Summary
이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표 intraepidermal 신경 섬유 내에서 미토 콘 드리 아 연구입니다. 따라서, 3D 이미징 및 분석 기술은 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하 여 평가 하는 감각 신경의 말 초에 있는 미토 콘 드리 아의 질병 유발 변경 개발 되었다. 프로토콜 형광 immunohistochemistry, confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 분석 기법을 결합 합니다. 상세한 매개 변수는 이러한 기술을 사용 하 여 신경 특정 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 구체적인 예를 제공 하기 위해 절차를 통해 정의 됩니다. 항 체 신경 라벨을 사용 했다 하 고 피부의 조직 섹션에서 미토 콘 드리 아 신호 펀치 생 검는 각각 신경 및 미토 콘 드리 아 녹색과 적색 형광 신호를 시각화 하는 간접 면역 형광에 의해 그 뒤를 이었다. 부터 Z-시리즈 이미지 confocal 현미경 검사 법으로 인수 했다 고 3D 분석 소프트웨어 처리 하 고 신호를 분석 하는 데 사용 되었다. 그것은 정확한 매개 변수, 설명에 따라 필요가 없습니다 하지만 얼룩, 수집 및 분석 단계를 통해 선택 하는 것 들과 일치 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜의 힘 그것은 다양 한 상황에 적용 한 형광 신호를 사용 하 여 그렇지 않으면 불가능 한 것을 혼자 공부 하는 다른 신호를 분리 하는 곳입니다.
Introduction
미토 콘 드리 아 세포 에너지, 칼슘, 그리고 괴 규제, apoptotic 세포 죽음1,2,3버퍼링 생산을 포함 하는 중요 한 세포 기능을 제공 합니다. 신 경계는 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 뉴런 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 형태로 세포 에너지의 높은 수준의 생성 제안 몸4 에 비해 높은 신진 대사 속도 있다. 많은 신경 기능 ATP5,6시 냅 스 특히 의존 하는 증거 문서. 따라서, 신경 세포 내 미토 콘 드리 아의 유통이 중요 합니다.
정보를 많이 보여주었다는 인신 매매와 신경 미토 콘 드리 아의 도킹 지난 10 년 동안은 매우 통제. 모터 단백질 신경 통해 특정 세포 구획을 미토 콘 드리 아를 배포에서 포함 된다. 뉴런 프로젝트 축 삭과 dendrites soma에서 멀리 떨어져 있기 때문에 미토 콘 드리 아의 인신 매매 하는 것이 특히 중요 합니다. Kinesin 모터 단백질 주로 직접 (소마)에서 참가자 다 모터 단백질 직접 (소마) 쪽으로 역행 운동7,,89 동안 microtubules 따라 미토 콘 드리 아의 매매 , 10. 같은 미토 콘 드리 아 막 잠재력과 존재와 미토 콘 드리 아 밀매11,,1213의 방향에 영향을 주는 충 동 전도 셀룰러 신호가 있다.
미토 콘 드리 아, 수송 이외에 미토 콘 드리 아 노드의 Ranvier, 시 냅 스8,14, 등의 높은 에너지 요구를 있는 특정 세포 구획을 지역화 하려면 특수 단백질 17. 사실, 축 삭 내의 미토 콘 드리 아의 대다수는 비 운동9,13,18. Syntaphilin 앵커 걸 골격19-21을 다른 단백질 앵커 미토 콘 드리 아 동안 축 삭을 따라 microtubules에 미토 콘 드리 아 같은 특수 단백질. 성장 인자와 같은 칼슘 이온의 미토 콘 드리 아 운동 어디 그들은 필요한21,,2223지역에 지역화를 지원 하기 위해 보고 되었다.
함께 찍은, 밀매 하 고 미토 콘 드리 아의 도킹 뉴런의 적절 한 기능을 위해 생명 이다. 이 지원 중단 미토 콘 드 리아 인신 매매에 연결 되었습니다 Alzheimer의 질병, 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, Huntington의 질병, 유전 경련을 포함 하 여 여러 신경학 상 조건 paraparesis, 그리고 광섬유 위축15,,2425,26,27. 최근 연구 결과 당뇨병 신경 병, 당뇨병28,,2930,31과 관련 된 감각 손실에 대 한 잠재적인 메커니즘으로 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 병 리에 집중 했다 ,,3233. 가설은 당뇨병 피부 신경 결말의 감각 계획 내의 미토 콘 드리 아의 배포 변경입니다. 따라서, 기술은 시각화 하 고 계량 미토 콘 드리 아 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs), 지 루트 신경 절 감각 afferents의 원심 끝에 내에서 개발 되었다. 기술을 결합 하 여 특정 미토 콘 드리 아와 신경 섬유 라벨의 형광 immunohistochemistry confocal 현미경 검사 법부터 z-시리즈 수집 관련 신경의 분포를 측정 하기 위해 강력한 3 차원 이미지 분석 소프트웨어와 신호 미토 콘 드리 아에서 인간의 피부 펀치 생 검이이 목표를 달성 하기 위해.
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Protocol
피부 펀치 생체 검사 (솔트 레이크 시티, 유타) 유타 대학 당뇨병 센터에서 큰 지역 사회 기반의 1 차 진료소 네트워크에서 모집 된 과목에서 얻은 했다. 이 연구는 미시간 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었고 헬싱키의 선언의 신조를 준수. 테스트 하기 전에 각 주제에서 동의 얻어 작성.
1. 형광 Immunohistochemistry
- intraepidermal 신경 섬유 immunohistochemistry 위한 준비 펀치 생 검:
- 수행 3mm 피부 biopsies 의료 여 직원을 1.5에서 전체 생 장소 mL 잠 ' s 통 솔루션 (2 %paraformaldehyde, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.4에에서 0.3% 포화 picric 산) 4 ° C 하룻밤에.
- 16-24 h 또는 샘플 싱크 때까지 4 ° C에서 30% 자당의 솔루션 샘플 PBS에 린스.
- 최적의 절삭 온도에 소스 샘플 화합물 (10 월)는 cryomold를 사용 하 여. 금형에서 아래로 향하게 하는 표 피와 전체 3mm 생을 놓고 약 2 mL 10 월 동결 건조 얼음에 형의 몰드를 채울 합니다. 저장소 사용 하 여 준비까지-80 ° C에.
- 잘라 50 µ m 두께 cryostat를 사용 하 여 횡단면 고 180 µ L 부동 액 스토리지 솔루션을 사용 하 여 잘 (30% 에틸렌 글리콜, PBS에서 30% 글리세롤) 당 96 잘 접시의 개별 우물에 저장 합니다. 다음 방향 96 잘 접시의 8 우물입니다. 서로 떨어져 200-300 µ m에서 각 생 사이트 섹션 얼룩.
1 일:
- 지층 corneum의 일반적인 라벨 끄다:
- 레이블 96 잘 접시 그림 1에서 보듯이.
- 피펫으로 150 µ L 줄이기 위해 각 우물에 이차 항 체 34 , 35의 일반적인 바인딩 재고 신호 증강 솔루션의. 전송 섹션 inoculating 루프를 사용 하 여 신호 증강 솔루션으로.
참고: 조직 손상 또는 찢 어 조직 섹션을 피하기 위해 함께 작업 하는 동안 주의. 플랫 로커에 실 온에서 30 분 동안 신호 증강 솔루션에서 유지. - 준비 린스 각 우물에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 150 µ L을 추가 하 여 행 2와 3 96 잘 접시의 우물.
- 신중 하 게 행 2와 실 온에서 10 분의 1 x PBS에 린스 섹션 전송.
- 린스 (3 행) 실 온에서 10 분에 대 한 1 x PBS에 두 번째 시간.
- 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 솔루션 준비:
- 준비 5 %BSA 포함 하는 솔루션을 차단 하는 5%와 0.3% 트리톤 X 100 (TX-100) 0.1 M PBS (표 1 참조) 섹션 동안에 잠복기는 신호 증강 해결책입니다. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.
- 각 우물에 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 4 행에 차단 우물 준비.
- 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 개별 우물으로 섹션을 전송 하 고 섹션 평면 로커에 실 온에서 1-2 h에 대 한 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 품 어.
- 1 %BSA 솔루션 및 주요 항 체의 희석을 rinsing 준비:
- TX-100 0.1 M PBS (표 2 참조) 동안 섹션 준비 1 %rinsing 솔루션 1 %BSA 0.3%를 포함 하는 5 %BSA 차단 솔루션에서 잠복기. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.
- 섹션 5 %BSA 차단 솔루션에 잠복기는 하는 동안 1% BSA rinsing 솔루션에서 기본 항 체 희석.
- 1500 µ L의 1 차적인 항 체 솔루션을 만들고 각 추가 행 5에서 잘.
- 희석 주 항 체: 신경 관련 레이블, 토끼 polyclonal 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5)를 사용 하 여 1:1, 000에. 미토 콘 드리 아-특정 라벨을 사용 하 여, 단일 클로 널 항 pyruvate 효소 E2/E3bp 항 체 (PDH) 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 1: 100에서 마우스.
- 준비 1 차 항 체:
- 피펫으로 150 µ L 각 1 차적인 항 체의 잘에 96 잘 접시의 5 행.
- 루프 도구를 사용 하 여 1 차적인 항 체를 포함 하는 5 행에 차단 솔루션 (4 행)에서 전송 섹션.
- 단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 parafilm으로 접시 포장.
- 1 시간 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 º C에서 샘플을 품 어.
주 2:
- 린스 샘플:
- 행 6, 7, 8 각 우물에 솔루션을 rinsing 1 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 준비 린스 우물.
- 첫 1% BSA rinsing 솔루션 (6 행)에 섹션을 전송 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 린스 섹션 1 %BSA 실 온에서 7과 1 시간에 8 행에 솔루션을 rinsing에 잠복기에 의해 두 번 더 반복.
- 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 이차 항 체 희석:
- 이차 항 체 솔루션 섹션 1 %BSA 솔루션 (8 행)을 rinsing의 마지막 린스에 잠복기는 하는 동안 만들 1500 µ L.
- 이차 항 체 희석: PGP9.5 (녹색 형광 활용된 염소 안티 토끼 항 체, 1:1000), 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 PDH (레드 형광 활용된 염소 반대로 마우스, 1:1, 000)에 대 한 대 한.
- 준비 이차 항 체:
- 96 잘 접시의 9 행으로 이차 항 체의 피펫으로 150 µ L.
- 부드럽게 이차 항 체 웰 스 (행 9)에 해결책 (8 행)을 rinsing 1 %BSA 섹션을 전송.
- 사용 parafilm 랩 단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 접시. 커버 알루미늄 호 일. 1 시간에 대 한 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 ˚C에서 샘플을 품 어.
제 3 일:
- 준비는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 여 1 x PBS 청소:
- 피펫으로 150 µ L의 행 10, 11 및 12에 1 x PBS를 필터링.
- 행 10 샘플을 전송 하 고 실 온에서 1 h 1 x PBS에 씻어. 커버 알루미늄 호 일로 96 잘 접시 고 린스 동안 플랫 로커에 놓습니다. 반복 필터링 PBS 린스 2 x 1 번 더 각 행 11 및 12에에서 실 온에서 1 h.
- 현미경 슬라이드 조직 단면도 장착을 위한 준비:
- 장소 50 µ L의 필터링 슬라이드 1 x PBS.
- 50으로 1 x PBS (행 12)에서 전송 섹션 µ L 드롭. 신중 하 게 조직 전개 하 고 부드럽게 유리 슬라이드에 병합 하 여 PBS의 드롭에 섹션을 배치 합니다. 유리 피 펫을 장착 시 약 희석을 피하기 위해 초과 PBS를 제거 합니다. 섹션 유리 전구를 만지지 마십시오.
- 피펫으로 1-2 방울 DAPI를 포함 하는 사용 하 여 현미경 슬라이드 섹션 위에 직접 장착 시 약의 관리 섹션의 방향을 방해 하지. 부드럽게 섹션 50 mm x 24 mm #1.5 현미경 유리 coverslip 장소.
- 고는 coverslip 배치 하면서 형성 된 기포는 coverslip 가장자리에서 과잉 액체를 닦아. 새 슬라이드를 준비 하 고 장착 홍보를 반복각 섹션에 대 한 ocess.
- 치료/건조 실 온에서 어두운 하룻밤에 슬라이드를 삽입 하 여 설치 미디어. 슬라이드 4 ° C 또는-20 ° C (2 주 이상) 장기 저장을 위한 단기 (1-2 주)에 대 한 전송.
주: 부정적인 컨트롤 단계 1.4.2.2에서에서 PGP9.5 또는 PDH에 대 한 1 차 항 체를 생략 하 고 신경이 나 표 피에서 미토 콘 드리 아의 구별할 수 없는 라벨 표시. 컨트롤이 수행한 긍정적인는 PDH에 대 한 항 체 그것을 증명 하기 위해 레이블이 모든 미토 콘 드리 아 (데이터 표시 되지 않음). 녹색 형광 단백질 (GFP) 신호 레이블 미토 콘 드리 아를 잠재로 불리고 그리고 다음 고정 되었고 PDH 항 체와 붉은 형광 스테인드 교양된 기본 마우스 지 루트 ganglion 신경에 긍정적인 컨트롤 수행 이차 항 체입니다. GFP를 표현 했다 모든 미토 콘 드리 아 공동 PDH immunohistochemistry (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 레드 라벨으로 분류 했다.
2. Confocal 영상
- confocal 영상 수행:
- 수집 이미지는 거꾸로 한 현미경에 기름 침수 (1.25 숫자 조리개 (없음)) 목표 X 40 confocal 현미경 스캐닝 레이저를 사용 하 여.
- 각 초점면에서 순차적으로 형광 신호 취득:
핵: 여기 λ = 405 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 420-480 nm
신경 섬유: 여기 λ = 488 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 505-560 nm
Mitoch ondria: 여기 λ = 543 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 606-670 nm
- 각 초점면에서 순차적으로 형광 신호 취득:
- 현미경 소프트웨어에 다음과 같은 검색 매개 변수를 입력: 2 프레임 평균 및 2.2;의 확대와 함께 600 Hz의 스캔 속도 12 비트 강도 해상도 (4096 회색 수준)입니다.
- 설정 최적화 측면 검사용 현미경 소프트웨어 (스캔 해상도 1024 x 1024 =) 및 축 해상도/광학 단면 (confocal 조리개 z 단계 크기 210의 = 1 공기 단위 (AU) nm).
참고: 결과 XYZ 해상도 172.2 x 30-50 µ m x 176.1 µ m x 176.1 µ m의 이미지 크기와 172.2 nm x 210 nm nm.
- 설정 최적화 측면 검사용 현미경 소프트웨어 (스캔 해상도 1024 x 1024 =) 및 축 해상도/광학 단면 (confocal 조리개 z 단계 크기 210의 = 1 공기 단위 (AU) nm).
- 신경 신호 (그린 형광)에 대 한 실시간 검색을 활성화 하 고 찾아서 설정 상단 z-초점 조정 조직 섹션 내에서 신경 신호를 포함 하는 현미경 소프트웨어에 초점 비행기를 내립니다. 총 z 범위는 일반적으로 30-50 µ m 50 µ m 조직 섹션.
- 표 피는 가로 또는 세로로 위치에 이미지 라이브 검색 중 현미경 소프트웨어 검색 필드를 회전.
- 별도로 각 신호를 스캔 하 고 검출기 (광 전 증폭 관 관, PMT) 조정 전압 및 오프셋 어떤 이상과 포화 픽셀에서 최소화/제거.
참고: 위의 매개 변수 검사 시간이 걸릴 z 조각 수에 따라 약 20-40 분.
- 수집 이미지는 거꾸로 한 현미경에 기름 침수 (1.25 숫자 조리개 (없음)) 목표 X 40 confocal 현미경 스캐닝 레이저를 사용 하 여.
3. 3D 시각화 및 분석의 미토 콘 드리 아 내에서 인간 Intraepidermal 신경 섬유
- 3D 표 피 분리:
- 원본 이미지를 복제 하 고 최대 강도 사용 하 여 식별 하 고 표 피를 분리 하는 이미지의 (초점 보기 확장) 프로젝션.
- 결 석 지층 corneum 피부 등의 원치 않는 영역을 제거 하려면 표 피의 위쪽과 아래쪽 가장자리를 따라 추적 도구 관심의 영역을 사용 intraepidermal 신경 섬유의. 이 선택 영역을 자르기.
- 신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호에 사용 deconvolution:
참고: Deconvolution 형광 신호 무결성을 복원 하는 데 도움이. 이미지에 그들의 원래 소스에서 신호를 확산 하는 얼마나 많은 결정 하는 형광 신호를 사용 하기 때문에이 프로토콜에서 사용 하는 복원 장 님 deconvolution 이라고 (지점 확산 기능). 프로세스는 그것의 원래 위치에 다시 확산 신호를 재할당 함으로써 신호 해상도를 향상 시킵니다.- 계산 지점 확산 기능 (PSF) 녹색 형광 신경 신호 (그린 형광)에 대 한 다음 매개 변수:
- 설정 계산된 PSF confocal. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기 1 공기 단위 (거리)를 설정 합니다. 설정된 레이저 여기 파장 488 nm 및 방출 파장 515 nm.
- PSF 빨간 형광 미토 콘 드리 아 신호 (레드 형광)에 대 한 다음 매개 변수 계산:
- 세트 confocal PSF 계산. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기를 1로 설정 AU. 617 543 nm 및 방출 파장을 설정된 레이저 여기 파장 nm.
- Deconvolution 해당 PSFs를 사용 하 여 신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호는 위에 나열 된 최적화와 반복 복원 기능 설정 100% 자신감 10 사이클의 반복 제한.
- 계산 지점 확산 기능 (PSF) 녹색 형광 신경 신호 (그린 형광)에 대 한 다음 매개 변수:
- 신경 특정 표면 작성:
- 사용은 " 서피스를 생성 " 도구 deconvolved 녹색 형광 보조 라벨에 PGP9.5의에서 신경의 단단한 표면을 식별 신경.
- Uncheck는 " 부드러운 " 기능을 사용 하 여 절대 강도 기능 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 상당히 밝은 배경 형광 보다.
- 절대 강도 기능 사용 하 여 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 크게 배경 형광 보다 밝은. 정확 하 게 식별 하는 신경을 충분히 낮은 임계값 설정.
- 필터 작은, 비 신경 표면 밖으로 크기에 따라.
참고: 필요한 경우 수동으로 편집 내 추가 비 신경 서피스는 " 편집 " 여러 개체를 강조 하기 위해 제어 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭.
- 격리 신경 특정 형광 미토 콘 드리 아 신호:
- 볼 신경 표면의 편집 탭을 선택 하는 " 마스크 속성 " 기능. 단계 3.3에서에서 만든 신경 표면은 keratinocytes와 관련 된 미토 콘 드리 아 신호에서 그 신경 내의 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 됩니다.
- 로 " 마스크 모든 ' 엽니다 단추는 " 마스크 채널 " 창, 풀 다운 메뉴 아래에서 deconvolved 레드-형광 신호를 선택 " 채널 선택 " 미토 콘 드리 아 신호.
- 확인 표시를 넣어 하 고 상자에 클릭 합니다 " 마스크를 적용 하기 전에 중복 채널 " 옵션.
- 클릭 라디오 버튼의 앞에 " 일정 내부/외부 " 확인 표시를 넣어 하 고 마스크 설정 상자에서 클릭 옵션은 " 설정에 외면 복 " 옵션 및 입력 값에 대 한 0.00. 확인을 클릭 버튼을 만들 신경 표면 내 미토 콘 드리 아 신호를 나타내는 새로운 채널.
- 미토 콘 드리 아-특정 표면 작성:
- 사용은 " 서피스를 생성 " 도구를 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호를의 새로 만든된 형광 채널에서는 미토 콘 드리 아의 단단한 표면 3.4 단계.
- Uncheck는 " 부드러운 " 기능 및 선택은 " 배경 빼기 " 임계값을 설정 하는 기능. 이 기능은 미토 콘 드리 아 신호 주변 지역 대비를 사용 하 여 배경에서 미토 콘 드리 아를 식별.
- 세트 미토 콘 드리 아를 정확 하 게 식별 하 게 충분히 낮은 임계값 값입니다. 이 예제에서 더 낮은 임계값 2000 16 비트 (65536) 규모에 대 한 설정 했다.
- 필터 크기에 따라 미토 콘 드리 아 표면. 이 예제에서는 1.0 복 복 제한 설정, 최저는 제한 가능 합니다. 필요한 경우 수동으로 내 미토 콘 드리 아 비 표면에 밖으로 편집 된 " 편집 " 여러 개체를 선택 하려면 CONTROL 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭.
참고: 때때로, 소프트웨어가 만들어집니다 구별할 수 형광 미토 콘 드리 아 신호 연결 되지 않은 표면. 이러한 경우에, 그것은 그들을 제거할 수 있는 " 편집 " 탭
- 수출 분석에 대 한 형태학 값 계산:
- 신경 및에서 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 값을 내보내기는 " 통계 " 전자 스프레드시트 소프트웨어와 추가 분석을 위해 탭.
- 신경 및 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 값을 내보낼.
- 개별 신경 섬유에 각 이미지의 수를 세 고 전자 스프레드시트에 값을 기록.
- 각 이미지에 대 한 전자 스프레드시트에서 분석에 대 한 다음 잠재적인 값 계산:
- 모든 신경 표면 위한 볼륨 합계.
- 필터 보다 0.02 µ m 3와 빈의 볼륨 아래 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 밖으로 표면 크기. 예를 들어 0.02-같은 저장소를 사용 하 여 0.04 0.04-0.08, 0.08-0.16, 0.16-0.32, 0.32-0.64, 0.64-1.28 1.28-2.56, 2.56 µ m 3 보다 큰.
참고: 0.02 µ m 3 mitonchodria 36 , , 37 38의 이전 게시 된 볼륨에 따라 미토 콘 드리 아 볼륨의 하한값 설정. - 쓰레기통 (0.02-2.56 µ m 3 이상)를 통해 각 빈 내 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 수와 표면의 총 수를 계산.
- 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 각 빈에서의 비율을 계산합니다. 수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 표면의 총 수로 나눈 빈 당.
- 모든 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 합계.
- 모든 미토 콘 드 리아 표면 볼륨의 합으로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 미토 콘 드리 아 신호 신경의 비율을 계산.
- 모든 미토 콘 드 리아 표면 수로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 신경 볼륨 당 미토 콘 드리 아의 수를 계산.
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Representative Results
시각화 및 인간 IENFs 내 미토 콘 드리 아의 정량화
형광 immunohistochemistry 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 시각화를 인간의 피부 생 검으로 여러 신호 동시 라벨에 대 한 수 있습니다. 96 잘 접시 immunohistochemistry 절차의 단계를 구성 하는 편리한 방법입니다. 그림 1 는이 구성 계정에 대 한 솔루션의 12 단계를 통해 처리 될 8 섹션까지 보여준다. 무료-부동 메서드 플랫 로커와 부드러운 동요와 결합 항 체 양쪽에서 섹션 침투에 대 한 충분 한 액세스는 보장 합니다. 프로토콜 기본 및 보조는 항 체 4 ° C에서 지속적으로 신경 및 미토 콘 드리 아를 라벨에 하룻밤 외피 때문에 크게는 완료, 3 일이 걸린다.
절차의 나머지 통합 이미징, 처리 및 형광 신호 분석. Confocal 현미경 검사 법은 형광 신호 광학 섹션 이산 신호 초점면에서 밖의 초점 신호를 제거 하 여 합니다. 조직 섹션을 통해 z 시리즈의 수집의 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵에 대 한 형광 신호 3D 표현을 제공합니다. 매개 변수 5 신경의 평균을 포함 하는 표 피의 길이 따라 이미지 172 µ m에 최적화 되어 있다. 그림 2 에서는 표 피에서 수집 된 3 개의 형광 신호의 전형적인 3D 이미지를 보여 줍니다. PGP9.5 얼룩 (그림 2B) 조직의 배경 자동 형광 보다 더 높은 강도 표 피 및 진 신경의 풍부한 신호를 제공 합니다. 핵 얼룩 (그림 2C) 표 피 intraepidermal 신경 섬유 자극의 경계를 식별 하는 데 도움이 됩니다. 표 피 때문일 수 지층 corneum 구성 하는 corneocytes에 잔여 DNA 확산 신호를 외부 층에 대 한 일반적입니다. Mitochondria는 PDH 얼룩 (그림 2D) 신호의 대부분은 주로 keratinocytes는 표 피 세포와 관련 하 여 명확 하 게 표시 되어 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 인수 매개 1.25 숫자 조리개와 2.2의 확대/축소 비율 기름 침수 목표 X 40을 사용 합니다. 30-50 µ m x 176.1 µ m x 176.1 µ m의 XYZ 이미지 크기에이 결과. 이러한 설정은 충분히 이미지 (그림 3A) 당 4-6 신경 섬유의 평균을 포함 하는 표 피를 캡처합니다. 더 높은 해상도에서 샘플링 각 이미지에 신경의 수를 줄일 것 이다. 그림 3B 이미지 당 적은 신경 인 114.8 µ m x 114.8 µ m XY 영역 감소, 3.3, 확대/축소 비율을 보여 줍니다. 이상적인 샘플링 밀도 x 1.25 숫자 조리개와 기름 침수 목표 40에 대 한 퀴 (http://www.svi.nl/NyquistCalculator)에 의해 정의 된 대로 54 nm x 54 nm x 205 nm의 XYZ 스캔 해상도 제안 합니다. 이 6.6 배 1024 x 1024 해상도에서 확대/축소 비율을 필요 것 57.4 µ m x 57.4 µ m XY 보기를 감소 하 고 캡처할 이미지 (그림 3C) 당 1-2 신경의 평균.
다음 단계는 이미지의 원치 않는 영역을 제거 하 고 신호를 향상 시키기 위해 이미지 처리를 수행 하는. 이 프로토콜에서 진 피와 지층 corneum는 IENFs 자극 하는 표 피 지역에 분석을 집중 하기 위해 제거 됩니다. 3 차원 소프트웨어 분리, 강화 하 고 형광 신호를 분석할 수 있습니다. 소프트웨어 도구 영역 위와 아래 (그림 4A-C) 표 피 밖으로 자르기에 의해 표 피 신경 및 미토 콘 드리 아를 격리 하기 위해 필요 합니다. 이 프로세스는 확장된 보기에 신호를 축소 하 고 다음 표 피 주위의 자유 영역을 추적 하 여 간단 합니다. 자른된 이미지 추가 이미지 복원 알고리즘에 의해 처리 됩니다. Deconvolution 신경 및 미토 콘 드리 아 신호 (그림 4D)의 해상도 최적화 하는 데 사용 됩니다.
마지막 단계를 감지 하 여 신호에서 형태학 기능 추출입니다. 이 프로토콜의 중요 한 부분 신경 특정 미토 콘 드리 아의 기능을 측정 하는 것입니다. 이미지 분석 소프트웨어는 그 표면에 내에서 (이 경우 미토 콘 드리 아)에서 다른 형광 신호를 분리 하는 마스킹 도구로 만든 표면 (이 경우 신경 표면)에서 하나의 신호에 대 한 사용 하는 기능이 있습니다. 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분석의 첫 번째 단계는 3D 표면 주위 신경 (그림 5A-B)를 만드는 것입니다. 신경 표면 다음 신경 특정 형광 미토 콘 드리 아 신호 (그림 5C, 5D, 5E, 5 G)을 수확 하는 데 사용 됩니다. 마지막으로, 3D 표면 체적 측정 (그림 5 층, 5H)를 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호 주위 만들어집니다. 표 3 은 형태학 측정 이미지 분석 소프트웨어 및 요약 데이터에서 수출을 보여준다. 수출을 주요 값은 신경 및 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호에 대 한 볼륨 값입니다. 미토 콘 드리 아에서 볼륨 데이터 크기 주파수 히스토그램 (그림 6)를 생성 하는 데 사용 되는 미토 콘 드리 아 크기 주파수 데이터를 생성 하 범주화 됩니다. 볼륨 데이터 또한 IENF 볼륨 당 미토 콘 드리 아의 수와 IENF 볼륨 내에서 미토 콘 드리 아 볼륨의 비율에 대 한 요약 조치를 확인 하는 데 사용 됩니다.
표 3, 그림 6 에 표시 데이터가이 기술은 피부 생 검에서 인간의 IENFs 내 미토 콘 드리 아를 계량 하는 수단을 제공 합니다 입증. 이 샘플에서 신경 있다 미토 콘 드리 아를 통해 배포 하 고 미토 콘 드리 아의 대다수 0.02-사이 0.32 µ m3. 이 크기는 정상적인 미토 콘 드리 아36,37,,3839와 관련 된 범위에 있습니다. 작은 미토 콘 드리 아 큰 미토 콘 드리 아39 이 신경에 미토 콘 드리 아 더 운동 될 수도 있습니다 제안 보다 더 많은 운동 되도록 표시 되었습니다. 실제로, 연구는 더 큰, 부 미토 콘 드리 아 작은 미토 콘 드리 아 뿐만 아니라 수송 하지 않습니다 및 axonal 변성39,,4041로 이어질 수 있습니다 연루 있다. 따라서, 신경 특정 미토 콘 드리 아의 특성은 어디 미토 콘 드 리아 형태 및 전송에 변화가 axonal 변성 와 연결 하는 신경 퇴행 성 질환의 연구에 적용할 수 있을 것 이라고 하는 귀중 한 기술 15,25,26,27,,4243.
| 5 %BSA 차단 솔루션 | |
| 5 %BSA 차단 솔루션의 구성 요소 | 필요한 금액 |
| 소 혈 청 알 부 민 (BSA) [최종 농도: 5%] | 0.625 g |
| 1.0% 트라이 톤 X-100 (TX-100) [최종 농도: 0.3%] | |
표 1: 솔루션을 차단 하는 5 %BSA. 5 %BSA 차단 솔루션 차단 항 체의 비 특정 바인딩 immunohistochemistry 프로토콜의 초기 단계에서 사용 됩니다.
| 1% BSA Rinsing 솔루션 | |
| 1% BSA Rinsing 솔루션의 구성 요소 | 필요한 금액 |
| 소 혈 청 알 부 민 (BSA) [최종 농도: 1%] | 0.125 g |
| 1.0 %TX-100 [최종 농도: 0.3%] | 3.75 mL |
| 1 x PBS | ~8.125 mL |
| 총 (12.5 ml 전체 볼륨을가지고 1 X PBS를 사용) | 12.5 mL |
표 2: 1 %BSA 솔루션을 Rinsing. 1 %BSA 솔루션을 rinsing immunohistochemistry 프로토콜에서 사용 하는 차단 항 체의 비 특정 바인딩 및 차 및 2 차 항 체를 diluting에 대 한 사용.
| IENFs 및 신경 특정 미토 콘 드리 아에 대 한 형태학 측정 | ||||||||
| 이미지 분석 소프트웨어에서 내보낸 및 요약 데이터 | ||||||||
| 마운트 크기 주파수 방식 | Mt 크기 주파수 빈에서의 수 | 빈에서 산의 비율 | Mt의 총 수 | 마운트 볼륨 (µ m3) | IENF 볼륨 (µ m3) | IENF 볼륨 (수/100 µ m3) 당 산 수 | IENF 볼륨에서 마운트 볼륨의 비율 | IENFs의 수 |
| 사이 .04.02 µ m3 |
20 | 24.4% | 82 | 13.41 | 518.88 | 15.8 | 2.58% | 4 |
| 사이 .04.08 µ m3 |
28 | 34.1% | ||||||
| 사이 .08.16 µ m3 |
14 | 17.1% | ||||||
| 사이 .16.32 µ m3 |
12 | 14.6% | ||||||
| 사이 .32-.64 µ m3 |
4 | 4.9% | ||||||
| 사이 .64 1.28 µ m3 |
3 | 3.7% | ||||||
| 사이 1.28-2.56 µ m3 |
1 | 1.2% | ||||||
| 사이 2.56 + µ m3 |
0 | 0.0% | ||||||
표 3: IENFs 및 신경 특정 미토 콘 드리 아에 대 한 형태학 측정. 테이블을 측정 이미지 분석 소프트웨어 및 요약 데이터에서 내보낸 형태학 값을 나타냅니다. 약어: IENF, intraepidermal 신경 섬유; Mt, 미토 콘 드리 아
그림 1 : 피부 생 검 Immunohistochemistry 96 잘 접시에 대 한 설치 프로그램을 대표 하는 회로도. 접시에 행 블록, 세척 및 부 화 솔루션에 대 한 프로토콜의 단계와 열 (1 접시 당 8 섹션)에서 개별 조직 단면도 대표 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대표 3D 형광 Immunohistochemistry 인간의 표 피 생 검에서 조직 단면도의 Confocal 현미경 이미지 처리. 처리 되지 않은 3D 프로젝션 이미지 병합 (A) 형광 신호 및 개별 신호 (B) 신경 (신경, 녹색), (C) 핵 (Nuc, 블루) 및 (D) 미토 콘 드리 아 (Mt, 레드)는 표 피에 대 한 설명 및 진 피입니다. 표 피의 지층 corneum 계층에 신호의 부족 note 바 규모 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 이미지 해상도 결과 적은 신경에 후속 분석을 위해 개선. 모든 이미지는 1.25 숫자 조리개와 40 X 오일 목적으로 캡처하고 3D 프로젝션 신경 (녹색), 미토 콘 드리 아 (Mt, 빨간색) 및 핵 (Nuc, 블루)에 대 한 형광 신호를 설명 합니다. 2.2 (A) 의 확대/축소 비율에서 찍은 이미지 뷰 내에서 여러 가지 신경을 포함 되어 있습니다. 3.3 (B) 또는 6.6 (C)확대/축소 비율 증가, 이상적인 나이 키스 트 샘플링, 크게 각 이미지 내에서 신경의 수가 줄어듭니다. 바 규모 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 이미지 처리. 대표 인간의 표 피 생 검에서 조직 단면도의 confocal 현미경 검사 법에서 이미지의 초점 (최대 강도 투영) 보기를 확장합니다. 처리 되지 않은 프로젝션 이미지 (A) (녹색), 신경 핵 (Nuc, 파란색)과 미토 콘 드리 아 (Mt, 빨간색)에 대 한 병합 된 형광 신호를 보여 줍니다. 진 피와 지층 corneum는 inte의 영역이 잘릴 (B)나머지 (ROI) 자유 선택 도구 (강조 표시 된 영역을 블루, ROI를 자르기)는 표 피에만 신호를 분리. (C) 자른 표 피는 계산 된 포인트 (D) deconvolution 확산 신경 (녹색)의 해상도 개선 하는 기능에 대 한 처리 및 미토 콘 드리 아 (Mt, 빨간색) 신호. 바 규모 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 이미지 분석. 대표적인 3D confocal 현미경 이미지 (A)에서는 신경 관련 녹색 형광 신호. (B) 3 차원 표면 (녹청) 신경 신호에 대 한 만들어집니다. 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호 (D) 신경 표면 마스킹 도구를 사용 하 여 (C) 상피 미토 콘 드리 아 신호 (Mt, 빨간색)의 나머지 부분에서 격리 됩니다. 신경-특정 미토 콘 드 리아 빨간색 형광 신호는 결과 (E, G) (F, H) 신경 표면 (녹청) 내의 미토 콘 드리 아 주위 표면 (Mt 표면, 마젠타색). G와 H는 E에서 흰색 상자의 확대 보기 및 F. 규모 바 = 20 µ m (A-F), 5 µ m (G-H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 미토 콘 드리 아의 크기 주파수 히스토그램. Mitochondrialsurface 데이터는 그들의 볼륨 (µ m3)에 따라 다양 한 쓰레기통의 각각에 존재 하는 미토 콘 드리 아의 비율을 시각화 하는 크기 주파수 히스토그램으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 분리, 계량 및 크기와 인간의 피부 생 검에서 3d에서 IENFs 내 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 분석 설계 되었습니다. 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 부동성 형광 immunohistochemistry는 얼룩 답사 연구44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석 하 고 설계 되었습니다. 이 절차는 confocal 현미경 이미지 및 3D 분석에 필요한 50 µ m 섹션에 걸쳐 이미지 수집을 극대화 하기 위해 조직에 항 체의 침투에 대 한 수 있습니다. 또 다른 중요 한 단계는 이미지 수집 매개 변수를 측정 하는 미토 콘 드리 아에 대 한 해상도 유지 하면서 이미지 당 충분 한 신경을 캡처 사이 균형 이다. 조직 섹션에 사용 하 고 표준 피부 생 검 프로토콜은 약 3 m m 긴45,,4647,48. 인수 매개 변수가 프로토콜 캡처 이미지 당 4-6 신경 섬유의 평균을 포함 하는 표 피의 충분히 설명 합니다. 더 높은 해상도에서 샘플링 크게 나이 키스 트 샘플링에서 특히 각 이미지에 신경의 수를 줄일 것 이다. 세 번째 중요 한 단계는 신호, 특히 미토 콘 드리 아의 명암과 해상도 개선 하기 위해 deconvolution 알고리즘을 사용 하는. Deconvolution 이미지의 높은 해상도에서 샘플링 하지에 대 한 보상 도움이. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 표 피 세포와 관련 된 미토 콘 드리 아에서 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하는 마지막 중요 한 단계가입니다. 이것은 신경 내에서 지역화 미토 콘 드리 아 신호 자르려면 신경 표면 마스킹 도구 사용 하 여 수행 됩니다.
고려 하는 것이 기술의 일부 잠재적인 수정 있다. 한 가지 가능한 수정 형광 immunohistochemistry의 기간을 단축 하는 것입니다. 4 ° C에서 1 차 및 이차 항 체 솔루션에 하룻밤 외피는 실 온에서 3-4 시간 단축 될 수 있습니다. 그러나, 실내 온도에 짧은 외피 종종 배경 형광, 그래서 증가 주의 가난한 신호 잡음을 피하기 위하여 취해야 한다. 또 다른 가능한 수정 이미지 수집 매개 변수를 조정 하는 것입니다. 위에서 설명 했 듯이, 여기에 설명 된 이미지 수집 이미지 당 신경의 적당 한 수 높은 이미지 해상도 통해 캡처 향해 편견 했다. 1.3 숫자 조리개와 63 x 기름 침수 목표 등 높은 배율 목표를 사용 하 여 가능 하다. 모든 매개 변수는 동일한 유지 63 X 목표 사용 되었다 XY 이미지 필드 112 µ m x 112 µ m 줄어들 것이 고 따라서 당 이미지 신경의 평균 수를 감소. 주요 포인트 획득 및 후속 분석을 통해 일관 된 매개 변수를 사용 하는 것입니다.
이 기술의 주요 제한은 시간이 소모 되는 것입니다. immunohistochemistry 조직 처리 3 일 소요, 이미지 수집 얼마나 많은 광학 z 단계 찍힌다, 따라 하는 이미지 당 약 30-50 분 걸리며 영상 처리/분석 약 20 분 소요. 이것은 중요 한 시간 투입 이다 하지만 결국에서 중요 한 형태학 측정을 생성. 이 기술의 또 다른 한계는 표 피 이미지 당 샘플의 제한 된 영역입니다. 그러나,이 의심할 여 지 없이 빠른 컴퓨터 프로세서 및 분석 소프트웨어와 결합 하는 향상 된 해상도와 이미지 수집 속도에 만들어진 발전을 향상 됩니다.
다른 방법을 통해이 프로토콜의 중요성 confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 분석 형광 immunohistochemistry 결합의 힘은. 전통적으로, intraepidermal 신경 섬유 분석 기반 chromogen immunohistochemistry와 밝은 분야 현미경 검사 법, 특히 신경45,,4749의 임상 진단을 위해 이루어집니다. 형광 immunohistochemistry 사용 얼룩 하 고 답사 연구44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석할 수 있습니다. 이 기법은 관심,이 경우 신경 특정 미토 콘 드리 아, 복잡 한 신호에서 미토 콘 드리 아 표 피 세포와 관련 된 특정 신호를 분리 하는 전략을 제공 합니다.
이 기술은 파워 미래의 응용 프로그램에서 그것의 유용성입니다. 격리 하 고 측정 신경 특정 미토 콘 드리 아 기능 질병 유발 변경 크기와 미토 콘 드리 아의 분포를 평가 가능 하 게. 여러 신경 합병증은 질병의 잠재적인 메커니즘으로 미토 콘 드 리아 기능 장애를 연루 있다. 특히,이 기술은의 수정된 된 버전 당뇨병과 당뇨병 주변 신경 병을 가진 환자는 크기와 일치 하는 나이에 비해 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 측정 가능 변화를 설명 하는 데 사용 되었습니다. 50을 제어합니다. 이 기술을 개선 하거나 감각 neuropathies를 치료 하도록 설계 된 치료의 효과 평가 하는 데 유용할 것 이다. 마지막으로, 기술의 다양성은 다양 한 형광 신호 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 사용 하 여 분석에 적용 합니다.
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Disclosures
아니 충돌의 관심 선언.
Acknowledgments
이 작품 신경과 연구는 프로그램 NS061039 01A2 건강 보조금 K08의 국가 학회에 의해 지원 되었다 & 발견, 그리고 미시간 대학에서 A. Alfred Taubman 의료 연구 연구소. 이 작품은 형태학 및 이미지 분석 핵심 미시간 당뇨병 연구 센터, 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신 장병에서 5 P 90 DK-20572 건강 그랜트의 국가 학회에 의해 투자의 사용. 저자는 인간의 피부 샘플의 그들의 관대 한 기부에 대 한 제이 로빈슨 싱글톤과 A. 고 든 스미스 (유타 대학) 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
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