Summary
Ce protocole utilise des techniques d’imagerie et d’analyse en trois dimensions (3D) de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Les techniques sont applicables à d’autres situations où un signal fluorescent est utilisé pour isoler un sous-ensemble des données d’un autre signal fluorescent.
Abstract
Le but du présent protocole est d’étudier les mitochondries dans les fibres nerveuses intra-épidermiques. Par conséquent, des techniques d’imagerie et d’analyse 3D ont été développés pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques et évaluer les altérations induites par la maladie des mitochondries dans l’extrémité distale des nerfs sensitifs. Le protocole associe immunohistochimie de fluorescence, microscopie confocale et techniques d’analyse des images 3D de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Paramètres détaillés sont définies dans les procédures afin de fournir un exemple concret d’utilisation de ces techniques pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques. Anticorps ont été utilisés pour étiqueter le nerf et signaux mitochondriales dans des sections de tissu de peau punch biopsies, qui a été suivie par immunofluorescence indirecte pour visualiser les nerfs et les mitochondries avec un signal fluorescent vert et rouge respectivement. Z-série images ont été acquises avec la microscopie confocale et logiciel d’analyse 3D a été utilisé pour traiter et analyser les signaux. Il n’est pas nécessaire de suivre les paramètres décrits dans, mais il est important d’être cohérent avec ceux choisis tout au long de la coloration, les étapes d’acquisition et d’analyse. La force de ce protocole est qu’il est applicable à une grande variété de circonstances où un signal fluorescent est utilisé pour isoler les autres signaux qui serait autrement impossibles à étudier seul.
Introduction
Mitochondries remplissent des fonctions cellulaires vitales qui comprennent la production d’énergie cellulaire, mise en mémoire tampon de calcium et réglementer nécrotiques et apoptose cellulaire mort1,2,3. Le système nerveux a un métabolisme élevé par rapport au corps4 suggérant que les neurones génèrent un degré élevé d’énergie cellulaire sous la forme d’adénosine triphosphate (ATP) par le biais de la respiration mitochondriale. Un grand nombre de documents de preuve que les fonctions neuronales dépendent de l’ATP5, surtout dans les synapses6. Par conséquent, la répartition des mitochondries dans les neurones est importante.
Au cours des 10 dernières années, que beaucoup d’information a montré que le trafic et l’accostage des mitochondries neuronales est très réglementées. Protéines motrices sont impliqués dans la distribution des mitochondries à compartiments cellulaires spécifiques tout au long du neurone. Traite des mitochondries est particulièrement importante parce que les neurones du projet les axones et les dendrites loin de soma. Les protéines motrices kinésine directement essentiellement antérograde (à l’opposé le soma) traite des mitochondries le long des microtubules pendant la dynéine protéines motrices direct motilité rétrograde (vers le soma)7,8,9 , 10. il sont a des signaux cellulaires un tel potentiel de membrane mitochondrial et la conduction d’impulsion qui influent sur la présence et la direction de mitochondrial trafic11,12,13.
En plus de transporter les mitochondries, il y a des protéines spécialisées à localiser les mitochondries pour les compartiments cellulaires spécifiques qui ont des exigences de haute énergie, tels que les nœuds de Ranvier et synapses8,14, 17. en effet, la majorité des mitochondries dans les axones sont non motiles9,13,18. Les protéines spécialisées comme mitochondries ancre syntaphilin aux microtubules le long des axones tandis que les autres protéines d’ancrage mitochondries à l’actine cytosquelette19–21. Facteurs de croissance et d’ions tels que le calcium ont été signalées à l’appui de la cessation du mouvement des mitochondries afin de les localiser dans des régions où ils sont nécessaires21,22,23.
Pris ensemble, le trafic et d’amarrage des mitochondries sont vitales pour le bon fonctionnement des neurones. À l’appui de cela, perturbation dans le trafic mitochondriale a été associée liée plusieurs maladies neurologiques dont la maladie d’Alzheimer, sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth, maladie de Huntington, spastique héréditaire paraparésie et atrophie optique15,24,25,26,27. Des études récentes ont mis l’accent sur le dysfonctionnement mitochondrial et la pathologie comme un mécanisme potentiel pour la neuropathie diabétique, la perte sensorielle associée diabète28,29,30,31 ,32,,33. L’hypothèse est que le diabète altère la distribution des mitochondries dans les projections sensorielles de terminaison nerveuse cutanée. Par conséquent, il a développé une technique pour visualiser et quantifier les mitochondries dans les fibres de nerf intra-épidermiques (IENFs), l’extrémité distale de la racine dorsale ganglion afférences sensorielles. La technique combine immunohistochimie de fluorescence spécifique mitochondriale et étiquettes de fibres nerveuses avec acquisition de série z microscopie confocale de signaux avec logiciel d’analyse d’image 3D puissant pour mesurer la distribution du nerf spécifiques mitochondries des biopsies punch cutanée humaine pour atteindre cet objectif.
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Protocol
punch biopsies de la peau ont été extraites des sujets qui ont été recrutés dans un réseau de grands soins primaires communautaires au centre du diabète de l’Université de l’Utah (Salt Lake City, Utah). Cette étude a été approuvée par l’Université du Michigan Institutional Review Board et respecter les principes de la déclaration d’Helsinki. Écrit le consentement éclairé a été obtenu auprès de chaque personne concernée avant le test.
1. immunohistochimie fluorescence
- biopsies punch Prepare pour immunohistochemistry fibre nerveuse intra-épidermiques :
- peau 3 mm effectuer des biopsies par medical personnel et placer la biopsie toute à 1.5 mL Zamboni ' solution de fixation s (paraformaldéhyde à 2 %, 0,3 % saturé d’acide picrique dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4) à 4 ° C du jour au lendemain.
- Rincer avec une solution de sucrose à 30 % des échantillons dans du PBS à 4 ° C pendant 16 à 24 heures ou jusqu'à ce que l’échantillon coule. Composé de
- Embed échantillons à la température de coupe optimale (OCT) à l’aide d’un cryomold. Placer la biopsie ensemble 3 mm avec l’épiderme vers le bas dans le moule et remplir le moule avec environ 2 mL de gel octobre le moule sur glace pilée. Magasin à-80 ° C jusqu'à utilisation.
- Couper 50 µm d’épaisseur cross sections à l’aide d’un cryostat et stocker dans les puits d’une plaque 96 puits à l’aide de 180 µL de solution de stockage antigel / puits (30 % d’éthylène glycol, 30 % de glycérol dans du PBS). Les indications ci-dessous sont pour 8 puits d’une plaque 96 puits. Détachant des sections de chaque site de la biopsie qui sont 200 à 300 µm de l’autre.
jour 1 :
- étancher non spécifiques d’étiquetage du stratum corneum :
- Label 96 puits plaque tel qu’illustré à la Figure 1.
- Pipette 150 µL de solution de renforceur de signal stock afin de réduire la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire 34 , 35 dans chaque puits. Transfert des sections dans la solution de renforceur de signal à l’aide d’une boucle d’inoculer.
Remarque : prendre soin tout en travaillant avec les tissus pour éviter d’endommager ou de déchirer les coupes de tissus. Garder en signal enhancer solution pendant 30 minutes à température ambiante sur un rocker plat. - Rinçage Prepare des puits dans les rangées 2 et 3 de la plaque à 96 puits en ajoutant 150 µL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque puits.
- Transvaser avec soin les sections dans la rangée 2 et rincer dans du PBS 1 x pendant 10 min à température ambiante.
- Rinçage une seconde fois dans du PBS 1 x pendant 10 min à température ambiante (ligne 3).
- Préparer 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) bloquant la solution :
- préparer 5 bloquant la solution qui contient 5 % de BSA et 0,3 % Triton X 100-TX-100 à 0,1 M PBS (voir tableau 1), tandis que les sections sont en incubation dans solution de renforceur de signal. BSA ne va pas facilement dans la solution. Solution de Vortex jusqu'à ce que le BSA se dissout complètement.
- Préparer les puits bloquants au 4ème rang de la plaque de 96 puits en ajoutant 150 µL de 5 % de BSA bloquant la solution dans chaque puits.
- Transfert de sections dans les puits individuels de 5 % de BSA bloquant la solution et incuber des sections de 5 % de BSA bloquant la solution pendant 1-2 h à température ambiante sur un rocker plat.
- Préparer 1 % BSA rincer la solution et dilution des anticorps primaires :
- Prepare 1 % solution de rinçage contenant 1 % de BSA et 0,3 % TX-100 en 0,1 M PBS (voir tableau 2), tandis que les sections sont incubation dans une solution 5 % BSA blocage. BSA ne va pas facilement dans la solution. Solution de Vortex jusqu'à ce que le BSA se dissout complètement.
- Diluer les anticorps primaires dans la solution de rinçage de BSA 1 % tandis que les sections sont en incubation dans une solution 5 % BSA blocage.
- Faire 1 500 µL de solution d’anticorps primaire et ajouter à chaque bien dans le rang 5.
- Diluer l’anticorps primaires : utiliser l’étiquette nerveuses spécifiques, produit de gène de la anti-protéine polyclonal de lapin 9,5 (PGP9.5) à 1:1, 000. Utiliser le label de mitochondries spécifiques, souris des anticorps de E2/E3bp anticorps monoclonal anti-pyruvate déshydrogénase (PDH) au 1/100 à 1 % de BSA solution de rinçage.
- Prepare anticorps primaire :
- pipette 150 µL d’anticorps primaire dans chaque bien en rang 5 de la plaque à 96 puits.
- à l’aide de l’outil de la boucle, transférer des sections de la solution de saturation (rang 4) dans la rangée 5 contenant l’anticorps primaire.
- Envelopper la plaque étroitement avec parafilm pour l’empêcher de se dessécher.
- Placer les échantillons sur un rocker plat à température ambiante pendant 1 h et puis incuber les échantillons à 4 ºC sur un rocker plat du jour au lendemain.
jour 2 :
- rincer les échantillons :
- puits rinçage Prepare dans les lignes 6, 7 et 8 de la plaque de 96 puits en ajoutant 150 µL de BSA 1 %, solution de rinçage dans chaque puits.
- Transfert de sections dans la première solution de rinçage BSA à 1 % (ligne 6) et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Répéter deux fois plus en incubant des sections de BSA 1 %, solution de rinçage dans les rangées 7 et 8 pour chaque 1 h à température ambiante rinçages.
- Diluer l’anticorps secondaires chez BSA 1 %, solution de rinçage :
- faire 1 500 µL de solution d’anticorps secondaire tandis que les sections sont en incubation dans le dernier rinçage de 1 % de BSA rinçage solution (ligne 8).
- Diluer l’anticorps secondaires : pour PGP9.5 (anticorps de anti-lapin chèvre conjugué fluorescent vert, 1/1000), pour PDH (rouge fluorescent conjugués chèvre anti-souris, 1:1, 000) BSA 1 %, solution de rinçage.
- Prepare anticorps secondaire :
- pipette 150 µL d’anticorps secondaire en ligne 9 de la plaque à 96 puits.
- Transférer doucement les sections de 1 % de BSA rinçage solution (ligne 8) dans les puits de l’anticorps secondaire (ligne 9).
- Using parafilm, enrouler la plaque étroitement pour l’empêcher de se dessécher. Recouvrir de papier d’aluminium. Placer les échantillons sur un rocker plat à température ambiante pendant 1 h et puis incuber les échantillons à 4 ° c sur un rocker plat du jour au lendemain.
jour 3 :
- Prepare nettoyer 1 x PBS en filtrant à travers un filtre de 0,22 µm :
- pipette 150 µL de filtré solution 1 PBS x dans la ligne 10, 11 et 12.
- Transfert des échantillons à la ligne 10 et rincer dans 1 x PBS pendant 1 h à température ambiante. Couvrir la plaque 96 puits avec du papier aluminium et placer sur un rocker plat pendant le rinçage. Répétez filtrée 1 x rinçage PBS deux fois plus pour chacune 1 h à température ambiante dans les rangées 11 et 12.
- Préparer des lames de microscope pour le montage des sections de tissu :
- Place 50 µL de filtration 1 x PBS sur une diapositive.
- Section de transfert de PBS 1 x (ligne 12) dans le 50 µL drop. Placez soigneusement la section dans le menu déroulant de PBS de déplier le tissu et aplatissant délicatement sur la lame de verre. Enlever l’excès PBS avec une pipette de verre pour éviter la dilution du réactif de montage. Ne touchez pas les sections avec l’ampoule de verre.
- Pipette 1 - 2 gouttes de réactif montage contenant DAPI directement sur le dessus de la section sur la glissière de microscope à l’aide de soins ne pas déranger l’orientation de la section. Placez délicatement une lamelle de verre 50 mm x 24 mm #1.5 microscope sur la mèche.
- Effacer les bulles d’air forment en plaçant la lamelle et essuyer le liquide en excès sur les bords de la lamelle. Préparer une nouvelle diapositive et répéter le pr montageprocessus pour chaque section.
- Cure/sec les supports de montage en plaçant les diapositives dans la sombre nuit à température ambiante. Transférer les lames à 4 ° C à court terme (1 à 2 semaines) ou à-20 ° C pour un stockage à long terme (plu de 2 semaines).
NOTE : Les contrôles négatifs omis des anticorps primaires pour PGP9.5 ou PDH dans étape 1.4.2.2 et n’affichent aucun étiquetage distinguables des nerfs ou des mitochondries dans l’épiderme. Positive, les contrôles ont été effectués pour la PDH anticorps pour le prouver étiquettes toutes les mitochondries (données non présentées). Les contrôles positifs ont été réalisés sur les neurones des ganglions de la racine dorsale cultivés de souris primaire qui étaient transduites avec un baculovirus aux mitochondries étiquette avec un signal de la protéine fluorescente verte (GFP) et ensuite fixés et colorés avec l’anticorps PDH et rouge fluorescent anticorps secondaire. Toutes les mitochondries qui exprimaient la GFP ont été conjointement étiquetés avec l’étiquette rouge pour immunohistochemistry PDH (données non présentées).
2. Imagerie confocale
- effectuer l’imagerie confocale :
- collecter des images à l’aide d’un laser scanning microscope confocal avec un 40 X objectif immersion dans l’huile (ouverture numérique 1,25 (N.A.)) sur un microscope inversé.
- Dans chaque plan focal séquentiellement acquérir des signaux fluorescents :
noyaux : λ excitation = 405 nm, émission spectrale filtre λ = 420-480 nm
des fibres nerveuses : excitation λ = 488 nm, émission spectrale filtre λ = 505-560 nm
Mitoch Ondria : excitation λ = 543 nm, émission spectrale filtre λ = 606-670 nm
- Dans chaque plan focal séquentiellement acquérir des signaux fluorescents :
- entrer les paramètres suivants de la numérisation dans le logiciel de microscope : vitesse de balayage de 600 Hz avec cadre en moyenne 2 et le zoom de 2,2 ; résolution de 12 bits intensité (4096 gris niveaux).
- Définie le logiciel microscope pour résolution latérale optimisée (résolution de numérisation = 1 024 x 1 024) et sectionnant la résolution optique/axial (ouverture confocal = 1 unité aérée (UA) avec volume de z-étape de 210 nm).
Remarque : La résolution XYZ qui en résulte est 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm, avec une taille d’image de 176,1 µm x 176,1 µm x 30 à 50 µm.
- Définie le logiciel microscope pour résolution latérale optimisée (résolution de numérisation = 1 024 x 1 024) et sectionnant la résolution optique/axial (ouverture confocal = 1 unité aérée (UA) avec volume de z-étape de 210 nm).
- Activer un balayage direct pour le signal de nerf (vert-fluorescence) et régler la commande de mise au point z pour trouver et mettre la partie supérieure et abaissez les plans focaux dans le logiciel de microscope qui englobent le signal nerveux au sein de la section de tissu. Z-variation totale est généralement de 30 à 50 µm pour une section de tissu de 50 µm.
- Faire pivoter le champ de balayage avec le logiciel de microscope pendant un balayage direct afin que l’épiderme est positionné horizontalement ou verticalement dans l’image.
- Analyser chaque signal séparément et régler le détecteur (tube photomultiplicateur, PMT) tension et offset pour minimiser ou supprimer toute au-dessus et sous pixel saturé.
NOTE : Temps de balayage avec les paramètres ci-dessus prennent environ 20 à 40 min selon le nombre de tranches de z.
- collecter des images à l’aide d’un laser scanning microscope confocal avec un 40 X objectif immersion dans l’huile (ouverture numérique 1,25 (N.A.)) sur un microscope inversé.
3. 3D de visualisation et d’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques
- isoler l’épiderme 3D :
- Dupliquer l’image d’origine et utiliser l’intensité maximale projection (étendu en vue de la mise au point) de l’image pour identifier et isoler l’épiderme.
- Utiliser une région de l’outil d’intérêt à la trace le long des bords supérieurs et inférieurs de l’épiderme pour éliminer les zones non désirées telles que la couche cornée et le derme qui sont absents des fibres nerveuses intra-épidermiques. Récolte à cette sélection.
- Déconvolution d’utilisation sur le nerf et les signaux fluorescents mitochondriales :
Remarque : déconvolution contribue à rétablir l’intégrité des signaux fluorescents. La restauration utilisée dans le présent protocole est appelée déconvolution aveugle parce qu’il utilise les signaux fluorescents dans les images pour déterminer combien les signaux propagé à partir de leur source d’origine (point spread function). Le processus améliore la résolution du signal en réassignant le signal de se propager dans son emplacement d’origine.- Calculer un point répandre fonction (PSF) pour le signal vert fluorescent nerf (fluorescence verte) avec les paramètres suivants :
- la valeur calculée de PSF confocale. La valeur moyenne indice de réfraction 1,515 et numérique ouverture à 1,25. Affectez à sténopé détecteur 1 unité aérée (U.A.). Longueur d’onde de laser Set excitation à 488 longueur d’onde, nm et d’émission, à 515 nm.
- Calculer un PSF pour le signal mitochondrial fluorescent rouge (rouge-fluorescence) avec les paramètres suivants :
- calculée PSF à confocale. La valeur moyenne indice de réfraction 1,515 et numérique ouverture à 1,25. La valeur sténopé détecteur 1 UA. Longueur d’onde de laser Set excitation 543 longueur d’onde, nm et émission, à 617 nm.
- Optimiser les signaux fluorescents nerveuses et des mitochondries par déconvolution utilisant le PSF correspondantes indiquées ci-dessus et la fonctionnalité de restauration itératif fixé à 100 % de confiance et une limite de 10 cycles d’itération.
- Calculer un point répandre fonction (PSF) pour le signal vert fluorescent nerf (fluorescence verte) avec les paramètres suivants :
- Créer des surfaces nerveuses spécifiques :
- utiliser le " créer surface " outil pour rendre une surface solide des nerfs de la deconvolved vert fluorescent secondaire étiquetage de le PGP9.5 identifié nerfs.
- Décochez la " lisse " en vedette et utiliser la fonction de l’intensité absolue pour régler le seuil pour le signal nerveux car il est beaucoup plus lumineux que la fluorescence de fond.
- Permet de définir le seuil pour le signal nerveux car il est beaucoup plus lumineux que la fluorescence de fond la fonction de l’intensité absolue. La valeur seuil assez bas pour identifier avec précision les nerfs.
- Filtre les surfaces petites, non-nerf selon la taille.
Remarque : Si nécessaire, modifiez manuellement sur des surfaces non-nerf supplémentaires au sein de la " édition " onglet en maintenant la touche Ctrl pour sélectionner plusieurs objets et ensuite de les supprimer avec la touche Suppr.
- Isolat signal mitochondrial fluorescent nerveuses spécifiques :
- Sélectionnez l’onglet édition de la surface de nerf pour afficher la " propriétés de masque " caractéristique. La surface du nerf créée aux étapes 3.3 est utilisée pour isoler des mitochondries dans les nerfs de signaux mitochondriales associés avec les kératinocytes.
- Comme le " masque tous les ' bouton ouvre un " canal masque " fenêtre, choisissez le signal fluorescent rouge deconvolved dans le menu déroulant le menu sous " sélection de canal " pour le signal mitochondrial.
- Cliquez dans la zone de mettre une coche dans la " en double canal avant d’appliquer le masque " option.
- Cliquez sur la radio bouton en face de la " constante à l’intérieur/extérieur " option des paramètres du masque et cliquez dans la zone de mettre une coche dans la " Set voxel en dehors de la surface à " option et tapez 0,00 pour la valeur. Le bouton cliquez sur OK pour créer la nouvelle chaîne qui représente des signaux mitochondriales dans la surface de nerf.
- Créer des surfaces spécifiques mitochondries :
- emploi la " créer surface " outil pour réaliser une surface solide des mitochondries du canal fluorescent nouvellement créé des signaux mitochondriales nerveuses spécifiques de les étapes 3,4.
- Décochez la " lisse " en vedette, puis sélectionnez la " soustraction de fond " fonction pour régler le seuil. Cette fonctionnalité utilise le contraste local autour du signal mitochondrial pour identifier les mitochondries des fond.
- Set seuil assez bas pour identifier avec précision les mitochondries. Dans cet exemple, le seuil a été fixé à 2 000 pour une échelle de 16 bits (65 536).
- Filtre mitochondriales surfaces selon la taille. Dans cet exemple, que la limite de voxel a été fixée à 1,0 voxels, qui est le plus bas limiter le possible. Si nécessaire, modifiez manuellement les surfaces non-mitochondries dans la " édition " onglet en maintenant la touche Ctrl pour sélectionner plusieurs objets et ensuite de les supprimer avec la touche Suppr.
Remarque : Parfois, le logiciel créera des surfaces qui ne sont pas associés avec un signal mitochondrial fluorescent distinguable. Dans ces cas, il est possible de les enlever avec la " édition " Tab
- Exportation et calculer les valeurs morphométriques pour analyse :
- exporter des valeurs de nerf et surfaces mitochondriales de la " statistique " onglet pour une analyse ultérieure avec le logiciel de chiffrier électronique.
- Exporter les valeurs de volume pour le nerf et surfaces mitochondriales.
- Compter le nombre de fibres nerveuses individuelles présents dans chaque image et enregistrez la valeur dans la feuille de calcul électronique.
- Pour chaque image, calculer les valeurs possibles suivantes pour l’analyse de la feuille de calcul électronique :
- somme les volumes pour toutes les surfaces de nerf.
- Filtre les surfaces mitochondriales nerveuses spécifiques sous un volume de moins de 0,02 µm 3 et bin les surfaces de taille. Par exemple, utiliser des emplacements tels que 0,02 - 0,04 0,04 - 0,08 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1,28, 1,28-2,56, supérieure à 2,56 µm 3.
Remarque : La limite inférieure du volume mitochondrial a été mises à 0,02 µm 3 basée sur les volumes déjà publiés de mitonchodria 36 , 37 , 38. - Compter le nombre de surfaces mitochondriales nerveuses spécifiques au sein de chaque emplacement et le nombre total de surfaces sur les bacs (0,02 - supérieur à 2,56 µm 3).
- Calculer la proportion des surfaces mitochondriales nerveuses spécifiques dans chaque emplacement. Utiliser le compte par bac divisé par le nombre total des surfaces de mitochondries.
- La somme des volumes pour toutes les surfaces mitochondriales nerveuses spécifiques.
- Calculer la proportion de nerf avec signal mitochondriale en divisant le volume de surface total de nerf par la somme de tous les volumes de surface mitochondriales.
- Calculer le nombre de mitochondries par volume de nerf en divisant le volume de surface total de nerf par le comte de toutes les surfaces mitochondriales.
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Representative Results
Visualisation et la quantification des mitochondries dans les IENFs humaines
Fluorescence immunohistochimie permet l’étiquetage simultanée de signaux multiples dans les biopsies de la peau humaine pour visualiser les nerfs, les mitochondries et les noyaux. Une plaque à 96 puits constitue un moyen pratique d’organiser les étapes de la procédure de l’immunohistochimie. La figure 1 montre que représente cette configuration jusqu'à 8 sections à traiter à travers les 12 étapes de solutions. La méthode flottante combinée à une agitation modérée avec un rocker plat garantit que les anticorps ont un accès suffisant pour pénétrer dans les sections des deux côtés. Le protocole dure 3 jours, qui est en grande partie due à des incubations durant la nuit dans des anticorps primaires et secondaires à 4 ° C, qui toujours étiquettent les mitochondries et les nerfs.
Le reste de la procédure intègre l’imagerie, le traitement et l’analyse des signaux fluorescents. Microscopie confocale tire profit des signaux fluorescents à optiquement section signaux discrets de plan focal en éliminant les signaux d’out-of-focus. Acquisition de z-series par l’intermédiaire de la section de tissu fournit une représentation 3D des signaux fluorescents pour les nerfs, les mitochondries et les noyaux. Les paramètres sont optimisés pour image 172 µm sur toute la longueur de l’épiderme qui inclurait une moyenne de 5 nerfs. La figure 2 illustre une image 3D typique des trois signaux fluorescents qui proviennent de l’épiderme. Le PGP9.5 coloration (Figure 2 b) délivre un signal riche des nerfs épidermiques et dermiques qui est d’une intensité plus élevée que l’auto-fluorescence de fond du tissu. La coloration nucléaire (Figure 2) permet d’identifier les limites de l’épiderme où innervent les fibres nerveuses intra-épidermiques. Il est fréquent que la couche externe de l’épiderme pour avoir un signal diffus qui pourrait être dû à l’ADN résiduel présent dans les cornéocytes qui composent la couche cornée. Les mitochondries sont clairement étiquetés par la PDH coloration (Figure 2D) où la majorité du signal est associée aux cellules de l’épiderme qui sont principalement des kératinocytes.
Les paramètres d’acquisition décrits dans le présent protocole utilisent un 40 X objectif à immersion d’huile avec une ouverture numérique 1,25 et un facteur de zoom du point 2.2. Cela se traduit par une taille d’image XYZ de 176,1 µm x 176,1 µm x 30 à 50 µm. Ces paramètres de capturent assez de l’épiderme pour inclure une moyenne de 4 à 6 des fibres nerveuses par image (Figure 3 a). Échantillonnage à résolution plus élevée permettrait de réduire le nombre de nerfs dans chaque image. Figure 3 b présente un facteur de zoom de 3.3, qui réduit la surface XY à 114,8 µm x 114,8 µm, ce qui entraîne moins de nerfs par image. La densité idéale d’échantillonnage telle que définie par Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) pour un 40 x objectif à immersion d’huile avec une ouverture numérique 1,25 suggère une résolution de numérisation XYZ de 54 nm x 54 nm x 205 nm. Cela requerrait un facteur de zoom de 6,6 fois à résolution de 1 024 x 1 024 et réduire la vue XY à 57,4 µm x 57,4 µm et capturer seulement une moyenne de 1-2 nerf par image (Figure 3).
La prochaine étape consiste à effectuer le traitement de l’image à supprimer les zones indésirables de l’image et à renforcer les signaux. Dans le présent protocole, le derme et la couche cornée sont supprimés afin d’axer l’analyse sur la région de l’épiderme où innervent les IENFs. Logiciels en trois dimensions permet d’isoler, de renforcer et d’analyser les signaux fluorescents. Outils du logiciel sont nécessaires pour isoler le nerf épidermique et les mitochondries en affleurant les régions au-dessus et au-dessous de l’épiderme (Figure 4 a-C). Ce processus est simplifié par s’effondrer les signaux dans une vue étendue et ensuite tracer une dessin à main levée région autour de l’épiderme. L’image recadrée est ensuite traitée par des algorithmes de rétablissement d’image. Déconvolution est utilisée pour optimiser la résolution des nerfs et des signaux mitochondriales (Figure 4).
La phase finale est de détecter et d’extraire des caractéristiques morphométriques des signaux. Un aspect important de ce protocole est de mesurer les caractéristiques des mitochondries nerveuses spécifiques. Logiciel d’analyse image a des fonctionnalités qui utilisent les surfaces créées pour un signal (dans ce cas la surface du nerf) comme un outil de masquage pour isoler un autre signal fluorescent (dans ce cas les mitochondries) au sein de cette surface. La première étape de l’analyse des mitochondries nerveuses spécifiques est de créer des surfaces 3D autour de nerfs (Figure 5 a-B). Les surfaces de nerf sont ensuite utilisés pour recadrer les signaux mitochondriales fluorescents nerveuses spécifiques (Figure 5, 5D, 5E, 5 G). Enfin, les surfaces 3D sont créées autour des signaux mitochondriales nerveuses spécifiques pour obtenir des mesures volumétriques (Figure 5F, 5H). Le tableau 3 montre les mesures morphométriques qui sont exportées à partir du logiciel d’analyse image et données sommaires. Les principales valeurs à l’exportation sont les valeurs de volume pour le nerf et les signaux mitochondriales nerveuses spécifiques. Les données de volume de la mitochondrie sont mis en cellule pour générer des données de fréquence de taille de mitochondries, qui sont ensuite utilisées pour créer des histogrammes de fréquence Dimensions (Figure 6). Les données de volume servent aussi à faire des mesures agrégées pour nombre de mitochondries par volume IENF et pourcentage du volume des mitochondries dans les volumes IENF.
Les données présentées au tableau 3 et Figure 6 montrent que cette technique permet de quantifier les mitochondries au sein de l’IENFs humaines de biopsies de la peau. Les nerfs de cet échantillon ont distribués dans les mitochondries et la majorité des mitochondries est entre 0,02 - 0,32 µm3. Ces tailles sont dans une plage associée aux mitochondries normales36,37,38,39. Mitochondries plus petits ont démontré d’être plus mobiles que grandes mitochondries39 , suggérant que les mitochondries dans ces nerfs pourraient être plus mobiles. En effet, des études ont mis en cause que plus gros et gonflés des mitochondries ne pas transportent ainsi que de plus petites mitochondries et peuvent conduire à une dégénérescence axonale39,40,41. Caractérisation des mitochondries nerveuses spécifiques est donc une technique qui serait applicable à l’étude des maladies neurodégénératives où des changements dans la morphologie mitochondriale et les transports ont été associés à une dégénérescence axonale 15,25,26,27,42,43.
| Solution de blocage 5 % BSA | |
| Composants de 5 % de BSA bloquant la Solution | Montant nécessaire |
| Albumine sérique bovine (BSA) [Concentration finale : 5 %] | 0,625 g |
| 1,0 % Triton X-100 (TX-100) [Concentration finale : 0,3 %] | |
Tableau 1 : 5 % de BSA bloquant la Solution. La solution de saturation 5 % BSA est utilisée dans les étapes précoces du protocole immunohistochemistry pour bloquer des anticorps non-spécifiques.
| Solution de rinçage 1 % BSA | |
| Composants de BSA 1 %, Solution de rinçage | Montant nécessaire |
| Albumine sérique bovine (BSA) [Concentration finale : 1 %] | 0,125 g |
| 1,0 % TX-100 [Concentration finale : 0,3 %] | 3,75 mL |
| 1 x PBS | ~8.125 mL |
| TOTAL (utiliser 1 X PBS pour porter le volume total de 12,5 mL) | 12,5 mL |
Tableau 2 : BSA 1 %, Solution de rinçage. La BSA 1 %, solution de rinçage est utilisée dans le protocole d’immunohistochemistry pour bloquer des anticorps non-spécifiques et utilisée pour diluer les anticorps primaires et secondaires.
| Mesures morphométriques pour IENFs et mitochondries nerveuses spécifiques | ||||||||
| Données exportées et sommaires de logiciel d’analyse Image | ||||||||
| Bacs de fréquence de taille MT | Nombre de Mt dans bac de fréquence de taille | Pourcentage de Mt dans Bin | Nombre total de Mt | MT Volume (µm3) | IENF Volume (µm3) | Nombre de TM par IENF Volume (nombre/100 µm3) | Pourcentage du Volume de Mt IENF volume | Nombre de IENFs |
| entre .02-.04 µm3 |
20 | 24,4 % | 82 | 13.41 | 518,88 | 15,8 | 2,58 % | 4 |
| entre .04-.08 µm3 |
28 | 34,1 % | ||||||
| entre .08-.16 µm3 |
14 | 17,1 % | ||||||
| entre .16-.32 µm3 |
12 | 14,6 % | ||||||
| entre .32-.64 µm3 |
4 | 4,9 % | ||||||
| entre .64-1,28 µm3 |
3 | 3,7 % | ||||||
| entre 1.28-2,56 µm3 |
1 | 1,2 % | ||||||
| entre 2,56 + µm3 |
0 | 0,0 % | ||||||
Tableau 3 : Mesures morphométriques pour IENFs et nerveuses spécifiques mitochondries. Le tableau représente les valeurs de morphométriques qui sont mesurées et exportés du logiciel d’analyse images et données de synthèse. Abréviations : IENF, intra-épidermiques des fibres nerveuses ; MT, les mitochondries.
Figure 1 : Diagramme schématique qui représente le programme d’installation pour une plaque à 96 puits d’immunohistochimie de biopsie de peau. Lignes la plaque représentent des étapes décrites dans le protocole pour les solutions de bloc, de lavage et d’incubation et colonnes représentent des coupes de tissus individuels (de 1 à 8 sections par plaque). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : 3D représentant Image de microscopie confocale d’une Section de tissu d’une biopsie épidermique humaine transformés pour Fluorescence Immunohistochemistry. Image de projection 3D non transformés illustre les signaux fluorescents (A) ont fusionné et les signaux individuels pour les nerfs (B) (nerf, vert), (C) des noyaux (Nuc, bleu) et (D) les mitochondries (Mt, rouge) dans l’épiderme et derme. Notez l’absence de signaux dans la couche de la couche cornée de l’épiderme. Barreaux de l’échelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : De meilleurs résultats de résolution Image en moins de nerfs pour analyse ultérieure. Toutes les images sont capturées avec un objectif d’huile X 40 avec une ouverture numérique 1,25 et les projections 3D illustrent des signaux fluorescents pour les nerfs (vert), les mitochondries (Mt, rouge) et les noyaux (Nuc, bleu). Une photo prise à un facteur de zoom de 2.2 (A) contient plusieurs nerfs dans la vue. Augmentation du facteur de zoom à 3.3 (B) ou 6,6 (C), l’échantillonnage Nyquist idéal, réduit considérablement le nombre des nerfs au sein de chaque image. Barreaux de l’échelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Traitement d’images. Représentant a vue de la mise au point (projection d’intensité maximale) d’une image de microscopie confocale d’une section de tissu d’une biopsie épidermique humaine. Image de projection non transformés illustre (A) les fluorescentes fusionné des signaux pour les nerfs (verts), les noyaux (Nuc, bleu) et des mitochondries (Mt, rouge). Le derme et la couche cornée sont (B) cropped out avec une région d’inteoutil de sélection à main levée reste (ROI) (blue zone en surbrillance, ROI des cultures) isolant seulement des signaux dans l’épiderme. L’épiderme (C) recadrée est ensuite traitée pour la propagation de déconvolution (D) avec point calculé fonctions pour améliorer la résolution des nerfs (vert) et mitochondriaux (Mt, rouge) signaux. Barreaux de l’échelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse d’image. Image de microscopie confocale 3D représentant illustre (A) le signal fluorescent vert nerveuses spécifiques. (B) une surface 3D (cyan) est créée pour le signal nerveux. Le signal mitochondrial nerveuses spécifiques est isolé du reste des signaux mitochondriales épidermiques (C) (TM, rouge) par (D) à l’aide de la surface de nerf comme un outil de masquage. résultante (E, G) nerveuses spécifiques mitochondrial signal fluorescent rouge sert à créer (F, H) surfaces (surface de Mt, magenta) autour de la mitochondrie dans la surface de nerf (cyan). G et H sont une vue agrandie les cases blanches en E et F. échelle bars = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Taille mitochondriale fréquence histogramme. Mitochondrialsurface données sont présentées comme un histogramme de fréquence de taille pour visualiser le pourcentage des mitochondries qui sont présents dans chacun des emplacements différents selon leur volume (µm3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole est conçu pour isoler, de quantifier et d’analyser la taille et la distribution des mitochondries nerveuses spécifiques au sein de la IENFs en 3D de biopsies de la peau humaine. Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. L’immunohistochimie de fluorescence flottant est conçu pour souiller et analyser des signaux multiples dans chaque échantillon, fournissant une méthodologie plus souple pour la recherche exploratoire44,45. Cette procédure permet la pénétration des anticorps dans le tissu afin de maximiser l’acquisition des images tout au long de la section µm 50, ce qui est nécessaire pour acquérir des images de microscopie confocale et analyse 3D. Une autre étape critique est les paramètres d’acquisition image qui sont équilibrées entre capturer assez nerfs par image tout en conservant la résolution pour la mesure des mitochondries. Les sections de tissu utilisé dans le présent et les protocoles de biopsie de peau standard sont environ 3 mm long45,46,47,48. Les paramètres d’acquisition décrite dans cette capture de protocole assez de l’épiderme pour inclure une moyenne de 4 à 6 des fibres nerveuses par image. Échantillonnage à plus haute résolution réduirait significativement le nombre de nerfs dans chaque image, en particulier à l’échantillonnage Nyquist. Une troisième étape cruciale consiste à utiliser des algorithmes de déconvolution afin d’améliorer la résolution et le contraste des signaux, en particulier pour les mitochondries. Déconvolution des images souvent contribuer à compenser pas d’échantillonnage à plus haute résolution. La dernière étape critique est d’utiliser le logiciel d’analyse image pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques de la mitochondrie associée aux cellules de l’épiderme. Ceci est accompli en utilisant la surface du nerf comme un outil de masquage pour recadrer signal mitochondrial qui localiser dans le nerf.
Il y a quelques modifications possibles de cette technique à envisager. Une seule modification possible serait de raccourcir la durée de l’immunohistochimie de fluorescence. Les incubations durant la nuit dans les solutions d’anticorps primaires et secondaires à 4 ° C pourraient être réduites à 3-4 heures à température ambiante. Toutefois, des incubations plus courtes à la température ambiante augmentent souvent fluorescence de fond, donc attention devrait être prise pour éviter le mauvais signal au bruit. Une autre modification possible serait d’ajuster les paramètres d’acquisition de l’image. Comme mentionné ci-dessus, l’acquisition d’images décrite ici étaient biaisés pour capturer un nombre raisonnable de nerfs par image sur image haute résolution. Il est possible d’utiliser un objectif de grossissement plus élevé, comme un objectif à immersion à huile 63 x avec une ouverture numérique 1,3. Si tous les paramètres sont restés les mêmes, et un objectif X 63 a été utilisé, le champ d’image XY serait ramené à 112 µm x 112 µm et donc réduire le nombre moyen des nerfs par image. Le point principal consiste à utiliser des paramètres cohérentes tout au long de l’acquisition et l’analyse ultérieure.
La principale limite de cette technique est que c’est beaucoup de temps. L’immunohistochimie prend 3 jours pour traiter les tissus, acquisition d’images prend environ 30-50 min par image selon combien optique z-mesures et traitement d’image/analyse prend environ 20 min. C’est un engagement de beaucoup de temps mais donne des mesures morphométriques important en fin de compte. Une autre limite de cette technique est la zone limitée d’épiderme échantillonné par image. Cependant, ceci améliorera sans aucun doute que les progrès sont fabriqués en taux d’acquisition image avec une résolution améliorée combinée avec les processeurs informatiques plus rapides et logiciel d’analyse.
La signification du présent protocole par rapport aux autres méthodes est dans la puissance de la combinaison de fluorescence immunohistochimie avec la microscopie confocale et analyse d’images 3D. Traditionnellement, analyse des fibres nerveuses intra-épidermiques est fait avec immunohistochimie chromogène basé et au microscope à fond clair, surtout pour le diagnostic clinique de neuropathie45,47,49. L’utilisation de la fluorescence immunohistochimie permet à souiller et analyser des signaux multiples dans chaque échantillon, fournissant une méthodologie plus souple pour la recherche exploratoire44,45. Cette technique fournit une stratégie visant à isoler un signal particulier d’intérêt, dans ce cas spécifique du nerf mitochondries, partir d’un signal complex, mitochondries associées aux cellules épidermiques.
La puissance de cette technique est son utilité dans des applications futures. La capacité d’isoler et mesurer des mitochondries nerveuses spécifiques permet d’évaluer la modification induite par la maladie dans la taille et la distribution des mitochondries. Multiples complications neurologiques ont mis en cause le dysfonctionnement mitochondrial comme un mécanisme potentiel de la maladie. En particulier, une version modifiée de cette technique a été utilisée pour démontrer que les patients atteints de diabète et de la neuropathie diabétique périphérique ont des changements mesurables dans la taille et la distribution des mitochondries nerveuses spécifiques par rapport au même âge contrôle à50. Cette technique est utile pour évaluer l’efficacité des thérapies visant à améliorer ou de guérir les neuropathies sensorielles. Enfin, la polyvalence de la technique rend applicable à une large gamme d’analyses qui utilisent un signal fluorescent pour isoler un sous-ensemble des données d’autres signaux fluorescents.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions K08 NS061039-01A2, le programme de recherche de neurologie & découverte et l’a. Alfred Taubman Medical Research Institute à l’Université du Michigan. Ce travail a utilisé la morphologie et l’Image analyse Core du Michigan Diabetes Research Center, financé par les instituts nationaux de santé subvention 5P 90 DK-20572 du National Institute of Diabetes et digestives et les maladies des reins. Les auteurs tiens à remercier J. Robinson Singleton et A. Gordon Smith (Université de l’Utah) pour leur généreux don d’échantillons de peau humaine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
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