Abstract
Мембранного белка транспорта на одном уровне белка все еще уклоняется детальный анализ, если субстрат транслоцируются не является электрогенный. Значительные усилия были предприняты в этой области, но методы, позволяющие автоматизированный анализ высокой пропускной способностью транспорта в сочетании с не содержащих растворителей методами двухслойных липидов, необходимых для анализа мембранных транспортеров являются редкими. Этот класс транспортеров однако имеет решающее значение в ячейке гомеостаза и, следовательно, ключевой целью в разработке и методологий, чтобы получить новое понимание наркотиков крайне необходимо.
Здесь представлена рукопись описывает создание и обработку нового биочипа для анализа процессов переноса белковых опосредованной мембраны при одной резолюции переносчика. Биочипа состоит из микрорезонаторах приложенных нанопор, что чрезвычайно параллельный в своей конструкции и могут быть произведены в промышленном сортности и количестве. Белково-укрывает Липосомы могут непосредственно применяться кчип поверхность формирования самоорганизующихся пор остовного бислоев с использованием ССМ-методов (твердый поддерживается липидные мембраны). Поры остовного части мембраны отдельно стоящая, обеспечивая интерфейс для транслокации субстрата в или из пространства полости, что может сопровождаться мультиспектрального флуоресцентного считывания в режиме реального времени. Создание стандартных операционных процедур (СОП) позволяет прямое создание белка-укрывает липидного бислоя на поверхности чипа практически каждого мембранного белка, который может быть восстановленным функционально. Единственным условием является создание люминесцентной системы считыванием для не электрогенных транспортных субстратов.
высокопроизводительных приложений содержание скрининга осуществимы за счет использования автоматизированных перевернутых флуоресцентных микроскопов записи нескольких чипов параллельно. Большие наборы данных могут быть проанализированы с помощью свободно доступных специально разработанный программного обеспечения для анализа. Трехцветный мульти спектральная люминесцентнаясчитывание, кроме того, позволяет непредвзято дискриминации данных на различные классы событий, исключая ложные положительные результаты.
Технологии чипа в настоящее время базируется на SiO 2 поверхностях, но дополнительно функционализации с использованием поверхности чипа с золотым покрытием также возможно.
Introduction
Анализ мембранных белков стал повышенный интерес к основной и фармацевтических исследований в течение последних 20 лет. Разработка новых лекарственных средств зависит от идентификации и детальной характеристики новых целей, в настоящее время является одним из факторов, ограничивающих. Тот факт , что около 60% всех лекарственных мишеней являются мембранными белками , 1, делает разработку методов для выяснения их функции наиболее важной.
В прошлом, методы для изучения электрогенных каналов и транспортеров, были разработаны во множестве 2 - 4. Non-электрогенных субстратов в наоборот представляют собой более сложную задачу. Они, однако , представляют особый интерес в качестве главных мишеней для лекарственных средств, поскольку они контролируют поток растворенных веществ и питательных веществ через клеточную мембрану и функции в качестве ключевых рецепторов в сигнальных каскадов 5.
Значительные усилия были введены в разработку тechniques изучить функцию мембранных транспортных белков 6, 7. Системы , использующие на твердой подложке мембран появились как наиболее перспективные инструменты в этой области 8 - 10, в том числе твердых поддерживаемых липидных бислоев, привязанные Бислои 11, 12, microblack липидные мембраны 13, 14 и родной везикул массивов 15, 16 , чтобы назвать несколько. Некоторые из них даже доступны в качестве коммерческих установок 17, 18. Некоторые примеры были опубликованы комбинируя возможность изучать одиночные мембранные белки в очень параллельно 14, 19, является необходимым условием для отбора заявок. Тем не менее, эти методы редко мост от фундаментальных исследований к промышленной среде. Трудности часто заключаются в способности системы, чтобы быть автоматизированы, дорогостоящем производства и / или кропотливой подготовки. Подход оvercoming все вышеперечисленные препятствия является конечной целью.
Методика представлена здесь была разработана для изучения мембранных каналов и транспортеров в пробирке в контролируемой среде на одном уровне белка 20 - 22. Воссоздание очищенных мембранных белков в БУВ гораздо более , чем установлено , сопоставимых подходов к GUVs 23 - 26 или черный липидные мембраны 27. Они могут быть непосредственно нанесена на поверхность чипа, где возможно образование бислой проходит через процесс самосборки. Со стеклянным дном конструкция нанопористых чипа (рис. 1) позволяет воздушной микроскопии другим , что обеспечивает простую автоматизацию системы. В сочетании с моторизованным этапе множественные чипы могут быть измерены в то же время, с каждым полем зрения, содержащих тысячи закрытых полостей для анализа.
Рисунок 1. Дизайн мультиплексированных нанопористых биочипов. А) кремний на диэлектрике (КНД) пластина структурирована реактивно-ионное травление. Приблизительно 1,150 отдельные микросхемы изготавливаются из каждой пластины с одинаковыми свойствами и качеством. B) Каждый чип содержит отдельные 250000 микрорезонаторов с нано отверстиями. Шкала бар:. 200 мкм C) Каждая полость адресуется с помощью многоспектральная флуоресценции считывания. An непрозрачными блоки Верхний слой флуоресцентные сигналы от буферного резервуара, что делает биочип совместимым с перевернутыми микроскопов флуоресценции. D) атомно - силовой микроскопии (АСМ) изображений выявляет равномерно расположены отверстия пор и шероховатость поверхности слоя диоксида кремния 3,6 нм (п = 40) оптимальным для слияния пузырьков. Шкала бар:. 5 мкм E) Сканирующий электронный микрофонroscopy (СЭМ) изображение показывает поперечное сечение через нанопоры разрешение доступа к femtoliter полостей внутри кремниевого чипа. Эта цифра была повторно с разрешения 21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Весь анализ данных осуществляется с помощью бесплатное программное обеспечение, чтобы гарантировать неограниченный доступ для конечных пользователей. Временные ряды анализируются с помощью бесплатного программного обеспечения для обработки изображений и пользовательской кривой сборки программного обеспечения для анализа, позволяющий пакетной обработки и прямой корреляции больших наборов данных с несколькими флуоресцентными каналами и тысячи кривых.
Протеин модель , используемая в данном протоколе является механочувствительных канал большой проводимости канала (MSCL) белка , полученного из E. палочки. Он функционирует как клапан, чтобы выпустить осмотический шок по своей природе, но был изменен таким образом, чтобы рационально разработанной Synthetic функциональность может быть ковалентно присоединен к стороне канала сдавливания. Через заряда-отталкивания, ковалентно связанного активатора (MTSET) канал запускается для открытия, создания нано-клапан. Малые молекулы, такие как ионы, вода, небольшие белки, но и небольшие флуорофоров могут проникать через канал. Здесь, белок используется в качестве модели для демонстрации способности системы выявлять белок-опосредованного транслокацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Большой однослойные везикулы (БУВ)
- Очистите круглодонную колбу (объем 10 мл) с газообразным азотом, чтобы удалить любые частицы пыли. Промойте круглодонную колбу с этанолом.
Примечание: Остаточный этанол может быть допущено и не нарушает последующие шаги. - Промыть 1 мл стеклянный шприц 4 раза хлороформом, чтобы удалить любые загрязнения. Добавляют 4 SoyPC20 мл (25 мг / мл в хлороформе), в круглодонную колбу и легирование липидного раствора с дополнительным DOPE ATTO 390 до конечной концентрации 0,1% мол.
Примечание: вместо DOPE ATTO 390 других флуорофоров меченных липидов или липофильных красители также могут быть использованы, в зависимости от имеющихся источников возбуждения. - Подключите круглодонную колбу на роторном испарителе. Сушат липидную пленку в течение 40 мин при 300 мбар, 30 ° температуры водяной бани С и максимальная скорость вращения, с образованием гомогенной липидной пленки на стеклянной стенке колбы.
- Transfэр колбу с высоким вакуумным насосом и сухой липидной пленки еще в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 5 мл буфера (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8,0, фильтруют в стерильных условиях) и 8 стеклянных шариков (диаметр 2,7 мм, этанол промывают и сушат) в колбу. Подключение колбу на роторном испарителе и вращаются без вакуума при 50 ° C при максимальной скорости.
Примечание: Стеклянные шарики механически смещать липидную пленку из стеклянной стенки, что приводит к (многопластинчатой) формирования везикул. После вращения 45 мин раствор появляется млечный и никакого остаточного липидная пленка не должна быть видна на стенках колбы. Вместо того, чтобы стеклянные шарики и другие методы, такие как обработка ультразвуком колбу на водяной бане ультразвуковым дезинтегратором, встряхивая колбу или нежный метод регидратации также применимы. - Перенести колбу в атмосфере инертного газа (аргон) в ультразвуковой ванне и разрушать ультразвуком в течение 4 мин при комнатной температуре.
Примечание: ультразвуковые ударные волны разрушают липосом, делая их однослойными. - Разделить решение LUVв 1 мл аликвоты.
- Выполнение циклов 5 циклов замораживание / оттаивание при замораживании растворов LUV в жидком азоте, с последующим оттаиванием при 40 ° С в водяной бане.
Примечание: Это приводит к разрыву и спонтанной перестановке отдельных липосом друг с другом, что приводит к увеличению размеров. - На последнем этапе заморозки магазине все образцы при -80 ° С.
Примечание: БУВ будет стабильным в течение по крайней мере 6 месяцев.
2. Белок Воссоздание
- Оттепель 1 мл аликвоты LUV на льду. Непосредственно перед восстановлением, выдавливать через липосом 17x 400 нм поликарбоната мембранный фильтр с использованием мини-экструдер.
Примечание: липидные агрегаты будут удалены, и конечный равномерное распределение размера достигается. - Дестабилизироваться БУВ добавлением 4% Triton X-100 (об / об) до конечной концентрации 0,25% (об / об) и инкубировали в течение 5 мин при 50 ° С.
Примечание: Количество липосом используемое на этой стадии , зависит от массы очищенного MSCL G <SUP> 22 C используется (см шаг 2.3). Очищают MSCL G 22 C (полученный из E.coli) , как подробно описано в 28. - Смешайте очищенный MSCL G 22 C и моющими насыщенных липосом в 1:20 (вес / вес) отношение и инкубировать в течение еще 30 мин при 50 ° С.
- Для удаления детергента добавить био-частиц в трис-буфере (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8,0, фильтруют в стерильных условиях) к раствору белка / липосом, 16 мг (сырого веса) био-частиц за мкл моющего средства, используемого для дестабилизации липосом в шаг 2.2.
- Выполнить удаление моющего средства в течение ночи (16 ч) при 4 ° С на вращающейся пластине.
Примечание: Постоянное перемешивание раствора обеспечивает оптимальное удаление моющего средства. - После удаления моющего средства хранения протеолипосом при 4 ° C и использовать для экспериментов в тот же день.
3. Анализ активности
- Во время восстановления белка возьмите 100 мкл аликвоты очищающаядестабилизировали решение proteoliposome после окончания шага 2.3.
- Добавить 1 объем кальцеина (30 мМ) к раствору белка-липосомами и инкубировать еще 5 мин при 50 ° С.
- Удалите моющее средство из раствора, как это описано в пункте 2.4 - 2.6.
- После удаления моющего средства уравновешивания с эксклюзионной колонки (20 мл объема слоя или более) с трис-буфером (3x объема слоя).
Примечание: разделение Proteoliposome можно проводить при комнатной температуре, однако выдержки образца постоянно при температуре 4 ° С, рекомендуется, чтобы обеспечить лучшую активность белка после фракционирования. - Отдельные протеолипосомы от свободного кальцеина, применяя весь аликвоту (200 мкл) в колонку вытеснительной. Разрешить смесь, чтобы впитать в колонку с последующим элюированием протеолипосомах из колонны через непрерывного применения буферной на верхней части используя самотеком. Обратите внимание на кальцеина, содержащий Протеолипосомы в виде дискретной оранжевой полосы в элюции фронте. Собирают фракции 500 & #181; л соответственно.
Примечание: Free кальцеин краситель будет вымывается после proteoliposome фракции с полным разделением. - Пипетка 80 мкл каждой фракции на микро-луночный планшет для флуоресцентной Считывание и идентифицировать фракцию, содержащую наибольшее количество кальцеиновыми, содержащих протеолипосом с помощью флуоресцентной эмиссии. Обнаружение флуоресценции при длине волны 520 нм с возбуждением при длине волны 490 нм. Используйте proteoliposome фракцию с наивысшим сигналом для следующего анализа активности.
- Смешайте 20 мкл proteoliposome фракции, содержащей с 980 мкл буфера Трис в флуоресцентной кювете 1 мл.
- Мера эмиссии флуоресценции при длине волны 520 нм (возбуждение 490 нм) с использованием спектрофлуориметре. Запись в течение 1 мин, а затем добавляют 25 мкл MTSET ([2- (триметиламмоний) этил] methanethiosulfonate) из исходного раствора (160 мМ) и хорошо перемешать. Продолжайте записи во время перемешивания. Всегда подготовить исходный раствор свежего непосредственно перед использованием.
Примечание: После того, как решается в буфере MTSET Hydrolyzes в течение 30 минут и будет не реактивным. MTSET могут быть взвешены и выдерживают в виде сухого порошка аликвот при -20 ° С до использования.
Примечание: После активации С канал MSCL G 22 открывается и захваченный кальцеина, что приводит к локальному уменьшению концентрации от кальцеина когда effluxing в протеолипосомах и последующее dequenching красителя, что приводит к увеличению флуоресцентной эмиссии. - После того, как излучение флуоресценции вновь достигла стабильного плато, солюбилизации липосом путем добавления 50 мкл тритона Х-100 (4% об / об).
Примечание: В идеальном случае не наблюдается дальнейшее увеличение флуоресценции, подразумевающий активный белок в каждом липосом.
4. Измерение размера Распределение БУВ использование отслеживания нано-частиц
- Обратите внимание, что только минимальные образцы липосом или proteoliposome решения необходимы для анализа распределения частиц по размерам с использованием наночастиц трекера. Развести липосомной раствор 5 мг / мл концентрации липида 1: 5000 (об / об) в буфере (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8,0, фильтруют в стерильных условиях) для анализа до конечного объема 1 мл. Фильтр всех буферов, используемых для разбавления и предварительной подготовки LUV и восстановления с использованием мембраны 0,2 мкм для удаления любых взвешенных частиц, таких как пыль, которая может нарушить измерения распределения по размерам.
- Промыть блок-камеру с ультра-чистой воды.
- Используйте поверхностные маркеры, чтобы сосредоточиться на световой пучок. Вводят приблизительно 300 мкл разбавленного образца липосом и немедленно закрыть выпускной клапан, чтобы остановить поток внутри камеры потока, без введения каких-либо воздушных пузырьков.
- Настройка фокуса и затвор камеры / усиления настройки для обеспечения адекватного сигнала рассеяния образца для детектирования.
Примечание: 20 - 80 сигналы должны быть четко видны в поле зрения. Предотвращения перенаселенности (> 80 сигналов), как программное обеспечение не будет иметь возможность отслеживать отдельные сигналы, когда перекрываются. - Перейти к "Захват" ЮКЖДееп. Отрегулируйте регулятор температуры до 25 ° С и продолжительность съемки до 90 с помощью элементов управления программного обеспечения. Нажмите кнопку "Запись", чтобы начать запись временных рядов.
Примечание: После завершения временного ряда открывает новое окно. - Сохранение временных рядов в данном формате (* .avi). По практическим причинам во время пакетного анализа сохранить все файлы в одной папке.
- Откройте выпускной клапан и вводят еще 300 мкл в проточную камеру. Закройте клапан и повторите шаги 4.3 - 4.6 раза.
- После завершения всех образец проходит мыть проточную камеру с 5 мл сверхчистой воды. Перейдите к экрану "Pre-Process". Установите температуру параметров калибровки = 25 ° C и вязкость = 0,91 для буфера Трис, используемого в данном протоколе.
- Откройте окно пакетной обработки и загрузки записанных временных рядов (Advanced / Batch Process / Set File 1-3). Нажмите кнопку "GO", чтобы начать анализ распределения частиц по размерам.
Примечание: Аналитическая программа автоматизацчески отслеживает отдельные частицы и вычисляет их диаметр в зависимости от их поведения движения с использованием параметров, установленных на шаге 4.8.
Примечание: В результате анализа распределения по размерам сохраняется автоматически в ту же папку, файлы временного ряда. - Кроме того, создать файл отчета для подведения итогов (Экспорт / Создать отчет PDF).
5. Держатель Подготовка Чип
- Взвешивают 1,0 г MDX4 медицинского качества эластомерной основы и 0,1 г агента MDX4 отверждения в реакционную трубку 50 мл. Смешать и тщательно очищают с помощью стеклянной панели.
- Поместите трубку в эксикаторе в течение 1 часа, чтобы дегазировать клей. После этого использовать его в течение 30 мин для чипа склейки, как клей затвердеет и будет слишком трудно работать.
- Во время эластомерного дегазацию (этап 5.1) очистить объективное предметное стекло тщательно хлороформом для удаления любых загрязнений, прежде чем чип склеивания. Промыть слайд с 5 мл хлороформа с использованием стеклянного шприца. Собираютхлороформ в под расположенным стакан. После промывки дайте слайд высохнуть.
Примечание: Этот шаг следует выполнять под вытяжкой. Альтернатива хлороформа, могут быть также использованы другие органические растворители, такие как ацетон. - Депозит небольшое количество связующего материала на клеевой покровного стекла с помощью кончика пипетки (кристалл советы по 10 мкл пипеток). Помните, что чипы должны вписываться в держатель слайдов 8-камеры позже и должны быть размещены на слайде соответствующим образом.
- Осторожно удалите один чип в то время от вафельные плиты с использованием тонких наконечников пинцета и поместить фишку на каплю клея на покровного стекла. Убедитесь, что сторона с покрытием чипа была обращена вверх.
- Аккуратно вставьте чип на покровного стекла с задней тупым PE пинцетом. Для того, чтобы убедиться, что клей распределяется равномерно под чип, аккуратно вставьте чип вперед и назад. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Убедитесь, что пузырьки воздуха не оказались в ловушке под чипом, так как она будет мешать оптической томографиичипа полостей позже. Кроме того, убедитесь, что ни один клейкий материал не загрязняет поверхность чипа.
- Пересушивают готового покровного стекла в течение 2 ч при температуре 65 ° C в шкафу сушилки.
Примечание: Чипсы по - прежнему покрыты защитным слоем , происходящих из их изготовления , который должен быть удален. - Чтобы снять защитный слой, выполнить последовательный растворитель стадии промывки. Во время отверждения чипах, предварительно нагреть на водяной бане до 54 ° С.
- Поместите 3 стеклянные мензурки в воду ванны, два из них, наполненные изопропанола и один заполненный ацетоном.
- Вставьте защитное стекло чип в держатель слайдов и погрузить его в первый изопропанолом, заполненного блюдо в течение 10 мин. Затем перенести его на ацетон заполнены блюдо, инкубировать еще раз в течение 10 мин перед передачей его на конечной стадии промывки ко второму изопропанолом блюдо и инкубировать еще 10 мин.
- Снимите держатель слайдов из чашки и тщательно промойте его с широко ultrapurе водой, с последующей сушкой стружки с слабым потоком газообразного азота.
- Взлет ламинирования лист из 8-а липким горкой и положить его назад на скамью. Осторожно поднимите крышку слайд и осторожно нажмите на липкой горкой с фишками, стоящих скважин. Пусть готовый держатель чип остальное в течение нескольких минут перед использованием.
6. Анализ Получение
Примечание: нанопористых чипы приклеены к покровным стеклом и отделены друг от друга 8-луночного липкого горкой обладают преимуществом, что множественные чипы могут быть решены в одной экспериментальной серии, с щепа будучи полностью отделены друг от друга.
- После подготовки держателя чипа, промойте каждый чип с чистым этанолом и высушите газообразным азотом, чтобы удалить любые загрязнения, как пыль.
- Очистите поверхность чипа с воздухом, кислородом или азотной плазмы. В зависимости от типа периодов времени плазменной очистки варьируются: выполняют обработку кислородной плазмы в течение 1 мин, воздуха и NITРоген плазмы в течение 5 мин при 0,3 мбар при 80% мощности (настройка ВЧ-мощность средний или высокий).
- После плазменной очистки инкубировать чипы в чистом этаноле в течение 10-15 мин, чтобы обеспечить смачивание полости.
- Поэтапное обмен этанол для буфера путем добавления 400 мкл трис-буфера (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8,0, фильтруют в стерильных условиях), с последующим перемешиванием раствора без введения пузырьков воздуха и последующее удаление 400 мкл. Повторите эту процедуру 12 раз, чтобы обеспечить удаление этанола.
Примечание: Этанол было бы вредно для липосом и взвешенных липидного бислоя. - Dope Трис - буфер (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8,0, фильтруют в стерильных условиях ) с 5 мМ CaCl 2 и 1 мкМ Oy647 красителя. Полностью удалите промывочный буфер из чипа и сразу же добавить легированный буфер к чипу. Примечание: Чипы будут покрыты тонким буферной пленки после удаления буфера для промывок, так что чип не находится в непосредственном контакте с воздухом, обеспечивая постоянный смачивание полостей и поверхности чипа.
- Добавить 1 мг / мл БУВ или протеобактерий БУВ в Трис-буфере (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8,0, фильтруют в стерильных условиях) в каждую лунку.
Примечание: Конечный объем в каждой лунке составляет 300 мкл. Рассмотрим последующие дополнения управления красителя и химического модификатора MTSET во время легированного Трис буфера дополнительно. - Для получения липидной образования пор остовного двухслойном на поверхности чипа инкубировать чип в течение 1 ч при комнатной температуре с раствором липосом. Затем промойте каждый чип с 4x 400 мкл Ca 2 + -бесплатно Трис - буфера.
- Добавьте контрольный краситель в каждую лунку, при конечной концентрации 5 мкМ. Чипы теперь готовы для анализа транслокации.
7. Настройка анализа
- Установите держатель чипа к эпифлуоресцентной микроскопом (воздух объективной 20X, большое рабочее расстояние). Сосредоточиться на краю чипа нанопор легче найти фокальной плоскости микрополостями. После того, как полости находятся в фокусе сканирования массива нанопор для региона йна дисплеях высокий коэффициент уплотнения.
Примечание: Каждый перевернутой эпифлуоресцентной микроскоп может быть использован для выполнения анализов чип. В зависимости от объективного увеличения (20X - 60X) количество проанализированных полостей будет изменяться, вплоть до 9000 полостей в одном поле зрения с использованием 20X увеличения. Воздушные цели с большим рабочим расстоянием являются более предпочтительными. Использование перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопов (КЛСМ) также возможно, но получение изображений может быть ограничивающим фактором, из-за ограниченной глубины резкости. - Оптимизация освещения чипа.
Примечание: Убедитесь, что оба канала красителя не превышает максимального значения шкалы серого, так как не могут наблюдаться изменения. Для экспорта экспериментов регулировать освещение транслоцируется красителя до 90% от максимальной мощности сигнала. Регулировка управления красителя в открытых полостей до 80-90% от максимальной мощности сигнала, чтобы четко обнаружить любую протекающую уплотнение мембраны. - После того, как все каналы корректируются начинают временные ряды. Возьмите изображения каждые 10-20 сеС в течение 90 мин.
Примечание: Это достаточно, чтобы аналогичным образом следуют специфические и неспецифические эффлюксных события. - Инициализировать вытекание флуоресцентного субстрата путем добавления цистеина специфического, положительно заряженного соединения MTSET до конечной концентрации 3 мМ. Должно быть не менее 5 мин эксперимента выполнения до MTSET того, чтобы иметь возможность в дальнейшем создать стабильную флуоресцентного сигнала базовой линии до начала канала открытия. Всегда приготовить раствор MTSET свежей непосредственно перед использованием.
Анализ 8. Данные
- Откройте время стек серии изображений со стандартной версией ImageJ (Файл / Импорт / последовательности изображений).
- Если флуоресцентные каналы уложены, разделить каналы в отдельных стеков для каждого канала (Image / Стеки / Stack к изображениям).
- Дубликат первое изображение канала транслокации субстрата для ROI (области интереса) идентификации (Изображение / дубликат).
- Преобразование изображения в бинарное изображение (изображение / Adjust / Threshold). обеспечиватьчто алгоритм, используемый изображает сигналы для всех закрытых полостей без перекрытия пикселизации.
- Автоматическое определение областей, представляющих интерес с инструментом анализатора частиц (Анализ / Анализ частиц). Определить минимальный размер частиц, определенный, чтобы избежать частиц шума. Проверьте параметры "исключить по краям" и "включают в себя отверстия". Убедитесь в том, что в результате трансформирования отражают картину микрополость массива. Промежуточными трансформирования артефакты, поэтому удалить их. Сохранение списка ROI.
Примечание: параметр измерения должен быть установлен в положение "область" перед проведением анализа частиц (Analyze / Set Измерения / Area) - Откройте Time Series Analyzer плагин (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html~~HEAD=dobj), который изменяет размеры всех трансформирования автоматически одинакового размера. Изменение размера всех существующих трансформирования к ширине / высоте 6x6 пикселей и овальной формы (Таймер анализатор серии / AutoROIProperties). Отметьте опцию "Изменить размер существующего Ройс". Сохраните полученный с измененным размером списка ROI.
- Откройте диспетчер ROI(Анализ / Инструменты / ROI Manager) и загрузить малоформатной список ROI для каждого канала временного ряда (ROI Manger / More / Open). Трансформирования будут наложены. Для анализа изменения сигнала для каждого ROI начать мульти инструмент Измерить (ROI Manager / More / Multi Measure), выберите "Измерить все кусочки" и "по одной строке на срез" и начать Мультиселектором меру.
Примечание: параметр измерения должен быть установлен в положение "означают значение серого" для этого шага (Анализировать / Set Измерения / Среднее значение серого) - Сохраните полученную таблицу, давая среднее значение серого для каждого ROI в формате * .txt или * .xls формате.
- Импорт анализ ROI каждого канала формирования изображения в NanoCalcFX с помощью опции "Импорт файла". Набор "Использовать первую строку для обозначения серии". Устанавливает размер шага между изображениями в соответствии с периодами приобретения серии изображений времени и выбрать соответствующий столбец и десятичный разделитель.
- Используйте опцию "несколько листов", чтобы автоматически коррелируют графики индивидуального флуофлуоресцентным каналы.
Примечание: События теперь могут быть проанализированы и классифицированы с использованием информации, приведенной на 3-цветной спектральной информации. - Установить выбранные кривые, используя встроенные функции подгонки (FIT опция).
Примечание: Внедренная Отток и приток уравнение подходит для всех моноэкспоненциален диффузии управляемые события и подходят границы могут быть установлены. Полученные константы скорости могут быть построены с помощью инструмента гистограммы или экспортировать для уточнения дополнительных данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поры остовного мембраны могут быть легко созданы на поверхности наноструктурированного стружки в самоорганизующейся образом. Однако основной процесс по-прежнему тонкий и зависит от многих параметров, таких как размер липосом, монодисперсности липосомной населения, ламеллярности, липид и солевыми концентрации и химических поверхностных свойств. Большинство из этих параметров были тщательно охарактеризованы и стандартизованы в вышеприведенном протоколе. Другие параметры, однако, должны быть проверены во время каждого нового препарата, чтобы обеспечить успешный эксперимент. Это распределение по размерам липосомами и дисперсность популяции (рис. 2 А). Для формирования оптимальной мембраны пор охватывающей и избежать вторжения липосом в размерах полости пространство липосом значительно выше диаметра пор являются необходимостью. Кроме того, монодисперсные липосомные препараты, как было показано, чтобы получить наилучшие результаты в мембране распространения и Fusiна. Еще один важный шаг, который должен быть проверен для каждого препарата является активность белка после восстановления. С помощью флуоресцентного-dequenching анализ для липосом с восстановленным MSCL G 22 C, открытие канала можно контролировать с помощью флуоресцентной спектроскопии, давая отношение липосом , несущих активный MSCL G 22 С белка (рис. 2б).
После того, как распространилась на поверхности чипа, растворенное вещество транслокация флуоресцентной мишени MSCL G 22 C при активации лиганда может следовать (рис. 3 B). Engineered MSCL G 22 C каналы закрыты в состоянии по умолчанию, захватывая небольшие флуоресцентные молекулы внутри пространства полости. При добавлении химического модулятора MTSET положительные заряды введены в перетяжечной областьMSCL G 22 C пор, толкая его открытым с помощью электростатического отталкивания. До захваченный Флуорофор уклоняется пространство полости для достижения диффузионного равновесия. Последующее уменьшение флуоресценции внутри пространства полости можно контролировать. Этот процесс хорошо воспроизводим, что приводит к однородной популяции эффлюксных событий (рис. 3 C). Полученные кривые оттоку кластер в двух различных популяций, демонстрируя способность анализа различать одно- и многоканальных транслокации событий (рис. 3 D). Кроме того, система способна следовать до трех спектрально хорошо разделенных красителей параллельно и в режиме реального времени, что позволяет записывать скрининги высокого содержания и различить точно и объективно между положительными, ложных положительных и отрицательных результатов. В этом исследовании были проанализированы 9.046 герметичные полости, из которых 8% отображается efflповедение УБ. Развертывание различными флуоресцентными каналов считывающие, события могут подвергаться дискриминации в моноэкспоненциален эффлюксных событий, сложной кинетикой, липидные интрузий и мембранных разрывами (рис. 3 E). Только события, которые отображают устойчивые сигналы для управления растворенного вещества и мембраны красителя рассматриваются для окончательного анализа. Сложные кинетика представляют эффлюксных события с нестационарными сигналами управления и поэтому опущены. Жировые интрузии и мембранные разрывы артефакта события, происходящие по своей природе с использованием пор охватывающей двухслойных системах липидов. Они могут быть отброшены с использованием сигналов управления красителем , как указано выше (фиг. 4).
Рисунок 2. Распределение Размер протеолипосом и функции MSCL. А) Пузырьки были Analyz ред анализом отслеживания нано-частиц. Образцы LUV были рассмотрены ранее (черный след) и после восстановления MSCL G 22 C (красная линия). После подготовки LUV, средний размер частиц 214 ± 70 нм достигается. Размер уменьшается во время восстановления, что приводит к протеолипосом 158 ± 60 нм активности размера. B) MSCL была подтверждена после восстановления с помощью анализа эффлюксного. 28 Self-гас кальцеин высвобождается из протеолипосом через MTSET-опосредованного открытия канала MSCL, что приводит к dequenching флуорофора (красный) и быстрым увеличением интенсивности флуоресценции. Липосомы без белка не проявляют такой оттоку даже после многократного добавления MTSET (черный). Последующее детергента введено солюбилизации (ТХ-100) из выпусков липосом все ранее инкапсулированный краситель. Эта цифра была повторно с разрешения 21.и др = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Лигандами транслокация растворенного вещества по MSCL на уровне одной молекулы. А) Engineered MSCL G 22 C каналы закрыты в состоянии по умолчанию. Малые растворенные вещества, такие как флуорофор не могут проходить ни через канал, ни в липидный бислой. При добавлении MTSET, сконструированного одного цистеина каждого MSCL G 22 C протомера модифицируется, вводя несколько положительных зарядов в перетяжечной стороне канала пентамерной комплекса. MSCL G 22 С канала проталкивается открыто путем заряда отталкивания и захваченный краситель может диффундировать из полости, что приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции. B) Tiмне следы MSCL G 22 C открытия при добавлении MTSET. Протеолипосомы содержащие функционально водостойких MSCL G 22 C были распределены на поверхности чипа. Oy647 (красный) был захваченный внутри полостей как транслокации субстрата. OregonGreen декстран (70 кДа, зеленый) был добавлен в качестве канала управления непроницаемой подложки для контроля субстратной специфичности транспортного события, а также целостность мембраны в процессе эксперимента. БУВ были дополнены DOPE ATTO 390 (0,1 моль%, фиолетовый) , чтобы проверить на предмет загрязнения липидного внутри полостей. Добавление MTSET (3 мМ конечная) при Т = 0 сек открывает канал, ведущий к Oy647 оттоке из полостей, записанной с помощью флуоресцентной считыванием. C) Случайным выбрал MSCL G 22 кривые C оттоку демонстрируют типичные эффлюксных события. D) Оценка константы для транслокации событий (n = 242) кластер в двух гауссовских населенияs, демонстрируя , что одно- и многоканальные транспортные события могут подвергаться дискриминации. E) высокого содержания скрининга и статистический анализ 9,046 закрытых полостей чип тройным цветов в режиме реального времени отсчета. 8% всех анализируемых полостей чипа показывают экспоненциальный эффлюксных события. Из-спектрометрического декодирования (красный: транслоцируются растворенного вещества, зеленый: контроль растворенного вещества; фиолетовый: липидного), эффлюксных событий, сложной кинетикой, липидных интрузий и мембранных разрывам может подвергаться дискриминации, тем самым устраняя ложных срабатываний. Эта цифра была повторно с разрешения 21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Классы событий отличаются обнаружения трехцветной. Транслоцируются растворенного вещества (красный), CONTROл растворенного вещества (зеленый) и липидной краситель (фиолетовый) может быть спектрально дискриминации позволяет непредвзятого выбора данных. A) Герметичные полости не укрывательство не мембранного белка не показывают потока событий в экспериментальных условиях , описанных для MSCL канала записи (см. 3А) , Флуоресцентные считывания является стабильным для всех каналов. Б) Жестокое определенные взвешенные липидные двухслойные способны вторгаться полости. Результаты C) разрыв мембраны в разрывных липидный бислой , охватывающих нанопор фиссуры. не Таким образом, пространство полости больше не отделяется от буферного отсека. Захваченные красители (красный) уклоняться от полости вниз градиента концентрации. Контроль растворенного вещества (зеленый), которые ранее не могли проходить через мембрану, попадает в D) Пример для события проникновения липидный полости.. В то время как флуоресцентный сигнал для липидного красителя (фиолетовый) увеличивается за счет мембраны вторгающейся пространство полости, транслокация растворенное вещество Pushed из полости (красный), что приводит к уменьшению флуоресцентного сигнала. Нанопор блокируется липидный бислой, препятствуя прохождению субстрата управления (зеленый). E) Во время разрыва мембраны, прилагаемая транспорт растворенного вещества быстро ускользает из полости (красный), в то время как контроль растворенного вещества диффундирует (зеленого цвета). Эта цифра была повторно с разрешения 21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методика представлена здесь позволяет высокопараллельной анализ мембранного транспорта белков. Восстановленные системы мембранного белка может быть непосредственно применен к биочипа, что делает приспособлении теоретически каждый мембранный переносчик или канал, это возможно. Анализ транспорта ограничивается только установлением люминесцентной системы считыванием, либо путем прямого изменения флуоресценции (транслокации флуорофоров или флуоресцентно меченых субстратов) или косвенное изменение флуоресценции (рН-чувствительных красителей, вторичные ферментативных реакций). Последний, однако до сих пор не установлены.
Функциональная характеристика мембранных каналов или транспортеров на одном уровне белка является основным направлением этой методики. В сочетании с автоматизированной микроскопом, создание приложений для скрининга белковых эффекторов также возможно. Настройка анализа позволяет параллельно записывать до 8-ми микросхемах, с множеством точек анализа на каждом чипе, Из-за полного разделения чипов, это действительно параллельно, что позволяет несколько экспериментальных повторов, включая контроль в одной экспериментальной серии после того, как были созданы условия.
Критические шаги в процессе настройки эксперимента являются подготовка действительно однослойные везикулы, активное восстановление белка выбора, распространяясь эффективность протеолипосомах на поверхности чипа и способность удерживания подвешенного липидный бислой по отношению к субстратам, используемых в анализе.
В то время как подготовка однослойные везикулы имеет принципиальное значение для этого анализа, чтобы избежать создания мультиламеллярными мембранных листов на поверхности чипа в процессе формирования взвешенных липидного бислоя, это довольно легко обеспечить unilamellarity везикул с помощью обработки ультразвуком липосом во время приготовления.
Непосредственное применение протеолипосом является большим продвижение метода Presented. В отличие от предыдущих подходов более сложные и с медицинской точки зрения соответствующие белки теперь могут быть направлены, требуя конечно предварительное создание протокола восстанавливающей уступая функциональный белок выбора в БУВ. Кроме того, мембранные белки, обладающие большими экстра-мембранных доменов уменьшают образование собственных ВСС. Это должно быть оптимизировано для каждого нового белка, например , путем изменения концентрации CaCl 2.
Соотношение восстановление интересующего белка должен быть выбран тщательно. Анализ отдельных белковых событий желательно и выполнима с помощью представленной здесь техники. Количество восстановленного белка должно, следовательно, не превышает 1-2 функциональных единиц белка на пор остовного мембраны патч, предполагающей идеальную реконструирование и что белок мембраны стохастически распределены по бислой. Кроме Направленность белка после восстановления также следует иметь в виду, так как он имеет пВЗ равным между обоими directionalities.
И, наконец, как только все эти вопросы тщательно проверены и оптимизированы, ни один из используемых субстратов не может отображать любую неспецифическую проницаемость мембраны порового остовного мембраны. Положительно заряженные флуорофоры, как и большинство родаминовых на основе красителей в красном спектральном режиме, как правило, быстро преодолеть мембранный барьер. Сильные гидрофобные взаимодействия также может привести к неспецифической прикрепления к липидный бислой. Оба свойства не требуется.
Изучение ионных каналов в качественном способом также можно себе представить. Скрининг для канала эффекторов с использованием бинарного Да / Нет вывода данных может рассматриваться с помощью ионно-чувствительных красителей. Самым большим препятствием здесь будет создание по меньшей мере, частично ионном удерживающий липидный бислой. Это может быть только достижима с помощью модификации поверхности чипа нанопор.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
- Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. , (2015).
- Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
- Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
- Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
- Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
- Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
- Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
- Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
- Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
- Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
- Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
- Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
- Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
- Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
- Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
- Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
- Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
