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Neuroscience

Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/53369
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

Summary

Questo protocollo utilizza tecniche di imaging e l'analisi tridimensionali (3D) per visualizzare e quantificare i mitocondri del nervo specifico. Le tecniche sono applicabili ad altre situazioni in cui un segnale fluorescente viene utilizzato per isolare un sottoinsieme di dati da un altro segnale fluorescente.

Abstract

L'obiettivo del presente protocollo è quello di studiare i mitocondri all'interno di fibre nervose intraepidermiche. Pertanto, le tecniche di imaging e l'analisi 3D sono state sviluppate per isolare i mitocondri del nervo specifico e valutare le alterazioni indotte da malattia dei mitocondri nella parte distale dei nervi sensoriali. Il protocollo combina fluorescenza immunoistochimica, microscopia confocale e tecniche di analisi di immagine 3D per visualizzare e quantificare i mitocondri del nervo specifico. Parametri dettagliati sono definiti in tutto le procedure al fine di fornire un esempio concreto di come utilizzare queste tecniche per isolare i mitocondri del nervo specifico. Gli anticorpi sono stati utilizzati per etichettare il nervo e segnali mitocondriali all'interno di sezioni di tessuto di pelle punch biopsie, che è stata seguita dall'immunofluorescenza indiretta per visualizzare i nervi ed i mitocondri con un segnale fluorescente verde e rosso rispettivamente. Z-serie di immagini sono state acquisite con microscopia confocale e software per l'analisi 3D è stato utilizzato per elaborare e analizzare i segnali. Non è necessario seguire i parametri esatti descritti all'interno, ma è importante essere coerenti con quelle scelte durante la colorazione, la procedura di acquisizione e analisi. La forza di questo protocollo è che è applicabile a una vasta gamma di circostanze in cui viene utilizzato un segnale fluorescente per isolare altri segnali che altrimenti sarebbe impossibili studiare da soli.

Introduction

I mitocondri servono funzioni cellulari vitali che includono la produzione di energia cellulare, buffering di calcio e che regolano necrotico e apoptotica delle cellule morte1,2,3. Il sistema nervoso ha un alto tasso metabolico rispetto al corpo4 suggerendo che i neuroni generano un elevato grado di energia cellulare sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) attraverso la respirazione mitocondriale. Un sacco di documenti di prova che funzioni neuronali sono dipendente da ATP5, soprattutto presso le sinapsi6. Pertanto, la distribuzione dei mitocondri all'interno dei neuroni è importante.

Negli ultimi 10 anni che un sacco di informazioni ha dimostrato che il traffico e l'ancoraggio dei mitocondri di un neurone è altamente regolamentati. Proteine motrici sono coinvolti nella distribuzione di mitocondri a specifici compartimenti cellulari in tutto il neurone. Traffico dei mitocondri è particolarmente importante perché neuroni proiettano assoni e dendriti lontano dal soma. Proteine motrici chinesina principalmente diretto anterogrado (lontano il soma) tratta dei mitocondri lungo i microtubuli mentre dineina proteine motore diretto motilità retrograda (verso il soma)7,8,9 , 10. ci sono segnali cellulari un potenziale di membrana mitocondriale e conduzione di impulso che influenzano la presenza e la direzione di traffico mitocondriale11,12,13.

Oltre a trasportare i mitocondri, ci sono proteine specializzate per localizzare i mitocondri a specifici compartimenti cellulari che hanno richieste di alta energia, come nodi di Ranvier e sinapsi8,14, 17. In realtà, la maggior parte dei mitocondri all'interno di assoni è non motili9,13,18. Proteine specializzate come i mitocondri di ancoraggio syntaphilin i microtubuli lungo gli assoni, mentre altre proteine di ancoraggio mitocondri al actina citoscheletrica19–21. Ioni come il calcio e fattori di crescita sono stati segnalati per supportare la cessazione della circolazione di mitocondri per localizzarli in regioni dove sono necessari21,22,23.

Presi insieme, il traffico e l'attracco dei mitocondri sono vitali per il corretto funzionamento dei neuroni. A sostegno di ciò, interruzioni nel traffico mitocondriale sono stato associato con parecchi termini neurologici compreso la malattia di Alzheimer, sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth, malattia di Huntington, spastica ereditaria paraparesis e atrofia ottica15,24,25,26,27. Recenti studi hanno messo a fuoco su disfunzione mitocondriale e la patologia come un meccanismo potenziale per la neuropatia diabetica, la perdita sensitiva connessa con diabete28,29,30,31 ,32,33. L'ipotesi è che il diabete altera la distribuzione dei mitocondri all'interno delle proiezioni sensoriali del terminale nervoso cutaneo. Di conseguenza, una tecnica è stata sviluppata per visualizzare e quantificare i mitocondri all'interno le fibre nervose intraepidermiche (IENFs), la punta distale delle afferenze sensoriali del ganglio di radice dorsale. La tecnica combina fluorescenza immunoistochimica di specifici mitocondriali ed etichette di fibre nervose con microscopia confocale serie z acquisizione di segnali con software di analisi di immagine 3D potente per misurare la distribuzione del nervo specifico mitocondri da biopsie cutanee umane per raggiungere questo obiettivo.

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Protocol

biopsie di pelle sono state ottenute da soggetti che sono stati reclutati da una rete di grandi cure primarie comunitario presso l'Università dello Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Questo studio è stato approvato dalla Università del Michigan Institutional Review Board e rispettato i principi della dichiarazione di Helsinki. Scritto il consenso informato è stato ottenuto da ciascun soggetto prima del test.

1. fluorescenza immunoistochimica

  1. preparare le biopsie del punzone per intraepidermal fibre nervose immunohistochemistry:
    1. pelle di 3 mm di eseguire biopsie di medico personale e posizionare la biopsia tutta in 1.5 mL Zamboni ' soluzione fissante s (paraformaldeide al 2%, 0,3% saturato di acido picrico in tampone fosfato salino (PBS), pH 7.4) a 4 ° C durante la notte.
    2. Sciacquare i campioni con una soluzione di saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C per 16-24 h o fino a che il campione scende.
    3. Incorpora i campioni a temperatura ottimale di taglio composto (OCT) utilizzando un cryomold. Posizionare la biopsia intero 3 mm con l'epidermide rivolto verso il basso nello stampo e riempire lo stampo con circa 2 mL di ott. Freeze lo stampo su ghiaccio tritato a secco. Conservare a-80 ° C fino all'uso.
    4. Cut 50 µm spessore utilizzando un criostato sezioni trasversali e memorizzare in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti utilizzando unità di storage antigelo 180 µ l per pozzetto (glicole etilenico 30%, 30% glicerolo in PBS). Le seguenti indicazioni sono per 8 pozzetti di una piastra ben 96. Macchia sezioni da ogni sito di biopsia che sono 200-300 µm da altro.

1 ° giorno:

  1. placare il contrassegno non specifico dello strato corneo:
    1. etichetta 96 pozzetti come mostrato in Figura 1.
    2. Dispensare 150 µ l di soluzione enhancer stock segnale per ridurre il legame non specifico di anticorpi secondari 34 , 35 in ciascun pozzetto. Trasferire le sezioni nella soluzione di potenziatore di segnale utilizzando un'ansa da inoculo.
      Nota: fare attenzione mentre si lavora con il tessuto per evitare di danneggiare o strappare le sezioni di tessuto. Mantenere in soluzione di potenziatore di segnale per 30 minuti a temperatura ambiente su un piatto rocker.
    3. Preparare risciacquo pozzi nelle righe 2 e 3 della piastra 96 pozzetti aggiungendo 150 µ l di tampone fosfato salino (PBS): 1x in ciascun pozzetto.
    4. Trasferire con cautela le sezioni in riga 2 e risciacquo in 1X PBS per 10 min a temperatura ambiente.
    5. Risciacquare una seconda volta in 1X PBS per 10 min a temperatura ambiente (riga 3).
  2. Preparare 5% albumina di siero bovino (BSA) soluzione bloccante:
    1. preparare 5% soluzione contenente 5% BSA di blocco e lo 0,3% Triton X 100 (TX-100) in 0.1 M PBS (Vedi tabella 1) mentre sezioni sono incubando soluzione di potenziatore di segnale. BSA non entrare facilmente in soluzione. Soluzione di vortice fino a BSA si dissolva completamente.
    2. Preparare blocchi pozzi nella riga 4 della piastra 96 pozzetti aggiungendo 150 µ l di soluzione bloccante in ciascun pozzetto di 5% BSA.
    3. Trasferire sezioni nei singoli pozzetti di BSA 5% soluzione di blocco e incubare sezioni in 5% BSA blocco soluzione per 1-2 h a temperatura ambiente su un piatto rocker.
  3. Preparare 1% BSA risciacquo soluzione e diluizione di anticorpi primari:
    1. preparare 1% soluzione per sciacqui contenente BSA 1% e lo 0,3% TX-100 in 0.1 M PBS (Vedi tabella 2) mentre le sezioni sono incubazione in soluzione al 5% BSA blocco. BSA non entrare facilmente in soluzione. Soluzione di vortice fino a BSA si dissolva completamente.
    2. Diluire gli anticorpi primari in soluzione per sciacqui BSA 1%, mentre le sezioni sono incubando in soluzione al 5% BSA blocco.
      1. Fare 1.500 µ l di soluzione di anticorpo primario e aggiungere a ciascuna bene nella riga 5.
      2. Diluire gli anticorpi primari: utilizzare l'etichetta specifica del nervo, coniglio policlonale anti-proteina gene prodotto 9.5 (PGP 9.5) a 1:1, 000. Utilizzare l'etichetta di mitocondrio-specifica, mouse dell'anticorpo di E2/E3bp monoclonale anti-piruvato deidrogenasi (PDH) a 1: 100 in 1% BSA risciacquo soluzione.
  4. Preparare anticorpo primario:
    1. dispensare 150 µ l di anticorpo primario in ogni bene in fila 5 della piastra 96 pozzetti.
    2. Utilizzando lo strumento loop, trasferire sezioni dalla soluzione bloccante (riga 4) nella riga 5 contenente l'anticorpo primario.
    3. Avvolgere la piastra strettamente con parafilm per tenerlo da asciugare.
    4. Campioni su piatto rocker a temperatura ambiente per 1 h e poi incubare i campioni a 4 ° c su un rocker piatto durante la notte.

2 ° giorno:

  1. risciacquare campioni:
    1. preparare pozzi di risciacquo nelle righe 6, 7 e 8 della piastra 96 pozzetti aggiungendo 150 µ l di BSA 1% soluzione di risciacquo in ogni pozzetto.
    2. Trasferire sezioni in primo 1% soluzione per sciacqui BSA (riga 6) e incubare per 1 h a temperatura ambiente. Ripetere i risciacqui due volte più incubando sezioni in BSA 1% soluzione di risciacquo in righe 7 e 8 per ogni 1h a temperatura ambiente.
  2. Diluire anticorpi secondari in BSA 1% soluzione di risciacquo:
    1. fare 1.500 µ l di soluzione di anticorpo secondario mentre sezioni sono incubando nell'ultimo risciacquo di BSA 1% risciacquo soluzione (riga 8).
    2. Diluire anticorpi secondari: per PGP 9.5 (anticorpo anti-coniglio di capra coniugata con verde fluorescente, 1: 1000), per PDH (rosso-fluorescente coniugati capra anti-topo, 1:1, 000) in 1% BSA risciacquo soluzione.
  3. Preparare anticorpo secondario:
    1. dispensare 150 µ l di anticorpo secondario nella riga 9 della piastra a 96 pozzetti.
    2. Trasferire delicatamente le sezioni da 1% BSA risciacquo soluzione (riga 8) nei pozzetti di anticorpo secondario (riga 9).
    3. Using parafilm, avvolgere la piastra strettamente per tenerlo da asciugare. Coprire con carta stagnola. Posizionare il campione sul piatto rocker a temperatura ambiente per 1 h e poi incubare i campioni a 4 ˚ c su un rocker piatto durante la notte.

giorno 3:

  1. preparare pulire 1X PBS filtrando attraverso un filtro da 0,22 µm:
    1. dispensare 150 µ l di filtrato 1X PBS nella riga 10, 11 e 12.
    2. Trasferire campioni per riga 10 e risciacquare in 1X PBS per 1 h a temperatura ambiente. Coprire la piastra a 96 pozzetti con carta stagnola e mettere su un piatto rocker durante il risciacquo. Ripetere filtrata 1x risciacquo PBS due volte di più per 1 h a temperatura ambiente in righe 11 e 12.
  2. Preparare vetrini da microscopio per il montaggio di sezioni di tessuto:
    1. mettere 50 µ l di filtrato 1X PBS su una diapositiva.
      2. Goccia di
    2. sezione trasferimento da 1X PBS (riga 12) nella 50 µ l. Posizionare con attenzione la sezione nella goccia di PBS da svolgersi il tessuto e delicatamente l'appiattimento su lastra di vetro. Rimuovere l'eccesso di PBS con una pipetta di vetro per evitare di diluire il reagente di montaggio. Non toccare le sezioni con il bulbo di vetro.
    3. Pipetta da 1 - 2 gocce di reagente di montaggio contenente DAPI direttamente sopra la sezione sul microscopio diapositiva utilizzando cura per non disturbare l'orientamento della sezione. Posizionare delicatamente 50 mm x 24 mm #1.5 microscopio vetrino coprioggetti sopra la sezione.
    4. Cancellare eventuali bolle d'aria che formano pur ponendo il vetrino coprioggetto e asciugare il liquido in eccesso fuori dai bordi del coprivetrino. Preparare una nuova diapositiva e ripetere il montaggio process per ogni sezione.
    5. Cura/a secco il supporto di montaggio inserendo le diapositive nel buia durante la notte a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini a 4 ° C per a breve termine (1-2 settimane) o a-20 ° C per la conservazione a lungo termine (superiore a 2 settimane).
      Nota: Controlli negativi omessi gli anticorpi primari per PGP 9.5 o PDH nel passaggio 1.4.2.2 e non visualizzata alcuna etichettatura distinguibili dei nervi o mitocondri nell'epidermide. Positivi i controlli sono stati effettuati per il PDH anticorpo per dimostrarlo etichette tutti i mitocondri (dati non mostrati). Controlli positivi sono stati effettuati su neuroni del ganglio di radice dorsale coltivati primari del topo che erano trasdotte con un baculovirus ai mitocondri di etichetta con un segnale di proteina fluorescente verde (GFP) e quindi fissi e macchiati con l'anticorpo PDH e rosso fluorescente anticorpo secondario. Tutti i mitocondri che esprimevano GFP sono stati co-etichettati con l'etichetta rossa per PDH immunohistochemistry (dati non mostrati).

2. Formazione immagine confocal

  1. eseguire imaging confocale:
    1. raccolta immagini utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo a immersione in olio (apertura numerica 1.25 (N.A.)) su un microscopio invertito a 40x di scansione laser.
      1. a ogni piano focale in sequenza di acquisire il segnale fluorescente:
        Nuclei: eccitazione λ = 405 nm, emissione spettrale filtro λ = 420-480 nm
        fibre nervose: eccitazione λ = 488 nm, emissione spettrale filtro λ = 505-560 nm
        Mitoch moda: eccitazione λ = 543 nm, emissione spettrale filtro λ = 606-670 nm
    2. inserire i seguenti parametri di scansione nel software microscopio: velocità di scansione di 600 Hz con 2 averaging frame e zoom di 2,2; risoluzione di intensità 12 bit (4096 grigio livelli).
      1. Impostare il software di microscopio per ottimizzato risoluzione laterale (risoluzione di scansione = 1.024 x 1.024) e ottici ad alta risoluzione assiali di sezionamento (confocale apertura = 1 unità arioso (AU) con dimensioni di z-passaggio di 210 nm).
        Nota: La risoluzione XYZ risultante è 172,2 nm x 172,2 nm, x 210 nm con una dimensione di immagine di 176,1 µm x 176,1 µm x 30-50 µm.
    3. Attivare una scansione diretta per il segnale del nervo (verde-fluorescenza) e regolare il controllo di z-messa a fuoco per trovare e impostare la parte superiore e inferiore piani focali nel software microscopio che comprendono il segnale del nervo all'interno della sezione di tessuto. La z-gamma totale è in genere 30-50 µm per una sezione di tessuto 50 µm.
    4. Ruotare il campo di scansione con il software di microscopio durante una scansione diretta in modo che l'epidermide è posizionato orizzontalmente o verticalmente nell'immagine.
    5. Scansione ogni segnale separatamente e regolare il rivelatore (tubo di fotomoltiplicatore, PMT) tensione e offset per ridurre al minimo o rimuovere qualsiasi sopra e sotto pixel saturo.
      Nota: I tempi di scansione con i parametri sopra prendono circa 20-40 min a seconda del numero di fette z.

3. 3D di visualizzazione e analisi dei mitocondri all'interno umano Intraepidermal fibre nervose

  1. isolare l'epidermide 3D:
    1. duplicare l'immagine originale e utilizzare la massima intensità proiezione (vista di messa a fuoco estesa) dell'immagine per identificare e isolare l'epidermide.
    2. Utilizzare una regione di strumento di interesse per traccia lungo i bordi superiori e inferiori dell'epidermide per rimuovere aree indesiderate come il corneum dello strato e il derma che sono assenti di fibre nervose intraepidermiche. Ritaglia questo.
  2. Deconvoluzione uso sul nervo e segnali fluorescenti mitocondriali:
    Nota: deconvoluzione aiuta a ripristinare l'integrità dei segnali fluorescenti. Il restauro utilizzato in questo protocollo viene chiamato deconvoluzione cieco perché utilizza i segnali fluorescenti nelle immagini per determinare quanto i segnali diffuso dalla loro fonte originale (funzione di diffusione di punto). Il processo migliora la risoluzione del segnale riassegnando il segnale diffuso torna alla sua posizione di origine.
    1. Calcola un punto sparsa di funzione (PSF) per il segnale del nervo fluorescente verde (verde-fluorescenza) con i seguenti parametri:
      1. impostare PSF calcolato confocale. Impostare l'indice di rifrazione medio alla apertura 1.515 e numerica a 1.25. Impostare foro stenopeico detector 1 unità arioso (A.U.). Lunghezza d'onda di eccitazione laser set a 488 nm ed emissione lunghezza d'onda a 515 nm.
    2. Calcolare un PSF per il segnale mitocondriale fluorescente rosso (rosso-fluorescenza) con i seguenti parametri:
      1. Set calcolati PSF a confocale. Impostare l'indice di rifrazione medio alla apertura 1.515 e numerica a 1.25. Impostato su 1 foro stenopeico detector AU. Lunghezza d'onda di eccitazione laser set a 543 nm ed emissione lunghezza d'onda a 617 nm.
    3. Ottimizza i segnali fluorescenti del nervo ed i mitocondri di deconvoluzione utilizzando il PSFs corrispondente elencati sopra e funzione iterativa ripristino impostato al 100% di fiducia e un limite di iterazione di 10 cicli.
  3. Creare superfici specifiche del nervo:
    1. uso il " creare superficie " strumento per rendere una superficie solida dei nervi da Quantificaizone verde-fluorescente secondaria etichettatura del PGP 9.5 identificato nervi.
    2. Deselezionare la " liscia " dispongono e utilizzare la funzionalità di intensità assoluta per impostare la soglia per il segnale del nervo dal momento che è significativamente più luminosa di fluorescenza di fondo.
    3. Utilizzare la funzionalità di intensità assoluta per impostare la soglia per il segnale del nervo dal momento che è significativamente più luminosa di fluorescenza di fondo. Impostare il valore di soglia abbastanza basso per identificare con precisione i nervi.
    4. Filtro su superfici piccole, non-nervo basato su dimensione.
      Nota: Se necessario, modificare manualmente ulteriori superfici non-nervo all'interno del " modifica " scheda tenendo premuto il tasto CTRL per selezionare più oggetti e quindi eliminarli con il tasto CANC.
  4. Isolate del nervo specifico segnale mitocondriale fluorescente:
    1. selezionare la scheda modifica della superficie del nervo per visualizzare il " maschera proprietà " caratteristica. La superficie del nervo creata nei passaggi da 3.3 viene utilizzata per isolare i mitocondri all'interno di quei nervi lontano da segnali mitocondriali associati con i keratinocytes.
    2. Come la " maschera tutti ' pulsante apre un " canale maschera " finestra, scegliere l'elenco a discesa sotto il segnale rosso fluorescente Quantificaizone " selezione del canale " per il segnale mitocondriale.
    3. Fare clic nella casella per mettere un segno di spunta " canale duplicato prima di applicare la maschera " opzione.
    4. Clic sulla radio pulsante di fronte il " costante all'interno/esterno " opzione delle impostazioni della maschera e fare clic nella casella per mettere un segno di spunta " impostare voxel fuori superficie per " opzione e digitare 0.00 per il valore. Pulsante fare clic su OK per creare il nuovo canale che rappresenta mitocondriali segnali all'interno della superficie del nervo.
  5. Creare superfici mitocondrio-specifica:
    1. uso il " creare superficie " strumento per rendere una superficie solida dei mitocondri dal canale appena creato fluorescente dei segnali del nervo specifico mitocondriali da passi 3.4.
    2. Deselezionare la " liscia " dispongono e selezionare il " sfondo sottrazione " funzione per impostare la soglia. Questa funzionalità utilizza il contrasto locale intorno il segnale mitocondriale per identificare i mitocondri da background.
      3. Valore di soglia
    3. set abbastanza basso per identificare con precisione i mitocondri. In questo esempio la soglia inferiore è stata fissata a 2.000 per una scala di 16 bit (65.536).
    4. Mitocondriale superficie basati sulla dimensione del filtro. In questo esempio che il limite di voxel era impostato su 1,0 voxel, che è il più basso limitare possibili. Se necessario, modificare manualmente su superfici non-mitocondri all'interno del " modifica " scheda tenendo premuto il tasto CTRL per selezionare più oggetti e quindi eliminarli con il tasto CANC.
      Nota: In alcuni casi, il software verrà create le superfici che non sono associate con un segnale mitocondriale fluorescente distinguibile. In questi casi, è possibile rimuoverli con il " modifica " Tab.
  6. Esportare e calcolare i valori morfometrici per analisi:
    1. esportare i valori per il nervo e superfici mitocondriale dalla " Statistiche " scheda per ulteriori analisi con software del foglio elettronico.
    2. Esportare i valori di volume per il nervo e superfici mitocondriale.
    3. Contare il numero di singole fibre nervose presenti in ogni immagine e registrare il valore del foglio di calcolo elettronico.
    4. Per ogni immagine, calcolare i seguenti valori potenziali per l'analisi del foglio di calcolo elettronico:
      1. sommare i volumi per tutte le superfici del nervo.
      2. Filtro nervose specifiche superfici mitocondriale sotto un volume di meno di 0,02 µm 3 e bin le superfici di dimensioni. Ad esempio, utilizzare bidoni come 0,02 - 0,04, 0.04 - 0.08, 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0.32 - 0.64, 0.64 - 1,28, 1.28-2.56, maggiore di 2,56 µm 3.
        Nota: Il limite inferiore del volume mitocondriale è stato impostato su 0,02 µm 3 basato su volumi precedentemente pubblicati di mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Contare il numero di superfici mitocondriale del nervo specifico all'interno di ciascuna collocazione e il numero totale delle superfici sopra i bidoni (0.02 - maggiore di 2,56 µm 3).
      4. Calcolare la proporzione di nervo specifiche superfici mitocondriale in ciascuna collocazione. Utilizzare il conteggio a bin diviso per il numero totale delle superfici di mitocondri.
      5. Sum i volumi per tutte le specifiche del nervo mitocondriale superfici.
      6. Calcolare la proporzione del nervo con segnale mitocondriale dividendo il volume di superficie totale del nervo dalla somma di tutti i volumi di superficie mitocondriale.
      7. Calcolare il numero di mitocondri per volume di nervo dividendo il volume di superficie totale del nervo per il conteggio di tutte le superfici mitocondriale.

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Representative Results

Visualizzazione e quantificazione dei mitocondri all'interno di IENFs umano

Fluorescenza immunoistochimica permette l'etichettatura simultanea di molteplici segnali entro le biopsie della pelle umana per visualizzare i nervi, i mitocondri e nuclei. Una piastra a 96 pozzetti è un modo pratico per organizzare i passaggi della procedura di esame immuno-istochimico. La figura 1 Mostra che questo account di configurazione per fino a 8 sezioni per essere elaborati attraverso le 12 tappe delle soluzioni. Il metodo Free-Floating combinato con agitazione delicata con un rocker piatto garantisce che gli anticorpi hanno accesso sufficiente per penetrare le sezioni da entrambi i lati. Il protocollo prende 3 giorni per completare, che è in gran parte dovuto le incubazioni overnight in anticorpi primari e secondari a 4 ° C, che un'etichetta coerente per i nervi e i mitocondri.

Il resto della procedura incorpora imaging, elaborazione e analisi dei segnali fluorescenti. Microscopia confocale sfrutta i segnali fluorescenti otticamente sezione segnali discreti dal piano focale, eliminando i segnali di out-of-focus. Acquisizione di z-serie attraverso la sezione di tessuto fornisce una rappresentazione 3D dei segnali fluorescenti per i nervi, i mitocondri e nuclei. I parametri sono ottimizzati per immagine µm 172 lungo la lunghezza dell'epidermide che includerebbe una media di 5 nervi. La figura 2 illustra una tipica immagine 3D dei tre segnali fluorescenti che vengono raccolti dall'epidermide. Il PGP 9.5 macchiatura (Figura 2B) fornisce un segnale ricco dei nervi epidermici e dermici che è di un'intensità più elevata rispetto alla auto-fluorescenza di fondo del tessuto. La macchia nucleare (Figura 2) consente di identificare i confini dell'epidermide dove innervano le fibre nervose intraepidermiche. È comune per lo strato esterno dell'epidermide di avere un segnale diffuso che potrebbe essere causa del DNA residuo in corneociti che compongono lo strato corneo. I mitocondri sono chiaramente etichettati da PDH macchiatura (Figura 2D) dove la maggior parte del segnale è associata con cellule nell'epidermide che sono principalmente keratinocytes.

I parametri di acquisizione descritti nel presente protocollo utilizzano un obiettivo a immersione in olio a 40x con un'apertura numerica di 1.25 e un fattore di zoom di 2.2. In questo modo una dimensione di immagine XYZ di 176,1 µm x 176,1 µm x 30-50 µm. Queste impostazioni catturano abbastanza dell'epidermide per includere una media di 4-6 fibre nervose per immagine (Figura 3A). Campionamento a risoluzione superiore ridurrebbe il numero di nervi in ogni immagine. Figura 3B Mostra un fattore di zoom pari a 3,3, che riduce l'area XY a 114,8 µm x 114,8 µm, con conseguente meno nervi per immagine. La densità di campionamento ideale come definito da Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) per un obiettivo a immersione in olio con un'apertura numerica di 1.25 a 40x suggerisce una risoluzione di scansione XYZ di 54 nm, x 54 nm, x 205 nm. Questo richiederebbe un fattore di zoom di 6,6 volte alla risoluzione di 1.024 x 1.024 e ridurre la visualizzazione XY a 57,4 µm x 57,4 µm e acquisire solo una media di 1-2 del nervo per immagine (Figura 3).

La fase successiva consiste nell'eseguire elaborazione di immagini per rimuovere aree indesiderate dell'immagine e per migliorare la segnali. In questo protocollo il derma e strato corneo vengono rimossi al fine di concentrare l'analisi sulla regione dell'epidermide dove innervano la IENFs. Software tridimensionale permette di isolare, migliorare e analizzare i segnali fluorescenti. Strumenti all'interno del software sono necessari per isolare il nervo epidermica e mitocondri ritagliando fuori regioni sopra e sotto l'epidermide (fig. 4A-C). Questo processo viene semplificato dal crollando i segnali in una visualizzazione estesa e quindi tracciare una regione a mano libera intorno l'epidermide. L'immagine ritagliata viene ulteriormente elaborato da algoritmi di ripristino immagine. Deconvoluzione viene utilizzato per ottimizzare la risoluzione dei nervi e segnali mitocondriali (Figura 4).

La fase finale è quello di rilevare ed estrarre caratteristiche morfometriche dai segnali. Un aspetto importante di questo protocollo è quello di misurare la funzionalità dei mitocondri del nervo specifico. Software di analisi di immagine ha caratteristiche che utilizzano le superfici create per un segnale (in questo caso la superficie del nervo) come uno strumento di mascheratura per isolare un altro segnale fluorescente (in questo caso i mitocondri) all'interno di tale superficie. Il primo passo nell'analisi dei mitocondri del nervo specifico è quello di creare superfici 3D intorno ai nervi (Figura 5A-B). Le superfici del nervo sono poi usate per ritagliare i segnali mitocondriali fluorescenti del nervo specifico (Figura 5, 5D, 5E, 5g). Infine, superfici 3D vengono create intorno ai segnali mitocondriali del nervo specifico per ottenere misurazioni volumetriche (Figura 5F, 5H). La tabella 3 Mostra le misure morfometriche che vengono esportate dal software di analisi di immagine e dati di riepilogo. I valori principali di esportazione sono i valori di volume per il nervo ed il nervo specifici segnali mitocondriali. I dati del volume dai mitocondri sono cestinati per generare dati di frequenza dimensioni di mitocondri, che viene quindi utilizzati per creare istogrammi di frequenza dimensioni (Figura 6). I dati del volume sono utilizzati anche per fare misure sommarie per numero dei mitocondri per volume di IENF e la percentuale del volume mitocondriale all'interno di volumi IENF.

I dati presentati in tabella 3 e Figura 6 dimostrano che questa tecnica fornisce un mezzo per quantificare i mitocondri all'interno di IENFs umana da biopsie cutanee. I nervi da questo campione hanno mitocondri distribuiti in tutto e la maggior parte dei mitocondri è compresi tra 0,02 - 0,32 µm3. Queste misure sono in una gamma associati con i mitocondri normali36,37,38,39. I mitocondri più piccoli hanno dimostrati di essere più mobili rispetto più grandi mitocondri39 , suggerendo che i mitocondri in questi nervi potrebbero essere più mobili. Infatti, gli studi hanno implicato che i mitocondri più grandi, gonfiati, non trasportano così come mitocondri più piccoli e possono portare alla degenerazione assonale39,40,41. Di conseguenza, caratterizzazione dei mitocondri specifici del nervo è una tecnica importante che sarebbe applicabile agli studi delle malattie neurodegenerative dove cambiamenti nella morfologia mitocondriale e trasporto sono state associate con degenerazione assonale 15,25,26,27,42,43.

Soluzione al 5% BSA blocco
Componenti di BSA 5% soluzione di blocco Quantità necessaria
Albumina di siero bovino (BSA) [concentrazione finale: 5%] 0,625 g
1,0% Triton X-100 (TX-100) [concentrazione finale: 0,3%]
3,75 mL 1x PBS ~8.125 mL Totale (utilizzare 1X PBS per portare il volume totale a 12,5 mL) 12,5 mL

Tabella 1: 5% BSA soluzione bloccante. La soluzione al 5% BSA blocco viene utilizzata nelle prime fasi del protocollo immunohistochemistry per bloccare il legame non specifico degli anticorpi.

Soluzione di risciacquo BSA 1%
Componenti di BSA 1% soluzione di risciacquo Quantità necessaria
Albumina di siero bovino (BSA) [concentrazione finale: 1%] 0,125 g
1,0% TX-100 [concentrazione finale: 0,3%] 3,75 mL
1x PBS ~8.125 mL
Totale (utilizzare 1X PBS per portare il volume totale a 12,5 mL) 12,5 mL

Tabella 2: BSA 1% soluzione di risciacquo. La BSA 1% soluzione di risciacquo viene utilizzata nel protocollo di immunohistochemistry per bloccare il legame non specifico degli anticorpi e per diluire anticorpi primari e secondari.

Misure morfometriche per IENFs e nervo specifico mitocondri
Esportato e Riepilogo dati dal Software di analisi di immagine
Dimensioni mt frequenza bidoni Numero di Mt in dimensioni frequenza Bin Percentuale di Mt in Bin Numero totale di Mt Volume di mt (µm3) IENF Volume (µm3) Numero di Mt per IENF di Volume (numero/100 µm3) Percentuale del Volume di Mt in IENF Volume Numero di IENFs
tra
,02-.04 µm3		 20 24,4% 82 13,41 518.88 15,8 2,58% 4
tra
.04-.08 µm3		 28 34,1%
tra
.08-.16 µm3		 14 17,1%
tra
.16-,32 µm3		 12 14,6%
tra
,32-.64 µm3		 4 4,9%
tra
.64-1.28 µm3		 3 3,7%
tra
1.28-2,56 µm3		 1 1.2%
tra
2,56 + µm3		 0 0.0%

Tabella 3: Le misure morfometriche per IENFs e nervo specifico mitocondri. La tabella rappresenta i valori morfometrici sono misurati ed esportati dal software di analisi di immagini e dati di riepilogo. Abbreviazioni: IENF, intraepidermal fibre nervose; Mt, mitocondri.

Figure 1
Figura 1 : Diagramma schematico che rappresenta l'installazione per una piastra a 96 pozzetti per immunoistochimica di biopsia della pelle. Righe nella piastra rappresentano passaggi nel protocollo per le soluzioni di blocco, lavare e incubazione e colonne rappresentano sezioni di tessuto individuali (da 1 a 8 sezioni per piastra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : 3D rappresentante microscopia confocale immagine di una sezione di tessuto da una biopsia epidermica umana elaborata per fluorescenza Immunohistochemistry. Proiezione 3D non trasformati immagine illustra i singoli segnali per (B) i nervi (nervo, verde), (C) i nuclei (Nuc, blu) e (D) i mitocondri (Mt, rosso) nell'epidermide e segnali fluorescenti (A) fuse e derma. Si noti la mancanza di segnali nello strato corneo dell'epidermide. Scala bar = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Risultati di immagini ad alta risoluzione in un minor numero di nervi è migliorato per la successiva analisi. Tutte le immagini sono catturate con un obiettivo di olio X 40 con un'apertura numerica di 1.25 e illustrano le proiezioni 3D segnali fluorescenti per nervi (verde), mitocondri (Mt, rosso) ed i nuclei (Nuc, blu). Un'immagine scattata a un fattore di zoom di 2,2 (A) contiene parecchi nervi all'interno della visualizzazione. Aumentando il fattore di zoom a 3,3 (B) o 6,6 (C), il campionamento di Nyquist ideale, riduce significativamente il numero dei nervi all'interno di ogni immagine. Scala bar = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Elaborazione immagini. Rappresentante estesa vista di messa a fuoco (proiezione massima intensità) di un'immagine da microscopia confocal di una sezione di tessuto da una biopsia epidermica umana. Proiezione non trasformati immagine illustra (A) il fluorescente Unito segnali per nervi (verdi), nuclei (Nuc, blu) e mitocondri (Mt, rosso). Il derma e il corneum dello strato sono (B) tagliate fuori con una regione di intestrumento di selezione a mano libera di resto (ROI) (blu area evidenziata, ritagliare ROI) isolando solo segnali nell'epidermide. L'epidermide (C) ritagliata viene quindi elaborata per diffusa deconvoluzione (D) con punto calcolato funzioni per migliorare la risoluzione dei nervi (verde) e mitocondriale (Mt, rosso) segnali. Scala bar = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Analisi dell'immagine. Rappresentante di microscopia confocale 3D immagine illustra (A) il segnale fluorescente verde del nervo specifico. (B) viene creata una superficie 3D (ciano) per il segnale del nervo. Il segnale mitocondriale del nervo specifico è isolato dal resto dei segnali mitocondriali epidermici (C) (Mt, rosso) di (D) usando la superficie del nervo come uno strumento di mascheratura. La risultante (E, G) segnale fluorescente rosso mitocondriale del nervo specifico viene utilizzato per creare (F, H) superfici (Mt superficie, magenta) intorno i mitocondri all'interno della superficie del nervo (ciano). G e H sono viste ingrandite delle caselle bianche in E e F. scala bar = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Istogramma di frequenza dimensioni mitocondriale. Mitochondrialsurface i dati sono presentati come un istogramma di frequenza dimensioni per visualizzare la percentuale di mitocondri che sono presenti in ciascuno dei vari contenitori secondo il loro volume (µm3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo è progettato per isolare, quantificare e analizzare la dimensione e la distribuzione dei mitocondri nervose specifiche all'interno di IENFs in 3D da biopsie di pelle umana. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Immunohistochemistry digalleggiante fluorescenza è stato progettato per macchiare ed analizzare i segnali multipli in ogni campione, offrendo una metodologia più versatile per ricerca esplorativa44,45. Questa procedura consente per la penetrazione degli anticorpi nel tessuto al fine di massimizzare l'acquisizione di immagini in tutta la sezione 50 µm, che è necessario per l'acquisizione di immagini di microscopia confocale e analisi 3D. Un altro punto critico è i parametri di acquisizione di immagine che vengono bilanciati tra catturare abbastanza nervi per immagine pur mantenendo risoluzione per misurare i mitocondri. Le sezioni di tessuto utilizzati in questo e protocolli di biopsia della pelle standard sono circa 3mm lunga45,46,47,48. I parametri di acquisizione descritta in questa cattura di protocollo abbastanza dell'epidermide per includere una media di 4-6 fibre nervose per immagine. Campionamento a risoluzione superiore ridurrebbe significativamente il numero dei nervi in ogni immagine, soprattutto al momento del campionamento di Nyquist. Un terzo passo fondamentale è quello di utilizzare gli algoritmi di deconvoluzione per migliorare la risoluzione e il contrasto dei segnali, soprattutto per i mitocondri. Deconvoluzione delle immagini ha contribuito a compensare non campionamento a risoluzione superiore. L'ultimo passaggio critico è quello di utilizzare software di analisi di immagine per isolare specifiche del nervo mitocondri dai mitocondri associati con le cellule nell'epidermide. Questa operazione viene eseguita utilizzando la superficie del nervo come uno strumento di mascheratura per ritagliare segnale mitocondriale che localizzare all'interno del nervo.

Ci sono alcuni potenziali modifiche di questa tecnica da considerare. Una eventuale modifica sarebbe quello di ridurre la durata della fluorescenza immunohistochemistry. Le incubazioni pernottamento nelle soluzioni dell'anticorpo primario e secondario a 4 ° C potrebbero essere ridotto a 3-4 ore a temperatura ambiente. Tuttavia, più breve incubazione a temperatura ambiente aumentano spesso fluorescenza di fondo, quindi prestare attenzione per evitare di scarso segnale al rumore. Un'altra modifica possibile sarebbe quella di regolare i parametri di acquisizione immagine. Come accennato in precedenza, l'acquisizione dell'immagine descritta qui erano polarizzato verso l'acquisizione di un numero ragionevole di nervi per immagine sopra immagini ad alta risoluzione. È possibile utilizzare un obiettivo di ingrandimento più alto, come un obiettivo a immersione in olio 63 x con un'apertura numerica 1,3. Se tutti i parametri è rimasto lo stesso e un obiettivo X 63 è stata usata, il campo di immagine XY sarebbe ridotto a 112 µm x 112 µm e pertanto ridurre il numero medio dei nervi per immagine. Il punto principale è utilizzare i parametri coerenti in tutta l'acquisizione e l'analisi successiva.

La limitazione principale di questa tecnica è che è molto tempo. Immunohistochemistry prende 3 giorni per la lavorazione del tessuto, acquisizione immagine dura circa 30-50 min per ogni immagine a seconda di quanti ottico z-misure e immagine elaborazione/analisi dura circa 20 min. Questo è un impegno di tempo significativo, ma produce le misure morfometriche importante alla fine. Un'altra limitazione di questa tecnica è l'area limitata dell'epidermide campionate per immagine. Tuttavia, questo migliorerà indubbiamente come progressi nei tassi di acquisizione immagine con risoluzione migliorata combinata con processori più veloci di computer e software di analisi.

Il significato di questo protocollo rispetto ad altri metodi è nel potere di combinazione della fluorescenza immunoistochimica con microscopia confocale e analisi d'immagine 3D. Tradizionalmente, intraepidermal fibre nervose analisi sono fatta con cromogeno basato immunoistochimica e microscopia in campo chiaro, soprattutto per la diagnosi clinica di neuropatia45,47,49. L'uso di immunohistochemistry fluorescenza rende possibile macchiare ed analizzare i segnali multipli in ogni campione, offrendo una metodologia più versatile per ricerca esplorativa44,45. Questa tecnica fornisce una strategia per isolare un particolare segnale di interesse, in questo caso specifico del nervo mitocondri, da un segnale complesso, mitocondri associati a cellule epidermiche.

La potenza di questa tecnica è la sua utilità in future applicazioni. La capacità di isolare e misurare i mitocondri del nervo specifico rende possibile valutare alterazione indotta da malattia nella dimensione e nella distribuzione dei mitocondri. Complicazioni neurologiche multiple hanno implicato la disfunzione mitocondriale come meccanismo potenziale della malattia. In particolare, una versione modificata di questa tecnica è stata utilizzata per dimostrare che i pazienti con diabete e neuropatia periferica diabetica hanno cambiamenti misurabili nella dimensione e nella distribuzione dei mitocondri del nervo specifico rispetto ai pari età controlla50. Questa tecnica sarebbe utile per valutare l'efficacia di terapie volte a migliorare o curare neuropathies sensoriali. Infine, la versatilità della tecnica rende applicabile ad una vasta gamma di analisi che utilizzano un segnale fluorescente per isolare un sottoinsieme di dati da altri segnali fluorescenti.

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Disclosures

Senza conflitti di interesse di dichiarare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da NS061039 di istituti nazionali di salute sovvenzioni K08-01A2, il programma per la ricerca di neurologia & scoperta e r. Alfred Taubman Medical Research Institute presso l'Università del Michigan. Questo lavoro utilizzato la morfologia e il nucleo di analisi di immagine del Michigan diabete Research Center, finanziato da istituti nazionali di salute Grant 5P 90 DK-20572 dall'Istituto nazionale di diabete e digestivo e malattie renali. Gli autori vorrei ringraziare J. Robinson Singleton e r. Gordon Smith (Università dello Utah) per la loro generosa donazione di campioni di pelle umana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

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References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

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Neurobiologia problema 127 mitocondri fibre nervose intraepidermiche la biopsia della pelle umana formazione immagine tridimensionale e analisi neuropatia delle piccole fibre
Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal
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Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, … More

Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).

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