Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tredimensjonale Imaging og analyse av mitokondrier i menneskelig Intraepidermal Nerve Fibre

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/53369
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

Summary

Denne protokollen bruker tredimensjonale (3D) bildebehandling og analyse teknikker å visualisere og kvantifisere nerve produktspesifikk mitochondria. Teknikkene gjelder for andre situasjoner der en fluorescerende signal brukes til å isolere et delsett med data fra en annen fluorescerende signal.

Abstract

Målet med denne protokollen er å studere mitokondrier i intraepidermal nerve fibre. Derfor ble 3D bildebehandling og analyse teknikker utviklet for å isolere nerve-spesifikke mitokondrier og evaluere sykdom-induserte endringer av mitokondrier i den distale tuppen på sensoriske nerver. Protokollen kombinerer fluorescens immunohistochemistry, AC confocal mikroskopi og 3D image analyseteknikker å visualisere og kvantifisere nerve produktspesifikk mitochondria. Detaljerte parametere er definert gjennom fremgangsmåten for å gi en konkret eksempel på hvordan du bruker disse teknikkene til å isolere nerve produktspesifikk mitochondria. Antistoffer ble brukt til å merke nerve og mitokondrie signaler i vev deler av huden punch biopsier, som ble etterfulgt av indirekte immunofluorescence å visualisere nerver og mitokondrier med en grønn og rød fluorescerende signal henholdsvis. Z-serien bildene ble anskaffet med AC confocal mikroskopi og 3D analyseprogramvare ble brukt til å behandle og analysere signaler. Det er ikke nødvendig å følge nøyaktig parameterne som beskrives i, men det er viktig å være i samsvar med de valgt gjennom farging, oppkjøp og analyse. Styrken i denne protokollen er at det er gjelder for en rekke tilfeller der en fluorescerende signal brukes til å isolere andre signaler som ellers ville være umulig å studere i fred.

Introduction

Mitokondrier tjene vitale cellulære funksjoner som inkluderer produserer celle energi, bufring kalsium, og regulerer necrotic og apoptotisk celle død1,2,3. Nervesystemet er en høy metabolske rate i forhold til kroppen4 antyder at nervecellene generere en høy grad av cellular energi i form av adenosin trifosfat (ATP) gjennom mitokondrie åndedrett. Mye bevis dokumenter at neuronal funksjoner er avhengige av ATP5, spesielt på synapser6. Fordelingen av mitokondrier i neurons er derfor viktig.

De siste 10 årene mye informasjon har vist at handel med og dokking av neuronal mitokondrier regulerte sterkt. Motoren proteiner er involvert i å distribuere mitokondrier til bestemte mobilnettet rom gjennom Nevron. Smugling av mitokondrier er spesielt viktig fordi neurons prosjekt axons og dendrites langt unna soma. Kinesin motoren proteiner direkte primært anterograd (fra soma) smugling av mitokondrier langs piskehale som henger mens dynein motoren proteiner direkte retrograd (mot soma) motilitet7,8,9 , 10. det er mobilnettet signaler slik mitokondrie membran potensial og impuls ledning som påvirker tilstedeværelse og retning mitokondrie menneskehandel11,12,13.

I tillegg transport mitokondrier, finnes det spesialiserte proteiner å lokalisere mitokondrier til bestemte mobilnettet rom som har høy energi krav, som noder i Ranvier og synapser8,14, 17. flertallet av mitokondrier i axons er faktisk ikke-motile9,13,18. Spesialiserte proteiner som syntaphilin anker mitokondrier til piskehale som henger sammen axons mens andre proteiner anker mitokondrier begrepsordbok cytoskjelett19-21. Vekstfaktorer og ioner som kalsium er rapportert å støtte opphør av mitokondrier bevegelsen å lokalisere dem til områder der de er nødvendige21,22,23.

Samlet er menneskehandel og docking av mitokondrier avgjørende for riktig funksjon av nevroner. Dette har avbrudd i mitokondrie menneskehandel blitt assosiert med flere nevrologiske lidelser inkludert Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom, Huntingtons sykdom, arvelig spastisk paraparesis og optisk atrofi,15,,24,,25,,26,,27. Nyere studier har fokusert på mitokondrie dysfunksjon og patologi som en potensiell mekanisme for diabetisk nevropati, sensoriske tap forbundet med diabetes28,29,30,31 ,32,33. Hypotesen er at diabetes endrer fordelingen av mitokondrier i Sensorisk anslagene av cutaneous nerve slutt. Derfor utviklet en teknikk for å visualisere og kvantifisere mitokondrier i intraepidermal nervefibrene (IENFs), den distale tips dorsal root ganglion sensoriske afferente. Teknikken kombinerer fluorescens immunhistokjemi av spesifikke mitokondrie og nerve fiber etiketter med AC confocal mikroskopi z-serien oppkjøpet av signaler med kraftig 3D image analyseprogramvare å måle fordelingen av nerve-spesifikke mitokondrier fra menneskelige kutan punch biopsies å oppnå dette målet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hud punch biopsies Hentet fra temaer som ble rekruttert fra en stor fellesskapet-baserte primærhelsetjenesten nettverket ved University of Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Denne studien ble godkjent av University of Michigan institusjonelle Review Board og overholdt grunnsetningene i deklarasjonen i Helsinki. Skriftlig samtykke ble innhentet fra hvert emne før testing.

1. fluorescens Immunohistochemistry

  1. forberede punch biopsier for intraepidermal nerve fiber immunohistochemistry:
    1. utføre 3 mm hud biopsies av medisinske personalet og plassere den hele biopsy i 1.5 mL Zamboni ' s etappe, den stabiliserende løsning (2% paraformaldehyde, 0,3% mettet pikrinsyre i fosfat bufret saltvann (PBS), pH 7.4) på 4 ° C over natten.
    2. Skyll prøver en løsning av 30% sukrose i PBS på 4 ° C i 16-24 h eller til prøven synker.
    3. Embed prøver i optimal kutte temperatur sammensatte (OCT) bruker en cryomold. Plassere hele 3 mm biopsi overhuden vender ned i mold og Fyll formen med ca 2 mL oktober fryse mold på knust tørris. Butikken på-80 ° C til klar til bruk.
    4. Kutte 50 µm tykk tverrsnitt bruker en kryostaten og lagre i individuelle brønner av en 96-brønns plate med 180 µL frostvæske lagringsløsning per godt (30% etylenglykol, 30% glyserol i PBS). Retning er 8 brønner av en 96 godt plate. Stain deler fra hvert biopsi område som 200-300 µm fra hverandre.

dag 1:

  1. slukke uspesifisert merking av i stratum corneum:
    1. etiketten 96-brønns platen som vist i figur 1.
    2. Pipetter 150 µL av lager signal enhancer løsning å redusere uspesifikke binding av sekundær antistoffer 34 , 35 i hver brønn. Overføre deler til signalet enhancer løsning ved hjelp av en inoculating løkke.
      Merk: Vær forsiktig når du arbeider med vevet å unngå skade eller rive delene vev. Holde i signal enhancer løsning i 30 minutter ved romtemperatur på en flat rocker.
    3. Forberede skyll brønner i rader 2 og 3 i 96-brønnen platen ved å legge 150 µL av 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) i hver brønn.
    4. Nøye overføre deler til rad 2 og skyll i 1 x PBS i 10 min ved romtemperatur.
    5. Skylling en gang i 1 x PBS for 10 min ved romtemperatur (rad 3).
  2. Forberede 5% bovin serum albumin (BSA) blokkerer løsning:
    1. forberede 5 blokkerer løsning som inneholder 5% BSA og 0,3% Triton X 100 (TX-100) i 0.1 M PBS (se tabell 1) mens deler er incubating inne signalet enhancer løsning. BSA går ikke i løsning lett. Vortex løsning til BSA helt oppløses.
    2. Forberede blokkerer brønner i rad 4 i 96-brønnen platen ved å legge 150 µL av 5% BSA blokkerer løsning i hver brønn.
    3. Overføre deler til individuelle brønner på 5% BSA blokkerer løsning og ruge delene i 5% BSA blokkerer løsning for 1-2 h ved romtemperatur på en flat rocker.
  3. Forberede 1% BSA skylling løsning og fortynning av primære antistoffer:
    1. forberede 1% skyllingsprosess løsning som inneholder 1% BSA og 0,3% TX-100 i 0.1 M PBS (se tabell 2) når delene er incubating inne 5% BSA blokkerer løsning. BSA går ikke i løsning lett. Vortex løsning til BSA helt oppløses.
    2. Fortynne primære antistoffer i 1% BSA skyllingsprosess løsning mens deler er incubating inne 5% BSA blokkerer løsning.
      1. Gjøre 1500 µL av primære antistoff løsning og legge til hver i rad 5.
      2. Fortynne primære antistoffer: bruke nerve-spesifikke etiketten, kanin polyklonale anti-protein gene produktet 9.5 (PGP9.5) på 1:1, 000. Bruke mitokondrier-spesifikke etiketten, musen monoklonale anti-pyruvate-dehydrogenase E2/E3bp antistoff (PDH) på 1: 100 i 1% BSA skylling løsning.
  4. Forberede primære antistoff:
    1. Pipetter 150 µL primære antistoff i hvert godt i rad 5 i 96-brønnen platen.
    2. Bruker verktøyet loop, overføre deler fra blokkerer løsning (rad 4) i raden 5 inneholder primære antistoffer.
    3. Brytes platen tett med parafilm å holde det fra uttørking.
    4. Plasser eksempler på flat rocker ved romtemperatur 1t, og deretter ruge samples ved 4 ºC på en flat rocker natten.

dag 2:

  1. skyll eksempler:
    1. forberede skyll brønner i rad 6, 7 og 8 i 96-brønnen platen ved å legge 150 µL av 1% BSA skylling løsning i hver brønn.
    2. Overføre deler i første 1% BSA skyllingsprosess løsning (rad 6) og ruge 1t ved romtemperatur. Gjenta skyller to ganger mer av rugende inndelinger i 1% BSA skylling løsning i rad 7 og 8 1t hver ved romtemperatur.
  2. Fortynne sekundære antistoffer i 1% BSA skylling løsning:
    1. gjøre 1500 µL av sekundær antistoff løsning mens deler er incubating inne siste skylling av 1% BSA skylling løsning (rad 8).
    2. Fortynne sekundære antistoffer: for PGP9.5 (grønn-fluorescerende konjugert geit anti-kanin antistoff, 1:1000) for PDH (rød-fluorescerende konjugert geit anti-mus, 1:1, 000) i 1% BSA skylling løsning.
  3. Forberede sekundære antistoff:
    1. Pipetter 150 µL sekundære antistoff i rad 9 av 96-brønns plate.
    2. Forsiktig overføre delene fra 1% BSA skylling løsning (rad 8) i sekundære antistoff brønner (rad 9).
    3. Bruke parafilm, vikle platen tett for å holde det tørker ut. Dekk med aluminiumsfolie. Plasser eksempler på flat rocker ved romtemperatur 1t, og deretter ruge samples ved 4 grader på en flat rocker natten.

dag 3:

  1. forberede Rengjør 1 x PBS ved filtrering gjennom et 0.22 µm filter:
    1. Pipetter 150 µL av filtrert 1 x PBS i rad 10, 11 og 12.
    2. Overføre prøver til rad 10 og skyll i 1 x PBS 1t ved romtemperatur. Dekkramme 96-brønnen med aluminiumsfolie og plasser på en flat rocker under skylling. Gjenta filtrert 1 x PBS skyll to ganger for 1 h hver ved romtemperatur i rader 11 og 12.
  2. Forberede objektglass montering vev seksjoner:
    1. plass 50 µL av filtrert 1 x PBS på et lysbilde.
    2. Delen overføring fra 1 x PBS (rad 12) i 50 µL slipp. Plasser delen i rullegardinmenyen i PBS unfolding vevet og forsiktig sammenslåing det på av objektglass. Fjern overflødig PBS med en glass pipette for å unngå fortynne montering reagensen. Berør ikke deler med glassbulben.
    3. Pipetter 1 - 2 dråper av montering reagensen som inneholder DAPI direkte på under mikroskopet lysbildet bruke omsorg ikke forstyrre retningen for avsnittet. Forsiktig plassere en 50 x 24 mm #1.5 mikroskop glass dekkglassvæske over inndelingen.
    4. Fjern eventuelle luftbobler som dannet mens plassere dekkglassvæske og tørke av overflødig væske ut av dekkglassvæske. Klargjør et nytt lysbilde og gjenta montering prBehandle for hver inndeling.
    5. Hærder/tørker montering media ved å plassere lysbildene i den mørke natten i romtemperatur. Overføre lysbildene til 4 ° C for kortsiktige (1-2 uker) eller 20 ° C for langtidslagring (større enn 2 uker).
      Merk: Negative kontroller utelatt primære antistoffer for PGP9.5 eller PDH i trinn 1.4.2.2 og vises ikke skjelnes merking av nerver eller mitokondrier i overhuden. Positiv kontrollene ble utført for PDH antistoff å bevise det merker alle mitokondrier (data ikke vist). Positiv kontrollene ble utført på kulturperler hovedknappen på musen dorsal root ganglion nevroner som ble transduced med en baculovirus til etiketten mitokondrier med et grønt fluorescerende Protein (GFP) signal fast og farget med PDH antistoff og røde lysstoffrør sekundær antistoff. Alle mitokondrier som var uttrykke GFP var co merket med røde etiketten for PDH immunohistochemistry (data ikke vist).

2. AC confocal Imaging

  1. utføre AC confocal imaging:
    1. samle bilder ved hjelp av en laser skanning AC confocal mikroskop med en 40 X oljeneddyp (1,25 numeriske blenderåpning (N.A.)) mål på en invertert mikroskop.
      1. På hver fokalplanet sekvensielt erverve fluorescerende signaler:
        kjerner: eksitasjon λ = 405 nm, spectral utslipp filteret λ = 420-480 nm
        nervefibre: eksitasjon λ = 488 nm, spectral utslipp filteret λ = 505-560 nm
        Mitoch ondria: eksitasjon λ = 543 nm, spectral utslipp filteret λ = 606-670 nm
    2. angir du følgende parametere for søk i mikroskopet programvare: avsøkingshastigheten på 600 Hz med 2 ramme snitt og zoom av 2.2; 12-biters intensitet oppløsning (4096 grå nivåer).
      1. Satt mikroskop programvaren for optimalisert lateral oppløsning (skanneoppløsningen = 1024 x 1024) og aksial oppløsning/optisk snitting (AC confocal åpning = 1 luftige enhet (AU) med z-trinn størrelse på 210 nm).
        Merk: XYZ oppløsningen er 172.2 nm x 172.2 nm x 210 nm med en bildestørrelse på 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.
    3. Aktivere en live skanning for nerve signalet (grønn-fluorescens) og justere kontrollen z-fokus for å finne og angi øvre og lavere fokal fly i mikroskopet programvaren som omfatter nerve signalet i delen vev. Totalt z-området er vanligvis 30-50 µm for en 50 µm vev inndeling.
    4. Rotere feltet skanning med mikroskopet programvaren under en live søk slik at epidermis er vannrett eller loddrett plassert i bildet.
    5. Skanne hver signal separat og justere detektoren (photomultiplier rør, avdrag) spenning og offset å minimere/fjerne noen over og under mettet piksler.
      Merk: Skanning med parameterene ta ca 20-40 min hvor mange z skiver.

3. 3D visualisering og analyse av mitokondrier innen Human Intraepidermal Nerve fiber

  1. isolere 3D overhuden:
    1. kopiere det opprinnelige bildet og bruke den maksimale intensiteten projeksjon (utvidet fokus visning) av bildet for å identifisere og isolere overhuden.
    2. Bruker et område av interesse for å spore langs de øvre og nedre kantene av overhuden for å fjerne uønskede områder som stratum corneum og huden som er fraværende intraepidermal nerve fibre. Beskjær til dette utvalget.
  2. Bruk deconvolution på nerve og mitokondrie fluorescerende signaler:
    Merk: Deconvolution bidrar til å gjenopprette integriteten til fluorescerende signaler. Restaureringen i denne protokollen kalles blind deconvolution fordi den bruker fluorescerende signaler i bildene for å avgjøre hvor mye signalene spredte seg fra deres opprinnelige kilden (punkt spredning funksjon). Prosessen forbedrer signalet oppløsning ved blitt signalet spre tilbake til sin opprinnelse plasseringen.
    1. Beregn et punkt spredning funksjon (PSF) for grønne fluorescerende nerve signalet (grønn-fluorescens) med følgende parametere:
      1. satt beregnet PSF til AC confocal. Angi middels brytningsindeks 1.515 og numerisk aperture å 1,25. Angi detektor pinhole 1 luftige enhet (A.U.). Angi laser eksitasjon bølgelengde til 488 nm og utslipp bølgelengde til 515 nm.
    2. Beregne en PSF for rød fluorescerende mitokondrie signal (rødt-fluorescens) med følgende parametere:
      1. Sett beregnet PSF til AC confocal. Angi middels brytningsindeks 1.515 og numerisk aperture å 1,25. Angi detektor pinhole 1 AU. Angi laser eksitasjon bølgelengde til 543 nm og utslipp bølgelengde til 617 nm.
    3. Optimere nerve og mitokondrier fluorescerende signaler av deconvolution ved hjelp av de tilsvarende PSFs ovenfor og iterativ restaurering funksjonen satt til 100% sikkerhet og en gjentakelser av 10.
  3. Opprette nerve-spesifikke overflater:
    1. Bruk det " skape overflate " verktøy for å lage en solid overflate av nerver fra deconvolved green-fluorescerende sekundære merkingen av PGP9.5 identifisert nerver.
    2. Fjern den " glatt " funksjonen og bruke funksjonen absolutt intensitet angi terskelen for nerve signal siden det er betydelig lysere enn bakgrunn fluorescens.
    3. Bruke funksjonen absolutt intensitet angi terskelen for nerve signal siden det er betydelig lysere enn bakgrunn fluorescens. Angi terskelverdien lav nok til å nøyaktig identifisere nervene.
    4. Filter ut små, ikke-nerve flater basert på størrelse.
      Merk: Hvis nødvendig manuelt redigere ut ekstra ikke-nerve overflater i det " Rediger " kategorien ved å holde Ctrl-tasten til å markere flere objekter og deretter slette dem med del..
  4. Isolere nerve-spesifikke fluorescerende mitokondrie signal:
    1. Velg kategorien Rediger i nerve overflaten vise den " maske egenskaper " funksjon. Nerve overflaten opprettet i trinnene 3.3 brukes til å isolere mitokondrier innenfor disse nervene fra Mitokondrielt signaler knyttet til keratinocytter.
    2. Som den " maske alle ' knappen åpner en " maskekanalen " vinduet, velger du deconvolved rød-fluorescerende signalet fra rullegardinen under " kanalvalg " for mitokondrie signalet.
    3. Klikk i boksen til å sette en hake i den " dupliserte kanalen før maske " alternativet.
    4. Klikk på radio-knappen på den " konstant innsiden/utsiden " alternativet maske innstillinger og klikk på å sette en hake i den " sett voxel utenfor overflaten til " alternativet og skriver inn 0,00 kr for verdien. Klikk OK for å opprette den nye kanalen som representerer mitokondrie signaler i nerve overflaten.
  5. Opprette mitokondrier-spesifikke overflater:
    1. Bruk det " skape overflate " verktøy for å lage en solid overflate av mitokondrier fra den nyopprettede fluorescerende kanalen nerve-spesifikke mitokondrie signalene fra Trinn 3.4.
    2. Fjern den " glatt " funksjonen og velg den " bakgrunn subtraksjon " funksjonen til å angi terskelen. Denne funksjonen bruker lokale kontrasten rundt mitokondrie signalet for å identifisere mitokondrier bakgrunnen.
    3. Sett terskelverdien lav nok til å nøyaktig identifisere mitokondrier. I dette eksemplet nedre terskelen ble satt på 2000 til en 16-biters (65 536) skala.
    4. Filtrerer mitokondrie overflater basert på størrelse. I dette eksemplet voxel grensen ble satt til 1,0 voxels, som er den laveste begrense mulig. Eventuelt manuelt redigere ut ikke-mitokondrier overflater i det " Rediger " kategorien ved å holde Ctrl-tasten til å velge flere objekter og deretter slette dem med del..
      Merk: Noen ganger vil programvaren opprette overflater som ikke er knyttet til en identifiserbar fluorescerende mitokondrie signal. I disse tilfellene, er det mulig å fjerne dem med den " Rediger " kategorien
  6. Eksportere og beregne morphometric verdier for analyse:
    1. eksportere verdier for nerve og mitokondrie overflater fra det " statistikk " kategorien for videre analyse med elektronisk regneark.
    2. Eksportere volum verdiene for både nerve og mitokondrie overflater.
    3. Antall individuelle nerve fiber til stede i hvert bilde og registrere i elektronisk regneark.
    4. For hvert bilde, beregne følgende mulige verdier for analyse i elektronisk regneark:
      1. Sum volumene for alle nerve overflater.
      2. Filter ut nerve-spesifikke mitokondrie overflater under et volum på mindre enn 0.02 µm 3 og bin overflater av størrelse. For eksempel bruke hyller som 0,02 - 0.04 0.04 - 0,08 0,08 - 0,16, 0,16 - 0.32, 0.32 - 0,64, 0,64 - 1,28, 1,28-2.56, større enn 2.56 µm 3.
        Merk: Den laveste grensen for mitokondrie volum var satt til 0.02 µm 3 basert på tidligere publiserte mengder mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Telle antall nerve-spesifikke mitokondrie flater innenfor hver hylle og antall overflater over hyllene (0,02 - større enn 2.56 µm 3).
      4. Beregner andelen nerve-spesifikke mitokondrie overflater i hver hylle. Bruke greven hver delt på totalt antall mitokondrier overflater.
      5. Sum volumene for alle nerve-spesifikke mitokondrie overflater.
      6. Beregner andelen nerve med mitokondrie signalet ved å dele totale nerve overflaten volumet på summen av alle mitokondrie overflaten volumer.
      7. Beregne antall mitokondrier per nerve volum ved totalt nerve overflaten volumet med antall alle mitokondrie overflater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Visualisering og kvantifisering av mitokondrier i menneskelig IENFs

Fluorescens immunohistochemistry tillater samtidig merkingen av flere signaler i menneskelig hud biopsies å visualisere nerver og mitokondrier kjerner. En 96-brønns plate er en praktisk måte å organisere trinnene i prosedyren immunohistochemistry. Figur 1 viser at dette konfigurasjon står for opp til 8 deler behandles gjennom 12 nivåer av løsninger. Frittflytende metoden kombinert med mild omrøring med en flat rocker sikrer at antistoffer har tilstrekkelig tilgang til å trenge gjennom delene fra begge sider. Protokollen tar 3 dager å fullføre, noe som hovedsakelig skyldes overnatting incubations i primære og sekundære antistoffer i 4 ° C, som konsekvent etiketten nerver og mitokondrier.

Resten av fremgangsmåten inkorporerer bildebehandling, bearbeiding og analyse av fluorescerende signaler. AC confocal mikroskopi utnytter fluorescerende signalene optisk delen diskret signaler fra fokalplanet ved å eliminere ut-av-fokus signaler. Oppkjøpet av z-serien gjennom delen vev gir en 3D-representasjon av fluorescerende signaler til nerver, mitokondrier og kjerner. Parameterne er optimalisert til bildet 172 µm langs overhuden som vil inkludere et gjennomsnitt på 5 nerver. Figur 2 viser et typisk 3D-bilde av tre fluorescerende signaler som er samlet inn fra overhuden. PGP9.5 flekker (figur 2B) gir et rikt signal av epidermal og dermal nerver av en høyere intensitet enn bakgrunn auto-fluorescens av vev. Kjernefysisk flekken (figur 2C) bidrar til å identifisere grensene av overhuden der nervefibrene intraepidermal innervate. Det er vanlig for det ytre laget av overhuden å ha et diffus-signal som kan skyldes gjenværende DNA i corneocytes som utgjør i stratum corneum. Mitokondrier er tydelig merket av PDH flekker (figur 2D) hvor fleste av signalet er forbundet med celler i overhuden som primært keratinocytter.

Oppkjøpet parameterne som beskrives i denne protokollen bruker en 40 X nedsenking oljeobjektiv med en 1,25 numeriske blenderåpning og en zoomfaktor av 2.2. Dette resulterer i en XYZ bildestørrelse på 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm. Disse innstillingene fange nok av overhuden med et gjennomsnitt på 4-6 nervefibre per bilde (figur 3A). Prøvetaking med høyere oppløsning ville nedskrive antallet av nerver i hvert bilde. Figur 3B viser en zoomfaktor 3,3, som reduserer XY området til 114.8 µm x 114.8 µm, resulterer i færre nerver per bilde. Ideell prøvetaking tetthet som definert av Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) for en 40 x nedsenking oljeobjektiv med en 1,25 numeriske blenderåpning antyder en XYZ skanneoppløsning på 54 nm x 54 nm x 205 nm. Dette ville kreve en zoomfaktor på 6,6 fold 1024 x 1024 oppløsning og redusere visningen XY 57.4 µm x 57.4 µm og bare ta et gjennomsnitt av 1-2 nerve per bilde (Figur 3 c).

Den neste fasen er å utføre image bearbeiding å fjerne uønskede deler av bildet og styrke signaler. I denne protokollen fjernes dermis og stratum corneum for å fokusere analysen på regionen i overhuden hvor IENFs innervate. Tredimensjonale programvare gjør det mulig å isolere, forbedre og analysere fluorescerende signaler. Verktøy i programvaren er nødvendig å isolere epidermal nerve og mitokondrier ved beskjæring ut områder over og under overhuden (figur 4A-C). Denne prosessen er forenklet ved å skjule signaler i en utvidet visning og deretter spore en Frihånd regionen rundt overhuden. Det beskårede bildet behandles videre av image restaurering algoritmer. Deconvolution brukes til å optimalisere oppløsningen til nerver og mitokondrie signaler (Figur 4 d).

Den siste fasen er å oppdage og ekstra morphometric funksjoner fra signaler. En viktig del av denne protokollen er å måle funksjoner i nerve produktspesifikk mitochondria. Analyseprogramvare har funksjoner som bruker overflater laget for et signal (i dette tilfellet nerve overflaten) som maskering verktøy å isolere et annet fluorescerende signal (i dette tilfellet mitokondrier) i overflaten. Det første trinnet i analyse av nerve produktspesifikk mitochondria er å skape 3D flater rundt nerver (figur 5A-B). Nerve flater brukes deretter beskjære nerve-spesifikke fluorescerende mitokondrie signaler (figur 5C, 5D, 5E, 5 G). Til slutt opprettes 3D flater rundt nerve-spesifikke mitokondrie signaler å få volumetriske målinger (figur 5F, 5H). Tabell 3 viser morphometric målinger som eksporteres fra analyseprogramvare og sammendragsdata. De viktigste verdiene eksportere er volum verdiene for nerve og nerve-spesifikke mitokondrie signaler. Volum dataene fra mitokondrier er binned for å generere mitokondrier størrelse frekvensdata, som deretter brukes til å opprette størrelse frekvens histogrammer (figur 6). Volum dataene brukes også til å lage sammendrag tiltak for antall mitokondrier per IENF volum og andelen mitokondrie volumet i IENF volumer.

Dataene som vises i tabell 3 og figur 6 viser at denne teknikken gir et middel for å kvantifisere mitokondrier i menneskelig IENFs fra hud biopsies. Nervene fra dette eksemplet har mitokondrier distribuert gjennom, og fleste mitokondrier er mellom 0,02 - 0.32 µm3. Disse størrelsene er i et område med normal mitokondrier36,37,38,39. Mindre mitokondrier har vist seg å være mer motile enn større mitokondrier39 antyder at mitokondrier i disse nervene kan være mer motile. Faktisk har studier innblandet at større, hovne mitokondrier ikke løfter og mindre mitokondrier og kan føre til axonal degenerasjon39,40,41. Derfor er karakteristikk av nerve produktspesifikk mitochondria en verdifull teknikk som ville være aktuelt å studier av nevrodegenerative sykdommer der endringer i mitokondrie morfologi og transport har vært forbundet med axonal degenerasjon 15,,25,,26,,27,,42,,43.

5% BSA blokkerer løsning
Komponenter av 5% BSA blokkerer løsning Beløpet som er nødvendig
Storfe Serum Albumin (BSA) [siste konsentrasjon: 5%] 0.625 g
1,0% Triton X-100 (TX-100) [siste konsentrasjon: 0,3%]
3.75 mL 1 x PBS ~8.125 mL Totalt (bruk 1 X PBS for å bringe totalvolum 12.5 mL) 12.5 mL

Tabell 1: 5% BSA blokkerer løsning. 5% BSA blokkerer løsningen brukes i tidlige trinn immunohistochemistry protokollen for å blokkere ikke-spesifikk binding av antistoffer.

1% BSA skylling løsning
Komponenter i 1% BSA skylling løsning Beløpet som er nødvendig
Storfe Serum Albumin (BSA) [siste konsentrasjon: 1%] 0.125 g
1,0% TX-100 [siste konsentrasjon: 0,3%] 3.75 mL
1 x PBS ~8.125 mL
Totalt (bruk 1 X PBS for å bringe totalvolum 12.5 mL) 12.5 mL

Tabell 2: 1% BSA skylling løsning. 1% BSA skylling løsning brukes i immunohistochemistry protokollen for å blokkere ikke-spesifikk binding av antistoffer som brukes for fortynne primære og sekundære antistoffer.

Morphometric mål for IENFs og Nerve-spesifikke mitokondrier
Eksporterte og sammendragsinformasjon Data fra analyseprogramvare
MT størrelse frekvens hyller Antall Mt i størrelse frekvens hylle Prosentandel av Mt i Bin Totalt antall Mt MT volum (µm3) IENF volum (µm3) Antall Mt per IENF volum (antall/100 µm3) Prosentandel av Mt volum i IENF volum Antall IENFs
mellom
0,2-.04 µm3		 20 24,4% 82 13.41 518.88 15.8 2,58% 4
mellom
.04-.08 µm3		 28 34,1%
mellom
.08-.16 µm3		 14 17,1%
mellom
.16-.32 µm3		 12 14,6%
mellom
.32-.64 µm3		 4 4,9%
mellom
.64-1,28 µm3		 3 3,7%
mellom
1,28-2.56 µm3		 1 1,2%
mellom
2.56 + µm3		 0 0,0%

Tabell 3: Morphometric mål for IENFs og Nerve produktspesifikk Mitochondria. Tabellen representerer morphometric verdier som måles og eksportert fra analyseprogramvare og sammendragsdata. Forkortelser: IENF, intraepidermal nerve fiber; MT, mitokondrier.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk Diagram representerer oppsettet for en 96-brønns Plate for huden biopsi Immunohistochemistry. Rader i platen representerer trinnene i protokollen for blokk, vask og inkubasjon løsninger og kolonner representerer personlige vev deler (fra 1 til 8 deler per plate). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant 3D AC Confocal mikroskopi bildet for en vev fra en menneskelig Epidermal biopsi behandlet for fluorescens Immunohistochemistry. Ubehandlet 3D projeksjon bildet illustrerer den (A) flettes fluorescerende signaler og personlige signaler (B) nerver (Nerve, grønn), (C) kjerner (Nuc, blå) og (D) mitokondrier (Mt, rød) i overhuden og dermis. Legg merke til mangel på signaler i stratum corneum laget av overhuden. Skalere barer = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Forbedret bilde oppløsning resulterer i færre nerver for påfølgende analyse. Alle bilder er tatt med en 40 X oljeobjektiv med en 1,25 numeriske blenderåpning og 3D anslagene illustrerer fluorescerende signaler til nerver (grønn), mitokondrier (Mt, rød) og kjerner (Nuc, blå). Et bilde tatt på en zoomfaktor 2.2 (A) inneholder flere nerver i visningen. Økende zoomfaktoren 3,3 (B) eller 6.6 (C), reduserer perfekt Nyquist prøvetaking, antall nerver i hvert bilde. Skalere barer = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Bildebehandling. Representant utvidet fokus (maksimale intensitet projeksjon) visningen av et bilde fra AC confocal mikroskopi for en vev fra en menneskelig epidermal biopsi. Ubehandlet projeksjon bildet illustrerer (A) den flettede fluorescerende signaler til nerver (grønn), kjerner (Nuc, blå) og mitokondrier (Mt, rød). Dermis og stratum corneum er (B) beskjæres en region av interesten (ROI) Frihånd markeringsverktøy (blå uthevede området, beskjære avkastning) isolere bare signaler i overhuden. (C) beskjæres overhuden behandles deretter for (D) deconvolution med beregnede punkt spredt funksjoner for å forbedre oppløsningen på nervene (grønn) og mitokondrie (Mt, rød) signaler. Skalere barer = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Bildeanalyse. Representant 3D AC confocal mikroskopi bildet illustrerer (A) nerve-spesifikke grønne fluorescerende signalet. (B) en 3D-overflate (cyan) opprettes for nerve signalet. Nerve-spesifikke mitokondrie signalet er isolert fra resten av (C) epidermal mitokondrie signaler (Mt, rød) av (D) med nerve overflaten som maskering verktøy. Den resulterende (E, G) nerve-spesifikke mitokondrie røde fluorescerende signalet brukes til å opprette (F, H) overflater (Mt overflaten, magenta) rundt mitokondrier i nerve overflaten (cyan). G og H er forstørret visninger av de hvite boksene i E og F. skala barer = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Mitokondrie størrelse frekvens histogrammet. Mitochondrialsurface data presenteres som et størrelse frekvens histogram visualisere prosentandelen av mitokondrier som finnes i hver av de ulike hyllene i henhold til deres volum (µm3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen er utformet for å isolere, kvantifisere og analysere størrelse og distribusjon av nerve-spesifikke mitokondrier i IENFs i 3D fra menneskelig hud biopsies. Det er flere viktige skritt i protokollen. Frittflytende fluorescens immunohistochemistry er beregnet på flekken og analysere flere signaler i hver prøve, gir en mer allsidig metode for utforskende forskning44,45. Denne prosedyren gir gjennomtrengning av antistoffer til vev for å maksimere oppkjøpet av bilder gjennom 50 µm delen, som er nødvendig for å anskaffe AC confocal mikroskopi bilder og 3D Analyser. Et annet viktig skritt er bilde oppkjøpet parameterne som er balansert mellom fange nok nerver per bilde samtidig oppløsning for å måle mitokondrier. Delene vev brukes i standard huden biopsi protokoller er ca 3 mm lange45,46,47,48. Oppkjøpet parameterne som beskrives i denne protokollen fange nok av overhuden med et gjennomsnitt på 4-6 nervefibre per bilde. Prøvetaking med høyere oppløsning ville redusere antall nerver i hvert bilde, spesielt på Nyquist prøvetaking. En tredje kritiske trinnet er å bruke deconvolution algoritmer for å bedre oppløsning og kontrast signaler, spesielt for mitokondrier. Deconvolution bilder bidratt til å kompensere for ikke prøvetaking med høyere oppløsning. Det siste kritiske trinnet er å bruke analyseprogramvare for å isolere nerve produktspesifikk mitochondria fra mitokondrier forbundet med celler i overhuden. Dette gjøres ved hjelp av nerve overflaten som maskering verktøy beskjære bildet mitokondrie signal som lokalisere i nerve.

Det er noen potensielle endringer av denne teknikken å vurdere. En mulig endring vil være å redusere varigheten til fluorescens immunohistochemistry. De natten incubations i den primære og sekundære antistoff løsninger på 4 ° C kan bli forkortet til 3-4 timer ved romtemperatur. Men øke kortere incubations ved romtemperatur ofte bakgrunnen fluorescens, så forsiktighet bør utvises å unngå dårlig signal til støy. En annen mulig endring vil være å justere bildet oppkjøpet parametere. Som nevnt ovenfor, bildeopptak beskrevet her var forutinntatt mot fange et rimelig antall nerver per bilde over høy bildeoppløsning. Det er mulig å bruke en høyere forstørrelse mål, for eksempel en 63 x oljeobjektiv nedsenking med en 1.3 numeriske blenderåpning. Hvis alle parametere forblitt et 63 X mål ble brukt og XY bildefeltet ville bli redusert til 112 µm x 112 µm og dermed redusere gjennomsnittlig antall nerver per bilde. Hovedpoenget er å bruke konsekvent parametere gjennom oppkjøp og påfølgende analyse.

Den viktigste begrensningen av denne teknikken er at det er tidkrevende. Immunohistochemistry tar 3 dager å behandle vev, bildeopptak tar ca 30-50 min per bilde avhengig av hvor mange optisk z-skritt er tatt, og bildeanalyse behandlingen tar ca 20 min. Dette er en betydelig tid forpliktelse, men gir viktig morphometric mål til slutt. En annen begrensning av denne teknikken er begrenset område av overhuden samples per bilde. Men vil dette utvilsomt forbedre fremskritt er gjort i bildet oppkjøpet priser med forbedret oppløsning kombinert med raskere datamaskin-prosessorer og analyseprogramvare.

Betydningen av denne protokollen over andre metoder er i kraft av kombinere fluorescens immunohistochemistry AC confocal mikroskopi og 3D bildeanalyser. Tradisjonelt er intraepidermal nerve fiber analyse gjort med chromogen basert immunohistochemistry og lyse-feltet mikroskopi, spesielt for kliniske diagnosen nevropati45,47,49. Bruk av fluorescens immunohistochemistry gjør det mulig å flekken og analysere flere signaler i hver prøve, gir en mer allsidig metode for utforskende forskning44,45. Denne teknikken gir en strategi for å isolere en bestemt signal av interesse, i dette tilfellet nerve-spesifikke mitokondriene, fra et komplekst signal mitokondrier tilknyttet epidermal celler.

Kraften i denne teknikken er dens nytte i fremtidige anvendelser. Isolere og måle nerve produktspesifikk mitochondria gjør det mulig å evaluere sykdom-indusert endring i størrelse og distribusjon av mitokondrier. Flere nevrologiske komplikasjoner har innblandet mitokondrie dysfunksjon som en potensiell mekanisme av sykdommen. Spesielt er en modifisert versjon av denne teknikken brukt til å vise at pasienter med diabetes og diabetisk Perifer nevropati har measureable endringer i størrelse og distribusjon av nerve produktspesifikk mitochondria sammenlignet med alder-matchet kontrollerer50. Denne teknikken vil være nyttig for å vurdere effektiviteten av terapi utviklet for å forbedre eller kurere sensoriske neuropathies. Endelig gjør allsidighet av teknikken det gjelder for en rekke analyser som bruker en fluorescerende signal for å isolere et delsett med data fra andre fluorescerende signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen konflikter av interesse å erklære.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse tilskudd K08 NS061039-01A2, The Program for nevrologi forskning & funn, og A. Alfred Taubman Medical Research Institute ved University of Michigan. Dette arbeidet brukte morfologi og Image Analysis kjernen i Michigan Diabetes Research Center, finansiert av nasjonale institutter for helse gi 5P 90 DK-20572 fra National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer. Forfatterne ønsker å takke J. Robinson Singleton og A. Gordon Smith (University of Utah) for deres generøse donasjonen av menneskelig hud prøver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Tags

Nevrobiologi problemet 127 mitokondrier intraepidermal nervefibre menneskelig hudbiopsi tredimensjonale imaging og analyse lite fiber nevropati
Tredimensjonale Imaging og analyse av mitokondrier i menneskelig Intraepidermal Nerve Fibre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, … More

Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter