Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/53369
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

Summary

Dit protocol maakt gebruik van driedimensionale (3D) beeldvorming en analyse technieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. De technieken zijn van toepassing op andere situaties waar een fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van een subset van gegevens uit een ander fluorescent signaal.

Abstract

Het doel van dit protocol is het bestuderen van de mitochondriën binnen intraepidermal zenuwvezels. Daarom, 3D imaging en analyse technieken werden ontwikkeld om isoleren van zenuw-specifieke mitochondriën en evalueren van ziekte-geïnduceerde veranderingen van de mitochondriën in de distale uiteinde van sensorische zenuwen. Het protocol combineert fluorescentie immunohistochemistry, confocal microscopie en 3D beeld analysetechnieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. Gedetailleerde parameters worden gedefinieerd in de procedures om een concreet voorbeeld van het gebruik van deze technieken te isoleren van de zenuw-specifieke mitochondriën. Antilichamen werden gebruikt voor het label van de zenuw en mitochondriale signalen binnen weefselsecties van huid punch biopsieën, die werd gevolgd door indirecte immunofluorescentietest te visualiseren zenuwen- en mitochondriën met een groene en rode fluorescerende signaal respectievelijk. Z-serie beelden werden verkregen met confocale microscopie en 3D analysesoftware werd gebruikt voor het verwerken en analyseren van de signalen. Het is niet nodig om te volgen de exacte parameters beschreven binnen, maar het is belangrijk overeenstemming te zijn met degene die zijn gekozen door de kleuring, acquisitie en analyse stappen. De sterkte van dit protocol is dat is van toepassing op een breed scala aan omstandigheden waar één fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van andere signalen dat anders onmogelijk zijn zou om alleen te bestuderen.

Introduction

Mitochondriën dienen vitale cellulaire functies waarin het produceren van energie van de cel, calcium, en de regulering van necrotisch en de apoptotic cel dood1,2,3te bufferen. Het zenuwstelsel heeft een hoge stofwisseling ten opzichte van het lichaam4 suggereren dat neuronen een hoge mate van cellulaire energie in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP genereren) door middel van mitochondriale ademhaling. Een heleboel documenten van bewijs dat neuronale functies zijn afhankelijk van ATP5, met name op de synapsen6. Daarom is de verdeling van de mitochondriën binnen neuronen is belangrijk.

In de afgelopen 10 jaar die een heleboel informatie is gebleken dat de drugshandel en het couperen van neuronale mitochondriën is sterk gereguleerd. Motor eiwitten zijn betrokken bij de verdeling van de mitochondriën naar specifieke cellulaire compartimenten gedurende het neuron. Handel in mitochondriën is vooral belangrijk omdat de neuronen project axonen en dendrites ver weg van het soma. Kinesin motor eiwitten directe voornamelijk anterograde (weg van het soma) handel in mitochondriën langs microtubuli terwijl dynein motor eiwitten directe retrograde (richting het soma) beweeglijkheid7,8,9 , 10. er zijn cellulaire signalen zo'n Mitochondriale membraanpotentiaal en geleiding van de impuls die invloed hebben op de aanwezigheid en de richting van mitochondriale mensenhandel11,12,13.

Naast het vervoer van mitochondriën, zijn er gespecialiseerde eiwitten te lokaliseren mitochondriën naar specifieke cellulaire compartimenten die hoge energie-eisen, zoals de knopen van Ranvier en synapsen8,14, hebben 17. In feite de meeste mitochondria binnen axonen zijn niet-sporenvormende9,13,18. Gespecialiseerde eiwitten zoals syntaphilin anker mitochondriën tot microtubuli langs axonen terwijl andere eiwitten anker mitochondriën tot aan de actine cytoskelet19--21. Groeifactoren en ionen zoals calcium zijn ter ondersteuning van de stopzetting van de mitochondriën verkeer te lokaliseren hen aan regio's waar ze de benodigde21,22,23zijn gemeld.

Samen genomen, zijn de mensenhandel en docking van mitochondriën van vitaal belang voor de werking van neuronen. Ter ondersteuning van dit, verstoring van de mitochondriale mensenhandel is in verband gebracht met verschillende neurologische aandoeningen waaronder de ziekte van Alzheimer, Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth, ziekte van Huntington, erfelijke spastische paraparese en optische atrofie15,24,25,26,27. Recente studies hebben gericht op de mitochondriale dysfunctie en pathologie als een potentiële mechanisme voor diabetische neuropathie, de zintuiglijke verlies geassocieerd met diabetes28,29,30,31 3332, ,. De hypothese is dat diabetes de verdeling van de mitochondriën in de sensorische prognoses van cutane zenuw eindigt wijzigt. Daarom werd een techniek ontwikkeld om te visualiseren en te kwantificeren van mitochondria binnen de intraepidermal zenuwvezels (IENFs), de distale uiteinden van de achterwortelganglia ganglion sensorische afferents. De techniek combineert fluorescentie immunohistochemistry van specifieke mitochondriale en zenuw fiber etiketten met confocale microscopie z-serie overname van signalen met de software van de analyse van de krachtige 3D-beeld voor het meten van de verdeling van de zenuw-specifieke mitochondriën van menselijke cutane punch biopsieën om dit doel te bereiken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

huid punch biopten werden verkregen uit de onderwerpen die werden gerekruteerd uit een grote gemeenschap gebaseerde eerstelijnszorg netwerk op de Universiteit van Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Deze studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Michigan institutionele Review Board en naleving van de beginselen van de verklaring van Helsinki. Schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen van elk onderwerp voorafgaand aan testen.

1. fluorescentie Immunohistochemistry

  1. voorbereiden punch biopsieën voor intraepidermal zenuw fiber immunohistochemistry:
    1. uitvoeren 3 mm huid biopsieën door medisch personeel en plaats de hele biopsie in 1.5 mL Zamboni ' s kleefpoeders oplossing (2% paraformaldehyde, 0.3% verzadigd pikrinezuur in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4) bij 4 ° C's nachts.
    2. Spoel van monsters met een oplossing van 30% sucrose in PBS bij 4 ° C gedurende 16-24 uur of totdat het monster zinkt.
    3. Embed monsters in optimale scherpe temperatuur compound (OCT) met behulp van een cryomold. Schakel de hele 3 mm biopsie met de opperhuid naar beneden in de mal en vul de mal met ongeveer 2 mL OCT. Freeze de schimmel op gemalen droog ijs. Winkel bij-80 ° C tot gebruiksklare.
    4. Knippen 50 µm dik secties met behulp van een cryostaat Kruis en op te slaan in afzonderlijke wells van een 96-wells-plaat met behulp van 180 µL antivries opslagoplossing per putje (30% ethyleenglycol, 30% glycerol in PBS). De volgende aanwijzingen zijn voor 8 wells van een 96 goed plaat. Vlekken van secties vanuit elke biopsie-site die 200-300 µm afstand van elkaar.

dag 1:

  1. Quench aspecifieke labeling van het stratum corneum:
    1. Label 96-wells-plaat zoals afgebeeld in Figuur 1.
    2. Pipetteer 150 µL van voorraad signaal versterker oplossing om niet-specifieke binding van secundaire antilichamen 34 , 35 in elk putje. Pipetteer secties in signaal versterker oplossing met behulp van een lus inoculating.
      Opmerking: verzorgen terwijl u werkt met het weefsel te beschadigen of scheuren van de weefselsecties vermijden. Houden in signaal versterker oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een vlakke rocker.
    3. Voorbereiden spoelen wells in rijen 2 en 3 van de 96-wells-plaat door 150 µL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen in elk putje.
    4. Zorgvuldig breng secties in rij 2 en spoel in 1 x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Rinse een tweede keer in 1 x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (rij 3).
  2. 5% bovien serumalbumine (BSA) zijn blokkeren oplossing bereiden:
    1. bereiden 5% oplossing die 5% BSA bevat blokkeren en 0,3% Triton X 100 (TX-100) in 0,1 M PBS (Zie tabel 1) terwijl secties aan het broeden zijn signaal versterker oplossing. BSA gaat niet gemakkelijk in oplossing. Vortex oplossing tot BSA volledig oplost.
    2. Bereiden blokkerende putten in rij 4 van de 96-wells-plaat door toevoeging van 150 µL van 5% BSA blokkeren oplossing in elk putje.
    3. Breng secties in individuele putjes van 5% BSA blokkeren oplossing en incubeer secties in 5% BSA blokkeren oplossing voor 1-2 h bij kamertemperatuur op een vlakke rocker.
  3. Bereiden 1% BSA spoelen oplossing en verdunning van de primaire antilichamen:
    1. voorbereiden 1% spoeldouche-oplossing met 1% BSA en 0,3% TX-100 in 0,1 M PBS (Zie tabel 2) terwijl de afdelingen zijn broeden in 5% BSA blokkerende oplossing. BSA gaat niet gemakkelijk in oplossing. Vortex oplossing tot BSA volledig oplost.
    2. Verdund primaire antilichamen in 1% BSA spoeldouche oplossing terwijl secties aan het broeden zijn in 5% BSA blokkerende oplossing.
      1. 1500 µL van primair antilichaam oplossing maken en toevoegen aan elk goed in rij 5.
      2. Verdun de primaire antilichamen: gebruik van de zenuw-specifieke etiket, konijn polyklonale anti-eiwit gene product 9.5 (PGP9.5) op 1:1, 000. De mitochondriën-specifieke label gebruiken, muis monoklonaal anti-pyruvaat dehydrogenase E2/E3bp antilichaam (PDH) op 1:100 in 1% BSA oplossing spoelen.
  4. Primair antilichaam voorbereiden:
    1. Pipetteer 150 µL van primair antilichaam in elk goed in rij 5 van de 96-wells-plaat.
    2. Secties van de blokkerende oplossing (rij 4) met het gereedschap lus overboeken naar de rij 5 met het primaire antilichaam.
    3. Wrap de plaat strak met parafilm te houden tegen het uitdrogen.
    4. Leg monsters op vlakke rocker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, en dan na een nacht bebroeden monsters bij 4 ° c op een vlakke rocker.

dag 2:

  1. spoel monsters:
    1. voorbereiden spoelen putten in rijen 6, 7 en 8 van de 96-wells-plaat door toevoeging van 150 µL van 1% BSA spoelen oplossing in elk putje.
    2. Breng secties in eerste 1% BSA spoeldouche-oplossing (rij 6) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Herhaal gespoeld tweemaal meer door secties in 1% BSA oplossing spoelen in rijen 7 en 8 voor elk 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  2. Secundaire antilichamen in 1% BSA spoelen oplossing verdund:
    1. maken 1.500 µL van secundair antilichaam oplossing terwijl secties aan het broeden zijn in de laatste spoeling van 1% BSA oplossing (rij 8) spoelen.
    2. Secundaire antilichamen verdund: voor PGP9.5 (groen-fluorescerende geconjugeerd geit anti-konijn antilichaam, 1:1000), voor PDH (rood-fluorescerende geconjugeerd geit anti-muis, 1:1, 000) in 1% BSA oplossing spoelen.
  3. Voorbereiden secundair antilichaam:
    1. Pipetteer 150 µL van secundair antilichaam in rij 9 van de 96-wells-plaat.
    2. Voorzichtig het overbrengen van de secties van 1% BSA oplossing (rij 8) spoelen in secundair antilichaam wells (rij 9).
    3. Using parafilm, wikkel de plaat strak te houden tegen het uitdrogen. Dek af met aluminiumfolie. Leg monsters op vlakke rocker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, en dan na een nacht bebroeden monsters op 4 ˚C op een vlakke rocker.

dag 3:

  1. voorbereiden schoon 1 x PBS door te filteren door een 0,22 µm filter:
    1. Pipetteer 150 µL van gefilterd 1 x PBS in rij 10, 11 en 12.
    2. Overdracht van monsters naar rij 10 en spoel in 1 x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Dekking van de 96-wells-plaat met aluminiumfolie en leg op een vlakke rocker tijdens spoelen. Herhaal 1 x PBS spoelen twee gefilterd vaker voor 1 uur bij kamertemperatuur in rijen 11 en 12.
  2. Microscoop dia's voorbereiden voor de montage van weefselsecties:
    1. plaats 50 µL van gefilterd 1 x PBS op een dia.
    2. Sectie van de overdracht van 1 x PBS (rij 12) in de 50 µL drop. Plaats het gedeelte in de daling van PBS door het weefsel te ontvouwen en afvlakking het zachtjes op het glasplaatje. Verwijder overtollige PBS met een glazen pipet Voorkom verdunning van het montage-reagens. Raak niet secties met het lampglas.
    3. Pipetteer 1 - 2 druppels reagens van de montage DAPI direct boven aan het gedeelte over het gebruik van de Microscoop dia met zorg naar de richting van de sectie niet te storen. Een dekglaasje aan glas van de 50 mm x 24 mm #1.5-Microscoop zachtjes op de sectie plaatst.
    4. Schakelt alle luchtbellen die gevormd terwijl de plaatsing van het dekglaasje aan en veeg overtollige vocht uit de randen van het dekglaasje aan. Voorbereiden van een nieuwe dia en herhaal de montage-process voor elke sectie.
    5. Behandeling/droge montage media door het plaatsen van de dia's in de donkere overnachting bij kamertemperatuur. De dia's overbrengen in 4 ° C voor korte termijn (1-2 weken) of -20 ° C voor langdurige opslag (groter dan 2 weken).
      Opmerking: Negatieve controles weggelaten primaire antilichamen voor PGP9.5 of PDH in stap 1.4.2.2 en weergegeven geen te onderscheiden labeling van zenuwen of mitochondriën in de epidermis. Positieve controles werden uitgevoerd voor de PDH antilichaam om het te bewijzen etiketten alle mitochondriën (gegevens niet worden weergegeven). Positieve controles werden uitgevoerd op gekweekte primaire muisknop achterwortelganglia ganglion neuronen die zijn getransduceerde met een baculovirus aan label mitochondriën met een groen fluorescente proteïne (GFP) signaal en vervolgens vast en gekleurd met de PDH antilichaam en rode fluorescerende secundair antilichaam. Alle mitochondriën die GFP uiten waren werden samen met een label met de rode label voor PDH immunohistochemistry (gegevens niet worden weergegeven).

2. Confocale Imaging

  1. uitvoeren confocal beeldvorming:
    1. Collect beelden met behulp van een laser confocal microscoop met een 40 X olie-immersie (1,25 numerieke diafragma (N.A.)) doelstelling op een omgekeerde Microscoop scannen.
      1. Op elke brandvlak sequentieel verwerven fluorescerende signalen:
        kernen: excitatie λ = 405 nm, emissie spectrale filter λ = 420-480 nm
        zenuwvezels: excitatie λ = 488 nm, emissie spectrale filter λ = 505-560 nm
        Mitoch ondria: excitatie λ = 543 nm, emissie spectrale filter λ = 606-670 nm
    2. de volgende parameters van de scan aangaan met de Microscoop software: scanfrequentie van 600 Hz met 2 frame gemiddeld en zoom voor 2.2; 12-bits intensiteit resolutie (4096 grijs niveaus).
      1. De Microscoop software voor optimale zijdelingse resolutie ingesteld (scanresolutie = 1024 x 1024) en axiale resolutie/optische segmenteren (confocal diafragma = 1 luchtige eenheid (AU) met z-stap-grootte van 210 nm).
        Opmerking: De resulterende XYZ-resolutie is 172,2 nm x 172.2 nm x 210 nm met een afbeelding van 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.
    3. Activeren een levende scan voor het signaal van de zenuw (groen-fluorescentie) en past u de regelaar van de z-focus om te zoeken en instellen van de bovenste en lagere focal vliegtuigen in de Microscoop software die het signaal van de zenuw binnen de weefselsectie omvatten. Het totale z-bereik is doorgaans 30-50 µm voor een weefselsectie 50 µm.
    4. Het veld van de scan met de Microscoop software draaien tijdens een live scan zodat de epidermis horizontaal of verticaal in de afbeelding geplaatst is.
    5. Elk signaal afzonderlijk scannen en aanpassen van de detector (fotomultiplicator, bet) spanning en offset te minimaliseren/verwijderen een over en onder de verzadigde pixels.
      Opmerking: Scan keer met bovenstaande parameters duren ongeveer 20-40 min afhankelijk van het aantal z segmenten.

3. 3D visualisatie en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

  1. isoleren van de 3D epidermis:
    1. dupliceren de originele afbeelding en gebruik de maximale intensiteit projectie (extended focus weergave) van de afbeelding te identificeren en te isoleren van de epidermis.
    2. Gebruiken een regio van belang hulpprogramma trace langs de bovenste en onderste randen van de epidermis om te verwijderen van ongewenste gebieden zoals het stratum corneum en dermis die afwezig zijn van intraepidermal zenuwvezels. Uitsnijden naar deze selectie.
  2. Gebruik deconvolutie op de zenuw en de mitochondriale fluorescerende signalen:
    Opmerking: deconvolutie helpt om te herstellen van de integriteit van de fluorescerende signalen. Het herstel gebruikt in dit protocol wordt blind deconvolutie genoemd omdat het gebruik maakt van de fluorescerende signalen in de beelden om te bepalen hoeveel verspreid de signalen van hun oorspronkelijke bron (punt spread functie). Het proces verbetert de resolutie van het signaal door het opnieuw toewijzen van het signaal terug naar haar oorsprong locatie verspreid.
    1. Berekenen een punt verspreiden functie (PSF) voor de groen fluorescente zenuw signaal (groen-fluorescentie) met de volgende parameters:
      1. instelt berekende PSF confocal. Middellange refractive index ingesteld op 1.515 en numerieke diafragma te 1,25. Detector pinhole ingesteld op 1 luchtige eenheid (A.U.). Set laser excitatie golflengte op 488 nm en emissie golflengte te 515 nm.
    2. Een PSF voor het rood fluorescerende mitochondriale signaal (rood-fluorescentie) berekenen met de volgende parameters:
      1. Set berekend PSF confocal. Middellange refractive index ingesteld op 1.515 en numerieke diafragma te 1,25. Detector pinhole ingesteld op 1 AU. Set laser excitatie golflengte op 543 nm en emissie golflengte te 617 nm.
    3. Optimaliseren de zenuw- en mitochondriën fluorescerende signalen door deconvolutie met behulp van de bijbehorende spinnen bestemde hierboven vermelde en iteratieve herstel functie instellen op 100% vertrouwen en een iteratie limiet van 10 cycli.
  3. Zenuw-specifieke oppervlakken maken:
    1. gebruik het " oppervlak " tool voor het maken van een harde ondergrond van de zenuwen van de deconvolved groen-fluorescerende secundaire etikettering van de PGP9.5 geïdentificeerd zenuwen.
    2. Uncheck de " gladde " functie en de absolute intensiteit-functie gebruiken om in te stellen van de drempel voor het signaal van de zenuw, aangezien het is aanzienlijk lichter dan achtergrond fluorescentie.
      3. De absolute intensiteit functie
    3. gebruiken om in te stellen van de drempel voor het signaal van de zenuw, aangezien het is aanzienlijk lichter dan achtergrond fluorescentie. Drempel waarde laag genoeg zijn om nauwkeurig de zenuwen.
    4. Filter uit kleine, niet-zenuw oppervlakken op basis van grootte.
      Opmerking: Indien nodig, handmatig bewerken uit extra niet-zenuw oppervlakken binnen de " bewerken " tabblad door de controltoets om meerdere objecten en hen vervolgens te verwijderen met de Delete-toets.
  4. Isoleren zenuw-specifieke fluorescerende mitochondriale signaal:
    1. Klik op het tabblad bewerken van het oppervlak van de zenuw te bekijken het " masker eigenschappen " functie. Het oppervlak van de zenuw gemaakt in stap 3.3 wordt gebruikt voor het isoleren van mitochondria binnen deze zenuwen uit de buurt van mitochondriale signalen die is gekoppeld aan de keratinocyten.
    2. Als de " alle masker ' knop opent een " masker kanaal " venster, kies het deconvolved rood-fluorescerende-signaal van de trekkracht onderaan menu onder " kanaalselectie " voor de mitochondriale signaal.
    3. Klik in het vak te zetten een vinkje het " gedupliceerde kanaal alvorens masker " optie.
    4. Klik op de radio knop voor de " constante binnen/buiten " optie masker-instellingen en klik in het vak om een vinkje het " instellen voxel buitenoppervlak te " optie en typ in voor de waarde 0,00. Klik o.k. knoop om te maken van het nieuwe kanaal waarmee mitochondriale signalen binnen de oppervlakte van de zenuw.
  5. Maken mitochondriën-specifieke oppervlakken:
    1. gebruik het " oppervlak " tool voor het maken van een harde ondergrond van de mitochondriën van de zojuist gemaakte fluorescerende kanaal van de zenuw-specifieke mitochondriale signalen van stap 3.4.
    2. Uncheck de " gladde " functie en selecteer de " achtergrond van aftrekken " functie om in te stellen voor de drempel. Deze functie gebruikt lokaal contrast rond de mitochondriale signaal om te identificeren van de mitochondriën van achtergrond.
    3. Set drempelwaarde laag genoeg om te nauwkeurig identificeren mitochondriën. In dit voorbeeld werd de lagere drempel vastgesteld op 2.000 voor een 16-bits (65.536) schaal.
    4. Filteren mitochondriale oppervlakken op basis van grootte. In dit voorbeeld die de voxel limiet is ingesteld op 1.0 voxels, wat is de laagste mogelijk te beperken. Indien nodig, handmatig bewerken uit niet-mitochondriën oppervlakken binnen de " bewerken " tabblad door de CONTROL-toets ingedrukt om meerdere objecten te selecteren en ze vervolgens te verwijderen met de Delete-toets.
      Opmerking: Soms, zal de software oppervlakken die niet gekoppeld aan een te onderscheiden fluorescerende mitochondriale signaal zijn maken. In deze gevallen is het mogelijk om hen met de " bewerken " tab.
  6. Exporteren en berekenen van de Morfometrische waarden voor analyse:
    1. exporteren van waarden voor de zenuw en mitochondriale oppervlakken van de " statistieken " tabblad voor verdere analyse met elektronische spreadsheetsoftware.
    2. De volume-waarden voor zowel de zenuw en de mitochondriale oppervlakken exporteren.
    3. Het aantal individuele zenuwvezels aanwezig in elke afbeelding tellen en de waarde opnemen in de elektronische spreadsheet.
    4. Voor elke afbeelding, het berekenen van de volgende mogelijke waarden voor analyse in het elektronische werkblad:
      1. som van de volumes voor alle oppervlakken van de zenuw.
      2. Filter uit zenuw-specifieke mitochondriale oppervlakken onder een volume van minder dan 0,02 µm 3 en bin de oppervlakken door grootte. Bijvoorbeeld het gebruik van opslaglocaties zoals 0.02 - 0,04 0,04 - 0,08, 0.08 - 0.16, 0.16 - 0.32, 0.32 - 0.64, 0.64 - 1,28, 1.28-2,56, groter dan 2.56 µm 3.
        Opmerking: De ondergrens van mitochondriale volume is ingesteld op 0,02 µm 3 op basis van eerder gepubliceerde hoeveelheid mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Tellen het aantal zenuw-specifieke mitochondriale oppervlakken binnen elke opslaglocatie en het totale aantal oppervlakken over de opslaglocaties (0.02 - groter dan 2.56 µm 3).
      4. Bereken het percentage van de zenuw-specifieke mitochondriale oppervlakken in elke opslaglocatie. Gebruik de telling per bin gedeeld door het totale aantal mitochondriën oppervlakken.
      5. Som van de volumes voor alle zenuw-specifieke mitochondriale oppervlakken.
      6. Berekenen van het aandeel van de zenuw met mitochondriale signaal door het verdelen van het totale zenuw oppervlakte volume door de som van alle mitochondriale oppervlakte volumes.
      7. Het aantal mitochondriën per zenuw volume berekenen door het verdelen van het totale zenuw oppervlakte volume door de graaf van alle mitochondriale oppervlakken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Visualisatie en kwantificering van mitochondriën in menselijke IENFs

Fluorescentie immunohistochemistry zorgt voor de gelijktijdige labeling van meerdere signalen binnen de menselijke huid biopsieën te visualiseren van zenuwen, mitochondriën en kernen. Een 96-wells-plaat is een handige manier om te organiseren van de stappen in de procedure immunohistochemistry. Figuur 1 laat zien dat de rekeningen van deze configuratie voor maximaal 8 secties worden verwerkt door de 12 stadia van oplossingen. De zwevende methode gecombineerd met zachte agitatie met een platte rocker zorgt ervoor dat de antilichamen voldoende toegang hebben tot het doordringen van de secties van beide kanten. Het protocol duurt 3 dagen te voltooien, dat is grotendeels te wijten aan nachtelijke incubations in primaire en secundaire antilichamen bij 4 ° C, die consequent zenuwen- en mitochondriën labelen.

De rest van de procedure neemt imaging, verwerking en analyse van de fluorescerende signalen. Confocale microscopie profiteert van de fluorescerende signalen naar optisch sectie discrete signalen uit het brandvlak door het elimineren van out-of-focus signalen. Verwerving van z-serie door de weefselsectie biedt een 3D-weergave van de fluorescerende signalen voor zenuwen, mitochondriën en kernen. De parameters zijn geoptimaliseerd om te Foto 172 µm langs de lengte van de epidermis die een gemiddelde van 5 zenuwen omvatten zou. Figuur 2 toont een typische 3D beeld van de drie TL signalen die worden bijeengezocht uit de opperhuid. De PGP9.5 kleuring (figuur 2B) biedt een rijke signaal van de epidermale en dermale zenuwen dat van een hogere intensiteit dan de achtergrond auto-fluorescentie van het weefsel. De nucleaire vlek (figuur 2C) helpt bij het identificeren van de grenzen van de epidermis waar de zenuwvezels intraepidermal innervate. Het is gebruikelijk dat de buitenste laag van de opperhuid te hebben een diffuse signaal dat kan te wijten zijn aan residuele DNA in de corneocytes die deel van het stratum corneum uitmaken. De mitochondriën zijn duidelijk gemarkeerd door de PDH kleuring (figuur 2D) waarvan de meerderheid van het signaal is gekoppeld aan de cellen in de epidermis, die voornamelijk keratinocyten.

De parameters van de acquisitie beschreven in dit protocol gebruiken een 40 X olie onderdompeling doelstelling met een 1,25 numerieke diafragma en een zoomfactor van 2.2. Dit resulteert in een beeldformaat van XYZ 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm. Deze instellingen vastleggen genoeg van de opperhuid te nemen van gemiddeld 4-6 zenuwvezels per beeld (figuur 3A). Bemonstering met een hogere resolutie zou het verminderen van het aantal zenuwen in elk beeld. Figuur 3B toont een zoomfactor van 3.3, waardoor de XY-oppervlakte te 114.8 µm x 114.8 µm, wat resulteert in minder zenuwen per beeld. De ideale bemonsteringsdensiteit zoals gedefinieerd door Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) voor een 40 x olie immersie objectief met een 1,25 numerieke diafragma suggereert een XYZ scanresolutie van 54 nm x 54 nm x 205 nm. Dit zou vereisen een zoomfactor van 6,6 Vouw bij 1024 x 1024-resolutie en de XY-weergave beperken tot 57,4 µm x 57,4 µm en alleen vangen een gemiddelde van 1-2 zenuw per beeld (afbeelding 3 c).

De volgende fase is het uitvoeren van de beeldverwerking, het verwijderen van ongewenste gebieden van de afbeelding en het vergroten van de signalen. In dit protocol worden de dermis en de hoornlaag verwijderd om te richten van de analyse op het gebied van de epidermis waar de IENFs innervate. Driedimensionale software maakt het mogelijk te isoleren, te verbeteren en te analyseren de fluorescerende signalen. Hulpmiddelen binnen de software nodig zijn om te isoleren van de epidermale zenuw- en mitochondriën door het bijsnijden van de regio's boven en onder de opperhuid (figuur 4A-C). Dit proces wordt vereenvoudigd door het instorten van de signalen in een uitgebreide weergave en vervolgens het traceren van een freehand regio rond de epidermis. De bijgesneden afbeelding wordt verder verwerkt door afbeelding restauratie algoritmen. Deconvolutie wordt gebruikt voor het optimaliseren van de resolutie van de zenuwen en de mitochondriale signalen (Figuur 4 d).

De laatste fase is te detecteren en extract van Morfometrische functies van de signalen. Een belangrijk aspect van dit protocol is te meten kenmerken van zenuw-specifieke mitochondriën. De software van de analyse van de afbeelding heeft functies die gebruikmaken van oppervlakken die zijn gemaakt voor één signaal (in dit geval het oppervlak van de zenuw) als een maskerend hulpmiddel om te isoleren van een ander fluorescent signaal (in dit geval mitochondriën) binnen dat oppervlak. De eerste stap in de analyse van zenuw-specifieke mitochondriën is maken 3D oppervlakken rond zenuwen (figuur 5A-B). De zenuw oppervlakken worden vervolgens gebruikt om te snijden de zenuw-specifieke fluorescerende mitochondriale signalen (figuur 5C, 5D, 5E, 5 G). Ten slotte, 3D oppervlakken worden gemaakt rond de zenuw-specifieke mitochondriale signalen voor volumetrische meting (figuur 5F, 5H). Tabel 3 toont de Morfometrische metingen die zijn geëxporteerd vanuit de software van de analyse van het beeld en de samenvattingsgegevens. De belangrijkste waarden exporteren zijn de volume-waarden voor de zenuw en zenuw-specifieke mitochondriale signalen. De gegevens van de hoeveelheden uit de mitochondriën zijn weggegooid voor het genereren van mitochondriën grootte frequentiegegevens, die vervolgens wordt gebruikt voor het maken van grootte frequentie histogrammen (Figuur 6). Het volumegegevens worden ook gebruikt om samenvatting maatregelen voor aantal mitochondriën per IENF volume en percentage van mitochondriale volume binnen IENF volumes.

De gegevens in tabel 3 en Figuur 6 laten zien dat deze techniek biedt een manier om te kwantificeren mitochondriën in menselijke IENFs van huid biopsieën. De zenuwen uit dit monster hebben mitochondriën verspreid over en de meerderheid van de mitochondriën zijn tussen 0.02 - 0.32 µm3. Deze maten zijn in een reeks normale mitochondriën36,37,38,39is gekoppeld. Kleinere mitochondriën hebben aangetoond dat meer motile dan grotere mitochondriën39 suggereren dat de mitochondriën in deze zenuwen meer motile wellicht worden. Inderdaad, hebben studies betrokken dat groter, gezwollen mitochondria niet evenals kleinere mitochondriën vervoeren en tot degeneratie van axonale39,40,41 leiden kunnen. Karakterisering van zenuw-specifieke mitochondrium is dus een waardevolle techniek die zou gelden voor onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten waar veranderingen in de mitochondriale morfologie en vervoer geassocieerd met axonale degeneratie zijn 15,25,26,27,42,43.

5% oplossing van het blokkeren van de BSA
Onderdelen van 5% BSA blokkeren oplossing Bedrag dat nodig is
Bovien serumalbumine (BSA) [eindconcentratie: 5%] 0.625 g
1,0% Triton X-100 (TX-100) [eindconcentratie: 0,3%]
3,75 mL 1 x PBS ~8.125 mL Totale (gebruik 1 X PBS toe zodat het totale volume tot 12,5 mL) 12,5 mL

Tabel 1: 5% BSA blokkeren oplossing. De 5% BSA blokkerende oplossing wordt gebruikt in de eerste stappen van het protocol van immunohistochemistry niet-specifieke binding van de antistoffen blokkeren.

1% BSA spoelen oplossing
Onderdelen van 1% BSA oplossing spoelen Bedrag dat nodig is
Bovien serumalbumine (BSA) [eindconcentratie: 1%] 0,125 g
1,0% TX-100 [eindconcentratie: 0,3%] 3,75 mL
1 x PBS ~8.125 mL
Totale (gebruik 1 X PBS toe zodat het totale volume tot 12,5 mL) 12,5 mL

Tabel 2: 1% BSA oplossing spoelen. De 1% BSA spoelen oplossing wordt gebruikt in het protocol van immunohistochemistry te blokkeren van niet-specifieke binding van de antilichamen en gebruikt voor het verdunnen van de primaire en secundaire antilichamen.

Morfometrische metingen voor IENFs- en mitochondriën zenuw-specifieke
Geëxporteerde en samenvattende gegevens van de Software van de analyse van de afbeelding
MT grootte frequentie opslaglocaties Aantal Mt in grootte frequentie Bin Percentage van Mt in Bin Totaal aantal Mt MT Volume (µm3) IENF Volume (µm3) Aantal Mt per IENF Volume (aantal/100 µm3) Percentage voor Mt Volume in IENF Volume Aantal IENFs
tussen
.02-.04 µm3		 20 24,4% 82 13.41 518.88 15.8 2,58% 4
tussen
.04-.08 µm3		 28 34,1%
tussen
.08-.16 µm3		 14 17,1%
tussen
.16-.32 µm3		 12 14,6%
tussen
.32-.64 µm3		 4 4,9%
tussen
.64-1,28 µm3		 3 3,7%
tussen
1.28-2,56 µm3		 1 1,2%
tussen
2,56 + µm3		 0 0,0%

Tabel 3: Morfometrische afmetingen voor IENFs en zenuw-specifieke Mitochondria. De tabel geeft Morfometrische-waarden die zijn gemeten en van de software van de analyse van de afbeelding en samengevatte gegevens geëxporteerd. Afkortingen: IENF, intraepidermal zenuwvezels; MT, mitochondriën.

Figure 1
Figuur 1 : Schematisch Diagram vertegenwoordigt de Setup voor een 96-wells-plaat voor huid biopsie Immunohistochemistry. De rijen in de plaat vertegenwoordigen stappen in het protocol voor blok, wassen en incubatie oplossingen en kolommen vertegenwoordigen afzonderlijke weefselsecties (van 1 tot 8 secties per plaat). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Vertegenwoordiger 3D confocale microscopie beeld van een weefselsectie van een menselijke epidermale biopsie verwerkt voor fluorescentie Immunohistochemistry. Onbewerkte 3D projectie afbeelding illustreert de fluorescerende signalen van (A) samengevoegd en individuele signalen voor (B) zenuwen (zenuw, groen), (C) kernen (NOC, blauw) en (D) mitochondria (Mt, rood) in de opperhuid en dermis. Nota het ontbreken van signalen in de laag van de hoornlaag van de opperhuid. Schaal bars = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Verbeterde resolutie beeldresultaten in minder zenuwen voor latere analyse. Alle beelden zijn gemaakt met een 40 X olie doelstelling met een 1,25 numerieke diafragma en de 3D projecties illustreren fluorescerende signalen voor zenuwen (groen), de mitochondriën (Mt, rood) en de kernen (NOC, blauw). Een foto genomen bij een zoomfactor van 2.2 (A) bevat verschillende zenuwen binnen de weergave. Verhoging van de zoomfactor aan 3.3 (B) of 6,6 (C), vermindert de ideale Nyquist bemonstering, het aantal zenuwen binnen elke afbeelding. Schaal bars = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Beeldbewerking. Vertegenwoordiger uitgebreid focus (maximale intensiteit projectie) weergave van een afbeelding van de confocal microscopie van een weefselsectie van een menselijke epidermale biopsie. Projectie van de onbewerkte afbeelding illustreert (A) de samengevoegde TL voor zenuwen (groen), kernen (NOC, blauw)- en mitochondriën (Mt, rood signalen). De dermis en het stratum corneum zijn (B) bijgesneden uit met een regio van interest (ROI) freehand selectiegereedschap (blauw gemarkeerde gebied, bijsnijden van ROI) isoleren alleen signalen in de epidermis. De epidermis (C) bijgesneden wordt vervolgens verwerkt voor (D) deconvolutie met berekende punt verspreiding functies ter verbetering van de resolutie van de zenuwen (groen) en mitochondriale (Mt, rode) signalen. Schaal bars = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Analyse van het beeld. Representatieve 3D confocale microscopie afbeelding illustreert (A) de zenuw-specifieke groen fluorescent signaal. (B) een 3D-oppervlak (cyaan) wordt gemaakt voor het signaal van de zenuw. De zenuw-specifieke mitochondriale signaal is geïsoleerd van de rest van de epidermale mitochondriale signalen (Mt, rood) (C) door (D) met behulp van het zenuw-oppervlak als een maskerend hulpmiddel. De resulterende (E, G) , zenuw-specifieke mitochondriale rood fluorescerende signaal wordt gebruikt om te maken (F, H) oppervlakken (Mt oppervlak, magenta) rond de mitochondriën in de zenuw oppervlak (cyaan). G en H zijn vergrote weergaven van de witte vakken in E en F. schaal bars = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : De grootte van de mitochondriale frequentie Histogram. Mitochondrialsurface gegevens worden gepresenteerd als een histogram frequentie grootte te visualiseren van het percentage van de mitochondriën die aanwezig in elk van de verschillende opslaglocaties volgens hun volume (µm3 zijn). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol is ontworpen om te isoleren, te kwantificeren en te analyseren, de grootte en de distributie van zenuw-specifieke mitochondria binnen IENFs in 3D van menselijke huid biopsieën. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. De zwevende fluorescentie immunohistochemistry is ontworpen om vlekken en analyseren van meerdere signalen in elk monster, een meer veelzijdige methodologie voorziet exploratief onderzoek44,45. Deze procedure zorgt voor de penetratie van de antilichamen in het weefsel te maximaliseren van de verwerving van beelden via de 50 µm-sectie, die nodig is voor het verwerven van de confocal microscopie beelden en 3D analyse. Een andere belangrijke stap is de afbeelding overname parameters die zijn evenwicht tussen genoeg zenuwen per beeld vastleggen terwijl het handhaven van resolutie voor het meten van de mitochondriën. De weefselsecties gebruikt in dit en standaard huid biopsie protocollen zijn ongeveer 3 mm lang45,46,47,48. De acquisitie beschreven parameters in dit protocol opname genoeg van de opperhuid te nemen van gemiddeld 4-6 zenuwvezels per beeld. Bemonstering met een hogere resolutie zou aanzienlijk beperken van het aantal zenuwen in elk beeld, met name bij Nyquist bemonstering. Een derde belangrijke stap is het gebruik van deconvolutie algoritmen om de resolutie en het contrast van de signalen, met name voor de mitochondria. Deconvolutie van de beelden heeft bijgedragen tot compenseren niet bemonstering met een hogere resolutie. De laatste kritieke stap is het gebruik van software van de analyse van de afbeelding te isoleren van de zenuw-specifieke mitochondriën uit de mitochondriën gekoppeld aan cellen in de epidermis. Dit wordt bereikt door het gebruik van de zenuw oppervlak als een maskerend hulpmiddel Bijsnijden signaal mitochondriale die lokaliseren binnen de zenuw.

Er zijn een aantal mogelijke wijzigingen van deze techniek te overwegen. Een eventuele wijziging zou zijn om de duur van de fluorescentie immunohistochemistry te verkorten. De nachtelijke incubations in de primaire en secundaire antilichaam oplossingen bij 4 ° C kunnen worden verkort tot 3-4 uur bij kamertemperatuur. Echter, kortere incubations bij kamertemperatuur vaak verhogen achtergrond fluorescentie, zodat voorzichtigheid moet worden genomen om te voorkomen dat slecht signaal aan lawaai. Een andere mogelijke wijziging zou moeten aanpassen van de parameters van de overname afbeelding. Zoals hierboven vermeld, waren de hier beschreven Beeldacquisitie bevooroordeeld richting het vastleggen van een redelijk aantal zenuwen per beeld over hoge beeldresolutie. Het is mogelijk om een hogere doelstelling van vergroting, zoals een 63 x olie immersie objectief met een 1.3 numerieke lensopening gebruiken. Als alle parameters gelijk gebleven en een 63 X doelstelling werd gebruikt, wordt het afbeeldingsveld XY zou worden teruggebracht tot 112 µm x 112 µm en daarom het gemiddelde aantal zenuwen per beeld te verminderen. Het belangrijkste punt is het gebruik van consistente parameters tijdens de overname en latere analyse.

De belangrijkste beperking van deze techniek is dat het is tijdrovend. De immunohistochemistry duurt 3 dagen voor het verwerken van weefsel, Beeldacquisitie duurt ongeveer 30-50 min per beeld afhankelijk van hoeveel optische z-maatregelen worden genomen en verwerking/beeldanalyse duurt ongeveer 20 min. Dit is een significante tijdverplichting maar levert belangrijke Morfometrische metingen in het einde. Een andere beperking van deze techniek is de beperkte oppervlakte van epidermis bemonsterd per beeld. Dit zal echter ongetwijfeld verbeteren als vorderingen zijn gemaakt in beeld overname tarieven met verbeterde resolutie gecombineerd met een snellere computerprocessoren en analysesoftware.

De betekenis van dit protocol boven andere methoden is in de kracht van het combineren van fluorescentie immunohistochemistry met confocale microscopie en 3D beeldanalyse. Traditioneel wordt intraepidermal zenuw Vezelanalyse gedaan met chromogeen gebaseerd immunohistochemistry en helder-veld microscopie, vooral voor de klinische diagnose van neuropathie45,47,49. Het gebruik van fluorescentie immunohistochemistry maakt het mogelijk om vlekken en analyseren van meerdere signalen in elk monster, een meer veelzijdige methodologie voorziet exploratief onderzoek44,45. Deze techniek biedt een strategie voor het isoleren van een bepaalde signaal van belang, in dit geval zenuw-specifieke mitochondriën, van een complex signaal, mitochondriën epidermale cellen zijn gekoppeld.

De kracht van deze techniek is het nut ervan in toekomstige toepassingen. De mogelijkheid om te isoleren en meten van zenuw-specifieke mitochondriën maakt het mogelijk om te evalueren van ziekte-geïnduceerde wijziging in de omvang en de verdeling van de mitochondriën. Meerdere neurologische complicaties hebben betrokken mitochondriale dysfunctie als potentiële mechanisme van de ziekte. In het bijzonder is een gewijzigde versie van deze techniek gebruikt om aan te tonen dat patiënten met diabetes en diabetische perifere neuropathie measureable veranderingen in de omvang en de verdeling van de zenuw-specifieke mitochondriën in vergelijking met leeftijd-matched hebben Hiermee bepaalt u50. Deze techniek zou nuttig zijn voor de evaluatie van de doeltreffendheid van de therapieën die zijn ontworpen om te verbeteren of genezen van sensorische neuropathieën. Tot slot, de veelzijdigheid van de techniek maakt het voor een breed scala aan analyses die één fluorescent signaal te isoleren van een subset van gegevens uit andere tl signalen gebruiken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten te verklaren.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid subsidies K08 NS061039-01A2, het programma voor onderzoek van de neurologie & ontdekking, en het A. Alfred Taubman Medical Research Institute aan de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikt de morfologie en de afbeelding kern van de analyse van de Michigan Diabetes Research Center, gefinancierd door nationale instituten van gezondheid Grant 5P-90 DK-20572 van het nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en nierziekten. De auteurs bedank J. Robinson Singleton en A. Gordon Smith (Universiteit van Utah) voor hun gulle donatie van menselijke huid monsters.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Tags

Neurobiologie kwestie 127 mitochondriën intraepidermal zenuwvezels menselijke huid biopsie driedimensionale beeldvorming en analyse kleine vezel neuropathie
Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, … More

Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter