Abstract
전좌 기판 비 electrogenic 경우 단일 단백질 수준에서 세포막 단백질 수송 여전히 상세한 분석을 기피한다. 상당한 노력이 분야에서 제조되었지만, 막 수송의 분석에 필요한 무용제 지질 이중층 기술과 조합하여 높은 처리량 자동 반송 분석을 가능 기술들은 드물다. 운송의이 클래스는 그러나 세포 항상성에 중요한 따라서 신약 개발과 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법론의 주요 대상이 절실히 필요하다.
여기에 제시된 논문은 단일 트랜스 해상도 세포막 단백질 매개 수송 과정의 분석을위한 신규 한 바이오칩의 확립 및 처리를 설명. 바이오칩은 설계에서 매우 평행하고 산업 등급과 양으로 제조 할 수 나노 기공으로 둘러싸인 미세 공동으로 구성된다. 단백질 형질 리포좀에 직접 적용 할 수있다SSM-기술을 이용하여 자기 조립 기공 걸친 지질 이중층을 구성하는 칩면 (고체 지질 막을 지원됨). 막의 일부가 자립으로 또는 실시간 다중 분광 형광 판독 하였다 가능 캐비티 공간에서 기판 전위에 대한 인터페이스를 제공하는 세공은 스패닝. 표준 작업 절차 (SOP)의 설립은 기능적으로 재구성 될 수있는 거의 모든 막 단백질 칩 표면에 단백질 형질 지질 이중층의 간단한 구축을 허용한다. 유일한 필수 비 electrogenic 기판 반송 용 형광 판독 시스템의 구축이다.
하이 콘텐츠 스크리닝 응용 병렬 다중 칩 녹화 자동 반전 된 형광 현미경을 사용하여 accomplishable이다. 큰 데이터 세트는 자유롭게 사용할 맞춤 설계 해석 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수있다. 세 가지 색 멀티 스펙트럼 형광판독 또한 거짓 긍정적 인 결과를 제거, 다른 이벤트 클래스로 편견 데이터 차별을 허용합니다.
칩 기술은 현재의 SiO2 표면을 기반으로하지만, 금 코팅 칩 표면을 사용하여 추가로 작용하는 것도 가능하다.
Introduction
막 단백질의 분석은 지난 20 년 동안 기본 및 제약 연구에 대한 관심이 증가되고있다. 신약 개발은 현재 제한 요인 중 하나 인, 식별 및 새로운 목표의 상세한 특성에 의존한다. 모든 약물 표적의 약 60 %는 단백질 막 한 사실이 기술의 개발은 그 기능이 가장 중요 규명 할 수있다.
4 - 과거 electrogenic 채널 및 수송을 연구하는 기술이 다수 개발되었다. 반면에 비 electrogenic 기판은 더 어려운 과제를 제시한다. 그들은 캐스케이드 5 시그널링 키 수용체로서 세포막 기능 및 전체 용질 및 영양소의 유동을 제어하는대로 그러나 프라임 약물 표적으로서 특별한 관심이다.
상당한 노력이 t의 개발에 투입하고있다echniques은 막 수송 단백질 (6), (7)의 기능을 연구한다. 몇 가지 이름 고체 지원 지질 이중층, 닿는 이중층 11, 12, microblack 지질 막 13, 14 및 기본 소포 어레이 (15, 16)을 포함하여 10 일 - 고체 지원 멤브레인을 사용하는 시스템은이 분야 8로 가장 유망한 도구가 등장했다. 그들 중 일부는 상업 설정 17, 18으로도 사용할 수 있습니다. 몇 가지 예는 고도의 병렬 14, 19, 심사 애플리케이션을위한 전제 조건에서 하나의 막 단백질을 연구 할 수있는 능력을 결합 발표되었다. 그러나 이러한 방법은 거의 산업 환경에 대한 기초 연구에서 다리 없다. 어려움은 종종 자동화가 될 수있는 시스템의 능력, 비용 집약적 생산 및 / 또는 준비에 수고 거짓말. 접근 오위에서 언급 한 모든 장애물을 vercoming하는 최종 목표이다.
22 - 여기에 제시된 기술은 단일 단백질 수준 (20)에 제어 된 환경에서 시험 관내에서 막 채널 수송을 연구하기 위해 개발되었다. 26 검은 지질 막 (27) - LUVs로 정제 막 단백질의 재구성 훨씬 더 GUVs (23)에 대한 비교 방법보다 설정됩니다. 이들은 직접 이중층의 형성이 자기 조립 과정을 통해 이루어지고, 칩 표면에 적용될 수있다. 나노 다공성 칩 (도. 1)의 유리 바닥 디자인은 시스템의 간단한 자동화 허용 공기 현미경을 허용한다. 전동 스테이지와 함께 다중 칩 분석 밀봉 공동 수천 함유 뷰의 각 필드와 동시에 측정 될 수있다.
그림 1. 다중화 된 나노 기공 바이오칩의 설계. A)는 실리콘 - 온 - 인슐레이터 (SOI) 웨이퍼에 반응성 이온 에칭에 의해 구성된다. 약 1,150 개별 칩은 동일한 특성 및 품질. B) 각각의 칩은 나노 구멍에 25 만 개별 마이크로 공동을 포함하는 각각의 웨이퍼에서 제조된다. 스케일 바 :. 200 μm의 C) 각 공동 멀티 스펙트럼 형광 판독을 통해 주소입니다. 반전 된 형광 현미경. D) 원 자간 력 현미경으로 바이오칩 호환 만들기는 불투명 한 상부층 블록 버퍼 탱크에서 형광 신호 (AFM) 촬상 균등 (세공 개구 3.6 nm 인 이산화 규소 층의 표면 거칠기를 배치 계시 N = 소포 융합 40) 최적. 스케일 바 :. 5 μm의 E) 주사 전자 마이크roscopy (SEM) 이미지는 실리콘 칩 내부 femtoliter 캐비티에 대한 액세스를 허용 나노 기공을 통한 단면을 도시한다. 이 그림은 (21)로부터 허가를 재사용했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모든 데이터 분석은 최종 사용자가 제한되지 않은 액세스를 실현 프리웨어를 사용하여 수행된다. 시계열없는 화상 처리 소프트웨어 맞춤 제작 곡선 분석 소프트웨어 있도록 배치 프로세싱 곡선 여러 형광 채널 수천 대용량 데이터의 직접적인 상관 관계를 이용하여 분석 하였다.
이 프로토콜에서 사용되는 모델 단백질은 E. 유래의 컨덕턴스 (후 MsCl) 채널 단백질의 채널이다 mechanosensitive 대장균. 그것은 본질적으로 삼투압 충격을 해제하기위한 밸브로서 기능하지만 SYNT 합리적으로 설계하는 방식으로 수정hetic 기능은 공유 채널 수축 측에 부착 될 수있다. 나노 밸브를 만드는 채널이 열 트리거되는 공유 결합 활성제 (MTSET)의 전하 반발, 비아. 이온, 물, 작은 단백질뿐만 아니라, 작은 형광체 같은 작은 분자는 채널을 통해 투과 할 수있다. 여기서, 단백질은 단백질 - 매개 전위를 검출하기위한 시스템의 능력을 증명하기위한 모델로서 사용된다.
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Protocol
대형 단일 층 소포 1. 준비 (LUVs)
- 먼지 입자를 제거하기 위해 질소 가스 둥근 바닥 플라스크 (10 ㎖ 부피)를 청소한다. 에탄올로 둥근 바닥 플라스크를 씻어.
참고 : 잔류 에탄올이 허용 될 수 있으며, 다음 단계를 방해하지 않습니다. - 어떤 오염을 제거하기 위해, 클로로포름으로 1 ml의 유리 주사기의 4 배를 씻으십시오. 둥근 바닥 플라스크에 4- ML의 SoyPC20 (클로로포름 25 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 0.1 몰 %의 최종 농도로 추가 도핑 ATTO 390 지질 용액을 도핑.
주 : ATTO 390 대신 DOPE 다른 형광 표지 된 지질 또는 친 유성 염료를 사용할 수 있으며, 사용 가능한 여진 원에 따라. - 회전 증발기에 둥근 바닥 플라스크를 연결합니다. 플라스크의 유리 벽에 균일 지질 막을 형성, 300 mbar에서, 30 ℃의 수조 온도와 최대 회전 속도로 40 분 동안 지질 막을 건조.
- TRANSFER을 실온에서 추가로 30 분 동안 고 진공 펌프 건조한 지질 필름 플라스크.
- 플라스크 8 유리 구슬 (2.7 mm 직경, 에탄올 세척 및 건조) 5 ml의 버퍼 (멸균 여과 20 mM 트리스, 150 mM의 NaCl을, 산도 8.0)를 추가합니다. 회전 증발기 플라스크를 연결하고 최대 속도 50 ° C에서 진공없이 회전합니다.
주 : 유리 구슬 기계적 (다중 층) 소포 형성 선도 유리 벽에서 지질 필름을 대체. 45 분 후에 회전 용액 유백색 나타나고 잔류 지질 막이 플라스크 벽에 보이지 않을 것이다. 대신에 유리 비드를 플라스크 또는 부드러운 재수 방법 텍싱 수욕의 sonifier 플라스크를 초음파 처리 등의 다른 방법도 적용 할 수있다. - 실온에서 4 분 동안 초음파 욕조 초음파 처리에 불활성 가스 (아르곤) 하에서 플라스크에 옮긴다.
주 : 초음파 충격파 그들을 단층하게 리포좀을 방해. - LUV 솔루션을 분할1 ml의 분취 량에.
- 액체 질소의 LUV 용액을 동결 5 냉동 / 해동주기를 수행 수조에서 40 ℃에서 해동 하였다.
주 :이 대형화를 초래 파열 서로 개별 리포좀 자발 재배치하도록 이끈다. - 마지막 동결 단계 매장에서 -80 ° C에서 모든 샘플.
주 : LUVs는 6 개월 이상 안정 될 것이다.
2. 단백질에서 재구성
- 얼음에 1 ML의 LUV 나누어지는을 녹여. 직접 재구성 전에 미니 압출기를 이용하여 400 nm의 폴리 카보네이트 필터를 통해 리포좀 막 17 배 돌출.
주 : 지질 응집체가 제거되고 최종 균일 한 크기 분포에 도달한다. - 0.25 %의 최종 농도 4 % 트리톤 X-100 (v / v)로 첨가하여 LUVs 불안정 (v / v)로 50 ℃에서 5 분 동안 배양한다.
주 :이 단계에서 사용 리포좀의 양은 정제 후 MsCl G <질량에 의존SUP> 22 C (단계 2.3 참조)를 사용했다. 28에서 상세히 설명한 바와 같이 (E. 콜라이로부터 유래) 후 MsCl G 22 C를 정제. - 비 (W / W) 1:20 후 MsCl G (22) C 및 세제 포화 된 리포좀을 정제하고 50 ℃에서 추가로 30 분 동안 품어 섞는다.
- 세제를 제거하기 위해 트리스 완충액 바이오 비드를 추가 (20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH가 8.0, 멸균 여과) 단백질 / 리포좀 용액에 16 mg의 (습 중량) 바이오 비드 당에 리포좀을 불안정하게하는 데 사용되는 세제 μL 2.2 단계.
- 회전 접시에 4 ° C에서 하룻밤 세제 제거 (16 시간)을 수행합니다.
참고 : 솔루션의 지속적인 혼합은 최적의 세제 제거를 보장합니다. - 4 ° C에서 세제를 제거 저장소 테오 후 같은 날에 실험에 사용합니다.
3. 활동 분석
- 단백질 재구성하는 동안 detergent-의 100 μL 나누어지는을단계 2.3을 마친 후 불안정 proteoliposome 솔루션입니다.
- 단백질 - 리포좀 용액에 칼 세인의 1 볼륨 (30 mm)를 첨가하고, 50 ℃에서 추가로 5 분 동안 배양한다.
- 2.6 - 단계 2.4에 설명 된대로 솔루션에서 세제를 제거합니다.
- 세제 제거한 후 트리스 완충액 (베드 부피 3x)로 크기 - 배제 컬럼 (20 ㎖ 베드 부피 또는 그 이상)의 평형.
참고 Proteoliposome 분리는 분별 그러나 이후 최고의 단백질 활성을 위해 권장되는 39 ° C에서 끊임없이 샘플을 유지하면서 실온에서 수행 될 수있다. - 크기 제외 열을 전체 나누어지는 (200 μl를) 적용하여 무료 칼 세인에서 분리 테오. 혼합물이 중력 흐름을 사용하여 상단에 연속 버퍼 응용 프로그램을 통해 열에서 테오의 용출 다음, 열으로 흡수 할 수 있습니다. 용출 앞에 이산 오렌지 밴드 테오가 포함 된 칼 세인을 준수하십시오. 500 & #의 분수를 수집(181) 각각 리터.
참고 : 무료 칼 세인 염료는 완전한 분리와 proteoliposome 분획 한 후 용출됩니다. - 피펫을위한 마이크로 웰 플레이트 상에 각 분획의 80 μl의 형광 아웃을 읽고 형광 방출을 통해 칼 세인 포함 테오의 가장 높은 금액을 포함하는 분획을 식별합니다. 490 nm에서 여기에 520 nm에서 형광을 감지합니다. 다음 활동 분석에 대한 가장 높은 신호와 proteoliposome 분획을 사용합니다.
- 1 ml의 형광 큐벳에 980 ㎕의 트리스 버퍼와 proteoliposome 함유 분획의 20 μl를 섞는다.
- 분광를 사용하여 520 nm의 (여기 490 ㎚)에서 형광 방출을 측정합니다. 1 분 동안 녹화 한 후 원액 (160 밀리미터)에서 MTSET 25 μL ([2- (트리메틸) 에틸] methanethiosulfonate)를 추가하고 잘 섞는다. 혼합 동안 기록에 보관하십시오. 항상 직접 사용하기 전에 신선한 원액을 준비합니다.
참고 : 버퍼 MTSET의 가수 분해에 해결되면30 분 안에들과 비 반응성 될 것입니다. MTSET는 달아 사용할 때까지 -20 ° C에서 건조 분말 나누어지는을 유지할 수있다.
주 : 일단 후 MsCl G 22 C 채널은 형광 방출 증가의 결과로, 테오 및 염료의 후속 dequenching을 effluxing 때 칼 세인의 국소 농도 저하를 초래 포획 칼 세인을 열고 릴리스 활성화. - 형광 발광은 다시 안정적인 정체기에 도달 한 후, 50 ㎕의 트리톤 X-100을 첨가하여 리포좀을 용해 (4 % v / v)로.
참고 : 이상적으로 더 형광 증가는 관찰 할 수없는, 모든 리포좀에 활성 단백질을 의미.
나노 입자 추적을 사용하여 LUVs 4. 크기 분포 측정
- 리포좀 또는 proteoliposome 솔루션의 최소한의 샘플은 나노 입자 추적기를 사용하여 크기 분포 분석을 위해 필요합니다. 5 밀리그램 / m의 리포좀 용액을 희석리터 지질 농도 1 : 5000 (v / v)의 버퍼 (20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH가 8.0 여과 멸균) 1 ML의 최종 볼륨 분석. 크기 분포 측정을 방해 할 것 같은 모든 먼지 현탁 입자를 제거하기 위해 0.2 ㎛의 멤브레인을 사용하여 희석 전에 LUV 준비 및 재구성을 위해 사용되는 모든 버퍼 필터.
- 초순수 물 흐름 챔버를 씻으십시오.
- 광선에 초점을 표면 마커를 사용합니다. 희석 리포좀 샘플의 약 300 μl를 주입 한 즉시 기포를 도입하지 않고, 흐름 챔버 내의 흐름을 중지 출구 밸브를 닫는다.
- 검출을위한 시료의 적절한 산란 신호를 보장하기 위해 초점 카메라 셔터 / 게인 설정을 조정합니다.
참고 : 20-80 신호가 시야에 명확하게 볼 수 있어야합니다. 소프트웨어가 겹치는 경우 개별 신호를 추적 할 수 없습니다로 혼잡 (> 80 신호)를 방지합니다. - 은 "캡처"SCR로 이동EEN. 25 ° C의 온도 제어 및 소프트웨어 제어를 사용하여 90 초에 촬영 시간을 조정한다. 보도는 "기록은"시계열을 기록 시작합니다.
참고 : 새 창이 열립니다 시계열이 완료되면. - 지정된 형식의 시계열을 저장 (* .AVI). 배치 분석시 실제적인 이유를 들어 하나의 폴더에있는 모든 파일을 저장합니다.
- 출구 밸브를 열고 유량 용기에 다른 300 μl를 주입. 밸브를 닫고를 반복 4.3 단계 - 두 번 4.6.
- 완료 한 후 모든 샘플 실행 5 ml의 초순수와 유량 용기를 세척한다. 은 "사전 프로세스"화면으로 이동합니다. 이 프로토콜에 사용되는 트리스 버퍼에 대한 교정 파라미터 온도 = 25 ° C 및 점도 = 0.91를 설정합니다.
- 일괄 처리 창을 열고 기록 시간 시리즈 (고급 / 일괄 처리 / 설정 파일 1-3)로드합니다. 를 눌러 크기 분포 분석을 시작하기 위해 "GO".
참고 : 분석 소프트웨어 사설을캘리 단일 입자를 추적하고, 단계 480에서 설정 한 파라미터를 사용하여 움직임의 행동에 기초하여 자신의 직경을 산출한다.
주의 : 수득 크기 분포 분석은 시계열 파일과 동일한 폴더에 자동으로 저장한다. - 또한 결과를 (수출 /이 보고서 PDF 작성) 요약하는 보고서 파일을 만듭니다.
5. 칩 홀더 준비
- 50 ㎖의 반응 관에 MDX4 의료용 엘라스토머 기재 0.1 g MDX4 경화제 1.0 g을 단다. 유리 막대로 충분히 모두를 혼합.
- 탈기에 1 시간 접착제에 대한 데시 케이 터에 튜브를 넣어. 접착제가 경화와 작업하기 너무 힘들 것 같은 그 후, 칩 접착을위한 30 분 이내에 사용한다.
- 엘라스토머 탈 (단계 5.1) 동안 칩 본딩하기 전에 오염을 제거하기 위해 클로로포름으로 철저하게 객관적으로 유리 슬라이드를 청소합니다. 클로로포름 5 ㎖를 유리 주사기를 사용하여 함께 슬라이드를 씻어. 수집아래에 위치 비커에 클로로포름. 세척 후 슬라이드를 건조하게 할 수 있습니다.
참고 : 흄 후드에서이 단계를 수행합니다. 클로로포름에 대체, 아세톤과 같은 유기 용매도 사용할 수 있습니다. - 피펫 팁 (10 μL 피펫 크리스탈 팁)를 사용하여 커버 유리 상에 접착 재료를 소량 증착. 칩 나중에 8 챔버 슬라이드 홀더에 적합해야하고 따라서 슬라이드 상에 배치해야 할 것을 기억하라.
- 조심 미세한 팁 핀셋을 사용하여 웨이퍼 기판에서 한 번에 하나의 칩을 제거하고 커버 유리에 접착 성의 저하에 칩을 증착. 칩의 코팅 된면이 위쪽으로 향하도록해야합니다.
- 조심스럽게 무딘 PE 핀셋의 후면 커버 유리에 칩을 밀어 넣습니다. 접착제는 칩 아래에 균등하게 분배되는 것을 보장하기 위해 조심스럽게 앞으로 다시 칩을 밀어 넣습니다. 중요한 단계 : 그것은 광학 영상을 방해하므로, 공기 방울이 칩 아래에 갇혀 있지 않은지 확인나중에 칩 공동. 또한, 접착제 재료는 칩 표면을 오염되지 않도록.
- 캐비닛 건조기에서 65 ℃에서 2 시간 동안 완성 된 커버 유리를 건조하는.
주 : 칩은 아직 제거 할 필요가 그들의 제조의 보호 층으로 코팅 발신된다. - 보호 층을 제거하려면, 순차 용매 세척 단계를 수행합니다. 칩의 경화시, 54 ° C 수욕 예열.
- 수조에 3 유리 비커, 그들 중 두 사람은 이소프로판올로 가득하고 하나가 아세톤으로 채워 놓습니다.
- 슬라이드 홀더 칩 커버 글래스를 넣고 10 분 동안 제 이소프로판올 가득 접시로 잠수함. 그 후, 아세톤 가득 접시로 전송할 제 이소프로판올 접시 최종 세척 단계를 전송하기 전에 10 분 동안 다시 부화 또 다른 10 분 동안 배양한다.
- 접시에서 슬라이드 홀더를 제거하고 조심스럽게 ultrapur으로 광범위하게 씻어질소 가스의 완만 한 스트림 칩을 건조하여 전자 워터.
- 8 잘 끈적 슬라이드에서 적층 시트를-벗고 벤치에 거꾸로 넣어. 조심스럽게 커버 슬라이드를 선택하고 부드럽게 우물을 직면하고있는 칩 끈적 끈적한 슬라이드에 키를 누릅니다. 사용하기 전에 몇 분을위한 완성 된 칩 홀더 나머지 부분을 보자.
6. 분석 준비
주 : 나노 기공 칩 이점을 가지고 커버 유리에 접착 및 8 잘 접착 슬라이드로 구분하여 그 복수의 칩은 칩을 서로 완전히 분리되어 함께 단일 실험 실행에서 해결 될 수있다.
- 칩 홀더 준비 후, 순수 에탄올로 각각의 칩을 씻어 먼지 등 모든 오염을 제거하기 위해, 질소 가스로 건조 불어.
- 공기, 산소 또는 질소 플라즈마 칩 표면을 청소합니다. 플라즈마 세정 시간주기의 유형에 따라 달라질 수 : 1 분, 공기 및 NIT 산소 플라즈마 처리를 수행80 %의 전력 설정에서 0.3 밀리바 (RF 전원 중간 또는 높은)에서 5 분간 플라즈마 로겐.
- 플라즈마 세정 한 후 공동 습윤을 보장하기 위해 10 ~ 15 분 동안 순수한 에탄올에 칩을 품어.
- 트리스 완충액 400 ㎕를 첨가하여 버퍼 단계적 교환 에탄올 (20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH가 8.0, 멸균 여과), 기포, 400 μL의 후속 제거를 도입하지 않고, 용액을 혼합 하였다. 에탄올 제거를 보장하기 위해,이 절차를 12 번 반복합니다.
참고 : 에탄올은 리포좀과 정지 지질 이중층을위한 해가 될 것입니다. - 5 mM의 CaCl2를 1 μM Oy647 염료, 마약 트리스 버퍼 (멸균 여과 20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 8.0). 완전히 칩에서 세척 버퍼를 제거하고 즉시 칩에 도핑 된 버퍼를 추가합니다. 주 : 칩은 공동의 일정한 습윤 칩 표면을 보장 공기와 직접 접촉하지 않도록 칩은 세척 완충액의 제거 후 버퍼 얇은 막으로 피복된다.
- 트리스 버퍼에 1 ㎎ / ㎖ LUVs 또는 proteo-LUVs를 추가 (20 mM 트리스, 150 mM의 NaCl을, 산도 8.0, 멸균 여과) 각 웰에.
참고 : 각 웰의 최종 부피는 300 μL입니다. 도핑 된 트리스 완충액 첨가 도중에 제어 염료 및 화학 개질제 MTSET의 후속 첨가를 고려한다. - 칩 표면에 기공 스패닝 지질 이중층 형성 리포좀 용액을 실온에서 1 시간 동안 칩을 배양한다. 그 후 칼슘 2 + - 무료 트리스 버퍼의 4 배 400 μL와 각각의 칩을 씻는다.
- 5 μM의 최종 농도로 각 웰에 제어 염료를 추가한다. 이 칩은 이제 전위 분석에 대한 준비가되어 있습니다.
7. 분석 설치
- 표면 형광 현미경 (20X 공기 목적, 긴 작동 거리)에 칩 홀더를 탑재합니다. 더 쉽게 마이크로 캐비티의 초점면을 찾기 위해 나노 기공 칩의 가장자리에 초점을 맞 춥니 다. 공동 초점이 일단 영역 번째의 나노 기공 배열을 검사표시에서 가장 높은 비율을 밀봉.
주 : 모든 반전 표면 형광 현미경 칩 분석을 수행하는데 사용될 수있다. 목적 확대에 따라 (20X - 60X) 분석 충치의 수는 20 배의 배율을 사용하여보기의 단일 필드에 최대 9,000 충치와 다를 수 있습니다. 긴 작동 거리 공기 목적이 바람직하다. 반전 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)의 사용은 가능하지만, 화상 취득 인해 초점 제한 깊이로 제한 요인이 될 수있다. - 칩 조명을 최적화합니다.
주 : 변화가 관찰 될 수 없기 때문에, 두 염료 채널의 최대 계조 값을 초과하지 않도록해야. 수출 실험 최대 신호 용량의 90 %로 전좌 염료의 조명을 조정한다. 분명히 새는 어떤 막 시일을 검출하는 최대 신호 용량이 80 ~ 90 %로 개방 캐비티 내의 제어 염료를 조정한다. - 일단 모든 채널 시계열 시작 조정된다. 사진을 촬영할 때마다 10 ~ 20 자체90 분 동안 다.
참고 :이 마찬가지로 특정 및 불특정 유출 이벤트를 수행하기에 적절하다. - 특정 시스테인의 첨가에 의한 형광 기질의 유출을 초기화 긍정적 3mm의 최종 농도 화합물 MTSET 청구. 나중에 개방 채널에베이스 라인 이전에 안정적인 형광 신호를 구축 할 수 있도록 MTSET 첨가하기 이전의 실험 런타임 적어도 5 분을 허용합니다. 항상 사용하기 전에 신선한 직접 MTSET 솔루션을 준비합니다.
8. 데이터 분석
- ImageJ에의 표준 버전 (파일 / 가져 오기 / 이미지 시퀀스)로 시계열 이미지 스택을 엽니 다.
- 형광 채널을 적층하는 경우, 각 채널 (이미지에 이미지 / 스택 / 스택)에 대한 개별 스택의 채널을 분할합니다.
- 투자 수익 (ROI)에 대한 전위 기판 채널의 첫 번째 이미지 (관심 지역) 식별 (이미지 / 복제를) 중복.
- 이진 영상 (이미지 / 조정 / 임계 값)에 이미지를 변환합니다. 안전하게 하다것을 사용 된 알고리즘은 픽실 레이션 (pixilation)과 중첩하지 않고 밀봉 된 공동에 대한 신호를 나타낸다.
- 자동 입자 분석기 도구로 관심의 영역을 정의 (입자 분석 / 분석). 입자 소음을 방지하기 위해 규정 된 최소 입자 크기를 정의한다. "가장자리에서 제외"옵션을 확인하고 "구멍을 포함한다." 결과 로아는 마이크로 공동 배열 패턴을 반영하고 있는지 확인합니다. 개재 ROI를 따라서 제거, 유물이다. 투자 수익 (ROI) 목록을 저장합니다.
참고 : 측정 매개 변수를 설정해야합니다 입자 분석 (/ 설정 측정 / 지역 분석) 전에 "영역"에 - 시계열 분석 플러그인 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), 같은 크기에 자동으로 모든 로아 크기를 조정 엽니 다. 다시 크기 6X6 픽셀 및 타원형 모양 (타이머 시리즈 분석기 / AutoROIProperties)의 너비 / 높이에 기존의 모든 ROI를합니다. "기존 ROIS 크기 조정"옵션을 선택합니다. 그 결과 크기가 조정 ROI 목록을 저장합니다.
- 투자 수익 (ROI) 관리자를 엽니 다(ROI 매니저 / 추가 / 열기)을 (도구 / ROI 관리자 / 분석) 및 시계열의 각 채널의 크기를 조정 ROI 목록을로드합니다. 로아는 중첩됩니다. "모든 조각을 측정합니다"와 "슬라이스 당 하나의 행"을 시작 다중 측정을 선택, 멀티 측정 도구 (ROI 관리자 / 더 / 멀티 측정)를 시작 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 신호 변화를 분석합니다.
참고 : 측정 매개 변수 (/ / 설정 측정 분석 회색 값을 평균)이 단계에서 "회색 값을 의미한다"로 설정해야합니다 - *이 .txt 또는 * .XLS 형식으로 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 평균 회색 값을주고, 결과 테이블을 저장합니다.
- 은 "가져 오기 파일"옵션을 통해 NanoCalcFX에 각각의 영상 채널의 ROI 분석을 가져옵니다. 설정 "시리즈의 이름을 지정하기위한 첫 번째 줄을 사용합니다." 시간 시리즈 이미지 수집 기간에 따라 이미지 사이의 스텝 크기를 설정하고 해당 열 및 소수 구분 기호를 선택합니다.
- 자동으로 개별 FLUO의 그래프의 상관 관계를 위해 "여러 시트"옵션을 사용하여rescent 채널.
주 : 이벤트는 현재 분석 된 3 색 스펙트럼 정보에 의해 주어진 정보를 이용하여 분류 될 수있다. - 빌드에 맞는 기능 (맞춤 옵션)를 사용하여 선택된 커브를 장착한다.
참고 : 모든 단지 수 확산 기반 이벤트와 맞는 경계를 설정할 수 있습니다위한 구현 유출과 유입 식에 적합합니다. 그 결과 속도 상수는 히스토그램 도구를 사용하여 플롯 또는 추가 데이터 정제를 위해 내보낼 수 있습니다.
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Representative Results
기공 멤브레인 스패닝 쉽게 자기 조립 방식으로 나노 칩 표면 상에 생성 될 수있다. 그러나 기본 프로세스는 여전히 섬세하고 리포좀의 크기, 리포좀 인구, lamellarity, 지질 및 소금 농도와 화학적 표면 특성의 단 분산 같은 많은 매개 변수에 의해 영향을 받는다. 이러한 매개 변수의 대부분은주의 깊게 특징 및 위의 프로토콜 표준화되었다. 그러나 모든 새로운 제조시 확인해야 다른 매개 변수, 성공적인 실험을 보장합니다. 이러한 리포솜 크기 분포 및 인구 분산도 (도.이 A)이다. 최적의 기공 스패닝 제막과 잘 공경 상기 캐비티 공간 리포솜 크기로 리포좀의 침입을 방지하기 위해 필수적이다. 또한, 단 분산 리포좀 제제는 확산 및 FUSI 막에서 최상의 결과를 생성하는 것으로 나타났다에. 모든 제조 확인하는 또 다른 중요한 단계는 재구성 후 단백질 활성이다. 후 MsCl G 22 C로 재구성 리포좀하는 형광 dequenching 분석을 이용하여, 채널 개구부 활성화 후 MsCl G 22 C 단백질 (도.이 B)를 보유하는 리포좀의 비율을주는 형광 분광기를 통해 모니터링 할 수있다.
일단 칩 표면에 확산 리간드 활성화시 후 MsCl G 22 C, 형광등 대상 용질의 전위 (도. 3 B)을 다음 수있다. 설계 후 MsCl G (22) C 채널은 공동 공간 내부에 작은 형광 분자를 포획, 기본 상태로 닫혀있다. 화학 변조기 MTSET 첨가하여 양전하의 수축 영역에 도입후 MsCl G (22) C 기공, 정전 기적 반발력을 통해 오픈 추진. 종래 포획 형광 확산 평형을 달성하기위한 캐비티 공간을 기피한다. 캐비티 공간 내부의 형광의 후속 감소를 모니터 할 수있다. 이 과정은 유출 이벤트 균질 집단 (도. 3 C)의 결과, 높은 재현성이다. 얻어진 유출 곡선은 단일 및 다중 전위 이벤트 (도. 3 D)를 구별 할 수있는 분석의 능력을 보여주는 두 개의 별개 집단에서 클러스터. 또한, 시스템은 가능한 높은 콘텐츠 검진 기록 긍정적 위양성 결과 및 음극 사이에 정밀하고 객관적으로 구별 할 수있게 병렬 실시간 세 스펙트럼 잘 분리 염료까지 수행 할 수있다. 본 연구에서는 9.046 밀봉 충치는 8 %가 effl을 표시있는, 분석 하였다UX 행동. 서로 다른 형광 판독 채널을 배포, 이벤트는 단지 수 유출 사건, 복잡한 역학, 지질 침입 및 막 파열 (그림. 3 E)로 판별 할 수 있습니다. 제어 용질과 멤브레인 염료에 대한 꾸준한 신호를 표시 이벤트 만이 최종 분석에 대한 간주됩니다. 복잡한 반응 속도는 비정상 제어 신호에 유출 사건을 표현하기 때문에 생략한다. 지질 침입 및 막 파열은 본질적으로 기공에 걸쳐 지질 이중층 시스템을 사용하여 발생하는 이슈 이벤트입니다. (.도 4) 상술 한 바와 같이, 이들은 제어 염료 신호를 이용하여 폐기 될 수있다.
테오와 후 MsCl 기능 그림 2. 크기 분포. A) 소포는 analyz이었다 나노 입자 추적 분석 에디션. LUV 샘플 (블랙 추적) 전, 후 MsCl G (22) C (빨간색 추적)의 재구성 후 조사 하였다. LUV 준비 후, 214 ± 70 nm의 평균 입자 크기가 달성된다. 크기는 크기입니다. B) 후 MsCl 활동 158 ± 60 nm 인 테오의 결과로 재구성하는 동안 감소는 유출 분석에 의해 재구성 후 확인되었다. (28) 자기 담금질 칼 세인이 후 MsCl 채널의 MTSET 매개 개구부를 통해 테오에서 분리 될 때, 형광 물질 (적색) 및 형광 강도의 급격한 증가의 dequenching 선도. 단백질없이 리포좀은 이러한 유출, 반복해도 MTSET 추가 (검은 색)을 표시하지 않습니다. 리포좀의 출시 이후 세제 도입 가용화 (TX-100) 이전에 염료를 캡슐화. 이 수치는 21의 허가를 재사용했다.등 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 단일 분자 수준에서 후 MsCl에 의해 리간드 게이트 용질의 전위가. A) 엔지니어링 후 MsCl G (22) C 채널은 기본 상태로 닫혀있다. 이러한 형광 작은 용질은 채널이나 지질 이중층을 통해 모두를 통과 할 수 없습니다. MTSET, 각 후 MsCl G 22 C의 protomer의 설계 단일 시스테인의 첨가시 펜타 머 채널 복합체의 수축 측에서 여러 양전하를 도입, 수정됩니다. 후 MsCl G 22 C 채널 전하 반발력에 의해 밀어 개방하고, 포획 된 염료는 형광 강도의 저하를 초래 캐비티 밖으로 확산 될 수있다. B)를 티나 MTSET의 추가시 후 MsCl G 22 C 개방의 추적합니다. 기능적으로 재구성 된 후 MsCl G 22 C를 함유 테오는 칩 표면에 도포 하였다. Oy647 (적색) 전좌 기판으로서 캐비티 내부에 봉입 하였다. OregonGreen 덱스 트란 (70 kDa의 녹색은) 실험 기간 동안 상기 전송 이벤트의 기질 특이성뿐만 아니라 멤브레인의 무결성을 모니터링하는 제어 채널 투과성 기판으로서 첨가 하였다. 캐비티 내부의 지질 오염을 확인하기 위해, LUVs은 DOPE ATTO로 390 (보라색 0.1 몰 %)를 첨가 하였다. t = 0 초에서 MTSET의 추가 (3 mM의 최종)은 형광 판독. C를 통해 기록 된 캐비티에서 Oy647 유출) 무작위로 22 C 유출 곡선은 전형적인 유출 사건을 보여 주 후 MsCl G 들었다. D) 비율로 이어지는 채널을 엽니 다 두 가우스 인구에 전위 이벤트에 대한 상수 (N = 242) 클러스터S, 단일 및 다중 - 채널 전송 이벤트가 식별 될 수 있다는 것을 입증. E) 하이 콘텐츠 스크리닝 삼중 색 실시간 판독에 의해 9046 칩 밀봉 캐비티의 통계 분석. 모든 분석 칩 공동의 8 %는 지수 유출 이벤트를 보여줍니다. (:; : 제어 용질, 보라색 : 녹색 전좌 용질 빨간색 지질)로 인해 스펙트럼 디코딩에 유출 사건, 복잡한 역학, 지질 침입 및 막 파열 때문에 오탐 (false positive)을 제거 판별 할 수 있습니다. 이 그림은 (21)로부터 허가를 재사용했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 이벤트 클래스 삼색 검출 구별. 전좌 용질 (적색), controL 용질 (녹색) 및 지질 염료 (바이올렛) 스펙트럼 바이어스 데이터 선택을 가능하게 판별 할 수있다. A)를 더 세포막 단백질을 은닉하지 밀봉 캐비티 기록 후 MsCl 채널에 개시된 실험 조건 하에서 플럭스 이벤트를 표시하지 ().도 3A 참조 . 형광 판독은 모든 채널에 대한 안정적이다. B) 일시 중지 지질 이중층은 나노 기공의 균열에 걸쳐 연속적 지질 이중층의 공동. C) 막 파열 결과를 방해 할 수있는 병이 정의. 이로써, 캐비티 공간은 더 이상 버퍼 구획실로부터 분리되지 않는다. 포획 색소 (적색) 농도 구배 아래 캐비티를 회피. 멤브레인을 가로 질러 통과 이전에없는 제어 용질 (녹색), 지질 침입 이벤트에 대한 공동. D) 예를 들어갑니다. 지질 염료 (바이올렛)에 형광 신호가 상기 캐비티 공간에 침입 막으로 인해 증가하지만, 전위의 용질 인 pushe형광 신호의 저하로 이어지는 구멍 (적색) 중 D. 제어 용질 녹색 (로 확산하면서 나노 기공을 막 파단 동안 상기 제어 기판 (녹색). E)의 통과를 방지하는 지질 이중층에 의해 차단되어, 밀폐 수송 용질 신속), 캐비티 (적색) 발 회피. 이 그림은 (21)로부터 허가를 재사용했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 기술은 막 단백질 수송의 고도의 병렬 분석을 할 수 있습니다. 재구성 세포막 단백질 시스템은 직접 이론적마다 막 수송 체의 적응을 가능 또는 채널은 바이오 칩에 적용될 수있다. 전송 분석은 직접 형광 변화 (형광의 전위 또는 형광 표지 된 기판) 또는 간접 형광 변화 (pH 민감성 염료, 보조 효소 반응)을 통해 중, 형광 판독 시스템의 구축에 의해 제한된다. 후자는 그러나 아직 확립되어야한다.
단일 단백질 수준에서 막 채널 또는 운송의 기능 특성이 기술의 주요 초점이다. 자동화 현미경과 결합하여 단백질 이펙터 선별 애플리케이션의 구축이 가능하다. 분석 설정은 각각의 칩에 여러 개의 분석 포인트, 최대 8 개의 칩을 병렬 녹화를 할 수 있습니다. 때문에 칩의 완전한 분리, 그것은 조건이 설정 한 후에는 여러 실험적인 반복은 하나의 실험 실행에 컨트롤을 포함하여 허용, 진정으로 평행하다.
실험 설정시 중요한 단계는 상기 칩 표면과 상기 분석에 사용되는 기판을 향해 정지 지질 이중층의 보유 능력에 테오 효율 확산 진정한 단일 층 소포의 제조, 원하는 단백질의 활성의 재구성이다.
단일 층 소포의 제조 현탁 지질 이중층 형성시 칩 표면에 다중 층 막 시트의 설립을 방지하기 위해이 시험을 위해 기본적으로 중요하지만, 이는 제조 동안 리포좀 초음파를 통해 소포 unilamellarity을 위해 다소 용이하다.
테오의 직접 응용 프로그램은 방법 presente의 큰 발전이다디. 이전 방법과 대조적으로 더 복잡하고 의학적으로 중요한 단백질은 지금 물론 LUVs 선택의 기능성 단백질을 수득 재구성 프로토콜의 사전 설정을 필요로하는 타겟이 될 수있다. 또한, 대형 엑스트라 막 도메인을 갖는 막 단백질은 적절한 된 SSM의 형성을 감소시킨다. 이 CaCl2를 농도를 변화시킴으로써 예를 들어, 각각의 새로운 단백질에 대해 최적화되어야한다.
관심 단백질의 재구성 비율이 신중하게 선택되어야한다. 단일 단백질 이벤트의 해석은 여기에 제시된 기술을 이용하고 소망 accomplishable된다. 재구성 된 단백질의 양은 따라서 이상적인 재구성 가정 기공 멤브레인 스패닝 패치 당 멤브레인 단백질이 확률 적 이중층 분산되는 1-2 기능성 단백질 단위를 초과하지 않아야한다. 그것은 또한 N 갖는 한 재구성 후의 단백질의 방향성은 또한 명심해야한다오티는 모두 지향성과 동일합니다.
마지막으로 한 번에 모든 문제를주의 깊게 확인하고 최적화, 사용 된 기판 중 어느 것도 기공에 걸쳐 막의 불특정 막 투과성을 표시하지 않을 수 있습니다. 적색 스펙트럼 정권 가장 로다 계 염료 등 양전하 형광체 신속 막 장벽을 극복하는 경향이있다. 강한 소수성 상호 작용과 같은 지질 이중층에 비특이적 부착을 초래할 수있다. 두 특성이 요구되지 않습니다.
정성적인 방법으로 이온 채널에 대한 연구도 생각할 수있다. 예 이진을 사용하여 채널 이펙터 선별 / 아니오 판독 이온에 민감한 염료를 사용하여 생각하지 수 있습니다. 가장 큰 장애물은 여기에 적어도 부분적으로 이온 유지 지질 이중층의 설립이 될 것이다. 이것은 나노 기공 칩의 표면 개질을 통해 달성 될 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
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