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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/53369
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

Summary

Este protocolo usa tridimensional (3D) de imagem e análise técnicas para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. As técnicas são aplicáveis a outras situações onde um sinal fluorescente é usado para isolar um subconjunto de dados de outro sinal fluorescente.

Abstract

O objetivo do presente protocolo é estudar as mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas. Portanto, desenvolveram-se técnicas de análise e geração de imagens 3D para isolar o nervo específico mitocôndrias e avaliar alterações induzida por doença da mitocôndria na ponta distal dos nervos sensoriais. O protocolo combina imuno-histoquímica da fluorescência, microscopia confocal e técnicas de análise de imagem 3D para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. Parâmetros detalhados são definidos em todos os procedimentos a fim de fornecer um exemplo concreto de como usar essas técnicas para isolar o nervo específico mitocôndrias. Anticorpos foram usados para rotular o nervo e mitocondriais sinais dentro de seções de tecido da pele soco biópsias, que foi seguido por imunofluorescência indireta para visualizar os nervos e as mitocôndrias possuem um sinal fluorescente verde e vermelho, respectivamente. Z-série imagens foram adquiridas com microscopia confocal e software de análise 3D foi usado para processar e analisar os sinais. Não é necessário seguir os parâmetros exatos descritos dentro, mas é importante ser consistente com os escolhidos durante a coloração, etapas de aquisição e análise. A força deste protocolo é que é aplicável a uma ampla variedade de circunstâncias onde um sinal fluorescente é usado para isolar outros sinais que seriam impossíveis estudar sozinho.

Introduction

As mitocôndrias servem as funções celulares vitais que incluem a produção de energia celular, tampão cálcio e regulando necrótico e apoptose celular morte1,2,3. O sistema nervoso tem uma alta taxa metabólica, em comparação com o corpo4 , sugerindo que os neurônios geram um alto grau de energia celular na forma de adenosina trifosfato (ATP) através da respiração mitocondrial. Um monte de documentos de prova que funções neuronais são dependentes de ATP5, especialmente no sinapses6. Portanto, a distribuição de mitocôndrias dentro neurônios é importante.

Nos últimos 10 anos que um monte de informações mostrou que o tráfico e encaixe de mitocôndrias neuronais é altamente regulamentados. Proteínas do motor estão envolvidas na distribuição de mitocôndrias de compartimentos celulares específicos ao longo do neurônio. Tráfico de mitocôndrias é particularmente importante porque os neurônios projeto axônios e dendritos, longe do soma. Motor proteínas cinesina direto principalmente anterógrada (afastando-se da soma) tráfico de mitocôndrias ao longo dos microtúbulos, enquanto Dineína proteínas motor direto da motilidade retrógrada (em direção o soma)7,8,9 , 10. existem sinais de celulares como um potencial de membrana mitocondrial e condução do impulso que influenciam a presença e a direção de mitocondrial de tráfico11,12,13.

Além de transportar as mitocôndrias, existem proteínas especializadas para localizar as mitocôndrias de compartimentos celulares específicos que têm demandas de alta energia, tais como nós de Ranvier e sinapses8,14, 17. na verdade, a maioria das mitocôndrias dentro axônios são non-motile9,13,18. Proteínas especializadas como mitocôndrias de âncora syntaphilin de microtúbulos ao longo do axónio enquanto outras mitocôndrias de âncora de proteínas para o citoesqueleto de actina19–21. Íons como cálcio e fatores de crescimento têm sido relatados para apoiar a cessação do movimento de mitocôndrias localizá-los para regiões onde eles são necessários21,22,23.

Tomados em conjunto, o tráfico e o encaixe da mitocôndria são vitais para o bom funcionamento dos neurônios. Para apoiar isso, interrupção no tráfico mitocondrial tem sido associada com várias condições neurológicas, incluindo a doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth, doença de Huntington, espástica hereditária paraparesia e atrofia óptica15,24,25,26,27. Estudos recentes têm-se centrado na disfunção mitocondrial e patologia como um mecanismo potencial para neuropatia diabética, a perda sensorial associada com diabetes28,29,30,31 de32, ,33. A hipótese é que o diabetes altera a distribuição de mitocôndrias dentro as projeções sensoriais do nervo cutâneo. Portanto, uma técnica foi desenvolvida para visualizar e quantificar as mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas (IENFs), as pontas distais da raiz dorsal gânglio sensorial afferents. A técnica combina fluorescência immunohistochemistry específicos mitocondrial e rótulos de fibras nervosas com aquisição de z-series de microscopia confocal de sinais com software de análise de imagem 3D poderosa para medir a distribuição do nervo específico mitocôndrias de biópsias de soco cutâneo humano para atingir esse objetivo.

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Protocol

biópsias de pele soco foram obtidas a partir de temas que foram recrutados a partir de uma rede de grandes cuidados primários baseada na Comunidade, no centro de Diabetes da Universidade de Utah (Salt Lake City, UT). Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Michigan e respeitado os princípios da declaração de Helsinque. Escrito consentimento informado foi obtido de cada assunto antes do teste.

1. imuno-histoquímica da fluorescência

  1. preparar ponche biópsias para fibras nervosas intraepidérmicas imuno-histoquímica:
    1. pele de 3mm de realizar biópsias por médico pessoal e coloque a biópsia toda em 1.5 mL Zamboni ' s solução fixador (2% paraformaldeído, 0,3% saturada ácido pícrico em solução salina tamponada fosfato (PBS), pH 7,4) a 4 ° C durante a noite.
    2. Enxaguar amostras com uma solução de sacarose a 30% em PBS a 4 ° C por 16-24 h ou até que a amostra afunda.
    3. Incorporar amostras em temperatura ideal corte composto (OCT) usando um cryomold. Coloque a biópsia de toda 3 mm com a epiderme virado para baixo no molde e encher o molde com cerca de 2 mL de outubro Freeze o molde em gelo seco. Loja a-80 ° C até que esteja pronto para usar.
    4. Cortar 50 µm de espessura utilizando um criostato de secções transversais e armazenar em poços individuais de uma placa de 96 poços, usando a solução de armazenamento de anticongelante µ l 180 por alvéolo (30% de etileno glicol, glicerol 30% em PBS). As instruções seguintes são para 8 poços de uma placa bem 96. Mancha de seções de cada local de biopsia que são 200 a 300 µm longe um do outro.

dia 1:

  1. Quench não-específicas de rotulagem do estrato córneo:
    1. placa de 96 rótulo conforme mostrado na Figura 1.
    2. Pipetar 150 µ l de solução de potenciador sinal das ações para reduzir a ligação não específica de anticorpos secundários 34 , 35 em cada poço. Transferir as seções para solução de potenciador de sinal usando um loop inoculando.
      Nota: tenha cuidado ao trabalhar com o tecido para evitar danificar ou rasgar as secções de tecido. Manter em solução de potenciador de sinal por 30 minutos em temperatura ambiente em um balancim plana.
    3. Preparar enxágue poços nas linhas 2 e 3 da placa de 96 poços, adicionando 150 µ l de 1 x salina tampão fosfato (PBS) para cada poço.
    4. Transferir com cuidado as seções para linha 2 e enxágue em 1X PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    5. Enxaguar uma segunda vez em 1X PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente (linha 3).
  2. Preparar 5% albumina de soro bovino (BSA) obstrui a solução:
    1. preparar 5% obstrui a solução que contém 5% BSA e 0,3% Triton X 100 (TX-100) em 0.1 M PBS (ver quadro 1) enquanto seções estão incubando em solução de potenciador de sinal. BSA não entra facilmente em solução. Solução de vórtice até BSA dissolve-se completamente.
    2. Prepare poços de bloqueio na linha 4 da placa de 96 poços, acrescentando 150 µ l de BSA de 5%, solução de bloqueio para cada poço.
    3. Transferir seções em poços individuais de BSA de 5%, solução de bloqueio e incubar seções em 5% BSA obstrui a solução para 1-2 h à temperatura ambiente em um balancim plana.
  3. Preparar 1% BSA enxaguar a solução e a diluição de anticorpos primários:
    1. preparar 1% solução de lavagem que contém 1% de BSA e 0,3% TX-100 em 0.1 M PBS (ver quadro 2) enquanto as seções são incubação em solução a 5% BSA bloqueio. BSA não entra facilmente em solução. Solução de vórtice até BSA dissolve-se completamente.
    2. Diluir os anticorpos primários na solução de lavagem 1% BSA enquanto seções estão incubando em solução a 5% BSA bloqueio.
      1. Fazer 1.500 µ l da solução de anticorpo primário e adicionar a cada bem na linha 5.
      2. Diluir os anticorpos primários: usar o rótulo de nervo específico, produto de polyclonal antiproteína do gene coelho 9.5 (PGP9.5) em 1:1, 000. Use o rótulo de mitocôndrias específicos, mouse anticorpo de E2/E3bp de anticorpo monoclonal antipiruvato desidrogenase (PDH) a 1: 100 em BSA 1%, solução de lavagem.
  4. Anticorpo primário de preparar:
    1. Pipetar 150 µ l de anticorpo primário em cada bem na linha 5 da placa de 96 poços.
    2. Usando a ferramenta de laço, transferir seções a partir da solução de bloqueio (linha 4) para a linha 5, que contêm o anticorpo primário.
    3. Embrulhar a placa firmemente com parafilm para mantê-lo sequem.
    4. Local amostras plana basculante à temperatura ambiente durante 1 h e então incubar amostras a 4 ° c em um balancim plano durante a noite.

dia 2:

  1. enxaguar amostras:
    1. poços de enxaguamento preparar nas linhas 6, 7 e 8 da placa de 96 poços, adicionando 150 µ l de BSA 1%, solução de lavagem em cada poço.
    2. Transferir seções para a primeira solução a 1% BSA lavagem (linha 6) e incube por 1h à temperatura ambiente. Repita o enxágue duas vezes mais por seções em 1% de BSA enxaguar solução nas linhas 7 e 8 para 1 h cada à temperatura de incubação.
  2. Diluir a anticorpos secundários em BSA 1%, solução de lavagem:
    1. fazer 1.500 µ l da solução de anticorpo secundário enquanto seções estão incubando na última lavagem de 1% de BSA enxaguar solução (linha 8).
    2. Diluir a anticorpos secundários: para PGP9.5 (anticorpo antiverde-fluorescente cabra conjugados, 1: 1000), para PDH (vermelho-fluorescente conjugado cabra anti-rato, 1:1, 000) em BSA 1%, solução de lavagem.
  3. Anticorpo secundário preparar:
    1. Pipetar 150 µ l de anticorpo secundário na linha 9 da placa de 96 poços.
    2. Transferir suavemente as seções de 1% de BSA enxaguar solução (linha 8), em poços de anticorpo secundário (linha 9).
    3. Usando parafilm, enrole a placa firmemente para evitar que sequem. Cubra com papel alumínio. Colocar as amostras de basculante plana à temperatura ambiente durante 1 h e então incubar as amostras no 4 ˚ c um basculante plana durante a noite.

dia 3:

  1. preparar limpar 1X PBS pela filtragem através de um filtro de 0,22 µm:
    1. Pipetar 150 µ l de filtrado 1X PBS em linha 10, 11 e 12.
    2. Amostras de transferência para linha 10 e enxaguar em 1X PBS por 1h à temperatura ambiente. Cobrir a placa de 96 poços com papel alumínio e coloque sobre um roqueiro plano durante a lavagem. Repetição filtrado 1 x lavagem PBS duas vezes mais para 1 h à temperatura ambiente em linhas 11 e 12.
  2. Preparar corrediças do microscópio para cortes histologicos da montagem:
    1. colocar 50 µ l de filtrado 1X PBS em um slide.
    2. Seção de transferência de 1X PBS (linha 12), em 50 µ l drop. Posicione cuidadosamente a seção na gota de PBS desdobramento do tecido e achatamento-lo suavemente a lâmina de vidro. Remova o excesso PBS com uma pipeta de vidro para evitar diluir o reagente de montagem. Não toque em seções com o bulbo de vidro.
    3. Pipetar 1 - 2 gotas de reagente de montagem contendo DAPI diretamente sobre a seção sobre como usar o slide de microscópio cuidados para não perturbar a orientação da seção. Delicadamente, coloque uma lamela de vidro de microscópio de 50 x 24 mm #1.5 sobre a seção.
    4. Limpar quaisquer bolhas de ar que se formou ao colocar a lamela e limpe o excesso de líquido fora das bordas da lamela. Preparar um novo slide e repetir a montagem process para cada seção.
    5. Seco-cura os meios de montagem, colocando os slides na noite escura à temperatura ambiente. Transferir os slides para 4 ° C para curto prazo (1-2 semanas) ou a-20 ° C para armazenamento a longo prazo (mais de 2 semanas).
      Nota: Controlos negativos omitido os anticorpos primários para PGP9.5 ou PDH na etapa 1.4.2.2 e exibida sem rotulagem distinguíveis de nervos ou mitocôndria na epiderme. Positivo de controles foram realizadas para o PDH anticorpo para provar rótulos todas as mitocôndrias (dados não mostrados). Controles positivos foram realizados em neurônios de gânglio de raiz dorsal culta mouse principal que foram transformados com um baculovirus para mitocôndrias rótulo com um sinal de proteína fluorescente verde (GFP) fixo e manchados com o anticorpo do PDH e vermelho fluorescente anticorpo secundário. Todas as mitocôndrias que estavam expressando GFP foram co rotuladas com a etiqueta vermelha para imuno-histoquímica PDH (dados não mostrados).

2. Imagem latente confocal

  1. executar imagem latente confocal:
    1. coletar imagens usando um laser confocal microscópio com um 40 X objetivo de óleo-imersão (abertura numérica de 1.25 (N.A.)) em um microscópio invertido.
      1. Em cada plano focal sequencialmente adquirir sinais fluorescentes:
        núcleos: excitação λ = 405 nm, emissão espectral filtro λ = 420-480 nm
        fibras nervosas: excitação λ = 488 nm, emissão espectral filtro λ = 505-560 nm
        Mitoch ondria: excitação λ = 543 nm, emissão espectral filtro λ = 606-670 nm
    2. Insira os seguintes parâmetros de verificação dentro do software de microscópio: taxa de varredura de 600 Hz, com uma média de quadro 2 e zoom de 2.2; resolução de intensidade de 12 bits (4096 cinza níveis).
      1. Definir o software microscópio para resolução lateral otimizada (varredura resolução = 1.024 x 1.024) e seccionamento óptico/resolução axial (confocal abertura = 1 unidade arejada (AU) com tamanho de z-etapa de 210 nm).
        Nota: A resolução XYZ resultante é 172.2 nm x 172.2 nm, x 210 nm, com um tamanho de imagem de 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.
    3. Ativar um scan ao vivo para o sinal do nervo (verde-fluorescência) e ajuste o controle de foco-z para encontrar e definir a parte superior e inferior focais aviões no software microscópio que englobam o sinal do nervo dentro da seção de tecido. O z-gama total é tipicamente 30-50 µm para uma secção de tecido de 50 µm.
    4. Girar o campo de digitalização com o software microscópio durante um scan ao vivo para que a epiderme é posicionada horizontalmente ou verticalmente na imagem.
    5. Scan cada sinal separadamente e ajuste o detector (tubo fotomultiplicador, pgto) tensão e deslocamento para minimizar ou remover qualquer sobre e sob pixels saturados.
      Nota: Tempos de verificação com os parâmetros acima leva cerca de 20-40 min, dependendo do número de fatias de z.

3. 3D visualização e análise de mitocôndrias dentro humano fibras nervosas intraepidérmicas

  1. isolar a epiderme 3D:
    1. duplicar a imagem original e usar a intensidade máxima projeção (estendido vista foco) da imagem para identificar e isolar a epiderme.
    2. Usar uma ferramenta de interesse para o rastreamento ao longo das bordas superiores e inferiores da epiderme da região para remover áreas indesejadas, como o estrato córneo e derme que estão ausentes das fibras nervosas de intra-epidérmica. Colheita para esta selecção.
  2. Deconvolução de uso sobre o nervo e sinais fluorescentes mitocondriais:
    Nota: deconvolução ajuda a restaurar a integridade dos sinais fluorescentes. A restauração usada neste protocolo é chamada deconvolução cega porque ele usa os sinais fluorescentes nas imagens para determinar o quanto os sinais spread a partir de sua fonte original (ponto de espalhar função). O processo de melhora a resolução do sinal reatribuindo o sinal espalhado volta para seu local de origem.
    1. Calcular um ponto de espalhar função (PSF) para o sinal verde nervo fluorescente (verde-fluorescência) com os seguintes parâmetros:
      1. conjunto PSF calculado para confocal. Conjunto médio índice de refração para abertura de 1.515 e numérica de 1.25. Conjunto pinhole detector para 1 unidade arejada (U.A.). Comprimento de onda de excitação conjunto do laser de 488 nm e emissão de comprimento de onda a 515 nm.
    2. Calcular um PSF para o sinal mitocondrial fluorescente vermelho (vermelho-fluorescência) com os seguintes parâmetros:
      1. conjunto calculado PSF para confocal. Conjunto médio índice de refração para abertura de 1.515 e numérica de 1.25. Conjunto de pinhole detector para 1 AU. Conjunto da excitação comprimento de onda de 543 nm e emissão de comprimento de onda de 617 nm.
    3. Otimizar o nervo e mitocôndrias sinais fluorescentes por deconvolução usando o PSF correspondente listados acima e recurso de restauração iterativa definida em 100% de confiança e limite de uma iteração de 10 ciclos.
  3. Criar superfícies específicas do nervo:
    1. uso o " criar superfície " ferramenta para fazer uma superfície sólida dos nervos da deconvolved verde-fluorescente secundário rotulagem do PGP9.5 identificado nervos.
    2. Desmarque a " suave " apresentam e usar o recurso de intensidade absoluta para definir o limite para o sinal do nervo, uma vez que é significativamente mais brilhante do que a fluorescência de fundo.
    3. Usar o recurso de intensidade absoluta para definir o limite para o sinal do nervo, uma vez que é significativamente mais brilhante do que a fluorescência de fundo. Definir o valor de limiar baixo o suficiente para identificar com precisão os nervos.
    4. Filtro superfícies pequenas, não-nervo com base no tamanho.
      Nota: Se necessário, edite manualmente adicionais não-nervo superfícies dentro o " editar " guia mantendo a tecla CONTROL para destacar vários objetos e em seguida, excluí-los com a tecla Delete.
  4. Isolar nervo específico fluorescente mitocondrial sinal:
    1. Selecione a guia Editar da superfície do nervo para exibir o " Propriedades máscara " característica. A superfície de nervo criada em passos 3.3 é usada para isolar as mitocôndrias dentro desses nervos longe sinais mitocondriais associados com os queratinócitos.
    2. Como o " máscara todos ' botão abre um " canal de máscara " janela, escolher a puxar para baixo o menu sob o sinal vermelho-fluorescente deconvolved " seleção de canal " pelo sinal mitocondrial.
    3. Clique na caixa para colocar uma marca de seleção " canal duplicado antes de aplicar a máscara " opção.
    4. Clique no rádio botão na parte frontal o " constante dentro/fora " opção de máscara de configurações e clique na caixa para colocar uma marca de verificação " definir voxel fora da superfície para " opção e digite 0,00 para o valor. Botão de Okey clique para criar o novo canal que representa mitocondriais sinais dentro da superfície de nervo.
  5. Criar superfícies específicas de mitocôndrias:
    1. uso o " criar superfície " ferramenta para fazer uma superfície sólida das mitocôndrias do recém-criado canal fluorescente dos sinais específicos do nervo mitocondriais de passos 3.4.
    2. Desmarque o " suave " apresentam e selecione o " fundo subtração " característica para definir o limite. Esse recurso usa o contraste local ao redor do sinal mitocondrial para identificar mitocôndrias de fundo.
    3. Conjunto de valor de limite baixo o suficiente para identificar com precisão as mitocôndrias. Neste exemplo, o limite inferior foi fixado em 2.000 para uma escala de 16 bits (65.536).
    4. Filtro mitocondriais superfícies com base no tamanho. Neste exemplo, que o limite de voxel foi definido como 1,0 voxels, que é o mais baixo limite possível. Se necessário, edite manualmente superfícies não-mitocôndrias dentro o " editar " guia, mantendo a tecla CONTROL para selecionar vários objetos e em seguida, excluí-los com a tecla Delete.
      Nota: Ocasionalmente, o software irá criar superfícies que não estão associadas com um sinal mitocondrial fluorescente distinguível. Nesses casos, é possível removê-los com o " editar " Tab
  6. De exportação e calcular valores morfométricos para análise:
    1. Exportar valores de nervo e superfícies mitocondriais do " estatísticas " guia para posterior análise com o software de planilha eletrônica.
    2. Exportar os valores de volume para o nervo e superfícies mitocondriais.
    3. Contar o número de fibras nervosas individuais presentes em cada imagem e gravar o valor na planilha eletrônica.
    4. Para cada imagem, calcular os seguintes valores de potenciais para análise na planilha eletrônica:
      1. soma dos volumes de todas as superfícies de nervo.
      2. Filtro específico nervo mitocondrial superfícies abaixo um volume de menos de 0,02 µm 3 e bin as superfícies pelo tamanho. Por exemplo, usar caixotes como 0,02 - 0,04 0,04 - 0.08 0.08 - 0,16, 0.16 - 0.32, 0.32 - 0,64, 0,64 - 1.28, 1.28-2,56, superior a 2,56 µm 3.
        Nota: O limite inferior do volume mitocondrial foi definido como 0,02 µm 3 com base nos volumes publicados anteriormente de mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Contar o número de superfícies mitocondriais de nervo específico dentro de cada bin e o número total das superfícies sobre as lixeiras (0,02 - superior a 2,56 µm 3).
      4. Calcular a proporção das superfícies mitocondriais de nervo específico em cada bin. Usa a contagem por bin dividido pelo número total de superfícies de mitocôndrias.
      5. Somar os volumes para todas as superfícies mitocondriais nervo específico.
      6. Calcular a proporção de nervo com sinal mitocondrial dividindo o volume de superfície total do nervo pela soma de todos os volumes de superfície mitocondriais.
      7. Calcular o número de mitocôndrias por volume de nervo dividindo o volume de superfície total do nervo pela contagem de todas as superfícies mitocondriais.

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Representative Results

Visualização e quantificação das mitocôndrias dentro de IENFs humanas

Imuno-histoquímica da fluorescência permite a marcação simultânea de múltiplos sinais dentro de biópsias de pele humana para visualizar os nervos, mitocôndrias e núcleos. Uma placa de 96 poços é uma maneira conveniente de organizar as etapas do procedimento de imuno-histoquímica. A Figura 1 mostra que este contas de configuração para até 8 seções a serem processadas através das 12 fases de soluções. O método flutuante combinado com agitação suave com um roqueiro plana garante que os anticorpos tenham acesso suficiente para penetrar as seções de ambos os lados. O protocolo leva 3 dias para concluir, que é em grande parte devido a incubação do pernoite em anticorpos primários e secundários a 4 ° C, que consistentemente rotular os nervos e mitocôndrias.

O resto do procedimento incorpora imaging, processamento e análise dos sinais fluorescentes. Microscopia confocal aproveita os sinais fluorescentes opticamente seção sinais discretos de plano focal, eliminando os sinais fora de foco. Aquisição das z-séries através da seção de tecido fornece uma representação 3D dos sinais fluorescentes para núcleos, mitocôndrias e nervos. Os parâmetros são otimizados para imagem 172 µm ao longo do comprimento da epiderme que incluiria uma média de 5 nervos. A Figura 2 ilustra uma típica imagem 3D dos três sinais fluorescentes que são recolhidos a partir da epiderme. O PGP9.5 de coloração (Figura 2B) fornece um sinal rico dos nervos epidérmicos e dérmicos que é de uma intensidade mais elevada do que a autofluorescência do fundo do tecido. A mancha nuclear (Figura 2) ajuda a identificar os limites da epiderme onde inervam as fibras nervosas intraepidérmicas. É comum para a camada externa da epiderme ter um sinal difuso que pode ser devido ao DNA residual nos corneócitos que compõem o estrato córneo. As mitocôndrias são claramente identificadas pela coloração (Figura 2D) onde a maioria do sinal está associada a células da epiderme que são principalmente queratinócitos o PDH.

Os parâmetros de aquisição descritos neste protocolo usam um 40 X objetivo de imersão de óleo com uma abertura numérica de 1.25 e um fator de zoom de 2.2. Isso resulta em um tamanho de imagem XYZ de 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm. Essas configurações de captura suficiente da epiderme para incluir uma média de 4-6 fibras nervosas por imagem (Figura 3A). Amostragem em resolução maior reduziria o número de nervos em cada imagem. Figura 3B mostra um fator de zoom de 3.3, que reduz a área XY para 114,8 µm x 114,8 µm, resultando em menos nervos por imagem. A densidade de amostragem ideal, conforme definido pelo Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) para um 40 x objetivo de imersão de óleo com uma abertura numérica de 1.25 sugere uma resolução de digitalização XYZ de 54 nm a x 54 nm a x 205 nm. Isto requer um fator de zoom de 6.6 dobra com resolução de 1.024 x 1.024 e reduzir a exibição XY para 57.4 µm x 57.4 µm e captura apenas uma média de 1-2 nervo por imagem (Figura 3).

A próxima fase é para executar o processamento de imagem para remover indesejados de regiões da imagem e para melhorar os sinais. Neste protocolo a derme e o estrato córneo são removidos a fim de concentrar a análise sobre a região da epiderme onde inervam as IENFs. Software tridimensional torna possível isolar, melhorar e analisar os sinais fluorescentes. Ferramentas do software são necessários para isolar o nervo epidérmico e mitocôndrias, corte fora as regiões acima e abaixo da epiderme (Figura 4A-C). Este processo é simplificado pela recolhendo os sinais em um modo de exibição estendido e então traçando uma região à mão livre em torno da epiderme. É ulteriormente, por algoritmos de restauração de imagem, a imagem recortada. Deconvolução é usada para otimizar a resolução dos nervos e sinais mitocondriais (Figura 4).

A fase final é para detectar e extrair características morfométricas dos sinais. Um aspecto importante do protocolo é medir características das mitocôndrias de nervo específico. Software de análise de imagem tem características que usam superfícies criadas para um sinal (no caso a superfície de nervo) como uma ferramenta de mascaramento para isolar outro sinal fluorescente (na mitocôndria neste caso) dentro essa superfície. O primeiro passo na análise do nervo específico mitocôndrias é criar superfícies 3D em torno de nervos (Figura 5A-B). As superfícies de nervos são usadas para cortar os nervo específico fluorescentes sinais mitocondriais (Figura 5, 5D, 5E, 5g). Finalmente, superfícies 3D são criadas em torno dos sinais mitocondriais de nervo específico para obter medições volumétricas (Figura 5F,5h). A tabela 3 mostra as medidas morfométricas que são exportadas do software de análise de imagem e dados de resumidos. Os principais valores para exportar são os valores de volume para o nervo e mitocondriais sinais específicos do nervo. Os dados do volume de mitocôndrias são guardados para gerar dados de frequência do tamanho de mitocôndrias, que são usados para criar histogramas de frequência de tamanho (Figura 6). O volume de dados também é usados para fazer medidas resumidas para número de mitocôndrias por volume IENF e percentagem de volume mitocondrial dentro de volumes IENF.

Os dados apresentados na tabela 3 e Figura 6 demonstram que esta técnica proporciona um meio de quantificar as mitocôndrias dentro de IENFs humanas de biópsias de pele. Os nervos desta amostra possuem mitocôndrias distribuídas e a maioria das mitocôndrias são entre 0,02 - 0,32 µm3. Esses tamanhos são em uma escala associada a mitocôndria normal36,37,38,39. Mitocôndrias menores foram mostradas para ser mais móveis do que maior de mitocôndrias39 sugerindo que as mitocôndrias nestes nervos podem ser mais motile. De fato, estudos têm implicados que mitocôndrias maiores, inchadas não transporte bem como mitocôndrias menores e podem levar a degeneração axonal39,40,41. Portanto, a caracterização de nervo específico mitocôndrias é uma valiosa técnica que seria aplicável a estudos de doenças neurodegenerativas, onde mudanças na morfologia mitocondrial e transporte têm sido associadas com degeneração axonal 15,25,26,,27,42,43.

Solução a 5% BSA bloqueio
Componentes de BSA de 5%, solução de bloqueio Quantidade necessária
Albumina de soro bovino (BSA) [concentração Final: 5%] 0,625 g
1.0% Triton X-100 (TX-100) [concentração Final: 0,3%]
3,75 mL 1X PBS ~8.125 mL TOTAL (use 1X PBS para trazer o volume total de 12,5 mL) 12,5 mL

Tabela 1: 5% BSA bloqueando solução. A solução a 5% BSA bloqueio é usada nos primeiros passos do protocolo de imuno-histoquímica para bloquear a ligação não-específica dos anticorpos.

Solução de lavagem 1% BSA
Componentes da BSA 1%, solução de lavagem Quantidade necessária
Albumina de soro bovino (BSA) [concentração Final: 1%] 0,125 g
1.0% TX-100 [concentração Final: 0,3%] 3,75 mL
1X PBS ~8.125 mL
TOTAL (use 1X PBS para trazer o volume total de 12,5 mL) 12,5 mL

Tabela 2: 1% BSA enxaguar solução. A BSA 1% solução de lavagem é usada no protocolo de imuno-histoquímica para bloquear a ligação não-específica dos anticorpos e usada para diluir a anticorpos primários e secundários.

Medidas morfométricas para IENFs e nervo específico mitocôndrias
Exportado e resumidos de dados do Software de análise de imagem
Tamanho de MT frequência escaninhos Número de Mt em tamanho frequência Bin Percentagem de Mt em Bin Número total de Mt Volume de MT (µm3) IENF Volume (µm3) Número de Mt por IENF Volume (número/100 µm3) Percentagem do Volume de Mt em Volume IENF Número de IENFs
entre
.02-.04 µm3		 20 24,4% 82 13.41 518.88 15,8 2,58% 4
entre
.04-.08 µm3		 28 34,1%
entre
.08-.16 µm3		 14 17,1%
entre
.16-.32 µm3		 12 14,6%
entre
.32-.64 µm3		 4 4,9%
entre
.64-1.28 µm3		 3 3,7%
entre
1.28-2,56 µm3		 1 1,2%
entre
2,56 + µm3		 0 0,0%

Tabela 3: Medidas morfométricas para IENFs e nervo específico mitocôndrias. A tabela representa valores morfométricos que são medidos e exportados do software de análise de imagem e dados de resumo. Abreviaturas: IENF, as fibras nervosas intraepidérmicas; MT, mitocôndrias.

Figure 1
Figura 1 : Diagrama esquemático que representa a configuração de uma placa de 96 poços para Immunohistochemistry de biópsia de pele. Linhas na placa representam passos no protocolo para soluções de bloco, lavagem e incubação e colunas representam seções individuais do tecido (de 1 a 8 seções por placa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Representante 3D imagem de microscopia Confocal de uma amostra de tecido de uma biópsia epidérmica humana processado para fluorescência Immunohistochemistry. Projeção em 3D no seu estado inalterado imagem ilustra os sinais fluorescentes (A) mescladas e sinais individuais para (B) nervos (nervo, verde), (C) núcleos (Nuc, azul) e (D) mitocôndrias (Mt, vermelho) na epiderme e derme. Note a falta de sinais na camada do estrato córneo da epiderme. Escala de barras = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Melhorou a imagem resolução resulta em menos nervos para posterior análise. Todas as imagens são capturadas com um objectivo de óleo X 40 com uma abertura numérica de 1.25 e as projeções 3D ilustram os sinais fluorescentes para nervos (verde), mitocôndrias (Mt, vermelho) e núcleos (Nuc, azul). Uma imagem tirada em um fator de zoom de 2.2 (A) contém vários nervos dentro da visão. Aumentando o fator de zoom 3.3 (B) ou 6.6 (C), a amostragem de Nyquist ideal, reduz significativamente o número de nervos dentro de cada imagem. Escala de barras = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Processamento de imagem. Representante estendido vista de foco (projeção de intensidade máxima) de uma imagem de microscopia confocal de uma amostra de tecido de uma biópsia epidérmica humana. Imagem de projeção não transformados ilustra o (A) o fluorescente mesclado sinais para os nervos (verdes) e núcleos (Nuc, azul) e mitocôndrias (Mt, vermelho). A derme e o estrato córneo são (B) cortadas para fora com uma região de inteferramenta de seleção à mão livre de resto (ROI) (azul área realçada, ROI de culturas) isolando apenas sinais na epiderme. A epiderme (C) cortada é então processada para (D) deconvolução com ponto calculado espalhar funções para melhorar a resolução dos nervos (verde) e mitocondrial (Mt, vermelho) sinais. Escala de barras = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Análise de imagem. Imagem de microscopia confocal 3D representante ilustra o (A) o sinal fluorescente verde de nervo específico. (B) uma superfície 3D (ciano) é criada para o sinal do nervo. O sinal mitocondrial nervo específico é isolado do resto dos sinais mitocondriais epidérmicos (C) (Mt, vermelho) por (D) usando a superfície de nervo como uma ferramenta de mascaramento. A resultante (E, G) sinal fluorescente vermelho mitocondrial de nervo específico é usado para criar (F, H) (superfície de Mt, magenta) de superfícies ao redor as mitocôndrias dentro da superfície do nervo (ciano). G e H são vistas ampliadas das caixas brancas em E e F. escala barras = 20 µm (A-F), 5 µm (G-H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Histograma de frequência tamanho mitocondrial. Mitochondrialsurface os dados são apresentados como um histograma de frequência de tamanho para visualizar a porcentagem de mitocôndrias que estão presentes em cada um dos vários escaninhos de acordo com o respectivo volume (µm3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo é projetado para isolar, quantificar e analisar o tamanho e a distribuição de mitocôndrias de nervo específico dentro IENFs em 3D de biópsias de pele humana. Existem vários passos críticos no protocolo. A imuno-histoquímica da fluorescência flutuante é projetada para manchar e analisar vários sinais em cada amostra, fornecendo uma metodologia mais versátil para pesquisa exploratório44,45. Este procedimento permite a penetração dos anticorpos no tecido a fim de maximizar a aquisição de imagens em toda a seção de 50 µm, que é necessário para a aquisição de imagens de microscopia confocal e análise 3D. Outro passo crítico é os parâmetros de aquisição de imagem que são equilibrados entre captura bastante nervos por imagem, mantendo a resolução para medição de mitocôndrias. As secções de tecido usado no presente e os protocolos de biópsia de pele padrão são aproximadamente 3 mm longo45,46,47,48. Os parâmetros de aquisição descrito na captura deste protocolo suficiente da epiderme para incluir uma média de 4-6 fibras nervosas por imagem. Amostragem em resolução maior reduziria significativamente o número de nervos em cada imagem, especialmente na amostragem de Nyquist. Uma terceira etapa crítica é usar algoritmos de deconvolução para melhorar a resolução e contraste dos sinais, especialmente para as mitocôndrias. Deconvolução das imagens ajudou a compensar não amostragem em maior resolução. A última etapa crítica é usar software de análise de imagem para isolar o nervo específico mitocôndrias de mitocôndrias associadas com células na epiderme. Isto é realizado usando-se a superfície de nervo como uma ferramenta de mascaramento para cortar sinal mitocondrial que localizar dentro do nervo.

Existem algumas modificações potenciais desta técnica a considerar. Uma modificação possível seria diminuir a duração da imuno-histoquímica da fluorescência. A incubação do durante a noite nas soluções de anticorpo primário e secundário a 4 ° C pode ser reduzida para 3-4 horas em temperatura ambiente. No entanto, muitas vezes incubação do menor à temperatura aumenta fluorescência de fundo, assim que devem ser tomadas precauções para evitar o pobre sinal para ruído. Outra modificação possível seria ajustar os parâmetros de aquisição de imagem. Como mencionado acima, a aquisição de imagem descrita aqui estava inclinado para capturar um número razoável de nervos por imagem em alta resolução de imagem. É possível usar um objectivo maior de ampliação, como um objectivo de imersão de óleo 63 x com uma abertura numérica 1,3. Se todos os parâmetros permanecem o mesmo, e utilizou-se um objectivo X 63, o campo de imagem XY seria reduzido a 112 µm x 112 µm e, portanto, reduzir o número médio de nervos por imagem. O ponto principal é usar parâmetros consistentes em toda a aquisição e posterior análise.

A principal limitação dessa técnica é que é demorado. A imuno-histoquímica leva 3 dias para processar o tecido, aquisição de imagem leva cerca de 30 a 50 min por imagem dependendo de quantos ópticos z-medidas e processamento de imagem/análise leva cerca de 20 min. Este é um compromisso de tempo significativo, mas produz medições morfométricas importante no final. Uma outra limitação dessa técnica é a área limitada da epiderme amostrado por imagem. No entanto, isto irá melhorar, sem dúvida, como os avanços são feitos em taxas de aquisição de imagem com melhor resolução combinada com processadores mais rápidos de computador e software de análise.

O significado do presente protocolo sobre outros métodos é o poder de combinar fluorescência imuno-histoquímica com microscopia confocal e análise de imagens 3D. Tradicionalmente, a análise de fibras nervosas intraepidérmicas é feito com cromogénio baseado imuno-histoquímica e microscopia de campo claro, especialmente para o diagnóstico clínico de neuropatia45,,47,49. O uso de imuno-histoquímica da fluorescência torna possível para manchar e analisar vários sinais em cada amostra, fornecendo uma metodologia mais versátil para pesquisa exploratório44,45. Esta técnica fornece uma estratégia para isolar um sinal particular de interesse, neste caso específico do nervo mitocôndrias, de um sinal complexo, mitocôndrias associadas com células epidérmicas.

O poder desta técnica é sua utilidade em aplicações futuras. A capacidade de isolar e medir mitocôndrias nervo específico torna possível avaliar alteração induzida por doença, o tamanho e a distribuição de mitocôndrias. Várias complicações neurológicas têm implicados disfunção mitocondrial como um mecanismo potencial da doença. Em particular, uma versão modificada desta técnica serviu para demonstrar que os pacientes com diabetes e neuropatia periférica diabética têm mudanças mensuráveis no tamanho e na distribuição de mitocôndrias de nervo específico em relação a idade-correspondido controla a50. Esta técnica seria útil para a avaliação da eficácia das terapias destinadas a melhorar ou curar neuropatia sensorial. Finalmente, a versatilidade da técnica torna aplicável a uma ampla gama de análises que usam um sinal fluorescente para isolar um subconjunto de dados de outros sinais fluorescentes.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde subsídios K08 NS061039-01A2, o programa de pesquisa de Neurologia & descoberta e o r. Alfred Taubman Medical Research Institute da Universidade de Michigan. Este trabalho usou a morfologia e o núcleo de análise de imagem do Michigan Diabetes Research Center, financiado pelos institutos nacionais de saúde Grant 5P 90 DK-20572 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças renais e digestivo. Os autores gostaria de agradecer a J. Robinson Singleton e a Gordon Smith (Universidade de Utah), por sua generosa doação de amostras de pele humana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

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