Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tre-dimensionelle billedbehandling og analyse af mitochondrier i menneskelige Intraepidermal nervefibre

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/53369
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

Summary

Denne protokol bruger tre-dimensionelle (3D) billedbehandling og analyse teknikker til at visualisere og kvantificere nerve-specifikke mitokondrier. Teknikkerne, der er gældende for andre situationer, hvor en fluorescerende signal bruges til at isolere et undersæt af data fra en anden fluorescerende signal.

Abstract

Målet med denne protokol er at studere mitokondrier i intraepidermal nervefibre. Derfor blev 3D imaging og analyse teknikker udviklet for at isolere nerve-specifikke mitokondrier og evaluere sygdom-inducerede ændringer af mitochondrier i distale spidsen af sensoriske nerver. Protokollen kombinerer fluorescens immunhistokemi, Konfokal mikroskopi og 3D billede analyseteknikker til at visualisere og kvantificere nerve-specifikke mitokondrier. Detaljerede parametre er defineret i hele procedurerne for at give et konkret eksempel på, hvordan disse teknikker til at isolere nerve-specifikke mitokondrier. Antistoffer blev brugt til at mærke nerve og mitokondriel signaler inden for væv dele af huden punch biopsier, som blev efterfulgt af indirekte immunfluorescens at visualisere nerver og mitokondrier med en rød og grøn fluorescerende signal henholdsvis. Z-serie billeder blev erhvervet med Konfokal mikroskopi og 3D analyse software blev brugt til at behandle og analysere signalerne. Det er ikke nødvendigt at følge de nøjagtige parametre, der beskrives inden for, men det er vigtigt at være i overensstemmelse med de af dem valgt i hele farvning, erhvervelse og analyse trin. Styrken af denne protokol er, at det finder anvendelse på en bred vifte af omstændigheder hvor en fluorescerende signal bruges til at isolere andre signaler, der ellers ville være umuligt at studere alene.

Introduction

Mitokondrier tjene vitale cellulære funktioner, der omfatter produktion af celle energi, buffering calcium, og regulering af nekrotisk og apoptotiske celle død1,2,3. Nervesystemet har en høj stofskifte i forhold til kroppen4 tyder på, at neuroner generere en høj grad af cellulære energi i form af adenosin trifosfat (ATP) gennem mitokondrie respiration. En masse beviser dokumenter at neuronal funktioner er afhængige af ATP5, især på synapser6. Fordelingen af mitokondrier i neuroner er derfor vigtig.

I de sidste 10 år en masse oplysninger har vist, at menneskehandel og docking af neuronal mitokondrier er stærkt reguleret. Motor proteiner er involveret i distribution af mitokondrier til specifikke cellulære rum i hele neuron. Handel med mitokondrier er især vigtig, fordi neuroner projekt axoner og dendrites langt væk fra soma. Kinesin motor proteiner direkte primært anterograd (fra soma) handel med mitokondrier langs mikrotubuli mens dynein motor proteiner direkte retrograd (mod soma) motilitet7,8,9 , 10. der er trådløse signaler sådan mitokondrielle membran potentiale og impuls overledning, der påvirker tilstedeværelsen og retning af mitokondrie menneskehandel11,12,13.

Ud over transport af mitokondrier, er der specialiserede proteiner til at lokalisere mitokondrier til specifikke cellulære rum, der har høj energi krav, som noder af Ranvier og synapser8,14, 17. I virkeligheden, fleste af mitokondrier i axoner er ikke-motile9,13,18. Specialiserede proteiner som syntaphilin anker mitokondrier at mikrotubuli langs axoner mens andre proteiner anker mitokondrier til aktin cytoskeleton19-21. Vækstfaktorer og ioner som calcium er blevet rapporteret til at støtte ophør af mitokondrier bevægelse at lokalisere dem til regioner, hvor de nødvendige21,22,23.

Tilsammen, er menneskehandel og docking af mitokondrier afgørende for korrekt funktion af neuroner. Til støtte for dette, har forstyrrelser i mitokondrie handel været forbundet med flere neurologiske tilstande herunder Alzheimers sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sygdom, Huntingtons sygdom, arvelig spastisk paraparesis, og optisk atrofi15,24,25,26,27. Nylige undersøgelser har fokuseret på mitokondriel dysfunktion og patologi som en potentiel mekanisme for diabetisk neuropati, sensorisk tab forbundet med diabetes28,29,30,31 ,32,33. Hypotesen er, at diabetes ændrer fordelingen af mitokondrier i de sensoriske fremskrivninger af kutane nerve slutter. Derfor, en teknik blev udviklet for at visualisere og kvantificere mitokondrier i intraepidermal nerve fibre (IENFs), de distale tips af dorsalrods ganglion sensoriske afferenter. Teknikken kombinerer fluorescens Immunhistokemi specifikke mitokondrie og nerve fiber etiketter med konfokalmikroskopi z-serie erhvervelse af signaler med kraftige 3D billede analyse software til at måle fordelingen af nerve-specifikke mitokondrier fra menneskelige kutane punch biopsier at nå dette mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hud punch biopsier blev indhentet fra emner, der blev rekrutteret fra et stort community-baseret primær pleje netværk på University of Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Denne undersøgelse blev godkendt af University of Michigan institutionelle Review Board og overholdt grundsætningerne af Helsinki-erklæringen. Skrevet blev indhentet informeret samtykke fra hvert emne før afprøvningstidspunktet.

1. fluorescens Immunhistokemi

  1. Forbered punch biopsier for intraepidermal nerve fiber Immunhistokemi:
    1. udføre 3 mm hud biopsier af medicinsk personale og Placer de hele biopsi i 1,5 mL Zamboni ' s Fikseringsvæske løsning (2% PARAFORMALDEHYD, 0,3% mættet picrinsyre syre i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7,4) ved 4 ° C natten.
    2. Skylles prøver med en opløsning af 30% saccharose i PBS ved 4 ° C i 16-24 timer eller indtil prøven dræn.
    3. Embed prøver i optimal opskæring temperatur sammensatte (OCT) ved hjælp af en cryomold. Placere hele 3 mm biopsi med epidermis vender nedad i formen og fyld formen med ca. 2 mL oktober fryse mug på knust tøris. Opbevares ved-80 ° C indtil klar til brug.
    4. Skære 50 µm tykt cross sektioner ved hjælp af en kryostaten og gemme i individuelle brønde på en 96-brønd plade ved hjælp af 180 µL frostvæske storageløsning pr. brønd (30% ethylenglycol, 30% glycerol i PBS). Følgende anvisninger er for 8 brønde med en 96 godt plade. Pletten sektioner fra hver biopsi webstedet, der er 200-300 µm fra hinanden.

dag 1:

  1. dæmpning af ikke-specifik mærkning af stratum corneum:
    1. etiket 96-brønd plade som vist i figur 1.
    2. Afpipetteres 150 µL af stock signal forstærker løsning til at reducere uspecifik binding af sekundære antistoffer 34 , 35 i hver brønd. Overføre dele til signal forstærker løsning ved hjælp af en inoculating loop.
      Bemærk: være forsigtig samtidigt arbejder med væv til at undgå skadelige eller rive afsnittene væv. Holde i signal forstærker løsning i 30 minutter ved stuetemperatur på en flad rocker.
    3. Forbered skyl brønde i rækker 2 og 3 i 96-brønd pladen ved at tilføje 150 µL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i hver brønd.
    4. Omhyggeligt overføre sektioner i række 2 og skyl i 1 x PBS i 10 min ved stuetemperatur.
    5. Skylles en gang i 1 x PBS i 10 min. ved stuetemperatur (række 3).
  2. Forberede 5% bovint serumalbumin (BSA) blokerer løsning:
    1. forberede 5% blokering løsning, der indeholder 5% BSA og 0,3% Triton X 100 (TX-100) i 0,1 M PBS (Se tabel 1) mens sektioner inkubere i signal forstærker løsning. BSA går ikke let i løsning. Vortex løsning indtil BSA helt opløst.
    2. Forbered blokerende brønde i række 4 i 96-brønd pladen ved at tilføje 150 µL af 5% BSA blokering løsning i hver brønd.
    3. Overføre sektioner i individuelle brønde af 5% BSA blokering løsning og inkuberes sektioner i 5% BSA blokering løsning i 1-2 timer ved stuetemperatur på en flad rocker.
  3. Forberede 1% BSA skylning opløsning og fortynding af primære antistoffer:
    1. Forbered 1% føres løsning, der indeholder 1% BSA og 0,3% TX-100 i 0,1 M PBS (Se tabel 2) mens sektioner er inkubation i 5% BSA blokerende løsning. BSA går ikke let i løsning. Vortex løsning indtil BSA helt opløst.
    2. Fortyndes primære antistoffer i 1% BSA føres løsning, mens sektioner inkubation i 5% BSA blokerende løsning.
      1. Gøre 1.500 µL af primære antistof løsning og føje til hver godt i række 5.
      2. Fortyndes de primære antistoffer: bruge nerve-specifikke label, kanin polyklonale anti-genet produkt 9,5 (PGP9.5) på 1:1, 000. Bruge mitokondrier-specifikke label, musen monoklonalt anti-pyruvat dehydrogenase E2/E3bp antistof (PDH) på 1: 100 i 1% BSA skylning løsning.
  4. Forbered primære antistof:
    1. afpipetteres 150 µL af primære antistof til hvert godt i række 5 96-brønd nummerpladens.
    2. Ved hjælp af værktøjet loop transfer sektioner fra den blokerende løsning (række 4) i rækken 5 indeholder den primære antistof.
    3. Wrap plade tæt med parafilm at holde det fra udtørring.
    4. Prøveemner på flad rocker ved stuetemperatur i 1 time, og derefter inkuberes prøver på 4 ºC på en flad rocker natten.

dag 2:

  1. skylles prøver:
    1. Forbered skyl brønde i rækker 6, 7 og 8 i 96-brønd pladen ved at tilføje 150 µL af 1% BSA skylning løsning i hver brønd.
    2. Overføre sektioner i første 1% BSA føres løsning (række 6) og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Gentag skylninger to gange flere ved at inkubere sektioner i 1% BSA skylning løsning i rækkerne 7 og 8 i 1 time ved stuetemperatur.
  2. Fortyndes sekundære antistoffer i 1% BSA skylning løsning:
    1. gøre 1.500 µL af sekundær antistof løsning mens sektioner inkubere i den sidste skylning af 1% BSA skylning løsning (række 8).
    2. Fortyndes sekundære antistoffer: for PGP9.5 (grønt-fluorescerende konjugeret gede anti-kanin antistof, 1:1000), til PDH (rødt-fluorescerende konjugeret gede anti-mus, 1:1, 000) i 1% BSA skylning løsning.
  3. Forbered sekundær antistof:
    1. afpipetteres 150 µL af sekundær antistof i række 9 i 96-brønd plade.
    2. Forsigtigt overføre afsnittene fra 1% BSA skylning løsning (række 8) til sekundær antistof wells (række 9).
    3. Brug af parafilm, wrap plade stramt at holde den mod udtørring. Dæk med alufolie. Prøveemner på flad rocker ved stuetemperatur i 1 time, og derefter inkuberes prøver på 4 ˚C på en flad rocker natten.

dag 3:

  1. Forbered rense 1 x PBS ved filtrering gennem et 0,22 µm filter:
    1. afpipetteres 150 µL af filtreret 1 x PBS i række 10, 11 og 12.
    2. Overføre prøver til række 10 og skyl i 1 x PBS i 1 time ved stuetemperatur. Dække 96-brønd plade med alufolie og sted på en flade rocker under skylning. Gentag filtreret 1 x PBS skyl, to gange i 1 time ved stuetemperatur i rækker 11 og 12.
  2. Forberede objektglas til montering væv sektioner:
    1. sted 50 µL af filtreret 1 x PBS på et dias.
    2. Overførsel afsnit fra 1 x PBS (række 12) i 50 µL drop. Omhyggeligt placere afsnittet i drop PBS ved udfoldning væv og blidt udfladning det på glas dias. Fjern overskydende PBS med et glas pipette for at undgå fortynding montering reagens. Rør ikke sektioner med glas pære.
    3. Afpipetteres 1 - 2 dråber af montering reagens indeholdende DAPI direkte på afsnittet om mikroskop dias ved hjælp af pleje at ikke forstyrre orientering af afsnittet. Anbring forsigtigt en 50 mm x 24 mm #1.5 mikroskop glas coverslip over afsnittet.
    4. Fjern eventuelle luftbobler, der dannede samtidig med at placere coverslip og tørre overskydende væske fra kanterne af coverslip. Forberede et nyt dias og Gentag montering prBehandl for hvert afsnit.
    5. Kur/tør montering medier ved at placere dias i den mørke overnatning ved stuetemperatur. Overføre dias til 4 ° C for kortvarig (1-2 uger) eller -20 ° C til langtidsopbevaring (større end 2 uger).
      Bemærk: Negative Kontroller udeladt primære antistoffer for PGP9.5 eller PDH taktfast 1.4.2.2 og vises ingen identificerbar mærkning af nerver eller mitokondrier i epidermis. Positiv kontrol blev udført for PDH antistof til at bevise det mærker alle mitokondrier (data ikke vist). Positiv kontrol blev udført på kulturperler primære mus dorsalrods ganglion neuroner, der var transduced med en baculovirus til etiketten mitokondrier med en grøn fluorescerende proteiner (NGL) signal og derefter fast og farves med PDH antistof og rødt fluorescerende sekundær antistof. Alle mitokondrier, der udtryk for normal god landbrugspraksis var Co mærket med den røde etiket for PDH Immunhistokemi (data ikke vist).

2. Konfokal Imaging

  1. udføre Konfokal billedbehandling:
    1. indsamle billeder ved hjælp af en laser scanning Konfokal mikroskop med en 40 X immersionsolie (1,25 numerisk blænde (N.A.)) mål på en inverteret mikroskop.
      1. På hver brændplanet sekventielt erhverve fluorescerende signaler:
        kerner: excitation λ = 405 nm, spektrale emission filter λ = 420-480 nm
        nervefibre: excitation λ = 488 nm, spektrale emission filter λ = 505-560 nm
        Mitoch ondria: excitation λ = 543 nm, spektrale emission filter λ = 606-670 nm
    2. indtaste følgende scanningsparametrene i mikroskop software: scan rate af 600 Hz med 2 ramme gennemsnit og zoom på 2,2; 12-bit intensitet opløsning (4096 grå niveauer).
      1. Sæt mikroskop software til optimeret laterale opløsning (scanne opløsning = 1.024 x 1.024) og aksial opløsning/optisk skæring (Konfokal blænde = 1 luftige enhed (AU) med z-trin størrelse på 210 nm).
        Bemærk: Den resulterende XYZ opløsning er 172.2 nm x 172,2 nm x 210 nm med en størrelse af 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.
    3. Aktivere en levende scanning for nerve signal (grøn-fluorescens) og justere kontrolelementet z-fokus for at finde og angive øvre og lavere fokale fly i mikroskop software, der omfatter nerve signalet inden for afsnittet væv. Den samlede z-serien er typisk 30-50 µm for en 50 µm væv sektion.
    4. Rotere feltet scan med mikroskop software under en levende scanning, så overhuden placeres vandret eller lodret i billedet.
    5. Scan hvert signal separat og justere detektor (photomultiplier tube, ydelse) spænding og forskydning til at minimere/fjerne nogen over og under mættede pixels.
      Bemærk: Scanning gange med ovenstående parametre tager ca 20-40 min. afhængig af antallet af z skiver.

3. 3D visualisering og analyse af mitokondrier inden for menneskelige Intraepidermal nervefibre

  1. isolere 3D epidermis:
    1. duplikere det originale billede og bruger den maksimale intensitet projektion (extended fokus Se) af billedet for at identificere og isolere epidermis.
    2. Bruge en region af interesse værktøj til at spore langs de øvre og nedre kanter af epidermis til at fjerne uønskede områder såsom stratum corneum og dermis, der er fraværende af intraepidermal nervefibre. Afgrøde til denne udvælgelse.
  2. Brug deconvolution på nerve og mitokondriel fluorescerende signaler:
    Bemærk: Deconvolution hjælper med at genoprette integriteten af de fluorescerende signaler. Restaurering anvendes i denne protokol kaldes blind deconvolution, fordi det bruger de fluorescerende signaler i billeder til at afgøre, hvor meget signalerne spredt sig fra deres oprindelige kilde (punkt spredes funktion). Processen forbedrer signal opløsning af omfordeler signalet spredt tilbage til sin oprindelse placering.
    1. Beregn et punkt spredes funktion (PSF) for grøn fluorescerende nerve signal (grøn-fluorescens) med følgende parametre:
      1. Angiv beregnede PSF til Konfokal. Indstil medium brydningsindeks til 1.515 og numerisk blænde til 1,25. Sæt detektoren pinhole til 1 luftige enhed (A.U.). Sæt laser excitation bølgelængde 488 nm og emission bølgelængde til 515 nm.
    2. Beregner en PSF til de røde fluorescerende mitokondrie signal (rød-fluorescens) med følgende parametre:
      1. sæt beregnet PSF til fluorescens. Indstil medium brydningsindeks til 1.515 og numerisk blænde til 1,25. Sæt detektoren pinhole til 1 AU. Sæt laser excitation bølgelængde 543 nm og emission bølgelængde til 617 nm.
    3. Optimere de nerve og mitokondrier fluorescerende signaler ved deconvolution ved hjælp af de tilsvarende vævede ovennævnte og iterativ restaurering funktion indstillet på 100% tillid og en iteration grænse af 10 jernbanecykler.
  3. Oprette nerve-specifikke overflader:
    1. Brug den " skabe overflade " værktøj til at lave en fast overflade af nerver fra det deconvolved grønt-fluorescerende sekundær mærkning af PGP9.5 identificeret nerver.
    2. Uncheck den " glat " indslag og bruger funktionen absolut intensitet for at fastsætte tærskel for nerve signal, da det er betydeligt lysere end baggrunden fluorescens.
    3. Bruger funktionen absolut intensitet for at fastsætte tærskel for nerve signal, da det er betydeligt lysere end baggrunden fluorescens. Angive tærskelværdien tilstrækkeligt lavt til at identificere nerverne.
    4. Filter ud lille, ikke-nerve overflader baseret på størrelse.
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, manuelt redigere ud yderligere ikke-nerve overflader inden for den " Edit " fane ved at holde CTRL-tasten for at fremhæve flere objekter og derefter slette dem med Slettetasten.
  4. Isoleres nerve-specifikke fluorescerende mitokondrie signal:
    1. Vælg fanen Rediger af nerve overfladen for at se den " maske egenskaber " funktion. Nerve overfladen har oprettet i trin 3.3 bruges til at isolere mitokondrier inden for disse nerver fra mitokondrie signaler tilknyttet keratinocytter.
    2. Som den " maske alle ' knap åbner en " maskekanalen " vindue, vælge den deconvolved rødt-fluorescerende signal fra rullegardinsmenuen under " kanalvalg " mitokondrie-signalets.
    3. Klik på i feltet for at sætte et flueben den " duplikerede kanal før du anvender maske " indstilling.
    4. Klik på radioen knap foran den " konstant inde i/uden for " mulighed for maske indstillinger og klik på boksen for at sætte et flueben den " indstille voxel udenfor overflade til " indstilling og type i 0,00 for værdien. Klik på OK-knappen for at oprette den nye kanal, der repræsenterer mitokondrie signaler inden for nerve overflade.
  5. Oprette mitokondrier-specifikke overflader:
    1. Brug den " skabe overflade " værktøj til at lave en fast overflade af mitokondrier fra den nyoprettede fluorescerende kanal nerve-specifikke mitokondrie signaler fra trin 3.4.
    2. Uncheck den " glat " funktionen og vælg den " baggrund subtraktion " funktion til at angive tærsklen. Denne funktion bruger lokale kontrast omkring mitokondrie signalet til at identificere mitokondrier fra baggrunden.
    3. Sæt tærskelværdi lav nok til at identificere mitokondrier. I dette eksempel den lavere tærskel blev sat på 2.000 til en 16-bit (65.536) skala.
    4. Filter mitokondrie overflader baseret på størrelse. I dette eksempel voxel grænse blev sat til 1,0 voxels, hvilket er det laveste begrænse mulige. Hvis det er nødvendigt, manuelt redigere ud ikke mitokondrier overflader inden for den " Edit " fane ved at holde CTRL-tasten til at vælge flere objekter og derefter slette dem med Slettetasten.
      Bemærk: Lejlighedsvis, programmet vil skabe overflader, der ikke er knyttet til en identificerbar fluorescerende mitokondrie signal. I disse tilfælde, er det muligt at fjerne dem med den " Edit " tab.
  6. Eksportere og beregne morfometrisk værdier for analyse:
    1. eksportere værdier for nerve og mitokondriel overflader fra den " statistik " fane for yderligere analyse med elektroniske regneark software.
    2. Eksportere volumen værdier for både nerve og mitokondriel overflader.
    3. Tælle antallet af individuelle nerve fibre i hvert billede og optage værdien i den elektroniske regneark.
    4. For hvert billede, beregne følgende potentielle værdier for analyse i den elektroniske regneark:
      1. Sum diskenheder for alle nerve overflader.
      2. Filter ud nerve-specifikke mitokondrie overflader under en mængde mindre end 0,02 µm 3 og bin overflader af størrelse. For eksempel, bruge placeringer som 0,02 - 0,04 0,04 - 0,08, 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1,28, 1.28-2,56, større end 2,56 µm 3.
        Bemærk: Den nedre grænse af mitokondrie volumen var indstillet til 0,02 µm 3 baseret på tidligere udgivne bind af mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Tæller antallet af nerve-specifikke mitokondrie overflader inden for hver placering og det samlede antal overflader over placeringer (0,02 - større end 2,56 µm 3).
      4. Beregne andelen af nerve-specifikke mitokondrie overflader på hver placering. Bruge Greven pr. bakke divideret med det samlede antal mitokondrier overflader.
      5. Sum diskenheder for alle nerve-specifikke mitokondrie overflader.
      6. Beregne andelen af nerve med mitokondrie signal ved at dividere den samlede nerve overflade volumen af summen af alle mitokondrie overflade diskenheder.
      7. Beregne antallet af mitokondrier pr. nerve volumen ved at dividere den samlede nerve overflade volumen med Greven af alle mitokondrie overflader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Visualisering og kvantificering af mitokondrier inden for menneskelige IENFs

Fluorescens Immunhistokemi giver mulighed for den samtidige mærkning af flere signaler inden for menneskelige hud biopsier at visualisere nerver, mitokondrier og kerner. En 96-brønd plade er en praktisk måde til at organisere trin i proceduren Immunhistokemi. Figur 1 viser, at denne konfiguration tegner sig for op til 8 sektioner skal behandles gennem 12 faser af løsninger. Metoden frit svævende kombineret med blid agitation med en flad rocker sikrer, at antistofferne har tilstrækkelig adgang til at trænge ind i afsnit fra begge sider. Protokollen tager 3 dage at fuldføre, som er i vid udstrækning overnight inkubationer i primære og sekundære antistoffer ved 4 ° C, som konsekvent mærke nerverne og mitokondrier.

Den resterende del af proceduren, der inkorporerer imaging, behandling og analyse af de fluorescerende signaler. Konfokal mikroskopi udnytter de fluorescerende signaler til optisk sektion diskrete signaler fra brændplanet ved at fjerne out-of-fokus signaler. Erhvervelse af z-serien via afsnittet væv giver en 3D repræsentation af de fluorescerende signaler for nerver, mitokondrier og kerner. Parametrene er optimeret til billede 172 µm langs længden af epidermis, der ville omfatte et gennemsnit på 5 nerver. Figur 2 illustrerer en typisk 3D billedet af de tre fluorescerende signaler, der er indsamlet fra epidermis. PGP9.5 farvning (figur 2B) giver en rig signal af den epidermale og dermal nerver, der er af en højere støtteintensitet end baggrunden auto-fluorescens af væv. Den nukleare plet (figur 2 c) hjælper med at identificere grænserne for epidermis hvor intraepidermal nervefibre innerverer. Det er almindeligt for det yderste lag af overhuden har en diffus signal, der kan være på grund af resterende DNA i den corneocytes, der udgør stratum corneum. Mitokondrier er tydeligt mærket af PDH farvning (figur 2D), hvor størstedelen af signalet er forbundet med celler i overhuden, der primært keratinocytter.

Erhvervelse parametre i denne protokol bruger en 40 X oliebestandighedsobjektet med en 1,25 numerisk blænde og en zoomfaktor på 2.2. Dette resulterer i en XYZ billedstørrelse for 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm. Disse indstillinger fange nok af epidermis med et gennemsnit på 4-6 nerve fibre pr billede (figur 3A). Prøvetagning på højere opløsning ville reducere antallet af nerver i hvert billede. Figur 3B viser en zoomfaktor af 3.3, som reducerer XY område til 114.8 µm x 114.8 µm, hvilket resulterer i færre nerver pr. billede. Den ideelle prøveudtagningsdensitet som defineret af Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) for en 40 x oliebestandighedsobjektet med en 1,25 numerisk blænde antyder en XYZ scanningsopløsning på 54 nm x 54 nm x 205 nm. Dette ville kræve en zoomfaktor på 6,6 fold på 1.024 x 1.024 opløsning og reducere visningen XY til 57.4 µm x 57.4 µm og fanger kun et gennemsnit på 1-2 nerve pr billede (figur 3 c).

Den næste fase er at udføre billedbehandling til at fjerne uønskede dele af billedet og styrke signalerne. I denne protokol er dermis og stratum corneum fjernet for at fokusere analysen på regionen i epidermis hvor IENFs innerverer. Tre-dimensionelle software gør det muligt at isolere og analysere de fluorescerende signaler. Funktioner i softwaren for at isolere den epidermale nerve og mitokondrier ved at beskære ud områder over og under epidermis (figur 4A-C). Denne proces er forenklet af kollapse signalerne i en udvidet visning og derefter spore en frihånd regionen omkring epidermis. Det beskårne billede er yderligere behandlet af billede restaurering algoritmer. Deconvolution bruges til at optimere løsningen af nerver og mitokondriel signaler (figur 4D).

Den sidste fase er at registrere og uddrage morfometrisk funktioner fra signalerne. Et vigtigt aspekt af denne protokol er at måle funktioner af nerve-specifikke mitokondrier. Billede analyse software har funktioner, der bruger flader lavet for et signal (i dette tilfælde nerve overfladen) som en maskering redskab til at isolere en anden fluorescerende signal (i dette tilfælde mitokondrierne) inden for denne overflade. Det første skridt i analysen af nerve-specifikke mitokondrier er at skabe 3D overflader omkring nerver (figur 5A-B). Nerve overflader bruges derefter til at beskære nerve-specifikke fluorescerende mitokondrie signaler (figur 5 c, 5D, 5E, 5 G). Endelig, 3D overflader er skabt omkring de nerve-specifikke mitokondrie signaler at opnå volumetriske målinger (figur 5F, 5H). Tabel 3 viser de morfometrisk målinger, der er eksporteret fra billede analyse software og opsummerede data. De vigtigste værdier at eksportere er volumen værdier for nerve og nerve-specifikke mitokondrie signaler. De mængde data fra mitokondrierne er arkiveret lodret for at generere mitokondrier størrelse frekvens data, som derefter bruges til at oprette størrelse frekvens histogrammer (figur 6). Mængdeoplysninger, der er også brugt til at gøre sammenfattende foranstaltninger for antallet af mitochondrier pr. IENF volumen og procentdelen af mitokondrie diskenhed i IENF mængder.

De data, der er præsenteret i tabel 3 og figur 6 viser, at denne teknik giver et middel til at kvantificere mitokondrier inden for menneskelige IENFs fra hud biopsier. Nerver fra denne prøve har mitokondrier fordelt over hele og fleste af mitokondrier er mellem 0,02 - 0,32 µm3. Disse størrelser er i en række associerede med normal mitokondrier36,37,38,39. Mindre mitokondrier har vist sig at være mere bevægelige end større mitokondrier39 tyder på, at mitokondrier i disse nerver kan være mere motile. Undersøgelser har faktisk impliceret, større, hævede mitokondrier ikke transporterer samt mindre mitokondrier og kan føre til cytoskeletale degeneration39,40,41. Karakterisering af nerve-specifikke mitokondrier er derfor en værdifuld teknik, der ville gælde for undersøgelser af neurodegenerative sygdomme, hvor ændringer i mitokondrie morfologi og transport har været forbundet med cytoskeletale degeneration 15,25,26,27,42,43.

5% BSA blokering løsning
Komponenter af 5% BSA blokering løsning Nødvendige beløb
Bovint serumalbumin (BSA) [endelige koncentration: 5%] 0,625 g
1,0% Triton X-100 (TX-100) [endelige koncentration: 0,3%]
3,75 mL 1 x PBS ~8.125 mL Samlede (brug 1 X PBS til at bringe samlede volumen til 12,5 mL) 12,5 mL

Tabel 1: 5% BSA blokering løsning. 5% BSA blokerende løsning bruges i tidlige trin af Immunhistokemi protokol til at blokere ikke-specifik binding af antistoffer.

1% BSA skylning løsning
Komponenter af 1% BSA skylning løsning Nødvendige beløb
Bovint serumalbumin (BSA) [endelige koncentration: 1%] 0,125 g
1,0% TX-100 [endelige koncentration: 0,3%] 3,75 mL
1 x PBS ~8.125 mL
Samlede (brug 1 X PBS til at bringe samlede volumen til 12,5 mL) 12,5 mL

Tabel 2: 1% BSA skylning løsning. 1% BSA skylning løsning er anvendt Immunhistokemi protokollen for at blokere ikke-specifik binding af antistoffer og anvendes til fortynding af primære og sekundære antistoffer.

Morfometrisk målinger for IENFs og Nerve-specifikke mitokondrier
Eksporterede og sammenfattende Data fra billede analyse Software
MT størrelse frekvens placeringer Antallet af Mt i størrelse frekvens Bin Procentdel af Mt i Bin Samlede antal Mt MT volumen (µm3) IENF volumen (µm3) Antallet af Mt pr. IENF volumen (antal/100 µm3) Procentdel af Mt volumen i IENF volumen Antallet af IENFs
mellem
.02-.04 µm3		 20 24,4% 82 13.41 518.88 15.8 2,58% 4
mellem
.04-.08 µm3		 28 34.1%
mellem
.08-.16 µm3		 14 17,1%
mellem
.16-.32 µm3		 12 14,6%
mellem
.32-.64 µm3		 4 4,9%
mellem
.64-1.28 µm3		 3 3,7%
mellem
1.28-2,56 µm3		 1 1,2%
mellem
2,56 + µm3		 0 0,0%

Tabel 3: Morfometrisk målinger for IENFs og Nerve-specifikke mitokondrier. Tabellen repræsenterer morfometrisk værdier, der er målt og eksporteret fra billede analyse software og opsummerede data. Forkortelser: IENF, intraepidermal nerve fibre; MT, mitokondrier.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk Diagram repræsenterer installation til en 96-brønd plade til huden biopsi Immunhistokemi. Rækker i pladen repræsenterer trin i protokollen til blok, vask og inkubering løsninger og kolonner repræsenterer individuelle væv sektioner (fra 1 til 8 sektioner pr. plade). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentative 3D Konfokal mikroskopi billede af et væv afsnit fra en Human Epidermal biopsi behandlet for fluorescens Immunhistokemi. Uforarbejdede 3D projektion billede illustrerer de (A) fusionerede fluorescerende signaler og enkelte (B) nerver (Nerve, grønne), (C) kerner (NUK, blå) og (D) mitokondrier (Mt, red) i overhuden og dermis. Bemærk manglen signaler i stratum corneum lag af epidermis. Skalere barer = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Forbedret Image Resolution resulterer i færre nerver til efterfølgende analyse. Alle billeder er taget med en 40 X olie mål med en 1,25 numerisk blænde og 3D fremskrivningerne illustrere fluorescerende signaler for nerver (grøn), mitokondrier (Mt, red) og kerner (NUK, blå). Et billede taget på en zoomfaktor 2,2 (A) indeholder flere nerver i visningen. Stigende zoomfaktor 3.3 (B) eller 6,6 (C), reducerer den ideelle Nyquist prøveudtagning, antallet af nerver i hvert billede. Skalere barer = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Billedbehandling. Repræsentant udvidet fokus (maksimal intensitet projektion) visning af et billede fra Konfokal mikroskopi af en væv sektion fra en human epidermal biopsi. Uforarbejdede projektion billede illustrerer (A) den fusionerede fluorescerende signaler for nerver (grøn), kerner (NUK, blå) og mitokondrier (Mt, rød). Dermis og stratum corneum er (B) beskåret med en region af interesten (ROI) freehand markeringsværktøj (blå fremhævet område, beskære ROI) isolere kun signaler i epidermis. (C) beskåret epidermis behandles derefter for (D) deconvolution med beregnede punkt spredes funktioner for at forbedre opløsning af nerver (grøn) og mitokondriel (Mt, rød) signaler. Skalere barer = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Image Analysis. Repræsentative 3D Konfokal mikroskopi billede illustrerer (A) den nerve-specifikke grøn fluorescerende signal. (B) en 3D-overflade (cyan) er skabt til nerve signalet. Nerve-specifikke mitokondrie signalet er isoleret fra resten af de epidermale mitokondrie signaler (C) (Mt, rød) af (D) ved hjælp af nerve overfladen som en maskering værktøj. Den resulterende (E, G) nerve-specifikke mitokondrie rødt fluorescerende signal bruges til at oprette (F, H) overflader (Mt overflade, magenta) omkring mitokondrier i nerve overflade (cyan). G og H er forstørret udsigt over de hvide felter i E og F. skala barer = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Mitokondrie størrelse frekvens Histogram. Mitochondrialsurface data er præsenteret som en størrelse frekvens histogram til at visualisere procentdelen af mitochondrier, der er til stede i hvert af de forskellige placeringer efter deres volumen (µm3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol er designet til at isolere, kvantificere og analysere størrelse og fordeling af nerve-specifikke mitokondrier inden for IENFs i 3D fra menneskelige hud biopsier. Der er flere kritiske trin i protokollen. Frit svævende fluorescens Immunhistokemi er designet til at pletten og analysere flere signaler i hver prøve, at give en mere alsidig metodologi for udforskende forskning44,45. Denne procedure giver mulighed for indtrængen af antistoffer i væv for at maksimere erhvervelse af billeder i hele afsnittet 50 µm, som er nødvendige for at erhverve konfokalmikroskopi billeder og 3D analyse. En anden kritisk trin er parametrene billede erhvervelse, der er afbalanceret mellem fanger nok nerver pr billede samtidig opretholde opløsning til måling af mitokondrier. Afsnittene væv i dette og standard hud biopsi protokoller er omkring 3 mm lang45,46,47,48. Erhvervelse parametre er beskrevet i denne protokol fange nok af epidermis med et gennemsnit på 4-6 nerve fibre pr. billede. Prøvetagning på højere opløsning ville reducere antallet af nerver i hvert billede, især på Nyquist prøveudtagning. Et tredje vigtigt skridt er at bruge deconvolution algoritmer til at forbedre opløsning og kontrast af signalerne, især for mitokondrierne. Deconvolution af billederne bidraget til at kompensere for ikke prøvetagning ved højere opløsning. Den sidste afgørende skridt er at bruge billede analyse software til at isolere nerve-specifikke mitokondrier fra mitokondrierne forbundet med celler i overhuden. Dette opnås ved hjælp af nerve overfladen som en maskering værktøj til at beskære mitokondrie signal, at lokalisere i nerve.

Der er nogle potentielle ændringer af denne teknik til at overveje. En mulig ændring ville være at forkorte varigheden af fluorescens Immunhistokemi. De overnattende inkubationer i primær og sekundær antistof løsninger ved 4 ° C kan forkortes til 3-4 timer ved stuetemperatur. Men kortere inkubationer ved stuetemperatur ofte øge baggrunden fluorescens, så forsigtighed bør træffes for at undgå dårlig signal til støj. En anden mulig ændring ville være at justere parametrene billede erhvervelse. Som nævnt ovenfor, image erhvervelse beskrevet her var forudindtaget mod fanger et rimeligt antal nerver pr billede over høj billedopløsning. Det er muligt at bruge en højere forstørrelse mål, såsom en 63 x oliebestandighedsobjektet med en 1.3 numerisk blænde. Hvis alle parametrene forblev den samme, og en 63 X mål blev brugt feltet XY billede ville blive reduceret til 112 µm x 112 µm og derfor reducere det gennemsnitlige antal nerver pr. billede. Det vigtigste punkt er at bruge konsekvent parametre i hele erhvervelse og efterfølgende analyse.

Den største begrænsning af denne teknik er, at det er tidskrævende. Immunhistokemi tager 3 dage til at behandle væv, image erhvervelse tager omkring 30-50 min. per billede, afhængigt af hvor mange optisk z-skridt er taget, og billedanalyse behandling tager ca 20 min. Dette er en stor gang engagement men udbytter vigtigt morfometrisk målinger i sidste ende. En anden begrænsning af denne teknik er området begrænset af epidermis stikprøven pr billede. Dog, dette vil utvivlsomt forbedre som fremskridt er lavet billede erhvervelse satser med forbedret opløsning kombineret med hurtigere computer-processorer og analyse software.

Betydningen af denne protokol over andre metoder er i kraft af kombinerer fluorescens Immunhistokemi konfokalmikroskopi og 3D billedanalyse. Traditionelt, er intraepidermal nerve fiber analyse udført med kromogen baseret Immunhistokemi og -lysfelt mikroskopi, især for en klinisk diagnose af neuropati45,47,49. Brugen af fluorescens Immunhistokemi gør det muligt at pletten og analysere flere signaler i hver prøve, at give en mere alsidig metodologi for udforskende forskning44,45. Denne teknik giver en strategi for at isolere et bestemt signal om interesse, i dette tilfælde nerve-specifikke mitokondrier, fra en kompleks signal, mitokondrier tilknyttet epidermale celler.

Kraften i denne teknik er sin nytte i fremtidige anvendelser. Evnen til at isolere og måle nerve-specifikke mitokondrier gør det muligt at evaluere sygdom-induceret ændring i størrelse og fordeling af mitokondrier. Flere neurologiske komplikationer har impliceret mitokondriel dysfunktion som en potentiel mekanisme af sygdommen. Især er en modificeret version af denne teknik blevet brugt til at vise, at patienter med diabetes og diabetisk perifer neuropati har målbare ændringer i størrelse og fordeling af nerve-specifikke mitokondrier i forhold til alder-matchede styrer50. Denne teknik ville være nyttige til at vurdere effektiviteten af behandlinger til formål at forbedre eller helbrede sensoriske neuropatier. Endelig, alsidigheden af teknik gør det gælder for en lang række analyser, som bruger en fluorescerende signal til at isolere et undersæt af data fra andre fluorescerende signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed tilskud K08 NS061039-01A2, The Program for neurologi forskning & opdagelse, og den A. Alfred Taubman Medical Research Institute på University of Michigan. Dette arbejde anvendte morfologi og billede analyse kernen i Michigan Diabetes Research Center, finansieret af National Institutes af sundhed Grant 5P 90 DK-20572 fra National Institute for Diabetes og Digestive og nyresygdomme. Forfatterne vil gerne takke J. Robinson Singleton og A. Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donation af menneskelige hud prøver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Tags

Neurobiologi sag 127 mitokondrier intraepidermal nervefibre menneskelige hudbiopsi tredimensional billeddannelse og analyse lille fiber neuropati
Tre-dimensionelle billedbehandling og analyse af mitochondrier i menneskelige Intraepidermal nervefibre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, … More

Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter