Summary
Этот протокол использует трехмерные (3D) методы визуализации и анализа для визуализации и количественно нерва конкретных митохондрий. Методы применяются в других ситуациях, где один флуоресцентные сигнал используется для того, чтобы изолировать подмножество данных из другой флуоресцентного сигнала.
Abstract
Целью настоящего Протокола является изучение митохондрий в пределах intraepidermal нервных волокон. Таким образом 3D визуализации и анализа методов были разработаны для изолировать нерва конкретных митохондрии и оценивать болезнь индуцированные изменения митохондрий в дистального наконечника сензорных нервах. Протокол сочетает в себе флуоресценции иммуногистохимии, конфокальная микроскопия и методы анализа 3D изображение для визуализации и количественно нерва конкретных митохондрий. Подробные параметры определяются на протяжении процедуры для того, чтобы обеспечить конкретным примером того, как использовать эти методы для изоляции нервных специфичные митохондрий. Антитела были использованы для обозначения нерва и митохондриальной сигналов в рамках разделов ткани кожи пунш биопсий, который последовал непрямой иммунофлюоресценции для визуализации нервы и митохондрии с зеленым и красным флуоресцентного сигнала соответственно. Z-серии изображения были приобретены с помощью конфокальной микроскопии и программное обеспечение для 3D-анализа была использована для обработки и анализа сигналов. Это не обязательно следовать точные параметры, описанные в, но важно соответствовать те выбрали во всем окрашивание, сбора и анализа данных шаги. Сила настоящего Протокола является, что это применимо к самые разнообразные обстоятельства, где один флуоресцентные сигнал используется для того, чтобы изолировать других сигналов, которые в противном случае будет невозможно учиться самостоятельно.
Introduction
Митохондрии служат жизненно важные клеточные функции, которые включают производство энергии клеток, буферизация кальция и регулирование некротические и apoptotic клеток смерти1,2,3. Нервная система имеет высокую скорость метаболизма, по сравнению с тела4 , предполагая, что нейроны генерировать высокий уровень клеточной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ) через митохондриальное дыхание. Много доказательств документы, что нейронные функции зависят от АТФ5, особенно на синапсы6. Таким образом распределение митохондрий в пределах нейронов имеет важное значение.
За последние 10 лет много информации показал, торговлей и стыковка нейрональных митохондрий жестко регламентируется. Моторные белки участвуют в распространении митохондрий конкретных сотовых отделений во всем нейроном. Торговля митохондрий особенно важна, потому что нейроны проекта аксонов и дендритов вдали от Сома. Кинезин моторов белков главным образом прямые, антероградная (от soma) торговля митохондрий вдоль микротрубочек во время Динеин моторов белков прямой ретроградным (в сторону сома) моторики7,8,9 , 10. Существует клеточных сигналов такой митохондриальной мембранного потенциала и проводимости импульса, которые влияют на наличие и направление митохондриальной людьми11,12,13.
Помимо транспортировки митохондрий, существуют специализированные белки для локализации митохондрий для конкретных клеточных отсеков, которые предъявляют требования высокой энергии, таких как узлы по Ranvier и синапсы8,14, 17. В самом деле, большинство из митохондрий в пределах аксоны являются не подвижные9,13,18. Специализированные белки, как syntaphilin якорь митохондрий в микротрубочки вдоль аксоны в то время как другие белки митохондрий якорь в Цитоскелет актина19–21. Факторы роста и ионов, таких как кальций были зарегистрированы в поддержку прекращения движения митохондрий локализовать их в районы, где они являются необходимой21,22,23.
Взятые вместе, торговли людьми и закрепления митохондрий жизненно важное значение для надлежащего функционирования нейронов. В поддержку этого нарушения в митохондриальной людьми была связана с нескольких неврологических условий включая болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб, болезнь Хантингтона, наследственные спастический парезами и атрофия зрительного нерва15,24,25,,2627. Недавние исследования были сосредоточены на митохондриальной дисфункции и патологии как потенциального механизма для диабетической невропатии, сенсорные потери, связанные с диабетом28,,2930,31 ,32,33. Гипотеза является, что диабет изменяет распределение митохондрий в пределах сенсорные прогнозы конца кожный нерв. Таким образом метод был разработан для визуализации и количественно митохондрий в пределах intraepidermal нервных волокон (IENFs), дистальная советы корень спинной ганглий сенсорные афферентов. Техника сочетает в себе флуоресценции иммуногистохимия конкретных митохондриальных и нервных волокон этикетки с приобретением confocal микроскопии z серии сигналов с мощным 3D изображений программное обеспечение для анализа для измерения распределения нерва конкретных Митохондрии от человека кожный пробивать биопсии для достижения этой цели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
биопсия кожи удар были получены от предметов, которые были набраны из сети большой первичной помощи на базе общин в университете штата Юта диабет-центр (Солт-Лейк-Сити, UT). Это исследование было утверждено институциональных Наблюдательный Совет университета Мичигана и соблюдает принципы Хельсинкской декларации. Написанных информированное согласие было получено от каждого предмета до тестирования.
1. флуоресценции иммуногистохимия
- подготовить удар биопсии для иммуногистохимии intraepidermal нервных волокон:
- выполнять 3 мм кожи биопсии, медицинский персонал и место биопсии целый в 1,5 Мл Zamboni ' s фиксирующие раствор (параформальдегида 2%, 0,3% насыщенных пикриновой кислоты в фосфатный буфер (PBS), рН 7,4) при 4 ° C на ночь.
- Промыть образцы с раствором 30% сахарозы в PBS на 4 ° C для 16-24 ч или до тех пор, пока образец погружается.
- Вставить образцы оптимального раскроя температуры смеси (OCT) с помощью cryomold. Место биопсии целый 3 мм с эпидермисом, вниз в форму и заполнить форму с примерно 2 мл октября замораживания плесень на измельченного сухого льда. Хранить при температуре-80 ° C до готовой к использованию.
- Вырезать 50 мкм толщиной сечения с помощью криостат и хранить в отдельных скважинах 96-луночных пластины с помощью 180 мкл антифриз хранения решения за хорошо (30% этиленгликоля, 30% глицерина в PBS). Следующие направления предназначены для 8 скважин 96 хорошо плиты. Пятно от каждого сайта биопсии разделы, которые являются 200-300 мкм друг от друга.
день 1:
- утолить неспецифичный Этикетировочный из рогового:
- Label 96-луночных пластину как показано на рис. 1.
- Пипетки 150 мкл запасов сигнала усилитель решение уменьшить неспецифического связывания вторичные антитела 34 , 35 в каждой скважине. Перевести разделы в решение усилитель сигнала с использованием пересевать цикла.
Примечание: Будьте осторожны во время работы с ткани, чтобы избежать повреждения или разрывов разделов ткани. Держите в растворе усилитель сигнала для 30 минут при комнатной температуре на плоской рокер. - Подготовка промывки скважин в строках 2 и 3 96-луночных пластины, добавив 150 мкл 1 x-фосфатный буфер (PBS) в каждой скважине.
- Тщательно передачи Секции в строке 2 и промыть в однократном ПБС втечение 10 мин при комнатной температуре.
- Промыть во второй раз в однократном ПБС втечение 10 мин при комнатной температуре (строка 3).
- Подготовить 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) преграждая разрешение:
- подготовить блокирования решения, содержащего 5% BSA 5% и 0,3% Тритон X 100 (TX-100) в 0,1 М PBS (см. таблицу 1), а разделы инкубации в решение усилитель сигнала. BSA не вдаваться в раствор легко. Вихревой решения до тех пор, пока полностью растворяется BSA.
- Подготовить блокировки скважины в строке 4 96-луночных пластины, добавив 150 мкл 5% BSA, преграждая разрешение в каждой скважине.
- Переноса разделов в индивидуальные добра 5% BSA, преграждая разрешение и инкубировать секций в 5% BSA, преграждая разрешение для 1-2 ч при комнатной температуре на плоской рокер и.
- Подготовить 1% BSA полоскания раствор и разбавления первичных антител:
- подготовить 1% полоскания решение, содержащее BSA 1% и 0,3% TX-100 в 0,1 М PBS (см. таблицу 2), а разделы являются инкубации в 5% BSA блокирования решения. BSA не вдаваться в раствор легко. Вихревой решения до тех пор, пока полностью растворяется BSA.
- Развести первичных антител в промывной раствор 1% BSA в то время как разделы инкубации в 5% BSA блокирования решения.
- 1 500 мкл раствора первичного антитела и добавить к каждому хорошо в строке 5.
- Развести первичного антитела: используйте ярлык нерв конкретных, кролика polyclonal против белка гена продукт 9.5 (PGP9.5) 1:1, 000. Использовать метку митохондрии конкретных, мышь моноклонального анти пируват дегидрогеназа E2/E3bp антитела (PDH) в 1: 100 в 1% BSA полоскания решения.
- Подготовка основного антитела:
- 150 Накапайте µL первичных антител в каждый хорошо в строке 5 пластину 96-луночных.
- С помощью инструмента цикла, передачи секции от блокирования решения (строка 4) в строке 5, содержащий основное антитело.
- Обертывание пластины плотно с парафина держать его от высыхания.
- Образцы на плоских рокер при комнатной температуре в течение 1 ч и затем Проинкубируйте образцы на 4 ° c на плоской рокер на ночь.
день 2:
- промыть образцы:
- подготовить промывки скважин в строках 6, 7 и 8 96-луночных пластины, добавив 150 мкл 1% BSA полоскание решения в каждой скважине.
- Переноса разделов в первый промывной раствор 1% BSA (строка 6) и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Повторить полоскание вдвое больше по инкубации секций в 1% BSA полоскания раствор в строках 7 и 8 за 1 ч при комнатной температуре.
- Разбавленных вторичных антител в 1% BSA полоскания решение:
- сделать 1500 мкл раствора вторичное антитело в то время как разделы инкубации в последней промывки 1% BSA полоскания раствор (строка 8).
- Развести вторичные антитела: для PGP9.5 (антитела анти кролик зеленый люминесцентной конъюгированных коза, 1: 1000), для PDH (красный люминесцентные конъюгированных коза анти мышь, 1:1, 000) в 1% BSA полоскания решения.
- Подготовить вторичные антитела:
- пипетки 150 мкл вторичных антител в строку 9 пластину 96-луночных.
- Аккуратно перенести разделы с 1% BSA полоскания раствор (строка 8) в вторичное антитело скважины (строка 9).
- Использование парафина, оберните пластины плотно, чтобы сохранить его от высыхания. Накрыть алюминиевой фольгой. Поместите образцы на плоских рокер при комнатной температуре в течение 1 ч и затем Проинкубируйте образцы на 4 ° c на плоской рокер на ночь.
день 3:
- Подготовка чистота ПБС, фильтрация через фильтр 0,22 мкм:
- 150 Накапайте µL из отфильтрованных ПБС в строку 10, 11 и 12.
- Передавать строку 10 образцов и промыть в ПБС за 1 ч при комнатной температуре. Крышка 96-луночных с алюминиевой фольгой и поместите на плоской рокер во время полоскания. Повтор фильтруют 1 x PBS промыть два больше раз за 1 ч при комнатной температуре в строках 11 и 12.
- Подготовить Микроскоп слайды для монтирования разделов ткани:
- место 50 мкл фильтруют на слайде ПБС.
- Передачи секции с ПБС (строка 12) в 50 мкл падение. Осторожно поместите раздел в выпадающем PBS разворачивается в ткани и аккуратно уплощение на стеклянное скольжение. Удалите избыток PBS с стеклянной пипетки, чтобы избежать разбавления реагентов монтажа. Не прикасайтесь к секции с стеклянная колба. Уход за
- пипетки 1 - 2 капли реагента монтажа, содержащие DAPI непосредственно поверх раздел на слайд микроскопа с помощью не беспокоить ориентации секции. Осторожно поместите coverslip стекло микроскопа 50 x 24 мм #1.5 секции.
- Очистить все пузырьки воздуха, которые образуются при размещении coverslip и вытрите избыток жидкости от края coverslip. Подготовить новый слайд и повторите монтажа prголовки для каждого раздела.
- Лечение сухого монтажа СМИ, поместив слайды в темная ночь при комнатной температуре. Перенести слайды до 4 ° C для краткосрочного (1-2 недели) или от-20 ° C для длительного хранения (больше чем 2 недели).
Примечание: Негативный контроль опущены первичного антитела для PGP9.5 или PDH в шаге 1.4.2.2 и отображается не различимых маркировки нервов или митохондрий в эпидермисе. Положительные элементы управления были выполнены для PDH антитела, чтобы доказать это этикетки всех митохондрии (данные не показаны). Позитивные элементы были исполнены на искусственный мыши Спинной корень ганглия нейронов, которые были преобразованы с бакуловирусы в митохондрии этикетки с сигналом зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) и затем фиксированной и витражи с PDH антитела и красная лампа дневного света Вторичное антитело. Все митохондрий, которые выражали ГФП были совместно Приклеенные этикетку с красной этикеткой для иммуногистохимии PDH (данные не показаны).
2. Конфокальная томография
- выполняют конфокальная томография:
- собирать образы, используя лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп с 40 X нефти погружение (1,25 числовой апертуры (н.а.)) цель на инвертированным микроскопом.
- На каждом фокальной плоскости последовательно приобрести флуоресцентные сигналы:
ядер: возбуждения λ = 405 нм, спектральные выбросов фильтр λ = 420-480 Нм
нервных волокон: возбуждения λ = 488 нм, спектральные выбросов фильтр λ = 505-560 Нм
Mitoch ondria: возбуждения λ = 543 Нм, спектральные выбросов фильтр λ = 606-670 нм
- На каждом фокальной плоскости последовательно приобрести флуоресцентные сигналы:
- ввести следующие параметры сканирования в Микроскоп программное обеспечение: скорость сканирования 600 Гц с 2 усреднение и масштаб 2.2; 12-бит интенсивности резолюции (4096 серый уровни).
- Установить программное обеспечение микроскоп для оптимизированного латеральное разрешение (разрешение сканирования = 1024 x 1024) и осевой резолюции/оптический секционирование (конфокальный диафрагмы = 1 единица Эйри (АС) с z шаг размер 210 Нм).
Примечание: В результате резолюции XYZ – 172.2 Нм x 172.2 Нм x 210 Нм с размером изображения мкм 176.1 x 176.1 мкм x 30-50 мкм.
- Установить программное обеспечение микроскоп для оптимизированного латеральное разрешение (разрешение сканирования = 1024 x 1024) и осевой резолюции/оптический секционирование (конфокальный диафрагмы = 1 единица Эйри (АС) с z шаг размер 210 Нм).
- Активировать живой сканирования для нервных сигналов (зеленый флуоресцентным) и отрегулируйте z фокус управления, чтобы найти и задать верхний и Нижняя фокуса самолетов в Микроскоп программного обеспечения, которые охватывают нервных сигналов в разделе ткани. Общая z диапазон составляет обычно 30-50 мкм для секции ткани 50 мкм.
- Вращаться поля сканирования с помощью микроскопа программного обеспечения во время живой сканирования, так что эпидермисом располагается горизонтально или вертикально, на изображении.
- Проверять каждый сигнал отдельно и настроить детектор (фотоэлектронный умножитель трубки, PMT) напряжения и смещение для сведения к минимуму или удалить любой над и под насыщенных пикселей.
Примечание: Время сканирования с вышеуказанными параметрами принимать примерно 20-40 минут в зависимости от количество фрагментов z.
- собирать образы, используя лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп с 40 X нефти погружение (1,25 числовой апертуры (н.а.)) цель на инвертированным микроскопом.
3. 3D визуализации и анализа митохондрии внутри человека Intraepidermal нервных волокон
- изолировать 3D эпидермиса:
- дублировать исходное изображение и используйте максимальной интенсивности проекция (расширенный режим фокуса) изображения, чтобы идентифицировать и изолировать эпидермис.
- Использовать региона интерес инструмент для отслеживания вдоль верхнего и нижнего краев эпидермиса для удаления нежелательных областях, как роговой слой и дермы, которые отсутствуют intraepidermal нервных волокон. Урожай на этот выбор.
- Использования деконволюция на нерв и митохондриальной флуоресцентные сигналы:
Примечание: деконволюция помогает восстановить целостность флуоресцентные сигналов. Восстановление, используемые в настоящем Протоколе называется слепой Деконволюция, потому что он использует флуоресцентные сигналов в изображениях, чтобы определить, сколько сигналы распространения от их первоначального источника (точка распространения функция). Этот процесс улучшает сигнал резолюции путем перераспределения сигнал распространяться обратно в место его происхождения.- Вычислить точку распространения функция (PSF) для зеленого флуоресцентного нерва сигнала (зеленый флуоресцентным) со следующими параметрами:
- присвоено значение вычисляемого ПСФ конфокальный. Установите Средний показатель преломления 1.515 и числовой апертуры 1,25. Установка Детектор обскуры 1 блок Эйри (а.е.). Установка лазера длина волны возбуждения 488 нм и выбросов волны до 515 нм.
- Вычислить ПСФ для красных флуоресцентных митохондриальной сигнала (красный флуоресцентным) со следующими параметрами:
- набор рассчитывается ПСФ конфокальный. Установите Средний показатель преломления 1.515 и числовой апертуры 1,25. Установите детектор обскуры 1 АС. Установка лазера длина волны возбуждения 543 Нм и выбросов волны до 617 Нм.
- Оптимизировать нерва и митохондрий флуоресцентные сигналов по Деконволюция, используя соответствующий PSFs перечисленных выше и итеративный восстановление функций установлен на 100% доверие и итераций предел 10 циклов.
- Вычислить точку распространения функция (PSF) для зеленого флуоресцентного нерва сигнала (зеленый флуоресцентным) со следующими параметрами:
- Создать нерв конкретной поверхности:
- использования " создать поверхность " инструмент, чтобы сделать твердой поверхности нервов от deconvolved Грин люминесцентные вторичных маркировки PGP9.5 определены нервов.
- Снять " гладкой " есть и использовать функцию абсолютной интенсивности можно задать порог для сигнала нерв, так как это значительно ярче, чем фон флуоресценции.
- Использовать функцию абсолютной интенсивности можно задать порог для сигнала нерв, так как это значительно ярче, чем фон флуоресценции. Установите пороговое значение достаточно низко, чтобы точно определить нервы.
- Фильтр из мелких, не нерв поверхности на основе размера.
Примечание: При необходимости вручную изменить дополнительные номера нерв поверхности в пределах " редактирования " вкладку, удерживая клавишу CONTROL, чтобы выделить несколько объектов и затем удалить их с клавишей Delete.
- Изолировать нерва конкретных флуоресцентные митохондриальной сигнал:
- выберите вкладку Правка поверхности нерва для просмотра " свойства маски " особенность. Поверхности нерва, созданный в шагах 3.3 используется для изоляции митохондрии внутри этих нервов от митохондриальной сигналы, связанные с кератиноцитов.
- Как " все маски ' кнопка открывает " канал маски " окно, выберите deconvolved красный люминесцентные сигнал из выпадающего меню под " выбор канала " для митохондриального сигнала.
- Щелкните в поле, чтобы поставить галочку " дубликат канала перед нанесением маски " параметр.
- Нажмите на радио кнопку перед " постоянной внутри/вне " маска параметров и нажмите кнопку в окне возможность поставить галочку " задать voxel вне поверхности " вариант и введите 0.00 для значения. Нажмите ОК кнопку, чтобы создать новый канал, представляющий митохондриальной сигналов внутри поверхности нерва.
- Создать митохондрии конкретной поверхности:
- использования " создать поверхность " инструмент, чтобы сделать твердой поверхности митохондрий от созданного флуоресцентные канала нерв конкретных митохондриальной сигналов от шаги 3.4.
- Снять " гладкой " располагают и выберите " фон вычитания " функцию, чтобы установить порог. Эта функция использует локальный контраст вокруг митохондриальной сигнала для идентификации митохондрий из фона.
- Набор пороговое значение достаточно низко, чтобы точно определить митохондрий. В этом примере Нижний порог был установлен в 2000 на 16-бит (65536) масштаба.
- Фильтр митохондриальной поверхностей на основе размера. В этом примере для 1.0 вокселей был установлен предел voxel, который является самым низким ограничить возможности. При необходимости вручную редактировать из не митохондрии поверхности в пределах " редактирования " вкладку, удерживая клавишу CONTROL, чтобы выбрать несколько объектов и затем удалить их с клавишей Delete.
Примечание: Иногда, программное обеспечение будет создавать поверхностей, которые не связаны с различимым флуоресцентные митохондриальной сигнал. В таких случаях, это возможно удалить их с " редактирования " таб
- Экспорт и вычисления значений морфометрического анализа:
- экспорта значений для нервных и митохондриальной поверхностей от " статистики " вкладка для дальнейшего анализа с программным обеспечением электронной таблицы.
- Экспортировать значения громкости для нервных и митохондриальной поверхностей.
- Количество отдельных нервных волокон, которые присутствуют в каждом изображении и запишите значение в электронной таблице.
- Для каждого изображения, рассчитать следующие потенциальные значения для анализа в электронной таблице:
- Сумма томов для всех поверхностей нерва.
- Фильтр, нерв конкретных митохондриальной поверхности ниже объема менее 0,02 мкм 3 и Бен размер поверхности. Например, использование контейнеров например 0,02 - 0,04, 0,04 - 0,08, 0,08 - 0.16, 0,16 - 0.32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1,28, 1.28-2.56, больше 2.56 мкм 3.
Примечание: Нижний предел митохондриальной объем был установлен до 0,02 мкм 3 на основе ранее опубликованных томов mitonchodria 36 , , 37 38. - Подсчитать количество нервных конкретных митохондриальной поверхностей внутри каждого бункера и общее количество поверхностей над бункеров (0,02 - больше, чем 2.56 мкм 3).
- Вычислить долю нерва конкретных митохондриальной поверхностей в каждой ячейке. Используйте счетчик на бин, деленное на общее количество митохондрий поверхностей.
- Сумма томов для всех поверхностей нерва конкретных митохондриальной.
- Расчета доли нерва с митохондриальных сигнала путем деления всего нерв поверхности объем по сумме всех митохондриальных поверхности томов.
- Рассчитать количество митохондрий на нерв объема путем деления всего нерв поверхности объем, количество всех митохондриальных поверхностей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Визуализация и количественная оценка митохондрий в человека IENFs
Флуоресценции иммуногистохимия позволяет одновременное маркировки множества сигналов для визуализации нервы, митохондрии и ядер в пределах биопсии кожи человека. 96-луночных плита является удобным способом организовать шаги в процедуре иммуногистохимия. Рисунок 1 показывает, что эта конфигурация приходится до 8 секций обрабатываться через 12 этапов решения. Свободно плавающего метод, в сочетании с нежным агитации с плоской рокер гарантирует, что антитела имеют достаточный доступ к проникнуть в разделах с обеих сторон. Протокол занимает 3 дней для завершения, который в значительной степени обусловлено ночи инкубаций первичных и вторичных антител при температуре 4 ° C, которые последовательно ярлык нервы и митохондрии.
Оставшаяся часть процедуры включает в себя визуализации, обработки и анализа сигналов, флуоресцентные. Конфокальная микроскопия использует флуоресцентные сигналов оптически раздел дискретных сигналов от фокальной плоскости, устраняя сигналы вне фокуса. Приобретение z-серии через секцию ткани обеспечивает 3D представление флуоресцентные сигналов для нервов, митохондрии и ядер. Параметры оптимизированы для изображения 172 мкм по длине эпидермиса, который включал бы в среднем 5 нервов. Рисунок 2 иллюстрирует типичный 3D изображение трех флуоресцентных сигналов, которые собираются из эпидермиса. PGP9.5, окрашивание (рис. 2B) обеспечивает богатые сигнал эпидермис и дерму нервов, что является более высокой интенсивности чем auto флуоресценции фон ткани. Ядерные пятно (рис. 2 c) помогает определить границы эпидермиса, где intraepidermal нервные волокна иннервируют. Она является общей для наружный слой эпидермиса иметь диффузных сигнал, который может быть из-за остаточной ДНК в корнеоцитами, которые составляют роговой слой. Митохондрии четко обозначены, PDH, окрашивание (Рисунок 2D), где большинство сигнала связан с ячейками в эпидермисе, которые являются главным образом кератиноцитов.
Приобретение параметры, описанные в настоящем Протоколе использовать 40 X цель погружения нефти с 1,25 числовой апертуры и масштаб 2.2. Это приводит к XYZ изображения размера мкм 176.1 x 176.1 мкм x 30-50 мкм. Эти параметры захвата достаточно эпидермиса включить в среднем 4-6 нервных волокон в изображения (рис. 3A). Отбор проб с высоким разрешением позволит сократить число нервов в каждом изображении. Рисунок 3B показывает масштаб 3.3, который уменьшает площадь XY 114.8 мкм x 114.8 мкм, что приводит к меньше нервов на изображение. Плотность идеальный выборки определяемых Найквиста (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) для 40 x цель погружения нефти с 1,25 числовая апертура предполагает разрешение сканирования XYZ 54 Нм x 54 Нм x 205 Нм. Это потребует коэффициент масштабирования 6,6 раза разрешением 1024 x 1024 и уменьшить XY 57.4 мкм x 57,4 мкм и захватить только в среднем 1-2 нерва в изображения (рис. 3 c).
Следующий этап – для выполнения обработки изображения для удаления ненужных областей изображения и активизировать сигналы. В этом протоколе для того, чтобы сосредоточить анализ региона эпидермиса, где иннервируют IENFs удаляются дермы и рогового слоя. Трехмерное программное обеспечение делает возможным изолировать, усилить и анализировать флуоресцентные сигналы. Инструменты программного обеспечения необходимо изолировать эпидермального нерва и митохондрий путем обрезки из регионов выше и ниже эпидермиса (рис. 4A-C). Этот процесс упрощается рушится сигналы в расширенное представление и затем трассировки произвольной области вокруг эпидермиса. Обрезанное изображение обрабатывается далее алгоритмы восстановления изображений. Деконволюция используется для оптимизации резолюции нервы и митохондриальной сигналов (рис. 4 d).
Заключительный этап – обнаруживать и извлекать Морфометрические характеристики от сигналов. Важным аспектом этого протокола является для измерения функции митохондрий нерва конкретных. Программное обеспечение для анализа изображений имеет функции, которые используют поверхностей созданы для одного сигнала (в данном случае поверхности нерва) как инструмента маскирования изолировать другой флуоресцентного сигнала (в данном случае митохондрий) внутри этой поверхности. Первым этапом в анализе нерва конкретных митохондрий является создание 3D поверхностей вокруг нервы (Рисунок 5A-B). Нерв поверхности затем используются для обрезки нерв конкретных флуоресцентные митохондриальной сигналов (рис. 5 c, 5D, 5E, 5 G). Наконец 3D поверхности создаются вокруг нерва конкретных митохондриальной сигналы для получения объемного измерения (Рисунок 5F, 5Ч). Таблица 3 показывает морфометрические измерения, которые экспортируются из программного обеспечения для анализа изображений и сводных данных. Основными ценностями для экспорта являются объем значения для нервных и митохондриальной сигналы нерва конкретных. Объем данных из митохондрий сегментирования генерации данных частота размер митохондрий, который затем используется для создания гистограммы частоты размер (рис. 6). Объем данных также используются для сделать резюме мер количество митохондрий в IENF объем и доля митохондриальной тома в пределах IENF томов.
Данные, представленные в таблице 3 и на рисунке 6 показывают, что эта техника предоставляет средства для количественного определения митохондрий в человека IENFs от биопсии кожи. Нервы от этого образца имеют митохондрии, распределены по всему и большинство митохондрии между 0,02 - 0,32 мкм3. Эти размеры находятся в диапазоне, связанные с нормальные митохондрии36,37,,3839. Меньшие митохондрий было показано, быть более подвижные, чем больше митохондрий39 , предполагая, что митохондрий в этих нервов может быть более подвижные. Действительно исследования причастны больше, опухшие митохондрий не перевозите а также меньшие митохондрии и может привести к аксональной дегенерации39,40,41. Таким образом характеристика нерва конкретных митохондрий это ценный технику, которая будет применяться для исследования нейродегенеративных заболеваний, где изменения в митохондриальной морфологии и транспорта были связаны с аксональной дегенерации 15,25,26,27,42,43.
| 5% BSA блокирование раствор | |
| Компоненты 5% BSA, преграждая разрешение | Необходимое количество |
| Бычьим сывороточным альбумином (БСА) [конечная концентрация: 5%] | 0,625 г |
| 1,0% Тритон X-100 (TX-100) [конечная концентрация: 0.3%] | |
Таблица 1: 5% BSA, преграждая разрешение. 5% BSA блокирования решения используется в ранних стадиях иммуногистохимия протокола для блокировки неспецифической связывание антител.
| 1% BSA полоскания раствор | |
| Компоненты 1% BSA полоскания раствор | Необходимое количество |
| Бычьим сывороточным альбумином (БСА) [конечная концентрация: 1%] | 0,125 г |
| 1,0% TX-100 [конечная концентрация: 0.3%] | 3,75 мл |
| ПБС | ~8.125 мл |
| Всего (используйте ПБС довести объем до 12,5 мл) | 12,5 мл |
Таблица 2: 1% BSA полоскания решения. 1% BSA, полоскания раствор используется в протоколе иммуногистохимия блокировать неспецифической связывание антител и используется для разбавления первичных и вторичных антител.
| Морфометрические измерения для IENFs и нерв конкретных митохондрий | ||||||||
| Экспортированных и сводные данные из программного обеспечения для анализа изображений | ||||||||
| MT размер бункеров частоты | Количество Mt размер частоты Бен | Процент Mt в бин | Общее количество Mt | Объем MT (3мкм) | IENF объем (3мкм) | Количество тонн в IENF объем (число/100 мкм3) | Процент от объема Mt в IENF томе | Количество IENFs |
| между .02-.04 мкм3 |
20 | 24,4% | 82 | 13.41 | 518.88 | 15,8 | 2.58% | 4 |
| между .04.08 мкм3 |
28 | 34,1% | ||||||
| между .08-.16 мкм3 |
14 | 17,1% | ||||||
| между .16.32 мкм3 |
12 | 14,6% | ||||||
| между .32-.64 мкм3 |
4 | 4.9% | ||||||
| между .64-1,28 мкм3 |
3 | 3.7% | ||||||
| между 1.28-2.56 мкм3 |
1 | 1.2% | ||||||
| между 2.56 +3 мкм |
0 | 0,0% | ||||||
Таблица 3: Морфометрические измерения для IENFs и нерв конкретных митохондрий. Таблица представляет морфометрические значения, которые измеряются и экспортируемых изображений программное обеспечение для анализа и сводных данных. Сокращения: IENF, intraepidermal нервных волокон; MT, митохондрии.
Рисунок 1 : Схема, представляющая установки для 96-луночных пластины для иммуногистохимии биопсии кожи. Строки в пластине, представляют собой шаги в протокол для решения блока, мыть и инкубации и столбцы представляют собой отдельные ткани секций (от 1 до 8 секций на пластину). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель 3D обработка изображения конфокальная микроскопия ткани секции из человеческого эпидермиса биопсии для флуоресценции иммуногистохимия. Необработанные 3D проекция изображения показывает флуоресцентные сигналов (A) объединены и отдельных сигналов для нервов (воспалении, зеленый) (B) , (C) ядер (КНУ, синий) и (D) митохондрии (Mt, красный) в эпидермисе и дермы. Обратите внимание на отсутствие сигналов в рогового слоя эпидермиса. Масштаб баров = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Улучшить результаты изображения резолюции меньше нервов для последующего анализа. Все изображения записываются с 40 X нефти цель с 1,25 числовая апертура и 3D прогнозы иллюстрируют флуоресцентные сигналов для нервов (зеленый), митохондрии (Mt, красный) и ядра (КНУ, синий). Изображение, принятое на масштаб 2.2 (A) содержит несколько нервов в представлении. Увеличение масштаба для 3,3 (B) или 6.6 (C), идеальный Найквиста выборки, значительно снижает количество нервов в пределах каждого изображения. Масштаб баров = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Обработка изображений. Представитель расширенное представление фокус (максимальная интенсивность проекции) изображения от конфокальной микроскопии ткани секции из биопсии человеческого эпидермиса. Необработанные проекция изображения иллюстрирует (A) Объединенные люминесцентные сигналов для нервов (зеленый), ядра (КНУ, синий) и митохондриях (Mt, красный). Дермы и рогового слоя, что (B) , отброшена с регионом inteинструмент Выделение произвольной отдыха (ROI) (голубой выделенной области, обрезать ROI) изолирующие только сигналы в эпидермисе. (C) обрезанное эпидермис затем обрабатывается для деконволюция (D) с расчетные точки распространения функций для улучшения разрешения нервов (зеленый) и митохондриальной сигналов (Mt, красный). Масштаб баров = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Анализ изображений. Представитель 3D конфокальная микроскопия image иллюстрирует (A) нерва конкретных Зеленый флуоресцентный сигнал. (B) трехмерной поверхности (голубой) создается для сигнала нерва. Нерв конкретных митохондриальной сигнал изолирована от остальной части (C) эпидермальный митохондриальной сигналов (Mt, красный) (D) использование поверхности нерва как инструмента маскирования. Результате (E, G) нерва конкретных митохондриальной красный флуоресцентные сигнал используется для создания (F, H) поверхности (Mt поверхности, пурпурный) вокруг митохондрии внутри поверхности нерва (голубой). G и H, увеличенный вид белые коробки в E и F. масштаба бары = 20 мкм (A-F), 5 мкм (G-H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Митохондриальной размер частоты гистограммы. Mitochondrialsurface данные представлены в виде гистограммы частоты размер для визуализации процент митохондрий, которые присутствуют в каждом из различных контейнеров согласно их объема (3мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предназначен для изолировать, количественной оценки и анализа размера и распределения нерва конкретных митохондрий в IENFs в 3D от биопсии кожи человека. Есть несколько важных шагов в протоколе. Свободно плавающего флуоресценции иммуногистохимия предназначен для пятен и анализировать несколько сигналов в каждой пробе, обеспечивая более гибкой методологии для исследуют исследований44,45. Эта процедура позволяет для проникновения антител в ткани для того, чтобы максимизировать приобретения изображений во всем разделе 50 мкм, которая необходима для получения confocal микроскопии изображений и 3D анализа. Другим важным шагом является параметров получения изображений, которые сбалансированы между захвата достаточно нервов на изображение при сохранении резолюции для измерения митохондрий. В разделах ткани, используемые в этом и стандартные кожи биопсии протоколы являются около 3 мм длиной45,46,47,48. Приобретение параметры описаны в этот протокол захвата достаточно эпидермиса включить в среднем 4-6 нервных волокон на изображение. Отбор проб с высоким разрешением, значительно сократит количество нервов в каждом изображении, особенно частотой Найквиста. Третьим важнейшим шагом является использование деконволюция алгоритмы для улучшения разрешение и контрастность сигналов, особенно для митохондрий. Деконволюция помогли компенсировать не выборки с высоким разрешением изображения. Последний важный шаг является использование программного обеспечения для анализа изображений, чтобы изолировать нерва конкретных митохондрий из митохондрий, связанные с ячейками в эпидермисе. Это осуществляется с помощью поверхности нерва как инструмента маскирования отсекаются митохондриальной сигнал, что локализовать в течение нерва.
Есть некоторые потенциальные изменения этой техники для рассмотрения. Один из возможных изменений бы сократить продолжительность флуоресценции иммуногистохимия. На ночь инкубаций в растворах первичных и вторичных антител на 4 ° C может быть сокращен до 3-4 часов при комнатной температуре. Однако короче инкубаций при комнатной температуре часто увеличить флуоресценции фон, поэтому следует проявлять осторожность, чтобы избежать плохой сигнал к шуму. Еще одна возможная модификация бы для настройки параметров получения изображений. Как упоминалось выше, получение изображения, описанные здесь были смещены в сторону захвата разумное количество нервов на изображение более высокое разрешение. Это позволяет использовать выше увеличение цели, например цель погружения нефти 63 x с 1.3 числовая апертура. Если все параметры остались прежними и 63 X цель была использована, XY поле изображения будет сокращена до 112 мкм x 112 мкм и таким образом сократить среднее количество нервов на изображение. Основным моментом является использование последовательного параметров во всем на приобретение и последующего анализа.
Основным ограничением этой методики является, что это много времени. Иммуногистохимия занимает 3 дней для обработки тканей, захвата изображений занимает около 30-50 мин за образа зависящ сколько оптических z-шаги, и обработка/анализ изображений занимает около 20 мин. Это представляет собой значительное время обязательство, но дает важные морфометрические измерения в конце. Еще одним ограничением этой методики является ограниченной области эпидермиса, отобранных на изображение. Однако это несомненно улучшит как усовершенствования сделаны в цены приобретения изображений с улучшенным разрешением, в сочетании с более быстрые процессоры компьютера и программного обеспечения для анализа.
Значимость этого протокола над другими методами состоит в том, в силу сочетания флуоресценции иммуногистохимии с конфокальная микроскопия и анализ изображений 3D. Традиционно intraepidermal нервных волокон анализ делается с хромогена на основе иммуногистохимии и ярко поле микроскопии, особенно для клинической диагностики нейропатии45,,4749. Использование флюоресценции иммуногистохимия делает возможным пятно и анализировать несколько сигналов в каждой пробе, обеспечивая более гибкой методологии для исследуют исследований44,45. Эта техника обеспечивает стратегию изолировать определенный сигнал интереса, в этом случае нерва конкретных митохондрий, от сложный сигнал, митохондрии, связанные с клеток эпидермиса.
Мощность этой техники является его полезность в будущих приложениях. Способность изолировать и измерить нерва конкретных митохондрий делает возможным оценить болезни индуцированные изменения в размер и распределение митохондрий. Несколько неврологических осложнений причастны митохондриальной дисфункции как потенциальные механизма заболевания. В частности модифицированную версию этой техники был использован для демонстрации у пациентов с диабетом и диабетической периферической нейропатии измеримых изменений размера и распределения нерва конкретных митохондрий, по сравнению с соответствием возраст управляет50. Этот метод будет полезным для оценки эффективности терапии, предназначенных для улучшения или вылечить сенсорные нейропатии. Наконец универсальность техники делает применимым к широкий спектр анализов, которые используют один флуоресцентного сигнала изолировать подмножество данных из других флуоресцентные сигналов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов K08 NS061039-01A2, программа для неврологии исследований & открытия и A. Альфред Таубман медицинский научно-исследовательский институт в университете штата Мичиган. Эта работа использовала морфологии и ядро анализа изображения Мичиган диабет исследовательского центра, финансируемые национальными институтами здравоохранения грант 5P 90 DK-20572 от национального института диабета и пищеварения и болезни почек. Авторы хотели бы поблагодарить Дж. Робинсон Синглтон и а. Гордон Смит (Университет штата Юта) за их щедрое пожертвование образцов кожи человека.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
References
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
- Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
- Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
- Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
- Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
- Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
- Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
- Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
- Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
- Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
- Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
- Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
- Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
- Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
- Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
- Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
- Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
- Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
- Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
- Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
- Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
- Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
- Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
- Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
- Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
- Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
- Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
- Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
- Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
- Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
- Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).
