Summary
该协议使用三维 (3D) 成像和分析技术来可视化和量化神经特异性线粒体。这些技术适用于在其他情况下, 一个荧光信号被用来隔离一个子集的数据, 从另一个荧光信号。
Abstract
本议定书的目的是研究 intraepidermal 神经纤维内的线粒体。因此, 3D 成像和分析技术的发展, 以隔离神经特异性线粒体和评估疾病诱导的线粒体远端的感觉神经的变化。该协议结合荧光免疫组织化学、共聚焦显微镜和3D 图像分析技术来可视化和量化神经特异性线粒体。详细的参数在整个过程中定义, 以提供一个具体的例子, 如何使用这些技术来隔离神经特异性线粒体。抗体被用来标记的神经和线粒体信号的组织切片的皮肤穿孔活检, 其次是间接免疫荧光可视化的神经和线粒体与绿色和红色的荧光信号分别。利用共焦显微镜对 Z 系列图像进行采集, 并采用3D 分析软件对信号进行处理和分析。没有必要按照内部描述的确切参数, 但重要的是要与整个染色, 获取和分析步骤中选择的一致。该协议的优点是, 它适用于各种情况, 其中一个荧光信号被用来隔离其他的信号, 否则是不可能单独研究。
Introduction
线粒体提供重要的细胞功能, 包括产生细胞能量, 缓冲钙, 调节坏死和凋亡细胞死亡1,2,3。神经系统具有很高的新陈代谢率, 与身体的4相比, 这表明神经元通过线粒体呼吸以三磷酸腺苷 (ATP) 的形式产生高度的细胞能量。许多证据证明, 神经元函数依赖于 ATP5, 特别是在突触的6。因此, 神经元内线粒体的分布是很重要的。
在过去的10年里, 大量的信息表明, 神经元线粒体的贩运和对接受到高度的管制。运动蛋白参与在神经元中分布线粒体到特定的细胞隔间。线粒体的贩运是特别重要的, 因为神经元项目轴突和树突远离躯体。驱动马达蛋白质主要直接顺 (远离体细胞) 贩运的线粒体沿微管, 而蛋白马达蛋白直接逆行 (向 soma) 运动7,8,9,10. 有细胞信号, 这样的线粒体膜电位和冲动传导, 影响线粒体贩运的存在和方向11,12,13。
除了传送线粒体外, 还有专门的蛋白质将线粒体定位到具有高能量需求的特定蜂窝室, 如郎和突触的节点8,14,17. 实际上, 轴突内的大部分线粒体是 non-motile9、13、18。专门的蛋白质像 syntaphilin 锚定线粒体的微管沿轴突, 而其他蛋白质锚定线粒体的肌动蛋白细胞骨架19-21。生长因子和钙等离子被报告支持停止线粒体运动, 将它们本地化为需要的区域21,22,23。
两者结合在一起, 线粒体的贩运和对接对神经元的正常功能至关重要。为支持这一点, 线粒体贩运的中断与包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、腓骨-玛丽牙病、亨廷顿氏病、遗传性痉挛截瘫, 和视神经萎缩15,24,25,26,27。最近的研究侧重于线粒体功能障碍和病理作为糖尿病神经病变的潜在机制, 与糖尿病相关的感觉丧失28,29,30,31 ,32,33。假设是糖尿病改变了皮肤神经末端感官投射中线粒体的分布。因此, 在 intraepidermal 神经纤维 (IENFs), 背根神经节感觉传入的远端提示中, 开发了一种技术来可视化和量化线粒体。该技术将特定线粒体和神经纤维标签的荧光免疫组化与共焦显微镜相结合, 用强大的3D 图像分析软件对信号进行 z 系列采集, 测量神经特异性的分布线粒体从人体皮肤穿孔活检达到这个目的。
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Protocol
在犹他州糖尿病中心 (盐湖城), 从一个大型社区初级保健网络招募的受试者中获得了皮肤穿孔活检。这项研究得到了密歇根大学机构审查委员会的批准, 并遵守了《赫尔辛基宣言》的宗旨。在测试之前, 从每个主题获得书面知情同意.
1. 荧光免疫组化
- 为 intraepidermal 神经纤维免疫组织化学制备穿孔活检:
- 由医务人员进行3毫米皮肤活检, 并将整个活检放在1。5磨和 #39 s 固定液 (2% 甲醛, 0.3% 饱和苦味酸酸在磷酸盐缓冲盐水 (PBS), pH 7.4) 在4和 #176; C 过夜.
- 在 PBS 中用30% 蔗糖的溶液冲洗样品, 4 和 #176; C 为16-24 小时或直到样品下沉.
- 使用 cryomold 在最佳切削温度复合 (OCT) 中嵌入样本。放置整个 3 mm 活检与表皮朝下在模具和填充模具约2毫升的 OCT. 在粉碎的干冰上冻结模具。存储在-80 和 #176; C 直到准备使用.
- 切割50和 #181; m 厚剖面使用低温和存储在单个井的一个 96-井板使用180和 #181; L 防冻液每井 (30% 乙二醇, 30% 甘油在 PBS)。以下方向为96井板的8口井。从每一个活检网站 200-300 和 #181 的污点切片; 我远离彼此.
日 1:
- 对地层角质的非特异标记:
- 标签 96-好板如 图 1 中所示.
- 吸管150和 #181; L 股票信号增强剂解决方案, 以减少次级抗体的非特异性结合 34 , 35 到每个井。使用接种回路将部分转移到信号增强器解决方案中.
注意: 在使用组织时要小心, 避免损坏或撕裂组织切片。保持在信号增强解决方案在室温下的一个平面摇杆30分钟. - 通过添加150和 #181, 在96孔板的2和3行中准备冲洗井, 将1x 磷酸酯缓冲盐水 (PBS) 放入每个井中.
- 小心地将部分转移到2行, 并在室温下用 1x PBS 冲洗10分钟.
- 在室温下第二次在 1x PBS 中冲洗10分钟 (3 行).
- 准备5% 牛血清白蛋白 (bsa) 阻止解决方案:
- 在 100 M PBS 中准备5% 个包含 5% BSA 和0.3% 卫一 X 0.1 (TX-100) 的拦截解决方案 (参见 表 1 ), 而部分则在孵化信号增强解决方案。波塞军不容易进入解决方案。涡旋溶液直到 BSA 完全溶解.
- 在96井板的4排中, 通过添加150和 #181 来准备堵塞井; 5% BSA 将溶液插入每个井中.
- 将剖面转换为 5% bsa 阻断溶液的单个井, 并将 5% bsa 的 1-2 h 在室温下的平板摇杆中孵育剖面.
- 准备 1% bsa 冲洗溶液和主抗体稀释液:
- 准备1% 冲洗解决方案, 其中包含 1% bsa 和 0.3% TX-100 0.1 M PBS (见 表 2 ), 而节是在 5% BSA 阻断溶液中孵化。波塞军不容易进入解决方案。涡旋溶液直到 BSA 完全溶解.
- 在 1% bsa 冲洗液中稀释主抗体, 而切片则在 5% bsa 阻断溶液中孵化。
- 使1500和 #181; 主抗体溶液 L, 并在5行中的每个井中添加.
- 稀释主要抗体: 使用神经特异的标签, 兔多克隆 anti-protein 基因产品 9.5 (PGP9.5) 在 1:1, 000。使用线粒体特异的标签, 小鼠单克隆 anti-pyruvate 脱氢酶 E2/E3bp 抗体 (人) 在1:100 在 1% BSA 漂洗溶液.
- 准备主抗体:
- 吸管150和 #181; 在96个井板的5排中每一个井的主抗体 L.
- 使用循环工具, 将阻塞解决方案 (行 4) 中的部分传输到包含主抗体的行5中.
- 用膜把盘子紧紧地裹起来以防止它干燥.
- 将样品放在室温为1小时的平摇杆上, 然后在4和 #186 上孵育样品; C 在一夜之间的平摇杆上.
日 2:
- 冲洗样品:
- 在 96-井板的6、7和8行中准备冲洗井, 并加入150和 #181; 1% BSA 的 L, 每井冲洗溶液.
- 将剖面转换为前 1% BSA 冲洗液 (6 排) 并在室温下孵育1小时。重复漂洗两次以上的 1% BSA 冲洗解决方案在7和8行每在室温下1小时.
- 在 1% bsa 漂洗解决方案中稀释二级抗体:
- 使1500和 #181; 二级抗体溶液 L 在最后漂洗的 1% bsa 漂洗溶液 (列 8) 中孵化。
- 稀释二级抗体: 用于 PGP9.5 (绿色荧光共轭山羊兔抗体, 1:1000), 用于 (红色荧光共轭山羊 anti-mouse, 1:1, 000) 在 1% BSA 漂洗溶液中.
- 准备二级抗体:
- 吸管150和 #181; 二级抗体升至96井板的9排.
- 将 1% BSA 冲洗液 (8 排) 的部分轻轻地转到二级抗体井 (9 排).
- 使用膜, 将钢板紧紧地包裹起来, 防止其干燥。用铝箔盖。将样品放在室温为1小时的平摇杆上, 然后在4和 #730 上孵育样品; C 在一夜间平的摇椅上.
天 3:
- 通过0.22 和 #181 筛选来准备干净的 1x pbs; m 过滤器:
- 吸管150和 #181; 过滤后的 1x pbs 为10行、11和 12.
- 将样品转移到10行, 并在室温下在 1x PBS 中冲洗1小时。用铝箔覆盖96井板, 在冲洗时将其放在平摇杆上。重复过滤的 1x PBS 冲洗两次1小时, 每在室温在11和12行.
- 准备用于安装组织切片的显微镜幻灯片:
- 放置50和 #181; 在幻灯片上筛选 1x PBS 的 L.
- 将 1x PBS (12 行) 中的部分传输到50和 #181; 我掉了小心地放置在 PBS 下降的部分, 展开组织, 并轻轻地铺平它到玻璃幻灯片。用玻璃吸管除去多余的 PBS, 避免稀释安装试剂。不要触摸玻璃灯泡的部分.
- 吸管 1-2 滴安装试剂, 其中含有 DAPI 直接在显微镜幻灯片上的部分的顶部, 使用注意不要扰乱该节的方向。轻轻地放置一个50毫米 x 24 毫米 #1. 5 显微镜玻璃片在该部分.
- 清除在放置片时形成的气泡, 并将多余的液体从片的边缘擦除。准备一个新的幻灯片, 并重复安装公关每节 ocess.
- 通过在室温下一夜之间将幻灯片放置在黑暗中来固化/干燥安装介质。将幻灯片传输到4和 #176; c 用于短期 (1-2 周) 或-20 和 #176; c 用于长期存储 (大于2周).
注意: 阴性对照在阶梯1.4.2.2 中省略了 PGP9.5 的主要抗体, 并且在表皮中没有显示出可区分的神经或线粒体标记。对该抗体进行了阳性对照, 以证明它标记了所有的线粒体 (未显示数据)。对培养的原代小鼠背根神经节神经元进行了阳性对照, 用杆状病毒转荧光蛋白 (GFP) 信号对线粒体进行标记, 然后用抗体和红色荧光固定和染色二级抗体。所有表达 GFP 的线粒体都被 co-labeled 为免疫组织化学的红色标签 (未显示数据).
2。共焦成像
- 执行共聚焦成像:
- 使用激光扫描共聚焦显微镜收集图像, 40X 油浸 (1.25 数字孔径 (非)) 目标倒置显微镜。
- 在每个焦平面上依次获取荧光信号:
原子核: 激发和 #955; = 405 nm, 光谱发射过滤器和 #955; = 420-480 nm
神经纤维: 激发和 #955; = 488 nm, 光谱发射过滤器和 #955; = 505-560 nm
Mitochondria: 激发和 #955; = 543 nm, 光谱发射过滤器和 #955; = 606-670 nm
- 在每个焦平面上依次获取荧光信号:
- 在显微镜软件中输入以下扫描参数: 600 Hz 的扫描速率, 2 帧平均和缩放 2.2; 12 位强度分辨率 (4096 灰度级别)。
- 设置用于优化横向分辨率的显微镜软件 (扫描分辨率 = 1024 x 1024) 和轴向分辨率/光学切片 (共焦孔径 = 1 通风单元 (AU), z 步尺寸为 210 nm).
注: 产生的 XYZ 分辨率为 172.2 nm x 172.2 nm x 210 nm, 图像大小为176.1 和 #181; m x 176.1 和 #181; m x 30-50 和 #181; m.
- 设置用于优化横向分辨率的显微镜软件 (扫描分辨率 = 1024 x 1024) 和轴向分辨率/光学切片 (共焦孔径 = 1 通风单元 (AU), z 步尺寸为 210 nm).
- 激活对神经信号的实时扫描 (绿色荧光), 并调整 z 焦点控制, 以在显微镜软件中查找和设置包含该组织部分内的神经信号的上、下焦平面。总 z 范围通常是30-50 和 #181; m 为50和 #181; m 组织部分.
- 在实时扫描过程中, 使用显微镜软件旋转扫描域, 使表皮在图像中处于水平或垂直位置.
- 分别扫描每个信号, 并调整探测器 (光电倍增管、PMT) 的电压和偏移量以最小化/删除任何超过或低于饱和像素.
注: 扫描时间与上述参数约 20-40 分钟, 取决于 z 切片的数量.
- 使用激光扫描共聚焦显微镜收集图像, 40X 油浸 (1.25 数字孔径 (非)) 目标倒置显微镜。
3. 3D 人 Intraepidermal 神经纤维内线粒体的可视化和分析
- 隔离3D 表皮:
- 复制原始图像并使用最大强度图像的投影 (扩展焦点视图) 来识别和隔离表皮.
- 使用感兴趣的区域工具沿表皮的上下边缘进行追踪, 以去除不需要的区域, 如 intraepidermal 神经纤维缺乏的角质层和真皮。裁剪到此选定内容.
- 使用神经和线粒体荧光信号的反褶积:
注意: 反褶积有助于恢复荧光信号的完整性。此协议中使用的恢复称为盲反褶积, 因为它使用图像中的荧光信号来确定信号从其原始源 (点扩展函数) 传播了多少。该过程通过将信号重新分配回原位置来提高信号分辨率。- 计算用于绿色荧光信号 (绿色荧光) 的点扩展函数 (聚砜), 其参数如下:
- 设置计算的聚砜为共聚焦。将介质折射率设置为 1.515, 数值孔径为1.25。将探测器针孔设置为1通风装置 (a.u)。将激光激励波长设置为 488 nm, 发射波长为 515 nm.
- 使用以下参数计算红色荧光线粒体信号 (红色荧光) 的聚砜:
- 将计算的聚砜设置为共聚焦。将介质折射率设置为 1.515, 数值孔径为1.25。将探测器针孔设置为 1 AU。将激光激励波长设置为 543 nm, 发射波长为 617 nm.
- 通过使用上面列出的相应 PSFs 和迭代恢复功能设置为100% 的置信度和10周期的迭代限制, 对神经和线粒体荧光信号进行反褶积优化.
- 计算用于绿色荧光信号 (绿色荧光) 的点扩展函数 (聚砜), 其参数如下:
- 创建特定于神经的曲面:
- 使用和 #34; 创建曲面和 #34; 工具, 使一个固体表面的神经从积绿色荧光二次标记的 PGP9.5 识别神经.
- 取消选中和 #34; 平滑和 #34; 特征并使用绝对强度特性来设置神经信号的阈值, 因为它比背景荧光明显亮.
- 使用绝对强度特征来设置神经信号的阈值, 因为它比背景荧光明显亮。设置阈值足够低, 以准确识别神经.
- 根据大小筛选出小的、non-nerve 的曲面.
注: 如有必要, 请在 "和 #34 中手动编辑出其他 non-nerve 曲面; 编辑和 #34; 通过按住控制键以突出显示多个对象, 然后使用 Delete 键删除它们.
- 隔离神经特定的荧光线粒体信号:
- 选择神经表面的 "编辑" 选项卡以查看和 #34; 掩码属性和 #34; 功能。3.3 步所产生的神经表面被用来隔离那些神经内的线粒体, 远离与角质形成细胞相关的线粒体信号.
- #34; 掩码 #39; 按钮打开 #34; 掩码通道和 #34; 窗口, 从下拉菜单中选择积的红色荧光信号; 通道选择和 #34; 用于线粒体信号.
- 在应用掩码和 #34 之前, 在框中单击以在 #34;d 重复通道中放置一个复选标记; 选项.
- 单击 #34 前面的单选按钮; 常量内/外/#34; 掩码设置的选项, 并在框中单击以在和 #34 中放置复选标记; 将像素设置为外部曲面和 #34; 选项和键入值0.00。单击 OK 按钮创建新的通道, 表示在神经表面的线粒体信号.
- 创建特定于线粒体的曲面:
- 使用和 #34; 创建曲面和 #34; 工具, 使一个固体表面的线粒体从新创建的荧光通道的神经特异性线粒体信号从步骤 3.4.
- 取消选中和 #34; 平滑和 #34; 特征并选择 #34; 背景减法和 #34; 功能来设置阈值。该功能利用线粒体信号周围的局部对比来识别背景中的线粒体.
- 设置阈值足够低, 以准确识别线粒体。在本例中, 较低的阈值为16位 (65536) 的刻度设置为 2000.
- 根据大小筛选线粒体表面。在这个例子中, 体素限制被设置为1.0 体, 这是最低限制可能。如有必要, 手动编辑和 #34 中的 non-mitochondria 曲面; 编辑和 #34; 通过按住控制键以选择多个对象, 然后使用 Delete 键删除它们.
注: 有时, 该软件将创建与可分辨的荧光线粒体信号不相关的表面。在这些情况下, 可以使用 and #34 删除它们; 编辑和 #34; 选项卡.
- 导出并计算分析的形态学值:
- 从和 #34 中导出神经和线粒体表面的值; 统计和 #34; 使用电子表格软件进行进一步分析的选项卡.
- 导出神经和线粒体表面的音量值.
- 计算每个图像中存在的单个神经纤维的数量, 并在电子表格中记录该值.
- 对于每个图像, 在电子表格中计算以下潜在的分析值:
- 总和所有神经表面的体积.
- 将特定于神经的线粒体表面过滤出小于0.02 和 #181 的体积; m 3 , 并按大小对曲面进行装箱。例如, 使用垃圾箱, 如 0.02-0.04, 0.04-0.08, 0.08-0.16, 0.16-0.32, 0.32-0.64, 0.64-1.28, 1.28-2.56, 大于2.56 和 #181; m 3 .
注意: 线粒体容量的下限设置为0.02 和 #181; m 3 基于以前发布的卷 mitonchodria 36 、 37 、 38 . - 计算每个 bin 中特定神经的线粒体表面的数量, 以及在垃圾箱 (0.02-大于2.56 和 #181; m 3 ) 上的总曲面数.
- 计算每个纸盒中特定神经的线粒体表面的比例。使用每个 bin 的计数除以线粒体表面的总数量.
- 总和所有神经特定的线粒体表面的体积.
- 通过将总神经面积除以所有线粒体表面体积的总和来计算线粒体信号的神经比例.
- 通过将总神经表面体积除以所有线粒体表面的计数来计算每个神经体积的线粒体数.
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Representative Results
人 IENFs 中线粒体的可视化与量化
荧光免疫组织化学允许在人体皮肤活检中同时标记多个信号, 以可视化神经、线粒体和细胞核。96井板是组织免疫组化过程中的步骤的一种简便方法。图 1显示此配置占了多达8节, 可通过12阶段的解决方案进行处理。自由浮动的方法, 加上温和的搅拌与平摇杆, 确保抗体有足够的机会穿透双方的部分。该协议需要3天才能完成, 这主要是由于在4° c 的初级和二级抗体中过夜孵化, 这就持续地标记了神经和线粒体。
该程序的其余部分包含了对荧光信号的成像、处理和分析。共焦显微镜通过消除焦信号, 利用荧光信号从焦平面的光学截面离散信号。通过组织切片获得 z 系列提供了神经、线粒体和细胞核的荧光信号的3D 表示。参数的优化, 以图像172µm 沿长度的表皮, 将包括平均5神经。图 2说明了从表皮收集的三荧光信号的典型3D 图像。PGP9.5 染色 (图 2B) 提供的是表皮和真皮神经的丰富信号, 其强度高于组织的背景荧光。核染色 (图 2C) 有助于确定 intraepidermal 神经纤维支配的表皮边界。这是常见的表皮外层有一个弥漫的信号, 可能是由于残留 DNA 的 corneocytes, 构成了角质层。线粒体被清楚地标记为细胞染色 (图 2D), 其中大多数的信号是与表皮中主要的角质形成层的单元相联系的。
本协议中描述的采集参数使用40X 的油浸泡物镜, 其1.25 的数值孔径和变焦系数为2.2。这将导致 XYZ 图像大小为176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm。这些设置捕获足够的表皮, 包括平均每张图像4-6 神经纤维 (图 3A)。高分辨率的取样可以减少每个图像中的神经数量。图 3B显示一个缩放因子 3.3, 它将 XY 区域缩小到114.8 µm x 114.8 µm, 从而使每个图像的神经更少。理想的取样密度, 由奈奎斯特 (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) 定义的40x 油浸泡目标与1.25 的数值孔径建议 XYZ 扫描分辨率 54 nm x 54 nm x 205 nm。这将需要一个缩放系数为6.6 倍, 在 1024 x 1024 分辨率和减少 XY 视图到57.4 µm x 57.4 µm 和只捕获平均 1-2 神经每图像 (图 3C)。
下一个阶段是执行图像处理, 以消除图像中不需要的区域, 并增强信号。在这个协议中, 为了集中分析 IENFs 支配的表皮区域, 真皮和角质层被移除。三维软件使其能够隔离、增强和分析荧光信号。该软件中的工具是需要的, 以分离的表皮神经和线粒体, 裁剪出的区域以上的表皮 (图 4A-C)。通过将信号折叠到一个扩展视图中, 然后在表皮周围描摹一个手绘区域, 简化了这个过程。通过图像恢复算法进一步处理裁剪后的图像。反褶积用于优化神经和线粒体信号的分辨率 (图 4D)。
最后一个阶段是从信号中检测和提取形态特征。该协议的一个重要方面是测量神经特异性线粒体的特征。图像分析软件的特点是使用为一个信号 (在这种情况下, 神经表面) 创建的表面, 作为掩蔽工具, 以隔离另一个荧光信号 (在这种情况下, 线粒体) 在该表面。神经特异性线粒体分析的第一步是在神经周围创建3D 表面 (图 5A-b)。然后用神经表面来裁剪神经特异的荧光线粒体信号 (图 5C, 5D, 5E, 5G)。最后, 3D 表面围绕神经特异性的线粒体信号产生, 以获得体积测量 (图 5F, 5H)。表 3显示从图像分析软件和汇总数据导出的形态测量度量。输出的主要价值是神经和神经特异的线粒体信号的体积值。线粒体的体积数据搁置生成线粒体大小频率数据, 然后用于创建大小频率直方图 (图 6)。体积数据也用于对每 IENF 体积的线粒体数量和 IENF 体积内线粒体体积的百分比作简易测量。
表3和图 6中的数据表明, 该技术提供了一种从皮肤活检中量化人体 IENFs 线粒体的方法。从这个样本的神经有线粒体分布在整个和大多数的线粒体是在 0.02-0.32 µm3。这些大小在与正常线粒体相关的范围内36,37,38,39。更小的线粒体被证明比较大的线粒体更具能动性39表明这些神经中的线粒体可能更具能动性。事实上, 研究表明, 较大的, 肿胀的线粒体不传输以及更小的线粒体和可能导致轴突变性39,40,41。因此, 对神经特异性线粒体的定性是一种有价值的技术, 可用于研究神经退行性疾病, 线粒体形态学和转运的变化与轴突变性有关.15,25,26,27,42,43。
| 5% BSA 堵塞解决方案 | |
| 5% BSA 阻断液的组成 | 所需金额 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) [最终浓度: 5%] | 0.625 克 |
| 1.0% 海卫 X-100 (TX-100) [最后的集中: 0.3%] | |
表 1:5% BSA 阻止解决方案5% BSA 阻断液用于免疫组化协议的早期步骤, 以阻断抗体的非特异性结合。
| 1% BSA 漂洗液 | |
| 1% BSA 漂洗液的成分 | 所需金额 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) [最终浓度: 1%] | 0.125 克 |
| 1.0% TX-100 [最后的集中: 0.3%] | 3.75 毫升 |
| 1x PBS | 〜8.125 毫升 |
| 总计(使用 1X PBS, 使总体积为12.5 毫升) | 12.5 毫升 |
表 2:1% BSA 漂洗解决方案1% BSA 漂洗溶液用于免疫组化协议, 阻断抗体的非特异性结合, 用于稀释初级和二级抗体。
| IENFs 和神经特异性线粒体的形态学测量 | ||||||||
| 从图像分析软件导出和汇总数据 | ||||||||
| Mt 大小频率箱 | 大小频率箱中的 Mt 数 | Mt 在 Bin 中的百分比 | Mt 总数量 | Mt 卷 (µm3) | IENF 卷 (µm3) | 每 IENF 卷的 Mt 数 (number/100 µm3) | IENF 容积中 Mt 体积的百分比 | IENFs 数量 |
| 之间 02-. 04 µm3 |
20 | 24.4% | 82 | 13.41 | 518.88 | 15。8 | 2.58% | 4 |
| 之间 04-. 08 µm3 |
28 | 34.1% | ||||||
| 之间 08-. 16 µm3 |
14 | 17.1% | ||||||
| 之间 16-. 32 µm3 |
12 | 14.6% | ||||||
| 之间 32-. 64 µm3 |
4 | 4.9% | ||||||
| 之间 . 64-1. 28 µm3 |
3 | 3.7% | ||||||
| 之间 1.28-2. 56 µm3 |
1 | 1.2% | ||||||
| 之间 2.56 + µm3 |
0 | 0.0% | ||||||
表 3:IENFs 和神经特异性线粒体的形态测量.该表表示从图像分析软件和汇总数据中测量和导出的形态计量值。缩写: IENF, intraepidermal 神经纤维;Mt, 线粒体。
图 1: 示意图表示 96-井板的皮肤活检免疫组织化学的设置。板中的行表示在协议中的步骤, 用于块、洗涤和孵化解决方案, 而列代表单个组织切片 (每片1到8节)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:代表3D 人表皮活检组织切片的共焦显微图像, 用于荧光免疫组化。未处理的3D 投影图像说明了(A)合并的荧光信号和单独的信号(B)神经 (神经, 绿色), (C)核 (校正, 蓝色) 和(D)线粒体 (Mt, 红色) 在表皮和真皮.注意表皮角质层层缺乏信号。缩放栏 = 20 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 改进后的图像分辨率会导致更少的神经进行后续分析.所有的图像都是用一个1.25 的数字孔径40X 的油目标捕捉的, 3D 的投影说明了神经 (绿色), 线粒体 (Mt, 红色) 和细胞核 (校正, 蓝色) 的荧光信号。在缩放系数为 2.2 (a)中拍摄的图像在视图中包含若干个神经。将缩放因子增加到 3.3 (B)或 6.6 (C), 这是理想的奈奎斯特采样, 大大减少了每个图像中的神经数量。缩放栏 = 20 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 图像处理.从人表皮活检组织切片的共聚焦显微镜观察图像的具有代表性的扩展焦点 (最大强度投影) 视图。未处理的投影图像说明(A)神经 (绿色)、细胞核 (校正、蓝色) 和线粒体 (Mt、红色) 的合并荧光信号。真皮和角质层是(B)裁剪出与一个区域的界面rest (roi) 徒手选择工具 (蓝色高亮区域, 作物 ROI) 仅隔离表皮中的信号。然后, (C)裁剪表皮被处理为(D)反褶积, 并使用计算点扩展函数来改善神经 (绿色) 和线粒体 (Mt、红色) 信号的分辨率。缩放栏 = 20 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 图像分析.代表性3D 共焦显微图像说明 (A) 神经特异性绿色荧光信号。(B)为神经信号创建3D 曲面 (青色)。神经特异性的线粒体信号与(C)表皮线粒体信号 (Mt, 红色) 的其余部分分离, 由(D)使用神经表面作为掩蔽工具。产生的(E, G)神经特异的线粒体红色荧光信号被用来创建 (F, H)表面 (Mt, 洋红) 周围的线粒体内的神经表面 (青色)。g 和 H 是放大的看法的白色框在 E 和 f. 规模酒吧 = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 线粒体大小频率直方图.Mitochondrialsurface 数据被提出作为一个大小频率直方图, 以可视化的百分比线粒体是存在于每个不同的垃圾箱根据其体积 (µm3)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本议定书的目的是分离, 量化和分析的大小和分布的神经特异性线粒体在 IENFs 3D 从人体皮肤活检。协议中有几个关键步骤。自由浮动荧光免疫组织化学设计用于对每个样本中的多个信号进行着色和分析, 为探索性研究提供了一种更加通用的方法44,45。这一过程允许抗体渗入组织, 以最大限度地获得图像整个50µm 部分, 这是必要的获得共聚焦显微镜图像和3D 分析。另一个关键的步骤是图像采集参数, 这是平衡之间捕捉足够的神经每个图像, 同时保持分辨率测量线粒体。本和标准皮肤活检协议中使用的组织切片约为 3 mm 长45,46,47,48。该协议中描述的采集参数捕获足够的表皮, 包括平均每张4-6 神经纤维。高分辨率的取样会显著减少每个图像中的神经, 特别是在奈奎斯特取样时。第三个关键步骤是使用反褶积算法来提高信号的分辨率和对比度, 特别是对线粒体。图像的反褶积有助于补偿非采样的高分辨率。最后一个关键步骤是使用图像分析软件来隔离与表皮细胞相关的线粒体的神经特异性线粒体。这是通过利用神经表面作为掩蔽工具来裁剪出神经内的线粒体信号来实现的。
这项技术有一些潜在的修改要考虑。一个可能的修改是缩短荧光免疫组织化学的持续时间。在4° c 的初级和二级抗体溶液中过夜的孵化可以在室温下缩短到3-4 小时。然而, 在室温下较短的孵化通常会增加背景荧光, 因此应谨慎避免信号噪音差。另一个可能的修改是调整图像采集参数。如上所述, 这里描述的图像采集偏向于在高图像分辨率下捕捉每个图像的合理数目的神经。它可以使用一个更高的放大率的目标, 如63x 油浸泡目标与1.3 的数字光圈。如果所有参数保持不变, 并且使用了63X 目标, 则 XY 图像字段将减少到112µm x 112 µm, 从而减少每个图像的平均神经数。要点是在整个购置和后续分析中使用一致的参数。
这项技术的主要限制是它是费时的。免疫组化需要3天来处理组织, 图像采集需要大约 30-50 分钟的每个图像取决于多少光学 z 步骤采取, 图像处理/分析大约需要20分钟。这是一个重要的时间承诺, 但最终产生重要的形态计量测量。这项技术的另一个局限性是每个图像的表皮取样面积有限。然而, 随着计算机处理器和分析软件的快速提高, 图像采集率得到改进, 这无疑会改善。
该协议对其他方法的意义在于将荧光免疫组化与共聚焦显微镜和3D 图像分析相结合的力量。传统上, intraepidermal 神经纤维分析采用原基免疫组化和光场显微镜进行, 特别是对神经病变的临床诊断45,47,49。使用荧光免疫组化技术, 可以对每个样本中的多个信号进行着色和分析, 为探索性研究提供一种更通用的方法44,45。这项技术提供了一个策略, 以隔离特定的信号的兴趣, 在这种情况下, 神经特异性线粒体, 从一个复杂的信号, 线粒体与表皮细胞有关。
这种技术的威力在于它在将来的应用中是有用的。分离和测量神经特异性线粒体的能力使得有可能评估疾病引起的线粒体大小和分布的改变。多发性神经并发症牵连线粒体功能障碍作为一种潜在的疾病机制。特别是, 这项技术的修改版本已被用来证明糖尿病患者和糖尿病周围神经病变可的大小和分布的神经特异性线粒体的变化相比, 年龄匹配控制50。这项技术将有助于评估治疗的效果, 旨在改善或治疗感官神经病。最后, 该技术的通用性使它适用于广泛的分析, 使用一个荧光信号, 以隔离一个子集的数据, 从其他荧光信号。
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Disclosures
没有利益冲突要申报。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院的资助, K08 NS061039-01A2, 神经病学研究和 #38; 发现, 和密歇根大学 Taubman 医学研究所的 a。这项工作使用的形态学和图像分析核心的密歇根糖尿病研究中心, 由国家卫生研究院资助 5P90 DK-20572 来自国家糖尿病和消化系统和肾脏疾病研究所。作者要感谢 j. 鲁滨逊单身人士和 a. 戈登？史密斯 (犹他大学) 慷慨捐献人体皮肤样本。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
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