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Neuroscience

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/53369
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

Summary

Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls ist, Mitochondrien innerhalb Intraepidermal Nervenfasern zu studieren. Daher wurden 3D Bildgebung und Analysetechniken entwickelt, um Nerv-spezifische Mitochondrien zu isolieren und Krankheit verursachten Veränderungen der Mitochondrien in der distalen Spitze der sensorischen Nerven zu bewerten. Das Protokoll verbindet Fluoreszenz Immunohistochemistry, konfokale Mikroskopie und 3D-Bild Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Detaillierte Parameter sind im gesamten Verfahren definiert, um ein konkretes Beispiel, wie man diese Techniken verwenden, um Nerv-spezifische Mitochondrien isolieren zu bieten. Antikörper wurden verwendet, um Nerven zu beschriften und mitochondriale Signale in Gewebeschnitten der Haut Punsch Biopsien, die folgte indirekte Immunfluoreszenz, Nerven und Mitochondrien mit grünen und roten Fluoreszenzsignal bzw. zu visualisieren. Z-Serie-Bilder wurden mit der konfokalen Mikroskopie erworben und 3D Analyse-Software wurde zur Verarbeitung und Analyse der Signale. Es ist nicht notwendig, die genauen Parameter innerhalb beschrieben folgen, aber es ist wichtig, die konsistent mit denen, die in der Färbung, Erfassung und Analyse Schritten gewählt werden. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es auf eine Vielzahl von Umständen anwendbar ist, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um andere Signale zu isolieren, die sonst unmöglich, allein zu studieren.

Introduction

Mitochondrien dienen wichtige Zellfunktionen, die Produktion von Zellenergie, Pufferung, Kalzium, und Regulierung der nekrotischen und Apoptotic Zelle Tod1,2,3enthalten. Das Nervensystem hat eine hohe metabolische Rate im Vergleich zu den Körper4 darauf hindeutet, dass Neuronen ein hohes Maß an zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP erzeugen) durch mitochondriale Atmung. Eine Menge Beweise dokumentiert, dass neuronale Funktionen ATP5, vor allem bei den Synapsen6abhängig sind. Die Verteilung der Mitochondrien innerhalb von Neuronen sind deshalb wichtig.

In die letzten 10 Jahren, die eine Vielzahl von Informationen, dass gezeigt hat der Handel und das Andocken des neuronalen Mitochondrien, ist streng reglementiert. Motorproteine sind bei der Verteilung der Mitochondrien zu spezifischen zellulären Fächer in das Neuron beteiligt. Handel mit Mitochondrien ist besonders wichtig, weil Neuronen Axone und Dendriten fernab der Soma-Projekt. Motorproteine Kinesin direkt in erster Linie Anterograde (Weg von der Soma) Handel mit Mitochondrien entlang der Mikrotubuli während Dynien Motorproteinen direkte retrograde (in Richtung der Soma) Motilität7,8,9 , 10. Zelluläre Signale gibt es solch eine mitochondriale Membranpotential und Impuls-Leitung, die Einfluss auf das Vorhandensein und die Richtung der mitochondrialen Menschenhandel11,12,13.

Neben Mitochondrien zu transportieren, gibt es spezielle Proteine, Mitochondrien zu spezifischen zellulären Kompartimenten zu lokalisieren, die hohen Energiebedarf, wie Knoten von Ranvier und Synapsen8,14, 17. In der Tat, die meisten von Mitochondrien in Axonen sind nicht bewegliche9,13,18. Spezielle Proteine wie Syntaphilin Anker Mitochondrien Mikrotubuli entlang der Axone während andere Proteine Anker Mitochondrien an den Aktin-Zytoskelett19–21. Wachstumsfaktoren und Ionen wie Calcium wurden berichtet, um die Einstellung der Mitochondrien Bewegung sie Regionen lokalisieren wo sie benötigte21,22,23sind zu unterstützen.

Zusammengenommen, sind Menschenhandel und docking der Mitochondrien entscheidend für die richtige Funktion der Neuronen. Zur Unterstützung dieser wurde Unterbrechung des mitochondrialen Handel mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit, Huntington Krankheit, erbliche spastische Paraparese und Optikusatrophie15,24,25,26,27. Neuere Studien konzentrierten sich auf mitochondriale Dysfunktion und Pathologie als ein möglicher Mechanismus für diabetische Neuropathie, die sensorische Verlust im Zusammenhang mit Diabetes28,29,30,31 ,32,33. Die Hypothese ist, dass Diabetes die Verteilung der Mitochondrien innerhalb der sensorischen Projektionen der kutanen Nervenendigung verändert. Daher wurde eine Technik entwickelt, um zu visualisieren und zu quantifizieren Mitochondrien innerhalb der Intraepidermal Nervenfasern (IENFs), die distalen Spitzen der Dorsal Root Ganglion sensorischen Afferenzen. Die Technik kombiniert Fluoreszenz Immunohistochemistry spezifische mitochondriale und Nervenfaser Etiketten mit konfokalen Mikroskopie Z-Serie Erwerb von Signalen mit leistungsstarken 3D Bildanalyse-Software zur Messung der Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien von menschlichen kutanen Stanzbiopsien zur Erreichung dieses Ziels.

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Protocol

Haut Stanzbiopsien stammen aus Themen, die von einem großen Community-basierte Erstversorgung Netzwerk an der University of Utah Diabeteszentrum (Salt Lake City, UT) rekrutiert wurden. Diese Studie wurde von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt und erfüllt mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Schriftliche Einwilligung eingeholt wurde, aus jedem Fach vor dem Test.

1. Fluoreszenz Immunohistochemistry

  1. Prepare Stanzbiopsien für Intraepidermal Nervenfaser Immunohistochemistry:
    1. Perform 3 mm Haut Biopsien durch medizinisches Personal und die gesamte Biopsie in 1,5 mL Zamboni ' s Fixativ Lösung (2 % Paraformaldehyd, 0,3 % gesättigt Pikrinsäure in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) bei 4 ° C über Nacht.
    2. Spülen Proben mit einer Lösung von 30 % Saccharose mit PBS-Puffer bei 4 ° C für 16-24 h oder bis die Probe sinkt.
    3. Embed Proben in optimale Arbeitstemperatur Verbindung (OCT) mit einem Cryomold. Legen Sie die ganze 3 mm-Biopsie mit der Epidermis nach unten in die Form und füllen Sie den Schimmel mit etwa 2 mL Okt. Freeze der Schimmel auf zerstoßenem Trockeneis. Shop bei-80 ° C bis zum Gebrauch.
    4. Cut 50 µm Dicke Querschnitte mit einem Kryostaten und speichern in einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 180 µL Frostschutzmittel Speicherlösung pro Bohrloch (30 % Ethylenglykol, 30 % Glycerin in PBS). Die folgenden Anweisungen sind für 8 Brunnen von einer 96-well-Platte. Flecken auf Abschnitte von jedem Standort der Biopsie, die 200-300 µm voneinander entfernt sind.

Tag 1:

  1. unspezifische Kennzeichnung des Stratum corneums zu stillen:
    1. Etikett 96-Well-Platte wie in Abbildung 1 gezeigt.
    2. Lager Signal Enhancer Lösung, um unspezifische Bindung der Sekundärantikörper 34 , 35 in jede Vertiefung Pipettieren 150 µL. Abschnitte in Signal-Enhancer-Lösung mit einer Impfkeimen Schleife übertragen.
      Hinweis: Achten Sie darauf, während der Arbeit mit dem Gewebe beschädigen oder reißen die Gewebeschnitte zu vermeiden. Halten Sie in Signal-Enhancer-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem flachen Rocker.
    3. Vorbereiten spülen Brunnen in den Zeilen 2 und 3 des 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung.
    4. Abschnitte sorgfältig in Zeile 2 und Spülen mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur übertragen.
    5. Spülen ein zweites Mal mit 1 X PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur (Zeile 3).
  2. 5 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert Lösung vorbereiten:
    1. bereiten 5 % Lösung, die 5 % BSA enthält blockieren und 0,3 % Triton X 100 (TX-100) in 0,1 M PBS (siehe Tabelle 1) während der Abschnitte sind Inkubation Signal-Enhancer-Lösung. BSA geht einfach nicht in Lösung. Vortex Lösung bis BSA vollständig auflöst.
    2. Bereiten Sie blockierende Brunnen in Zeile 4 der 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 5 % BSA Lösung in jedem Bohrloch blockieren.
    3. Abschnitte in individuelle Vertiefungen von 5 % BSA Lösung blockiert und inkubieren Sie Abschnitte in 5 % BSA Lösung für 1-2 h bei Raumtemperatur auf einem flachen Rocker blockieren.
  3. 1 % BSA Spülung Lösung und Verdünnung der Primärantikörper vorbereiten:
    1. bereiten Sie 1 % Spüllösung, die 1 % BSA und 0,3 % enthält TX-100 in 0,1 M PBS (siehe Tabelle 2) während der Abschnitte sind Inkubation in 5 % BSA blockierende Lösung. BSA geht einfach nicht in Lösung. Vortex Lösung bis BSA vollständig auflöst.
    2. Verdünnen Primärantikörper in 1 % BSA Spüllösung während Abschnitte in 5 % BSA blockierende Lösung brüten sind.
      1. 1.500 µL Primärantikörper Lösung machen und fügen Sie jeweils gut in Zeile 5.
      2. Verdünnen die primären Antikörper: verwenden Sie das Nerven-spezifische Beschriftung, Kaninchen polyklonale Anti-Protein Genprodukt 9.5 (PGP9.5) auf 1:1 000. Verwenden Sie die Mitochondrien-spezifische Bezeichnung, Maus monoklonalen Anti-Pyruvat-Dehydrogenase E2/E3bp Antikörper (PDH) bei 1: 100 in 1 % BSA Spüllösung.
  4. Primärantikörper vorbereiten:
    1. Pipettieren 150 µL Primärantikörper in jede Zeile auch in 5 von 96-Well-Platte.
    2. Mit der Loop-Werkzeug Abschnitte aus der blockierenden Lösung (Zeile 4) in der Zeile 5 enthält den primären Antikörper übertragen.
    3. Wickeln Sie die Platte fest mit Parafilm zu halten vor dem Austrocknen.
    4. Proben auf flachen Rocker bei Raumtemperatur für 1 h und inkubieren Sie Proben bei 4 ° c auf einem flachen Rocker Übernachtung.

Tag 2:

  1. spülen Proben:
    1. Prepare spülen Brunnen in Reihen 6, 7 und 8 der 96-Well-Platte durch Zugabe von 150 µL 1 % BSA Spüllösung in jede Vertiefung.
    2. Abschnitte in ersten 1 % BSA Spüllösung (Zeile 6) und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Spülungen durch Inkubation Abschnitte in 1 % BSA Spüllösung in den Zeilen 7 und 8 für 1 h bei Raumtemperatur noch zweimal zu wiederholen.
  2. Sekundärantikörper in 1 % BSA Spüllösung zu verdünnen:
    1. machen 1.500 µL Sekundärantikörper Lösung während Abschnitte in den letzten Spülgang 1 % BSA Spüllösung (Zeile 8) Inkubation werden.
    2. Sekundärantikörper verdünnen: für PGP9.5 (grün-fluoreszierende konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, 1: 1000), für PDH (rot-fluoreszierend konjugierten Ziege Anti-Maus, 1:1 000) in 1 % BSA Spüllösung.
  3. Sekundärantikörper vorbereiten:
    1. Pipettieren 150 µL Sekundärantikörper in Zeile 9 von 96-Well-Platte.
    2. Sanft übertragen die Abschnitte von 1 % BSA Spüllösung (Zeile 8) in Sekundärantikörper Vertiefungen (Zeile 9).
    3. Mit Parafilm, wickeln Sie die Platte fest zu halten vor dem Austrocknen. Mit Alufolie abdecken. Proben auf flachen Rocker bei Raumtemperatur für 1 h und inkubieren Sie Proben bei 4 ° c auf einem flachen Rocker Übernachtung.

Tag 3:

  1. vorbereiten reinigen 1 X PBS durch Filterung durch einen 0,22 µm-Filter:
    1. Pipettieren 150 µL gefiltert 1 X PBS in Zeile 10, 11 und 12.
    2. Proben auf Zeile 10 übertragen und spülen Sie mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Decken Sie 96-Well-Platte mit Alufolie ab und auf einen flachen Rocker beim Spülen. Wiederholung gefiltert 1 x PBS spülen zwei weitere Male für 1 h bei Raumtemperatur in den Zeilen 11 und 12.
  2. Montage Gewebeschnitte Objektträger vorbereiten:
    1. Ort 50 µL 1 X PBS auf einer Folie gefiltert.
    2. Transfer-Abschnitt von 1 X PBS (Zeile 12) in den 50 µL Tropfen. Positionieren Sie sorgfältig Abschnitt in der Dropdownliste der PBS durch Entfaltung des Gewebes und Abflachung es sanft auf dem Objektträger. Entfernen Sie überschüssige PBS mit einer Glaspipette um das Montage-Reagenz Verdünnung zu vermeiden. Abschnitte mit der Glaskolben nicht berühren.
    3. Pipettieren 1 - 2 Tropfen Montage Reagenz mit DAPI direkt auf den Abschnitt über das Mikroskop Folie mit Sorgfalt um die Ausrichtung des Abschnitts nicht zu stören. Sanft lege ein 50 mm x 24 mm #1.5 Mikroskop Glas Deckglas über Abschnitt.
    4. Klare Luftblasen gebildet, indem man das Deckglas und wischen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Kanten des Deckglases. Bereiten Sie eine neue Folie und wiederholen Sie die Montage-prdet für jeden Abschnitt.
    5. Heilung/trockene Montage Medien indem man die Folien in der dunklen Nacht bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Folien auf 4 ° C für kurzfristige (1-2 Wochen) oder-20 ° C für die Langzeitspeicherung (mehr als 2 Wochen).
      Hinweis: Negativkontrollen Primärantikörper für PGP9.5 oder PDH in Schritt 1.4.2.2 weggelassen und angezeigt, keine unterscheidbare Kennzeichnung von Nerven oder Mitochondrien in der Epidermis. Positiv, dass Kontrollen wurden Etiketten für die PDH Antikörper zu beweisen alle Mitochondrien (Daten nicht gezeigt). Positivkontrollen wurden auf kultivierten primäre Maustaste Dorsal Root Ganglion Neuronen durchgeführt, die mit einem Baculovirus zum Label Mitochondrien mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Signal ausgestrahlt wurden und dann fixiert und befleckt mit dem PDH-Antikörper und rot fluoreszierende Sekundärantikörper. Alle Mitochondrien, die GFP zum Ausdruck zu bringen, wurden gemeinsam mit dem roten Etikett für PDH Immunohistochemistry (Daten nicht gezeigt) beschriftet wurden.

2. Confocal Imaging

  1. konfokale Bildgebung durchführen:
    1. sammeln Bilder mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop mit einem 40 X Ölimmersion (1,25 numerische Apertur (N.A)) Ziel auf einem inversen Mikroskop.
      1. Bei jedem Brennebene sequenziell erwerben fluoreszierende Signale:
        Kerne: Erregung λ = 405 nm, spektrale Emission Filter λ = 420-480 nm
        Nervenfasern: Erregung λ = 488 nm, spektrale Emission Filter λ = 505-560 nm
        Mitoch Ondria: Erregung λ = 543 nm, spektrale Emission Filter λ = 606-670 nm
    2. die folgenden Scan-Parameter in die Mikroskop-Software eingeben: Scan-Rate von 600 Hz mit 2 Rahmen mit durchschnittlich und Zoom von 2,2; Intensität 12-Bit Auflösung (4096 grau Ebenen).
      1. Stellen die Mikroskop-Software für optimierte laterale Auflösung (scan-Auflösung = 1.024 x 1.024) und axiale Auflösung/optische-Schnitt (konfokale Blende = 1 luftig Einheit (AU) mit Z-Schrittweite von 210 nm).
        Hinweis: Die resultierende XYZ-Auflösung ist 172,2 nm x 172,2 nm X 210 nm mit einer Bildgröße von 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.
    3. Aktivieren Sie ein live-Bild für das Nervensignal (grün-Fluoreszenz) und stellen Sie die Z-Fokus-Regler zu finden und einstellen den oberen und unteren Brennweite Flugzeuge in der Mikroskop-Software, die das Nervensignal im Abschnitt Gewebe umfassen. Z-Gesamtreichweite beträgt in der Regel 30-50 µm für einen 50 µm Gewebe Abschnitt.
    4. Feld Scan mit der Mikroskop-Software während einer live-Bild drehen, so dass die Epidermis in das Bild horizontal oder vertikal positioniert ist.
    5. Scannen jedes Signal getrennt und passen Sie den Detektor (Photomultiplier Röhre, PMT) Spannung und Offset zu minimieren/über und unter gesättigten Pixel entfernen.
      Hinweis: Die Scan-Zeiten mit den oben genannten Parametern dauern ca. 20-40 min je nach Anzahl der Z-Scheiben.

3. 3D Visualisierung und Analyse der Mitochondrien innerhalb menschlicher Intraepidermal Nervenfasern

  1. 3D Epidermis zu isolieren:
    1. duplizieren Sie das Originalbild und verwenden Sie die maximale Intensität Projektion (erweiterte Fokusansicht) des Bildes zu identifizieren und isolieren die Epidermis.
    2. Verwenden eine Region von Interesse-Werkzeug, um Spur entlang der oberen und unteren Kanten der Epidermis, um unerwünschte Bereiche wie das Stratum Corneum und Dermis zu entfernen, das Fehlen von Intraepidermal Nervenfasern. Auf diese Auswahl zuschneiden.
  2. Verwendung Dekonvolution auf die Nerven und mitochondriale fluoreszierende Signale:
    Hinweis: Dekonvolution hilft, die Integrität der fluoreszierenden Signale wieder herzustellen. Die Wiederherstellung, die in diesem Protokoll verwendeten wird blind Deconvolution genannt, weil es die fluoreszierenden Signale in den Bildern nutzt um zu bestimmen, wie viel die Signale von ihrer ursprünglichen Quelle verbreiten (Punkt spread Funktion). Der Prozess verbessert Signal Auflösung durch die Neuzuweisung des Signals zurück in seine Ursprungsposition verbreitet.
    1. Berechnen einen Punkt verteilen Funktion (PSF) für das grün fluoreszierende Nervensignal (grün-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern:
      1. stellen berechneten PSF auf konfokalen. Stellen Sie mittlere Brechungsindex auf 1.515 und numerische Apertur auf 1,25. Stellen Sie Detektor Lochkamera auf 1 luftig Einheit (AE). Set Laser Erregung Wellenlänge 488 nm und Emissions-Wellenlänge 515 nm.
    2. Ein PSF für rote mitochondriale Fluoreszenzsignal (rot-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern zu berechnen:
      1. Set PSF auf konfokalen berechnet. Stellen Sie mittlere Brechungsindex auf 1.515 und numerische Apertur auf 1,25. Detektor Lochkamera auf 1 gesetzt AU. Eingestellten Erregung Laserwellenlänge 543 nm und Emissions-Wellenlänge, 617 nm.
    3. Optimieren die Nerven- und Mitochondrien fluoreszierende Signale von Dekonvolution unter Verwendung der entsprechenden PSFs oben aufgeführten und iterative Wiederherstellung Feature auf 100 % Vertrauen und einer Iteration-Grenze von 10 Zyklen festgelegt.
  3. Nerv-spezifische Oberflächen zu schaffen:
    1. Gebrauch der " DGM erstellen " Werkzeug, um eine feste Oberfläche der Nerven von den deconvolved grün-fluoreszierende sekundäre Kennzeichnung von der PGP9.5 identifiziert Nerven.
    2. Uncheck die " glatt " verfügen und absolute Intensität-Funktion verwenden, um die Schwelle für das Nervensignal gesetzt, denn es ist deutlich heller als Hintergrundfluoreszenz.
    3. Funktion zum setzen Sie den Schwellenwert für das Nervensignal, da es deutlich heller als Hintergrundfluoreszenz ist die absolute Intensität. Legen Sie Schwellenwert niedrig genug, um die Nerven genau zu identifizieren.
    4. Filter, kleinen, nicht-Nerv Oberflächen basierend auf Größe.
      Hinweis: Manuell bearbeiten Sie ggf. zusätzliche nicht-Nerv Oberflächen innerhalb der " bearbeiten " Registerkarte "halten Sie die Strg-Taste, um mehrere Objekte markieren und dann mit der Entf-Taste löschen.
  4. Isolieren Nerv-spezifische mitochondriale Fluoreszenzsignal:
    1. Wählen Sie die Registerkarte "Bearbeiten" der Nerv Oberfläche zum Anzeigen der " Maskeneigenschaften " Funktion. Die Nerv-Oberfläche in Schritten 3.3 erstellt wird verwendet, um die Mitochondrien in die Nerven weg von mitochondrialen Signale zugeordnet die Keratinozyten isolieren.
    2. Als die " Maske alle ' Taste öffnet sich ein " Maskenkanal " Fenster, wählen Sie das deconvolved rot-fluoreszierend-Signal aus dem Pull-down-Menü unter " Kanalwahl " für das mitochondriale Signal.
    3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen ein Häkchen setzen der " doppelten Kanal vor dem Auftragen der Maske " Option.
    4. Klicken Sie auf die Radio-Taste an der " konstant innen/außen " Möglichkeit, die Maskeneinstellungen und klicken Sie im Feld ein Häkchen setzen die " Voxel Außenfläche zu setzen " Option und geben Sie für den Wert 0,00. Klicken Sie auf "OK"-Taste, um den neuen Kanal erstellen, die mitochondriale Signale innerhalb der Nerv Oberfläche darstellt.
  5. Mitochondrien-spezifische Oberflächen zu schaffen:
    1. Gebrauch der " DGM erstellen " Werkzeug, um eine feste Oberfläche der Mitochondrien aus dem neu geschaffenen fluoreszierende Kanal der Nerv-spezifische mitochondriale Signale von 3.4 Schritte.
    2. Uncheck die " glatt " verfügen, und wählen Sie den " Hintergrund Subtraktion " Funktion, um den Schwellenwert festlegen. Diese Funktion nutzt lokale Kontrast um das mitochondriale Signal Mitochondrien aus Hintergrund identifizieren.
    3. Set-Schwellenwert ist niedrig genug, um die Mitochondrien genau zu identifizieren. In diesem Beispiel wurde der untere Grenzwert auf 2.000 für einen 16-Bit (65.536) Maßstab festgelegt.
    4. Filtern mitochondriale Oberflächen basierend auf Größe. In diesem Beispiel wird das Voxel-Limit auf 1,0 Voxel festgelegt wurde, ist die niedrigste möglich zu begrenzen. Bearbeiten Sie ggf. manuell nicht Mitochondrien Oberflächen innerhalb der " bearbeiten " Registerkarte "halten Sie die Strg-Taste, um mehrere Objekte auswählen und dann mit der Entf-Taste löschen.
      Hinweis: Gelegentlich wird die Software Oberflächen erstellen, die keine unterscheidbare mitochondriale Fluoreszenzsignal zugeordnet sind. In diesen Fällen ist es möglich, entfernen sie mit dem " bearbeiten " tab.
  6. Exportieren und morphometrische Werte für die Analyse berechnen:
    1. Werte für Nerven- und mitochondriale Oberflächen aus exportieren der " Statistik " Registerkarte zur weiteren Analyse mit elektronischen Tabellenkalkulations-Software.
    2. Exportieren die Volumenwerte für die Nerven und die mitochondriale Oberflächen.
    3. Die Anzahl der einzelnen Nervenfasern vorhanden in jedem Bild und notieren Sie den Wert in der elektronischen Tabellenkalkulation.
    4. Für jedes Bild die folgenden möglichen Werte für die Analyse in der elektronischen Tabellenkalkulation berechnen:
      1. Sum Volumes für alle Nerven Oberflächen.
      2. Filter, Nerven-spezifische mitochondriale Oberflächen unter einem Volumen von weniger als 0,02 µm 3 und bin Größe Oberflächen durch. Z. B. Behälter z. B. 0,02 - 0,04 0,04 - 0,08 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1.28 1.28-2,56, größer als 2,56 µm 3.
        Hinweis: Die untere Grenze der mitochondrialen Volumen wurde gegründet um 0,02 µm 3 anhand der bisher erschienenen Bände der Mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Zählen die Anzahl der Nerven-spezifische mitochondriale Flächen in jedem Lagerplatz und die Gesamtzahl der Flächen über die Lagerplätze (0,02 - mehr als 2,56 µm 3).
      4. Berechnung des Anteils der Nerv-spezifische mitochondriale Oberflächen in jedem Lagerplatz. Verwenden Sie die Anzahl die pro bin dividiert durch die Gesamtzahl der Mitochondrien Oberflächen.
      5. Summe der Volumina für alle Nerven-spezifische mitochondriale Oberflächen.
      6. Berechnet den Anteil des Nervs mit mitochondrialen Signal dividiert das total Nerv Oberfläche Volumen durch die Summe aller mitochondriale Oberfläche Volumes.
      7. Berechnen Sie die Anzahl der Mitochondrien pro Nerv Volumen dividiert das total Nerv Oberfläche Volumen durch den Grafen von allen mitochondriale Oberflächen.

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Representative Results

Visualisierung und Quantifizierung der Mitochondrien innerhalb von menschlichen IENFs

Fluoreszenz Immunohistochemistry ermöglicht die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Signalen innerhalb menschlicher Hautbiopsien, Nerven, Mitochondrien und Kerne zu visualisieren. Eine 96-Well-Platte ist eine komfortable Möglichkeit, die Schritte des Verfahrens Immunohistochemistry zu organisieren. Abbildung 1 zeigt, dass diese Konfiguration Konten für bis zu 8 Sektionen durch die 12 Stufen der Lösungen verarbeitet werden. Die frei schwebenden Methode kombiniert mit sanfter Bewegung mit einem flachen Rocker sorgt dafür, dass die Antikörper ausreichenden Zugang haben zu die Abschnitten von beiden Seiten zu durchdringen. Das Protokoll dauert 3 Tage in Anspruch, die ist im Wesentlichen auf Übernachtung Inkubationen in primäre und sekundäre Antikörper bei 4 ° C, die konsequent Nerven und Mitochondrien bezeichnen.

Der Rest der Prozedur beinhaltet Imaging, Verarbeitung und Analyse der fluoreszierenden Signale. Konfokale Mikroskopie nutzt die fluoreszierenden Signale optisch Abschnitt diskrete Signale von der Fokalebene durch den Wegfall von Out-of-Focus-Signale. Erwerb der Z-Serie über die Gewebe-Sektion bietet eine 3D-Darstellung der fluoreszierenden Signale für Nerven, Mitochondrien und Kerne. Die Parameter sind auf Bild 172 µm entlang der Länge der Epidermis optimiert, die durchschnittlich 5 Nerven enthalten würde. Abbildung 2 zeigt ein typisches 3D Bild der drei fluoreszierende Signale, die von der Epidermis gesammelt werden. Die PGP9.5 Färbung (Abb. 2 b) liefert eine reiche Signal der epidermalen und dermalen Nerven, die eine höhere Intensität als der Hintergrund Auto-Fluoreszenz des Gewebes ist. Der nuklearen Fleck (Abbildung 2) hilft, um Grenzen der Epidermis zu identifizieren, wo die Intraepidermal Nervenfasern innervieren. Es ist üblich, dass die äußere Schicht der Epidermis, eine diffuse Signal zu haben, die durch passives DNA in die Hornpfropfen sein könnten, aus denen sich das Stratum Corneum. Die Mitochondrien sind eindeutig gekennzeichnet durch die PDH Färbung (Abb. 2D), wo die Mehrheit des Signals mit Zellen in der Epidermis verbunden ist, die in erster Linie Keratinozyten sind.

Die Aufnahmeparameter beschrieben in diesem Protokoll verwenden eine 40 X Öl Immersion Ziel mit einem 1,25 numerische Apertur und einen Zoomfaktor von 2,2. Daraus resultiert eine XYZ-Bildgröße von 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm. Diese Einstellungen erfassen Sie genug von der Epidermis enthalten durchschnittlich 4-6 Nervenfasern pro Bild (Abbildung 3A). Probenahme bei höheren Auflösung verringert die Anzahl der Nerven in jedem Bild. Abbildung 3 b zeigt einen Zoomfaktor von 3,3, der Bereich XY auf 114,8 µm x 114,8 µm reduziert, was zu weniger Nerven pro Bild. Die ideale Sampling-Dichte definiert durch Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) für 40 x Öl Immersion Ziel mit einem 1,25 numerischer Apertur schlägt die XYZ-Scanauflösung von 54 nm X 54 nm X 205 nm. Dies würde erfordern einen Zoomfaktor von 6,6 Falte bei 1.024 x 1.024 Auflösung und reduzieren die XY-Ansicht auf 57,4 µm x 57,4 µm und erfassen nur durchschnittlich 1-2 Nerv pro Bild (Abbildung 3).

Die nächste Phase ist auszuführenden Bildverarbeitung, unerwünschte Bereiche des Bilds zu entfernen und die Signale zu verstärken. In diesem Protokoll werden die Dermis und Stratum Corneum entfernt, um die Analyse auf die Region der Epidermis zu konzentrieren, wo die IENFs innervieren. Dreidimensionaler Software macht es möglich zu isolieren, zu verbessern und die fluoreszierende Signale analysieren. Werkzeuge in der Software sind erforderlich, die epidermalen Nerven und Mitochondrien zu isolieren, indem Sie zuschneiden aus Regionen oberhalb und unterhalb der Epidermis (Abbildung 4A-C). Dieser Prozess wird vereinfacht, indem die Signale in eine erweiterte Ansicht ausblenden und dann tracing eine Freihand Region rund um die Epidermis. Das zugeschnittene Bild wird durch Bild Restaurierung Algorithmen weiterverarbeitet. Dekonvolution wird verwendet, um die Auflösung der Nerven und mitochondriale Signale (Abbildung 4) zu optimieren.

Die Abschlussphase ist zu erkennen und morphometrische Funktionen aus den Signalen zu extrahieren. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist es, Funktionen der Nerven-spezifische Mitochondrien messen. Bildanalyse-Software hat Funktionen, mit denen Oberflächen geschaffen für ein Signal (in diesem Fall der Nerv Oberfläche) als Maskierungswerkzeug, ein weiterer Fluoreszenzsignal (in diesem Fall Mitochondrien) innerhalb dieser Fläche zu isolieren. Der erste Schritt bei der Analyse der Nerv-spezifische Mitochondrien ist die Schaffung 3D-Oberflächen um Nerven (Abbildung 5A-B). Die Nerv-Oberflächen werden verwendet, um die Nerven-spezifischen fluoreszierenden mitochondriale Signale (Abbildung 5, 5D, 5E, 5 G) zuschneiden. Schließlich sind 3D Flächen rund um die Nerv-spezifische mitochondriale Signale volumetrische Messungen (Abb. 5F, 5H) erstellt. Tabelle 3 zeigt die morphometrische Messungen, die von der Bildanalyse-Software und zusammengefasste Daten exportiert werden. Die wichtigsten Werte exportieren werden die Volumenwerte für die Nerven und Nerven-spezifische mitochondriale Signale. Die Volumendaten aus den Mitochondrien sind Makulatur, um Frequenz Größenangaben Mitochondrien erzeugen, die dann zum Erstellen von Größe Frequenz Histogramme (Abbildung 6). Die Volumendaten werden auch verwendet, Zusammenfassung Maßnahmen für die Anzahl der Mitochondrien pro IENF Volumen und Prozentsatz der mitochondrialen Volumen innerhalb IENF Bände zu machen.

Die Daten in Tabelle 3 und Abbildung 6 zeigen, dass diese Technik ein Mittel bietet, um die Mitochondrien innerhalb von menschlichen IENFs aus Hautbiopsien zu quantifizieren. Die Nerven von diesem Muster haben Mitochondrien verteilt und die Mehrheit der Mitochondrien sind zwischen 0,02 - 0,32 µm3. Diese Größen sind in einem Bereich mit normalen Mitochondrien36,37,38,39verbunden. Kleinere Mitochondrien haben gezeigt, zu mehr bewegliche als größere Mitochondrien39 darauf hindeutet, dass die Mitochondrien in dieser Nerven mehr bewegliche sein könnte. In der Tat haben Studien verwickelt, dass größere, geschwollene Mitochondrien nicht sowie kleinere Mitochondrien transportieren und axonalen Degeneration39,40,41führen können. Daher ist die Charakterisierung der Nerv-spezifische Mitochondrien eine wertvolle Technik, die auf Studien von neurodegenerativen Erkrankungen anwendbar wären, wo Veränderungen der mitochondrialen Morphologie und Transport axonalen Degeneration zugeordnet wurden 15,25,26,27,42,43.

5 % BSA blockiert Lösung
Komponenten von 5 % BSA Lösung blockieren Benötigte Menge
Rinderserumalbumin (BSA) [Endkonzentration: 5 %] 0,625 g
1,0 % Triton x-100 (TX-100) [Endkonzentration: 0,3 %]
3,75 mL 1 X PBS ~8.125 mL Insgesamt (1 X PBS 12,5 mL Gesamtvolumen zu verwenden) 12,5 mL

Tabelle 1: 5 % BSA Lösung blockiert. Die 5 % BSA blockierende Lösung wird in frühen Stufen des Protokolls Immunohistochemistry verwendet, um unspezifische Bindung der Antikörper blockieren.

1 % BSA Spülung Lösung
Komponenten von 1 % BSA Spüllösung Benötigte Menge
Rinderserumalbumin (BSA) [Endkonzentration: 1 %] 0,125 g
1,0 % TX-100 [Endkonzentration: 0,3 %] 3,75 mL
1 X PBS ~8.125 mL
Insgesamt (1 X PBS 12,5 mL Gesamtvolumen zu verwenden) 12,5 mL

Tabelle 2: 1 % BSA Spüllösung. Die 1 % BSA Spüllösung ist in der Immunhistochemie Protokoll verwendet, um unspezifische Bindung der Antikörper zu blockieren und zum Verdünnen von primären und sekundären Antikörper verwendet.

Morphometrische Maße für IENFs und Nerven-spezifische Mitochondrien
Exportierte und zusammenfassende Daten von Bildanalyse-Software
Mt Größe Frequenz Lagerplätze Anzahl der Mt in Größe Frequenz Bin Prozentsatz der Mt in Papierkorb Gesamtzahl der Mt Mt-Band (µm3) IENF Volumen (µm3) Anzahl der Mt pro IENF Volumen (Anzahl/100 µm3) Prozentsatz der Mt Volumen in IENF Volumen Anzahl der IENFs
zwischen
.02-.04 µm3		 20 24,4 % 82 13.41 518.88 15,8 2,58 % 4
zwischen
.04-.08 µm3		 28 34,1 %
zwischen
.08.16 µm3		 14 17.1 %
zwischen
.16-.32 µm3		 12 14,6 %
zwischen
.32-.64 µm3		 4 4,9 %
zwischen
.64-1,28 µm3		 3 3,7 %
zwischen
1.28-2,56 µm3		 1 1,2 %
zwischen
2,56 + µm3		 0 0,0 %

Tabelle 3: Morphometrische Maße für IENFs und Nerven-spezifische Mitochondrien. Die Tabelle stellt morphometrische Werte, die gemessen und von Bildanalyse-Software und zusammengefasste Daten exportiert. Abkürzungen: IENF, Intraepidermal Nervenfasern; MT, Mitochondrien.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung, darstellt das Setup für eine 96-Well-Platte für Haut Biopsie Immunohistochemistry. Zeilen in der Platte sind Schritte in das Protokoll für Block, Wasch- und Inkubation Lösungen und Spalten repräsentieren einzelne Gewebeschnitte (von 1 bis 8 Sektionen pro Platte). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative 3D konfokalen Mikroskopie Bild eines Abschnitts aus einer menschlichen epidermalen Biopsie Gewebe verarbeitet für Fluoreszenz Immunohistochemistry. Unverarbeitete 3D-Projektion Bild veranschaulicht die fluoreszierenden Signale (A) zusammengeführt und Einzelsignale für (B) Nerven (Nerven, grün), (C) Kerne (Nuc, blau) und (D) Mitochondrien (Mt, rot) in der Epidermis und Lederhaut. Beachten Sie das Fehlen von Signalen in das Stratum Corneum-Schicht der Epidermis. Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Verbesserte Auflösung Bildergebnisse in weniger Nerven für die spätere Analyse. Alle Bilder werden mit einem 40 X Öl Ziel mit einem 1,25 numerischer Apertur aufgenommen und die 3D Projektionen illustrieren fluoreszierende Signale für Nerven (grün), Mitochondrien (Mt, rot) und Kerne (Nuc, blau). Eine Aufnahme mit dem Zoomfaktor von 2,2 (A) enthält mehrere Nerven innerhalb der Ansicht. Erhöhen den Zoom-Faktor 3,3 (B) oder 6,6 (C), reduziert das ideale Nyquist Sampling deutlich die Anzahl der Nerven in jedem Bild. Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Bildverarbeitung. Vertreter erweiterten (maximale Intensität Projektion) Fokusansicht eines Bildes von konfokalen Mikroskopie eines Abschnitts von Gewebe aus einem menschlichen epidermalen Biopsie. Unverarbeitete Projektionsbild illustriert (A) das zusammengeführte Leuchtstoff für Nerven (grün), Kerne (Nuc, blau) und Mitochondrien (Mt, rot) signalisiert. Die Dermis und Stratum Corneum sind, (B) mit einer Region von Inte ausgeschnittenRest (ROI) Freihand-Auswahl-Werkzeug (blau markierten Bereich, Ernte ROI) nur Signale in der Epidermis zu isolieren. (C) beschnitten Epidermis wird dann bearbeitet für (D) Dekonvolution mit berechneten Punkt Funktionen zur Verbesserung der Auflösung der Nerven (grün) zu verbreiten und Mitochondrien (Mt, rot) Signale. Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Bildanalyse. Repräsentative 3D konfokalen Mikroskopie Bild illustriert (A) das Nerv-spezifische grünes Fluoreszenzsignal. (B) eine 3D-Oberfläche (Cyan) wird für das Nervensignal erstellt. Das Nerv-spezifische mitochondriale Signal ist isoliert vom Rest der epidermalen mitochondriale Signale (C) (Mt, rot) durch (D) mit der Nerv-Oberfläche als Maskierungswerkzeug. Die daraus resultierende (E, G) Nerven-spezifische mitochondriale rote Fluoreszenzsignal zur Erstellung dient (F, H) Oberflächen (Mt Oberfläche, Magenta) um die Mitochondrien innerhalb der Nerven-Oberfläche (Cyan). G und H sind vergrößerte Ansichten der weißen Boxen in E und F. Scale bars = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Mitochondriale Größe Frequenz Histogramm. Mitochondrialsurface Daten werden dargestellt als eine Größe Frequenz Histogramm, den Prozentsatz der Mitochondrien zu visualisieren, die in jedem der verschiedenen Lagerplätze nach ihrem Volumen (µm3) vorhanden sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieses Protokoll soll zu isolieren, zu quantifizieren und zu analysieren, die Größe und Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien innerhalb von IENFs in 3D aus Menschenhaut Biopsien. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die frei schwebenden Fluoreszenz Immunohistochemistry soll beflecken und mehrere Signale in jeder Probe, die eine vielseitigere Methodik für explorative Forschung44,45analysieren. Dieses Verfahren ermöglicht für die Penetration der Antikörper in das Gewebe um den Erwerb von Bildern im gesamten Abschnitt 50 µm zu maximieren, die für den Erwerb der konfokalen Mikroskopie-Bildern und 3D Analyse notwendig ist. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Bildparameter Akquisition, die ausgeglichen sind, zwischen Erfassung genug Nerven pro Bild unter Beibehaltung Auflösung zur Messung der Mitochondrien. Die Gewebeschnitte verwendet in diesem und standard-Skin Biopsie Protokolle sind etwa 3 mm langen45,46,47,48. Die Aufnahmeparameter beschrieben in diesem Protokoll-Capture genug von der Epidermis, durchschnittlich 4-6 Nervenfasern pro Bild aufzunehmen. Probenahme bei höheren Auflösung würde reduziert die Anzahl der Nerven in jedem Bild, vor allem bei Nyquist Sampling. Ein dritter wichtiger Schritt ist Dekonvolution Algorithmen verwenden, um die Auflösung und den Kontrast der Signale, vor allem für die Mitochondrien zu verbessern. Entfaltung der Bilder dazu beigetragen, um nicht Probenahme mit höherer Auflösung zu kompensieren. Der letzte entscheidende Schritt ist es, Bildanalyse-Software verwenden, um Nerv-spezifische Mitochondrien von den Mitochondrien zugeordnete Zellen in der Epidermis zu isolieren. Dies geschieht mithilfe der Nerv-Oberfläche als Maskierungswerkzeug zum Zuschneiden mitochondriale Signal, die innerhalb des Nervs zu lokalisieren.

Es gibt einige möglichen Erweiterungen dieser Technik zu prüfen. Eine mögliche Änderung wäre die Fluoreszenz Immunohistochemistry zu verkürzen. Die Übernachtung Inkubationen in den primären und sekundären Antikörper-Lösungen bei 4 ° C konnte auf 3-4 Stunden bei Raumtemperatur verkürzt werden. Jedoch erhöhen kürzere Inkubationen bei Raumtemperatur oft Hintergrundfluoreszenz, also Vorsicht genommen werden sollte, um schlechten Signal-Rausch zu vermeiden. Eine andere mögliche Änderung wäre die Bild-Erwerb-Parameter anpassen. Wie oben erwähnt, die hier beschriebenen Bildaufnahme waren voreingenommen Erfassung einer angemessenen Anzahl von Nerven pro Bild über hohe Bildauflösung. Es ist möglich, eine höhere Vergrößerung Ziel wie ein 63 X Öl Immersion Ziel mit einem 1,3 numerischer Apertur zu verwenden. Wenn alle Parameter gleich geblieben und ein 63 X Ziel diente, das Bildfeld XY würde auf 112 µm X 112 µm reduziert werden und verringern somit die durchschnittliche Anzahl der Nerven pro Bild. Die Hauptsache ist, konsistente Parameter über den Erwerb und die anschließende Analyse zu verwenden.

Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist, dass es zeitaufwändig ist. Die Immunohistochemistry dauert 3 Tage, Gewebe zu verarbeiten, Bildaufnahme dauert ca. 30-50 min pro Bild, je nachdem, wie viele optische Z-Maßnahmen ergriffen werden und Verarbeitung/Bildanalyse dauert ca. 20 min. Dies ist eine deutliche zeitliche Engagement aber liefert wichtige morphometrische Messungen am Ende. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist der begrenzte Bereich der Epidermis pro Bild abgetastet. Allerdings wird dies zweifellos verbessern, da Fortschritte in Bild Erfassungsraten mit verbesserter Auflösung, kombiniert mit schneller Computer-Prozessoren und Analyse-Software vorgenommen werden.

Die Bedeutung dieses Protokolls gegenüber anderen Methoden liegt in der Macht der Kombination Fluoreszenz Immunohistochemistry mit konfokalen Mikroskopie und 3D-Bildanalyse. Traditionell erfolgt die Intraepidermal Nervenfaser-Analyse mit Chromogen basierte Immunohistochemistry und Hellfeld Mikroskopie, vor allem für die klinische Diagnose der Neuropathie45,47,49. Die Verwendung von Fluoreszenz Immunohistochemistry ermöglicht es zu färben und mehrere Signale in jeder Probe, die eine vielseitigere Methodik für explorative Forschung44,45zu analysieren. Diese Technik bietet eine Strategie, um ein bestimmtes Signal von Interesse, in diesem Fall Nerven-spezifische Mitochondrien, aus einem komplexen Signal Mitochondrien zugeordnete epidermalen Zellen zu isolieren.

Diese Technik macht seine Nützlichkeit in zukünftigen Anwendungen. Die Fähigkeit zu isolieren und zu messen Nerv-spezifische Mitochondrien macht es möglich, Krankheit-induzierte Veränderung in der Größe und Verteilung der Mitochondrien zu bewerten. Mehreren neurologische Komplikationen haben mitochondriale Dysfunktion als ein möglicher Mechanismus der Krankheit beteiligt. Insbesondere hat eine geänderte Version dieser Technik verwendet worden, zu zeigen, dass Patienten mit Diabetes und diabetische Neuropathie messbare Veränderungen in der Größe und Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien im Vergleich zum Alter abgestimmt haben steuert die50. Diese Technik wäre hilfreich für die Bewertung der Wirksamkeit der Therapien zu verbessern oder zu heilen sensorische Neuropathien. Schließlich macht es die Vielseitigkeit der Technik für eine Vielzahl von Analysen, die ein Fluoreszenzsignal verwenden, um eine Teilmenge von Daten aus anderen fluoreszierende Signale zu isolieren.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08 NS061039-01A2, The Program für Neurologie Forschung & Entdeckung und A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Dabei verwendet die Morphologie und die Bild-Analyse-Kern des Michigan Diabetes Research Center, finanziert durch das National Institute of Health Grant 5P 90 DK-20572 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen. Die Autoren möchte J. Robinson Singleton und A. Gordon Smith (University of Utah) danken, für ihre großzügige Spende von menschlichen Hautproben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

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References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

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Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).

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