألياف العصبية: λ الإثارة = 488 نانومتر، والانبعاثات الطيفية تصفية λ = 505-560 نانومتر
ميتش أوندريا: الإثارة λ = 543 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات الطيفية تصفية λ = 606-670 نانومتر
- في كل المستوى البؤري تسلسلياً الحصول على إشارات الفلورسنت:
- دخول البرنامج مجهر مسح المعلمات التالية: تفحص معدل 600 هرتز مع الإطار المتوسط 2 والتكبير من 2.2؛ القرار كثافة 12-بت (4096 رمادي مستويات).
- مجموعة البرمجيات المجهر للقرار الأمثل الأفقي (دقة المسح الضوئي = 1,024 x 1,024) وتمزيقها القرار المحوري/ضوئية (الفتحة [كنفوكل] = 1 وحدة مهواة (الاتحاد الأفريقي) مع z-خطوة بحجم 210 nm).
ملاحظة: القرار XYZ الناتج هو 172.2 نيوتن متر x 172.2 نانومتر نانومتر x 210 مع صورة بحجم ميكرون 176.1 x µm 176.1 x 30-50 ميكرون.
- مجموعة البرمجيات المجهر للقرار الأمثل الأفقي (دقة المسح الضوئي = 1,024 x 1,024) وتمزيقها القرار المحوري/ضوئية (الفتحة [كنفوكل] = 1 وحدة مهواة (الاتحاد الأفريقي) مع z-خطوة بحجم 210 nm).
- تنشيط تفحص حية للإشارات العصبية (الأخضر-الأسفار) وقم بضبط z-التركيز إيجاد وتعيين العلوي وانخفاض الطائرات المحورية في برنامج مجهر التي تشمل الإشارات العصبية داخل قسم الأنسجة. ض-النطاق الإجمالي هو عادة 30-50 ميكرون لقسم أنسجة 50 ميكرومتر.
- تدوير ميدان المسح الضوئي مع برنامج مجهر أثناء تفحص يعيش حيث أن البشرة يوضع أفقياً أو عمودياً في الصورة-
- مسح كل إشارة على حدة وضبط الكاشف (أنبوب ضوئي، PMT) الجهد وإزاحة لتقليل/إزالة أي فوق وتحت مشبعة بكسل-
ملاحظة: مسح مرات مع المعلمات أعلاه يستغرق حوالي 20-40 دقيقة تبعاً لعدد الشرائح z.
- جمع الصور باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] مع 40 × الهدف النفط-الغمر (1.25 الفتحة العددية (السلطة الوطنية)) المتعلق مجهر مقلوب.
3. 3D التصور وتحليل الميتوكوندريا داخل الإنسان الألياف العصبية إينترايبيديرمال
- عزل البشرة ثلاثي الأبعاد:
- تكرار الصورة الأصلية واستخدام أقصى شدتها الإسقاط (تمديد عرض التركيز) للصورة لتحديد وعزل البشرة.
- استخدام منطقة أداة الفائدة للتتبع على طول الحواف العلوية والسفلية للبشرة لإزالة المناطق غير المرغوب فيها مثل الطبقة القرنية والادمه التي غائبة من الألياف العصبية إينترايبيديرمال. المحاصيل لهذا التحديد-
- Deconvolution الاستخدام على الأعصاب وإشارات الفلورسنت المتقدرية:
ملاحظة: Deconvolution يساعد على استعادة سلامة إشارات الفلورسنت. استعادة المستخدمة في هذا البروتوكول يتم استدعاء deconvolution الأعمى لأنه يستخدم إشارات مضيئة في الصور لتحديد مدى انتشار الإشارات من مصدرها الأصلي (نقطة انتشار وظيفة). يحسن العملية إشارة القرار بإعادة تعيين إشارة تنتشر مرة أخرى إلى موقعة الأصلي. نشر- حساب نقطة دالة (PSF) للإشارة العصبية الفلورية الخضراء (الأخضر-الأسفار) مع المعلمات التالية: تعيين
- PSF المحسوب إلى [كنفوكل]. تعيين معامل الانكسار المتوسط إلى الفتحة 1.515 والعددية إلى 1.25. تعيين للكشف عن الثقب لوحدة مهواة 1 (A.U.). ليزر مجموعة الإثارة الطول الموجي للطول الموجي نانومتر والانبعاثات 488 إلى 515 نانومتر.
- حساب PSF للإشارة المتقدرية الفلورسنت الأحمر (الأحمر-الأسفار) مع المعلمات التالية:
- مجموعة حساب PSF إلى [كنفوكل]. تعيين معامل الانكسار المتوسط إلى الفتحة 1.515 والعددية إلى 1.25. تعيين للكشف عن الثقب 1 الاتحاد الأفريقي. ليزر مجموعة الإثارة الطول الموجي للطول الموجي نانومتر والانبعاثات 543 إلى 617 نانومتر.
- تعيين أمثلية إشارات الفلورسنت العصب والميتوكوندريا من deconvolution استخدام بسفس المقابلة المذكورة أعلاه وميزة استعادة متكررة في الثقة 100% وحدا تكرار من 10 دورات.
- حساب نقطة دالة (PSF) للإشارة العصبية الفلورية الخضراء (الأخضر-الأسفار) مع المعلمات التالية: تعيين
- إنشاء الأسطح الخاصة بالاعصاب:
- الاستخدام " إنشاء سطح " وحدد أداة لجعل سطح صلب الأعصاب من ديكونفولفيد الأخضر-فلوري الثانوي العلامات PGP9.5 الأعصاب.
- أزل " السلس " ميزة واستخدام ميزة الكثافة المطلقة لتعيين الحد الأدنى للإشارات العصبية نظراً لأنه أكثر إشراقا بكثير من الأسفار الخلفية.
- استخدام ميزة الكثافة المطلقة لتعيين الحد الأدنى للإشارات العصبية نظراً لأنه أكثر إشراقا بكثير من الأسفار الخلفية. قم بتعيين قيمة عتبة منخفضة بما فيه الكفاية للتعرف بدقة على الأعصاب-
- عامل تصفية على الأسطح الصغيرة، غير العصب استناداً إلى حجم.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، تحرير يدوياً من الأسطح غير العصب إضافية داخل " تحرير " علامة التبويب بالضغط على مفتاح التحكم لتسليط الضوء على كائنات متعددة وحذفها ثم مع المفتاح Delete.
- عزل إشارة المتقدرية الفلورسنت العصب على حدة:
- حدد علامة التبويب تحرير سطح العصب لعرض " "خصائص قناع" " الميزة. يستخدم سطح العصبية التي تم إنشاؤها في الخطوات 3.3 عزل الميتوكوندريا داخل تلك الأعصاب بعيداً عن إشارات المتقدرية المرتبطة بالخلايا الكيراتينيه.
- " "كل قناع" ' زر يفتح " قناة قناع " النافذة، اختر الإشارة الأحمر نيون ديكونفولفيد من السحب لأسفل القائمة تحت " "اختيار القناة" " للإشارة المتقدرية.
- انقر فوق في مربع لوضع علامة الاختيار " قناة مكررة قبل تطبيق قناع " الخيار. زر
- انقر على الراديو أمام " المستمر داخل/خارج " خيار "قناع الإعدادات" وانقر فوق في المربع لوضع علامة اختيار " تعيين فوكسل خارج أرض " الخيار واكتب 0.00 للقيمة. انقر فوق الزر موافق لإنشاء القناة الجديدة التي تمثل إشارات المتقدرية داخل سطح العصب.
- إنشاء الأسطح الخاصة الميتوكوندريا:
- استخدامها " إنشاء سطح " أداة لجعل سطح صلب من الميتوكوندريا من قناة الفلورسنت التي أنشئت حديثا من إشارات المتقدرية العصب على حدة من خطوات 3.4.
- قم بإلغاء تحديد " السلس " ميزة وحدد " خلفية الطرح " ميزة تعيين العتبة. تستخدم هذه الميزة على النقيض المحلية حول إشارة المتقدرية لتحديد الميتوكوندريا من الخلفية.
- تعيين قيمة عتبة منخفضة بما فيه الكفاية للتعرف بدقة على الميتوكوندريا. في هذا المثال تم تعيين عتبة أدنى في 2000 لمقياس 16-بت (65,536)- تصفية
- الأسطح المتقدرية استناداً إلى حجم. في هذا المثال، تم تعيين الحد فوكسل فوكسيلس 1.0، وهو أدنى الحد الممكن. إذا لزم الأمر، بتحرير يدوياً على الأسطح غير الميتوكوندريا داخل " تحرير " علامة التبويب بالضغط على مفتاح التحكم لتحديد كائنات متعددة وحذفها ثم مع المفتاح Delete.
ملاحظة: في بعض الأحيان، البرنامج سيقوم بإنشاء الأسطح التي لا ترتبط مع إشارة المتقدرية فلورسنت يمكن تمييزها. وفي هذه الحالات، من الممكن إزالتها مع " تحرير " التبويب
- التصدير وحساب قيم شكلي لتحليل:
- تصدير قيم للأعصاب والسطوح المتقدرية من " الإحصاءات " التبويب لمزيد من التحليل مع برامج جداول البيانات الإلكترونية.
- تصدير قيم وحدة التخزين لكل من الأعصاب والسطوح المتقدرية.
- إحصاء عدد الألياف العصبية الفردية الموجودة في كل صورة وسجل القيمة في جدول البيانات الإلكترونية-
- لكل صورة، وحساب القيم المحتملة التالية للتحليل في جدول البيانات الإلكترونية:
- مجموع وحدات التخزين لجميع الأسطح الأعصاب-
- عامل تصفية على السطوح المتقدرية العصب على حدة أدناه حجم أقل من 0.02 ميكرومتر 3 وبن السطوح بالحجم. على سبيل المثال، استخدام صناديق مثل 0.02-0.04، 0.04-0.08، 0.08-0.16، 0.16-0.32، 0.32-0.64، 0.64-1.28، 1.28-2.56، أكبر من 2.56 ميكرومتر 3-
ملاحظة: تم تعيين الحد الأدنى لحجم الميتوكوندريا إلى 0.02 ميكرومتر 3 استناداً إلى وحدات تخزين تم نشرها مسبقاً من ميتونتشودريا 36 ، ، من 37 38- - عد عدد الأسطح المتقدرية العصب على حدة داخل كل بن والعدد الإجمالي للسطوح عبر صناديق (0.02-أكبر من 2.56 ميكرومتر 3)-
- حساب نسبة السطوح المتقدرية العصب على حدة في كل بن. استخدام العد كل بن مقسوماً على العدد الكلي للأسطح الميتوكوندريا.
- مجموع وحدات التخزين لكل الأسطح المتقدرية العصب محددة.
- حساب نسبة العصب مع إشارة المتقدرية بقسمة حجم مجموع الأعصاب السطحية على مجموع كافة وحدات التخزين السطحي المتقدرية.
- حساب عدد الميتوكوندريا الواحدة حجم العصب بقسمة حجم سطح العصب مجموع عدد جميع الأسطح المتقدرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والتصور والتقدير الكمي الميتوكوندريا داخل إيينفس البشرية
إيمونوهيستوتشيميستري fluorescence يسمح للعلامات المتزامنة لإشارات متعددة داخل خزعات الجلد البشري لتصور الأعصاب، الميتوكوندريا، ونوى. صفيحة 96-جيدا طريقة ملائمة لتنظيم الخطوات في الإجراء إيمونوهيستوتشيميستري. الشكل 1 يبين أن هذه الحسابات التكوين لما يصل إلى 8 أقسام بحيث تتم معالجتها من خلال مراحل 12 من الحلول. طريقة التعويم الحر جنبا إلى جنب مع الانفعالات لطيف مع الروك شقة يضمن أن الأجسام المضادة وجود وصول كاف إلى اختراق الأبواب من كلا الجانبين. البروتوكول يأخذ 3 أيام لإكمال، وهو إلى حد كبير بسبب إينكوبيشنز بين عشية وضحاها في أجسام الابتدائية والثانوية في 4 درجات مئوية، التي دأبت على تسمية الأعصاب والميتوكوندريا.
ما تبقى من هذا الإجراء يشمل تصوير ومعالجة وتحليل الإشارات الفلورسنت. مجهرية [كنفوكل] يستفيد من الإشارات الفلورسنت بصريا قسم إشارات منفصلة من الطائرة التنسيق عن طريق القضاء على إشارات الخروج من التركيز. ويوفر الحصول على سلسلة z عن طريق قسم الأنسجة تمثيل ثلاثي الأبعاد لإشارات مضيئة للأعصاب، الميتوكوندريا، ونوى. المعلمات هي الأمثل للصورة ميكرومتر 172 على طول البشرة التي ستشمل في متوسط 5 الأعصاب. ويبين الشكل 2 صورة 3D نموذجي من ثلاث إشارات الفلورسنت التي يتم جمعها من البشرة. PGP9.5 تلطيخ (الشكل 2) يوفر إشارة غنية للأعصاب عن طريق الجلد والبشرة موجودة كثافة أعلى من السيارات الخلفية-الأسفار من الأنسجة. وصمة النووي (الشكل 2) يساعد على تحديد الحدود في البشرة حيث الألياف العصبية إينترايبيديرمال يعصب. ومن الشائع للطبقة الخارجية من البشرة أن يكون إشارة منتشر بأن قد يكون بسبب بقايا الحمض النووي في الخلايا القرنية التي تشكل الطبقة القرنية. الميتوكوندريا هي المسمى بوضوح قبل PDH تلطيخ (الشكل 2D) حيث يرتبط معظم الإشارات مع الخلايا في البشرة التي هي أساسا من الخلايا الكيراتينيه.
استخدام لبارامترات المبينة في هذا البروتوكول 40 × النفط الغمر الهدف مع فتحه عددية 1.25 وعامل التكبير/تصغير من 2.2. ينتج عن هذا حجم صورة XYZ ميكرومتر 176.1 x µm 176.1 x 30-50 ميكرون. هذه الإعدادات التقاط ما يكفي من البشرة تشمل في متوسط 4-6 الألياف العصبية كل صورة (الشكل 3A). أخذ العينات في أعلى القرار سيقلل عدد الأعصاب في كل صورة. ويبين الشكل 3B عامل تكبير 3-3، مما يقلل من مجال س وص ميكرومتر 114.8 x 114.8 ميكرومتر، أسفر عن الأعصاب أقل كل صورة. كثافة العينات مثالية كما حددتها نايكست (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) 40 × النفط الغمر الهدف مع فتحه عددية 1.25 يوحي دقة المسح الضوئي XYZ من 54 نانومتر نانومتر x 205 شمال البحر الأبيض المتوسط x 54. هذا سيتطلب عامل التكبير/تصغير من حظيرة 6.6 في القرار 1,024 x 1,024 وتقليل العرض س وص ميكرومتر 57.4 x 57.4 µm والتقاط فقط في متوسط للعصب 1-2 كل صورة (الشكل 3).
المرحلة المقبلة تنفيذ معالجة الصورة لإزالة المناطق غير المرغوب فيها في الصورة وتعزيز الإشارات. في هذا البروتوكول تتم إزالة الأدمة والطبقة القرنية من أجل تركيز التحليل على منطقة البشرة حيث إيينفس يعصب. برنامج ثلاثي الأبعاد يجعل من الممكن عزل، وتعزيز وتحليل الإشارات الفلورسنت. أدوات داخل البرنامج ضرورية لعزل العصب البشرة والميتوكوندريا بالاقتصاص من المناطق المذكورة أعلاه وأدناه البشرة (الشكل 4 أ-ج). يتم تبسيط هذه العملية عن طريق طي الإشارات إلى نظرة طويلة وثم تتبع منطقة حر حول البشرة. الصورة المقتصة كذلك يجهزها خوارزميات استعادة الصورة. ويستخدم deconvolution لتحسين القرار الأعصاب وإشارات المتقدرية (الشكل 4).
هو المرحلة النهائية لاكتشاف واستخراج ملامح شكلي من الإشارات. جانبا مهما من هذا البروتوكول قياس سمات الميتوكوندريا العصب على حدة. برنامج تحليل الصور يحتوي على ميزات استخدام الأسطح التي تم إنشاؤها لإشارة واحدة (في هذه الحالة على سطح العصب) كأداة لإخفاء لعزل إشارة مضيئة أخرى (في هذه الحالة الميتوكوندريا) داخل ذلك السطح. الخطوة الأولى في تحليل الميتوكوندريا العصب محددة لإنشاء الأسطح ثلاثية الأبعاد حول الأعصاب (الشكل 5 أ-ب). ثم يتم استخدام الأسطح العصب للمحاصيل إشارات المتقدرية الفلورسنت العصب على حدة (الشكل 5، 5د، 5E, 5 غ). وأخيراً، يتم إنشاء الأسطح ثلاثية الأبعاد حول الإشارات المتقدرية العصب على حدة للحصول على القياسات الحجمية (5F الشكل،ح5). ويبين الجدول 3 شكلي القياسات التي يتم تصديرها من برنامج تحليل الصور والبيانات الموجزة. القيم الرئيسية لتصدير قيم حجم العصبية والإشارات الخاصة بالاعصاب المتقدرية. يتم إهمال البيانات حجم من الميتوكوندريا توليد بيانات الترددات حجم الميتوكوندريا، التي ثم يستخدم لإنشاء حجم التردد المدرج الإحصائي (الشكل 6). وتستخدم أيضا البيانات حجم جعل التدابير الموجزة لعدد الميتوكوندريا الواحدة وحجم إيينف والنسبة المئوية لحجم الميتوكوندريا داخل مجلدات إيينف.
وتبين البيانات الواردة في الجدول 3 و الشكل 6 أن هذا الأسلوب يوفر وسيلة لتحديد حجم الميتوكوندريا داخل إيينفس البشرية من خزعات الجلد. الأعصاب من هذه العينة قد الميتوكوندريا موزعة في جميع أنحاء وغالبيتهم من الميتوكوندريا بين 0.02-0.32 ميكرون3. هذه الأحجام في نطاق المرتبطة الميتوكوندريا العادي36،37،،من3839. أظهرت الميتوكوندريا أصغر لتكون أكثر متحركة من أكبر الميتوكوندريا39 مما يوحي بأن الميتوكوندريا في هذه الأعصاب قد تكون أكثر متحركة. وفي الواقع، تورطت الدراسات أن الميتوكوندريا أكبر وتورم عدم النقل فضلا عن الميتوكوندريا أصغر حجماً، وقد تؤدي إلى تنكس محواري39،،من4041. ولذلك توصيف الميتوكوندريا العصب على حدة هو أسلوب قيمة التي يمكن تطبيقها للدراسات المتعلقة بأمراض الأعصاب حيث ارتبطت التغيرات في مورفولوجيا mitochondrial والنقل مع تنكس محواري 15،25،،من2627،،من4243.
| الحل منع جيش صرب البوسنة 5% | |
| عناصر من جيش صرب البوسنة 5% إعاقة الحل | المبلغ المطلوب |
| ألبومين المصل البقري (BSA) [التركيز النهائي: 5%] | ز 0.625 |
| 1.0% Triton X-100 (تكساس-100) [التركيز النهائي: 0.3%] | |
الجدول 1: جيش صرب البوسنة 5% إعاقة الحل. الحل منع جيش صرب البوسنة 5% يستخدم في اتخاذ خطوات مبكرة لبروتوكول إيمونوهيستوتشيميستري لكتلة غير محددة ملزمة للأجسام المضادة.
| 1% من محلول الشطف جيش صرب البوسنة | |
| عناصر من جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل | المبلغ المطلوب |
| ألبومين المصل البقري (BSA) [التركيز النهائي: 1%] | ز 0.125 |
| 1.0 تكساس--100% [التركيز النهائي: 0.3%] | مل 3.75 |
| 1 x برنامج تلفزيوني | مل ~8.125 |
| المجموع (استخدام برنامج تلفزيوني X 1 لتحقيق الحجم الإجمالي لمل 12.5) | مل 12.5 |
الجدول 2: الشطف حل جيش صرب البوسنة 1%- جيش صرب البوسنة 1% الشطف الحل المستخدمة في البروتوكول إيمونوهيستوتشيميستري إلى كتلة غير محددة ملزمة للأجسام المضادة واستخدامها لتمييع أضداد، الابتدائي والثانوي.
| شكلي قياسات إيينفس والعصب على حدة الميتوكوندريا | ||||||||
| البيانات المصدرة وموجزة من برمجيات تحليل الصورة | ||||||||
| صناديق التردد الحجم طن متري | عدد طن متري في حجم التردد بن | النسبة المئوية لمليون طن في بن | العدد الإجمالي للنقل المتعدد الوسائط | حجم النقل المتعدد الوسائط (ميكرومتر3) | حجم إيينف (3من ميكرومتر) | عدد طن متري كل "وحدة التخزين إيينف" (3من عدد/100 ميكرومتر) | النسبة المئوية لحجم طن متري في المجلد إيينف | عدد إيينفس |
| بين .02.04 ميكرومتر3 |
20 | 24.4 في المائة | 82 | 13.41 | 518.88 | 15.8 | 2.58 في المائة | 4 |
| بين .04-.08 ميكرومتر3 |
28 | 34.1 في المائة | ||||||
| بين .08-.16 ميكرومتر3 |
14 | 17.1% | ||||||
| بين .16-.32 ميكرومتر3 |
12 | 14.6% | ||||||
| بين .32-.64 ميكرومتر3 |
4 | 4.9% | ||||||
| بين .64-1.28 ميكرومتر3 |
3 | 3.7% | ||||||
| بين 1.28-2.56 ميكرومتر3 |
1 | 1.2% | ||||||
| بين 2.56 + ميكرومتر3 |
0 | 0.0% | ||||||
الجدول 3: شكلي قياسات إيينفس والعصب على حدة الميتوكوندريا. ويمثل الجدول شكلي القيم التي يتم قياسها وتصديرها من برمجيات تحليل الصور والبيانات الموجزة. المختصرات: إيينف، إينترايبيديرمال الألياف العصبية؛ طن متري، الميتوكوندريا.
الشكل 1 : رسم تخطيطي يمثل الإعداد للوحة 96-جيدا للجلد خزعة إيمونوهيستوتشيميستري. تمثل الصفوف الموجودة في اللوحة الخطوات في البروتوكول للحلول كتلة، والمياه والصرف الصحي، وحضانة وتمثل الأعمدة أقسام الأنسجة الفردية (من 1 إلى 8 أقسام للوحة الواحدة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : 3D الممثل معالجة صورة مجهرية [كنفوكل] قسم الأنسجة من خزعة البشرة بشرية للأسفار إيمونوهيستوتشيميستري. يوضح صورة الإسقاط ثلاثي الأبعاد غير المجهزة (أ) دمج إشارات مضيئة وإشارات الفردية للأعصاب (العصب، الأخضر) من (ب) ، (ج) نوى (نشاط، الأزرق) والميتوكوندريا (د) (طن متري، الأحمر) في البشرة و الأدمة. ملاحظة عدم وجود إشارات في طبقة الطبقة القرنية من البشرة. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحسين صورة القرار النتائج في الأعصاب أقل للتحليل اللاحق. كل الصور التي تم التقاطها مع هدف نفط X 40 مع فتحه عددية 1.25 والإسقاطات ثلاثية الأبعاد توضح إشارات مضيئة للأعصاب (الأخضر)، الميتوكوندريا (Mt، أحمر) ونوى (نشاط، الأزرق). صورة المتخذة في عامل التكبير/تصغير من 2.2 (A) يحتوي على أعصاب عدة داخل طريقة العرض. زيادة عامل التكبير/التصغير إلى 3.3 (ب) أو (ج)من 6.6، أخذ العينات نايكست مثالية، يقلل كثيرا من عدد الأعصاب داخل كل صورة. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : معالجة الصور- تمديد الممثل التركيز (أقصى شدتها الإسقاط) عرض صورة من الفحص المجهري [كنفوكل] قسم الأنسجة من خزعة البشرة بشرية. ويوضح الصورة الإسقاط غير المجهزة (A) الفلورية المدمجة إشارات للأعصاب (الأخضر)، نوى (نشاط، الأزرق) والميتوكوندريا (Mt، أحمر). الأدمة والطبقة القرنية يتم اقتصاص (ب) مع منطقة inteأداة التحديد اليدوي بقية (ROI) (بلو ناحية مميزة، والمحاصيل ROI) عزل إلا من إشارات في البشرة. ثم تتم معالجة البشرة (ج) اقتصاص لانتشار deconvolution (د) مع نقطة محسوبة وظائف تحسين دقة الأعصاب (الأخضر) والمتقدريه (Mt، أحمر) إشارات. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : صورة التحليل. يوضح صورة مجهرية [كنفوكل] 3D الممثل (A) إشارة الفلورية الخضراء الخاصة بالاعصاب. (ب) يتم إنشاء سطح ثلاثي الأبعاد (السماوي) للإشارة العصبية. إشارة المتقدرية العصب محددة معزولة عن بقية الإشارات المتقدرية البشرة (Mt، حمراء) (ج) (د) استخدام سطح العصب كأداة لإخفاء. الناتجة عن ذلك (ه، ز) إشارة الفلورسنت الأحمر المتقدرية العصب محددة يتم استخدامها لإنشاء (و، ح) الأسطح (Mt السطح، أرجواني) حول الميتوكوندريا داخل سطح العصب (السماوي). زاي، وحاء، آراء المكبرة من مربعات بيضاء في ه والحانات ومقياس واو = 20 ميكرومتر (واو)، 5 ميكرومتر (ز-ح). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : حجم المتقدرية تردد المدرج التكراري. وترد البيانات ميتوتشوندريالسورفيس كرسم بياني حجم تردد لتصور النسبة مئوية الميتوكوندريا التي تكون موجودة في كل من صناديق مختلفة وفقا لحجمها (3من ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويهدف هذا البروتوكول إلى عزل وتحديد وتحليل حجم وتوزيع الميتوكوندريا العصب على حدة داخل إيينفس في 3D من خزعات الجلد البشري. وهناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. تم تصميم إيمونوهيستوتشيميستري fluorescence التعويم الحر لوصمة عار وتحليل إشارات متعددة في كل عينة، تقديم منهجية أكثر تنوعاً للبحوث الاستكشافية44،45. يسمح هذا الإجراء للاختراق من الأجسام المضادة في الأنسجة بغية تحقيق أقصى قدر من الحصول على الصور في جميع أنحاء القسم 50 ميكرومتر، هو أمر ضروري للحصول على صور مجهرية [كنفوكل] وتحليل ثلاثي الأبعاد. خطوة حاسمة أخرى هي المعلمات الحصول على الصورة التي تكون متوازنة بين التقاط ما يكفي الأعصاب كل صورة مع الحفاظ على دقة لقياس الميتوكوندريا. أقسام الأنسجة المستخدمة في هذا والبروتوكولات خزعة الجلد القياسية هي حوالي 3 مم طويل45،46،،من4748. لبارامترات الموصوفة في هذا البروتوكول التقاط ما يكفي من البشرة تشمل في متوسط 4-6 الألياف العصبية كل صورة. أخذ العينات في أعلى القرار التقليل من عدد الأعصاب في كل صورة، ولا سيما في أخذ العينات نايكست. خطوة حاسمة ثالث استخدام خوارزميات deconvolution لتحسين القرار وعلى النقيض من الإشارات، خاصة بالنسبة الميتوكوندريا. وساعدت deconvolution الصور للتعويض عن عدم أخذ العينات دقة أعلى. الخطوة الحاسمة الأخيرة استخدام برمجيات تحليل الصورة لعزل العصب على حدة الميتوكوندريا من الميتوكوندريا المرتبطة بالخلايا في البشرة. ويتم ذلك باستخدام السطح العصبية كأداة لإخفاء للمحاصيل خارج إشارة المتقدرية تعريب داخل العصب.
وهناك بعض التعديلات المحتملة لهذه التقنية للنظر. تعديل ممكن واحد سيكون لتقصير مدة إيمونوهيستوتشيميستري الأسفار. يمكن اختصارها في إينكوبيشنز بين عشية وضحاها في الحلول جسم الابتدائية والثانوية في 4 درجات مئوية لمدة 3-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. بيد أن إينكوباتيونس أقصر في درجة حرارة الغرفة غالباً ما تزيد fluorescence الخلفية، ولذلك ينبغي توخي الحذر لتجنب ضعف الإشارة إلى الضوضاء. آخر تعديل ممكن سيكون لضبط معايير الحصول على الصورة. وكما ذكر أعلاه، كانت متحيزة اقتناء الصورة الموضحة هنا نحو التقاط عدد معقول من الأعصاب كل صورة على مدى دقة الصورة عالية. من الممكن استخدام هدفا تكبير أعلى، مثل هدفا 63 x غمر نفط مع فتحه عددية 1.3. إذا كانت كافة المعلمات ظلت على حالها، وكان يستخدم هدفا X 63، الحقل صورة س وص سينخفض إلى 112 مكم x 112 مكم وبالتالي تقليل متوسط عدد الأعصاب كل صورة. أن النقطة الرئيسية استخدام معلمات متسقة في جميع أنحاء اقتناء والتحليل اللاحق.
القيد الرئيسي من هذا الأسلوب أنه مضيعة للوقت. إيمونوهيستوتشيميستري يأخذ 3 أيام لمعالجة الأنسجة والحصول على الصور يستغرق حوالي 30-50 دقيقة لكل صورة حسب كم بصري ض-خطوات تجهيز الصورة والتحليل يستغرق حوالي 20 دقيقة. هذا هو التزام قدر كبير من وقت ولكن غلة القياسات شكلي هامة في نهاية المطاف. قيد آخر لهذا الأسلوب هو مساحة محدودة من البشرة عينات كل صورة. ومع ذلك، هذا ستحسن بلا شك كما يتم إجراء التقدم في معدلات اقتناء الصورة مع تحسين القرار جنبا إلى جنب مع معالجات الكمبيوتر أسرع وتحليل البرمجيات.
من أهمية هذا البروتوكول عبر طرق أخرى في القوة للجمع بين immunohistochemistry الأسفار [كنفوكل] مجهرية وتحليل الصور الثلاثية الأبعاد. عادة، يتم تحليل الألياف العصبية إينترايبيديرمال مع تشروموجين على أساس إيمونوهيستوتشيميستري والفحص المجهري مشرق الميدان، خاصة بالنسبة للتشخيص السريري للاعتلال العصبي45،،من4749. استخدام إيمونوهيستوتشيميستري fluorescence يجعل من الممكن لوصمة عار وتحليل إشارات متعددة في كل عينة، تقديم منهجية أكثر تنوعاً للبحوث الاستكشافية44،45. هذا الأسلوب يوفر استراتيجية لعزل إشارة خاصة للفائدة، الميتوكوندريا في هذه الحالة الخاصة بالاعصاب، من إشارة معقدة، الميتوكوندريا المرتبطة بخلايا البشرة.
السلطة من هذا الأسلوب هو فائدته في التطبيقات المستقبلية. القدرة على عزل وقياس الميتوكوندريا العصب محددة يجعل من الممكن لتقييم التعديلات الناجمة عن المرض في الحجم والتوزيع من الميتوكوندريا. وقد تورط متعددة مضاعفات عصبية خلل mitochondrial كآلية محتملة للمرض. على وجه الخصوص، وقد استخدمت نسخة معدلة من هذا الأسلوب إثبات أن المرضى الذين يعانون من مرض السكري والاعتلال العصبي المحيطي السكري measureable التغييرات في الحجم والتوزيع من الميتوكوندريا العصب على حدة مقارنة بالعمر مطابقة يتحكم50. هذه التقنية ستكون مفيدة لتقييم مدى فعالية العلاجات تهدف إلى تحسين أو علاج اعتلالات الأعصاب الحسية. وأخيراً، براعة الأسلوب يجعل من تنطبق على مجموعة واسعة من التحليلات التي تستخدم الإشارات الفلورسنت واحدة لعزل مجموعة فرعية بيانات من الإشارات الفلورية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد تضارب في المصالح تعلن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها المعاهد الوطنية للصحة منح K08 NS061039-01A2، "البرنامج" "أبحاث الأمراض العصبية" & الاكتشاف، وا الفريد توبمان معهد الأبحاث الطبية في جامعة ميشيغان. هذا العمل المستخدمة في مورفولوجيا وصورة التحليل الأساسية لمركز أبحاث مرض السكري ميشيغان، تموله "المعاهد الوطنية للصحة منحة" 5 ف 90 كمبوتشيا الديمقراطية-20572 من المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي وأمراض الكلي. الكتاب يود أن يشكر ج. روبنسون المفرد وألف غوردون سميث (جامعة يوتا) على التبرع السخي من عينات الجلد البشري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
References
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
- Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
- Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
- Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
- Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
- Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
- Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
- Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
- Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
- Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
- Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
- Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
- Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
- Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
- Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
- Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
- Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
- Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
- Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
- Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
- Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
- Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
- Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
- Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
- Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
- Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
- Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
- Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
- Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
- Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
- Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).
