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Biology

झिल्ली परिवहन एकल प्रोटीन संकल्प पर एक अत्यधिक समानांतर nanopore चिप सिस्टम द्वारा विश्लेषण प्रक्रियाओं

doi: 10.3791/53373 Published: August 16, 2016

Abstract

झिल्ली एकल प्रोटीन के स्तर पर प्रोटीन परिवहन अभी भी विस्तृत विश्लेषण बचाव किया, अगर सब्सट्रेट translocated गैर electrogenic है। काफी प्रयास इस क्षेत्र में किया गया है, लेकिन विलायक मुक्त लिपिड bilayer झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के विश्लेषण के लिए आवश्यक तकनीक के साथ संयोजन में स्वचालित उच्च throughput परिवहन विश्लेषण को सक्षम करने की तकनीक दुर्लभ हैं। ट्रांसपोर्टरों का यह वर्ग हालांकि सेल homeostasis में महत्वपूर्ण है और इसलिए दवा के विकास और तरीकों नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य की सख्त जरूरत है।

यहाँ प्रस्तुत पांडुलिपि एक ट्रांसपोर्टर के प्रस्ताव पर झिल्ली प्रोटीन की मध्यस्थता परिवहन प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए स्थापना और एक उपन्यास biochip की हैंडलिंग का वर्णन है। biochip nanopores कि इसकी डिजाइन में अत्यधिक समानांतर है और औद्योगिक ग्रेड और मात्रा में उत्पादन किया जा सकता से घिरा microcavities से बना है। प्रोटीन शरण liposomes सीधे लागू किया जा सकताचिप सतह आत्म इकट्ठे ताकना फैले लिपिड का उपयोग कर एसएसएम तकनीक bilayers गठन (ठोस लिपिड झिल्ली समर्थित)। ताकना फैले झिल्ली के कुछ हिस्सों, freestanding रहे हैं में या गुहा जगह है, जो वास्तविक समय में मल्टी स्पेक्ट्रल फ्लोरोसेंट readout द्वारा पीछा किया जा सकता से बाहर सब्सट्रेट translocation के लिए इंटरफेस प्रदान करते हैं। मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) की स्थापना के लगभग हर झिल्ली प्रोटीन की चिप सतह कि कार्यात्मक पुनर्गठन किया जा सकता है प्रोटीन को शरण देने लिपिड bilayers का सीधा स्थापना की अनुमति देता है। एकमात्र शर्त गैर electrogenic परिवहन substrates के लिए एक फ्लोरोसेंट पढ़ने के लिए बाहर प्रणाली की स्थापना है।

उच्च सामग्री स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों स्वचालित औंधा फ्लोरोसेंट समानांतर में कई चिप्स रिकॉर्डिंग माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल से accomplishable हैं। बड़े डेटा सेट आसानी से उपलब्ध कस्टम डिजाइन विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है। तीन रंग बहु वर्णक्रमीय फ्लोरोसेंटपढ़ने के लिए बाहर इसके अलावा झूठी सकारात्मक परिणाम को नष्ट करने, विभिन्न वर्गों में घटना निष्पक्ष डेटा भेदभाव के लिए अनुमति देता है।

चिप प्रौद्योगिकी वर्तमान में 2 Sio सतहों आधारित है, लेकिन सोने में लिपटे चिप सतहों का उपयोग करते हुए आगे functionalization भी संभव है।

Introduction

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झिल्ली प्रोटीन के विश्लेषण के पिछले 20 वर्षों में बुनियादी और दवा अनुसंधान के लिए ब्याज में वृद्धि का बन गया है। उपन्यास दवाओं के विकास की पहचान और नए लक्ष्य की विस्तृत लक्षण वर्णन, वर्तमान में सीमित कारकों में से एक होने पर निर्भर करता है। तथ्य यह है कि सभी दवा लक्ष्यों के बारे में 60% झिल्ली प्रोटीन कर रहे हैं 1, तकनीक के विकास के उनके कार्य सबसे महत्वपूर्ण स्पष्ट करने के लिए बनाता है।

4 - अतीत में, electrogenic चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के अध्ययन के लिए तकनीक भीड़ 2 में विकसित किया गया है। इसके विपरीत में गैर-electrogenic substrates एक अधिक चुनौतीपूर्ण कार्य प्रस्तुत करते हैं। वे प्रधानमंत्री दवा लक्ष्य के रूप में विशेष रुचि के हैं, लेकिन के रूप में वे झरने 5 संकेत में विलेय और कोशिका झिल्ली और समारोह में मुख्य रिसेप्टर्स के रूप में सामने पोषक तत्वों के प्रवाह को नियंत्रित।

काफी प्रयास टी के विकास में डाल दिया गया हैechniques झिल्ली परिवहन प्रोटीन 6, 7 के समारोह में अध्ययन करने के लिए। 10, ठोस समर्थित लिपिड bilayers, सीमित bilayers 11, 12, microblack लिपिड झिल्ली 13, 14 और देशी पुटिका सरणियों 15, 16 के लिए कुछ नाम सहित - ठोस समर्थित झिल्ली सिस्टम का उपयोग कर इस क्षेत्र में 8 के रूप में सबसे होनहार उपकरण में उभरा है। उनमें से कुछ वाणिज्यिक setups 17, 18 के रूप में भी उपलब्ध हैं। कुछ उदाहरण एक अत्यधिक समानांतर तरीके से 14, 19, स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए एक शर्त में एक झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने की क्षमता के संयोजन प्रकाशित किया गया है। हालांकि, इन तरीकों को शायद ही कभी औद्योगिक वातावरण के लिए बुनियादी अनुसंधान से पुल। कठिनाइयों अक्सर प्रणाली की क्षमता automatable होने के लिए, लागत गहन उत्पादन और / या श्रमसाध्य तैयारी में झूठ बोलते हैं। एक दृष्टिकोण ओउपर्युक्त सभी बाधाओं vercoming अंतिम उद्देश्य है।

22 - यहाँ प्रस्तुत तकनीक एकल प्रोटीन के स्तर 20 पर एक नियंत्रित वातावरण में इन विट्रो में झिल्ली चैनलों और ट्रांसपोर्टरों अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। 26 या काले लिपिड झिल्ली 27 - LUVs में शुद्ध झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन और अधिक GUVs 23 के लिए तुलनीय दृष्टिकोण से भी स्थापना की है। वे सीधे चिप सतह, जहां bilayer गठन एक आत्म विधानसभा की प्रक्रिया के माध्यम से जगह ले जा रहा है के लिए लागू किया जा सकता है। Nanoporous चिप (छवि। 1) के गिलास नीचे डिजाइन हवा माइक्रोस्कोपी, जो प्रणाली का सीधा स्वचालन परमिट के लिए अनुमति देता है। एक मोटर चालित मंच के साथ संयोजन में कई चिप्स के विश्लेषण के लिए सील कर दिया गुहाओं के हजारों युक्त देखने के प्रत्येक क्षेत्र के साथ एक ही समय में मापा जा सकता है।


चित्रा 1। मल्टिप्लेक्स nanopore biochips के डिजाइन। ए) एक सिलिकॉन पर इन्सुलेटर (एसओआई) वेफर प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी द्वारा संरचित है। लगभग 1,150 व्यक्तिगत चिप्स समान गुण और गुणवत्ता। ख) प्रत्येक चिप नैनो apertures के साथ 250,000 व्यक्ति microcavities शामिल हैं के साथ प्रत्येक मे से गढ़े हैं। स्केल पट्टी:। 200 माइक्रोन सी) प्रत्येक गुहा मल्टी स्पेक्ट्रल प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए बाहर के माध्यम से पता है। एक intransparent ऊपर परत ब्लॉकों बफर जलाशय से फ्लोरोसेंट संकेत है, biochip औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी। डी) परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संगत बनाने (AFM) इमेजिंग समान रूप से ध्यान में लीन होना उद्घाटन और 3.6 एनएम के सिलिकॉन डाइऑक्साइड परत की सतह खुरदरापन की व्यवस्था की पता चलता है (एन = 40) पुटिका संलयन के लिए इष्टतम। स्केल पट्टी:। 5 माइक्रोन ई) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन microscopy (SEM) छवि nanopore सिलिकॉन चिप के अंदर femtoliter cavities के लिए उपयोग की अनुमति के माध्यम से एक पार अनुभाग से पता चलता है। यह आंकड़ा 21 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सभी डेटा विश्लेषण अंत उपयोगकर्ताओं के लिए अप्रतिबंधित पहुँच गारंटी करने के लिए फ्रीवेयर का उपयोग किया जाता है। समय श्रृंखला मुक्त इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर और एक कस्टम निर्माण वक्र विश्लेषण सॉफ्टवेयर को सक्रिय करने के बैच प्रसंस्करण और कई फ्लोरोसेंट चैनलों और घटता के हजारों के साथ बड़े डेटासेट का सीधा सह-संबंध का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं।

मॉडल इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल प्रोटीन बड़े चालकता (MSCL) चैनल प्रोटीन की mechanosensitive चैनल से प्राप्त होता है कोलाई। यह एक वाल्व प्रकृति में आसमाटिक सदमे को रिहा करने के रूप में कार्य करता है, लेकिन इस तरह है कि तर्क से SYNT डिजाइन में संशोधित किया गया थाhetic कार्यक्षमताओं covalently चैनलों कसना पक्ष से जुड़ा जा सकता है। के माध्यम से covalently बाध्य उत्प्रेरक (MTSET) चैनल खोलने के लिए शुरू हो रहा है के आरोप प्रतिकर्षण, एक नैनो वाल्व बनाने। आयनों, पानी, छोटे प्रोटीन, लेकिन यह भी छोटे fluorophores की तरह छोटे अणुओं चैनल के माध्यम से तर कर सकते हैं। इधर, प्रोटीन प्रोटीन की मध्यस्थता translocation का पता लगाने के लिए इस प्रणाली की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है।

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Protocol

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1. बड़े unilamellar vesicles की तैयारी (LUVs)

  1. नाइट्रोजन गैस के साथ एक दौर नीचे कुप्पी (10 मिलीलीटर की मात्रा) स्वच्छ किसी भी धूल कणों को दूर करने के लिए। इथेनॉल के साथ दौर नीचे कुप्पी कुल्ला।
    नोट: अवशिष्ट इथेनॉल सहन किया जा सकता है और बाद के चरणों को परेशान नहीं करता।
  2. , किसी भी संक्रमण को दूर करने के क्लोरोफॉर्म के साथ एक 1 मिलीलीटर कांच सिरिंज 4x धो लें। 4 मिलीलीटर SoyPC20 (क्लोरोफॉर्म में 25 मिलीग्राम / एमएल) के दौर नीचे कुप्पी में जोड़ें और 0.1 मोल% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक अतिरिक्त डोप ATTO 390 के साथ लिपिड समाधान डोप।
    नोट: डोप ATTO 390 अन्य fluorophore लेबल लिपिड या lipophilic रंगों के बजाय का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, उपलब्ध उत्तेजना स्रोतों पर निर्भर करता है।
  3. एक रोटरी बाष्पीकरण करने दौर नीचे कुप्पी कनेक्ट करें। 300 मिलीबार 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान तापमान और अधिक से अधिक रोटेशन की गति पर 40 मिनट के लिए लिपिड फिल्म सूखी, कुप्पी की कांच की दीवार पर एक समरूप लिपिड फिल्म बनाने के लिए।
  4. tRANSFएर कमरे के तापमान पर एक उच्च वैक्यूम पंप और अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सूखी लिपिड फिल्म के लिए कुप्पी।
  5. और फ्लास्क 8 कांच के मोती (2.7 मिमी व्यास, इथेनॉल धोया और सुखाया); 5 मिलीलीटर बफर (बाँझ फ़िल्टर 20 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, पीएच 8.0) जोड़ें। रोटरी बाष्पीकरण को कुप्पी कनेक्ट और अधिकतम गति से 50 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम बिना बारी बारी से।
    नोट: ग्लास मोती यंत्रवत् कांच की दीवार से लिपिड फिल्म विस्थापित, (multilamellar) पुटिका गठन के लिए अग्रणी। के बाद 45 मिनट रोटेशन समाधान दूधिया प्रकट होता है और कोई अवशिष्ट लिपिड फिल्म कुप्पी की दीवारों पर दिखाई जानी चाहिए। कांच के मोती के बजाय एक पानी के स्नान sonifier में कुप्पी sonicating, कुप्पी या कोमल पुनर्जलीकरण विधि vortexing जैसे अन्य तरीकों में भी लागू होते हैं।
  6. कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान और sonicate को अक्रिय गैस (आर्गन) के तहत कुप्पी स्थानांतरण।
    नोट: अल्ट्रासाउंड वारदात liposomes बाधित, उन्हें unilamellar कर रही है।
  7. LUV समाधान विभाजित1 मिलीलीटर aliquots में।
  8. तरल नाइट्रोजन में LUV समाधान ठंड से 5 / फ्रीज पिघलना चक्र को पूरा करें, एक पानी के स्नान में 40 डिग्री सेल्सियस पर विगलन द्वारा पीछा किया।
    नोट: यह टूटना करने के लिए और एक दूसरे के साथ अलग-अलग liposomes की सहज विपर्यय, आकार बढ़ाने के लिए प्रमुख होता है।
  9. पिछले ठंड कदम की दुकान पर -80 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों।
    नोट: LUVs कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर हो जाएगा।

2. प्रोटीन पुनर्गठन

  1. गला लें बर्फ पर 1 मिलीलीटर LUV विभाज्य। सीधे पुनर्गठन से पहले, एक मिनी बाहर निकालना का उपयोग कर एक 400 एनएम पॉली कार्बोनेट फिल्टर झिल्ली के माध्यम से liposomes 17x बाहर निकालना।
    नोट: लिपिड समुच्चय को हटा दिया जाएगा और अंतिम समरूप आकार के वितरण पर पहुंच गया है।
  2. 0.25% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 4% ट्राइटन X-100 (वी / वी) के अलावा द्वारा LUVs को अस्थिर (वी / वी) और 50 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: इस चरण में इस्तेमाल किया liposomes की राशि शुद्ध MSCL जी <की बड़े पैमाने पर निर्भर करता हैsup> 22 सी थी (2.3 कदम देखें)। शुद्ध MSCL जी 22 सी (ई कोलाई से प्राप्त) 28 में विस्तार से वर्णित है।
  3. 1:20 पर शुद्ध मिक्स MSCL जी 22 सी और डिटर्जेंट संतृप्त liposomes (डब्ल्यू डब्ल्यू /) अनुपात और 50 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. डिटर्जेंट हटाने के लिए Tris बफर में जैव-मोती जोड़ने (20 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, पीएच 8.0, बाँझ फ़िल्टर) प्रोटीन / liposome समाधान करने के लिए, 16 मिलीग्राम (गीला वजन) जैव-मोतियों के साथ प्रति में liposomes को अस्थिर करने के लिए इस्तेमाल डिटर्जेंट μl 2.2 कदम।
  5. एक घूर्णन प्लेट पर 4 डिग्री सेल्सियस पर डिटर्जेंट हटाने रातोंरात (16 घंटा) प्रदर्शन करना।
    नोट: समाधान की लगातार मिश्रण इष्टतम डिटर्जेंट हटाने सुनिश्चित करता है।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर डिटर्जेंट हटाने की दुकान proteoliposomes के बाद और एक ही दिन में प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करते हैं।

3. गतिविधि परख

  1. प्रोटीन पुनर्गठन के दौरान detergent- की 100 μl विभाज्य लेने2.3 कदम खत्म होने के बाद अस्थिर proteoliposome समाधान।
  2. calcein के 1 मात्रा (30 मिमी) प्रोटीन liposome समाधान के लिए जोड़ें और 50 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 5 मिनट सेते हैं।
  3. समाधान से डिटर्जेंट हटाये 2.4 चरण में वर्णित के रूप में - 2.6।
  4. डिटर्जेंट हटाने के बाद एक आकार अपवर्जन स्तंभ (20 मिलीलीटर बिस्तर मात्रा या अधिक) Tris बफर (बिस्तर मात्रा 3x) के साथ संतुलित करना।
    नोट: Proteoliposome जुदाई हालांकि 4 डिग्री सेल्सियस पर लगातार नमूना रखते हुए विभाजन के बाद सबसे अच्छा प्रोटीन गतिविधि को सुनिश्चित करने की सलाह दी है, कमरे के तापमान पर किया जा सकता है।
  5. आकार अपवर्जन स्तंभ के लिए पूरे विभाज्य (200 μl) को लागू करने से मुक्त calcein से अलग proteoliposomes। मिश्रण स्तंभ में लेना, गुरुत्वाकर्षण प्रवाह का उपयोग कर शीर्ष पर निरंतर बफर आवेदन के माध्यम से स्तंभ से proteoliposomes की क्षालन द्वारा पीछा किया की अनुमति दें। क्षालन सामने एक असतत नारंगी बैंड के रूप में proteoliposomes युक्त calcein का निरीक्षण करें। 500 & # के भागों ले लीजिए181, एल क्रमशः।
    नोट: नि: शुल्क calcein डाई पूरा जुदाई के साथ proteoliposome अंश के बाद elute जाएगा।
  6. पिपेट के लिए एक माइक्रो-अच्छी तरह से थाली पर प्रत्येक अंश के 80 μl फ्लोरोसेंट पढ़ने के लिए बाहर और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के माध्यम से calcein युक्त proteoliposomes की सबसे अधिक राशि युक्त अंश की पहचान। 490 एनएम पर उत्तेजना के साथ 520 एनएम पर प्रतिदीप्ति का पता लगाने। निम्नलिखित गतिविधि परख के लिए उच्चतम संकेत के साथ proteoliposome अंश का उपयोग करें।
  7. 1 मिलीलीटर प्रतिदीप्ति क्युवेट में 980 μl Tris बफर के साथ proteoliposome युक्त अंश के 20 μl मिक्स।
  8. उपाय 520 एनएम (उत्तेजना 490 एनएम) एक spectrofluorometer का उपयोग करने पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन। 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड और फिर एक शेयर समाधान (160 मिमी) से ([2- (trimethylammonium) एथिल] methanethiosulfonate) MTSET के 25 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। मिश्रण के दौरान रिकॉर्डिंग पर रखें। हमेशा स्टॉक समाधान सीधे उपयोग करने से पहले नए सिरे से तैयार करते हैं।
    नोट: एक बार बफर MTSET Hydrolyze में हल30 मिनट के भीतर और गैर प्रतिक्रियाशील हो जाएगा। MTSET तौला और उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखे के रूप में पाउडर विभाज्य रखा जा सकता है।
    नोट: एक बार सक्रिय MSCL जी 22 सी चैनल खुल जाता है और रिलीज फँस calcein, calcein की एक स्थानीय एकाग्रता में कमी करने के लिए अग्रणी जब proteoliposomes और डाई के बाद dequenching effluxing, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की वृद्धि हो जाती है।
  9. बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिर एक स्थिर पठार तक पहुँच गया है, 50 μl ट्राइटन X-100 के अलावा द्वारा liposomes solubilize (4% वी / वी)।
    नोट: आदर्श रूप में आगे कोई प्रतिदीप्ति वृद्धि मनाया जा सकता है, हर liposome में सक्रिय प्रोटीन जिसका अर्थ।

LUVs के 4. आकार वितरण माप नैनो कण ट्रैकिंग का उपयोग

  1. ध्यान दें कि liposome या proteoliposome समाधान का केवल न्यूनतम नमूने nanoparticle नजर रखने का उपयोग आकार के वितरण के विश्लेषण के लिए जरूरी हैं। 5 मिलीग्राम / मीटर की liposome समाधान पतलाएल लिपिड एकाग्रता 1: 5000 (वी / वी) बफर (20 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, पीएच 8.0, बाँझ फ़िल्टर) में 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को विश्लेषण के लिए। धूल है कि आकार के वितरण के माप में खलल डालते तरह किसी भी निलंबित कणों को दूर करने के लिए एक 0.2 माइक्रोन झिल्ली का उपयोग कर कमजोर पड़ने और पूर्व LUV तैयारी और पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल सभी बफ़र्स फ़िल्टर।
  2. अति शुद्ध पानी के साथ प्रवाह चैम्बर धो लें।
  3. सतह मार्कर का उपयोग प्रकाश किरण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए। पतला liposome नमूना के लगभग 300 μl इंजेक्षन और तुरंत प्रवाह कक्ष के अंदर प्रवाह को रोकने के लिए बाहर निकलने के वाल्व बंद, किसी भी हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना।
  4. पता लगाने के लिए नमूने के पर्याप्त संकेत बिखरने सुनिश्चित करने के लिए ध्यान केंद्रित करने और कैमरे के शटर / लाभ सेटिंग्स समायोजित करें।
    नोट: 20 - 80 संकेतों देखने के क्षेत्र में स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए। भीड़भाड़ (> 80 संकेतों) को रोकने के रूप में सॉफ्टवेयर जब ओवरलैपिंग व्यक्ति संकेतों को ट्रैक करने में सक्षम नहीं होगा।
  5. "कब्जा" एससीआर के लिए जाओeen। सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग कर 90 सेकंड के लिए कब्जा अवधि 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान नियंत्रण और समायोजित करें। प्रेस "रिकार्ड" एक समय श्रृंखला की रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए।
    नोट: समय की श्रृंखला में एक नया विंडो खुलती है के पूरा होने पर।
  6. दिए गए प्रारूप में समय श्रृंखला बचाने के लिए (* .avi)। बैच विश्लेषण के दौरान व्यावहारिक कारणों के लिए एक एकल फ़ोल्डर में सभी फाइलों को बचाने के लिए।
  7. बाहर निकलने के वाल्व खोलने और प्रवाह के चेंबर में एक और 300 μl इंजेक्षन। वाल्व बंद और दोहराने कदम 4.3 - 4.6 दो बार।
  8. पूरा करने के बाद सभी नमूना रन 5 मिलीलीटर अति शुद्ध पानी के साथ प्रवाह कक्ष धो लें। "पूर्व प्रक्रिया" स्क्रीन पर जाएं। अंशांकन मापदंडों के तापमान = 25 डिग्री सेल्सियस और चिपचिपाहट = 0.91 इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल Tris बफर के लिए सेट करें।
  9. बैच प्रक्रिया विंडो खोलें और दर्ज की गई समय श्रृंखला (उन्नत / बैच प्रक्रिया / फ़ाइल 1-3 से सेट) लोड। प्रेस आकार के वितरण विश्लेषण शुरू करने के लिए "जाओ"।
    नोट: विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर अपने आपबड़ी सफाई एक कण पटरियों और उनके व्यास मापदंडों के कदम 4.8 में सेट का उपयोग कर अपने आंदोलन व्यवहार के आधार पर गणना करता है।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप आकार के वितरण विश्लेषण समय श्रृंखला फ़ाइलों के रूप में एक ही फ़ोल्डर में स्वचालित रूप से बचाता है।
  10. इसके अतिरिक्त परिणाम (निर्यात / रिपोर्ट पीडीएफ बनाएँ) संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए एक रिपोर्ट फाइल बना सकते हैं।

5. चिप धारक तैयारी

  1. एक 50 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में MDX4 चिकित्सा ग्रेड इलास्टोमेर आधार और 0.1 ग्राम MDX4 इलाज एजेंट की 1.0 ग्राम वजन। एक गिलास पट्टी के साथ अच्छी तरह से दोनों ब्लेंड।
  2. देगास को 1 घंटा चिपकने के लिए एक desiccator में ट्यूब रखो। बाद में, चिप gluing के लिए 30 मिनट के भीतर यह प्रयोग के रूप में चिपकने वाला कठोर और भी साथ काम करने के लिए मुश्किल हो जाएगा।
  3. इलास्टोमेर degassing (5.1 कदम) के दौरान चिप संबंध से पहले किसी भी संदूषण दूर करने के लिए क्लोरोफॉर्म के साथ अच्छी तरह से एक उद्देश्य गिलास स्लाइड साफ। क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर एक गिलास सिरिंज का उपयोग कर के साथ स्लाइड कुल्ला। लीजिएएक के नीचे तैनात बीकर में क्लोरोफॉर्म। धोने के बाद स्लाइड सूखी।
    नोट: एक धूआं हुड के तहत यह कदम प्रदर्शन करना। क्लोरोफॉर्म के लिए वैकल्पिक, एसीटोन जैसे अन्य कार्बनिक सॉल्वैंट्स भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. कांच कवर एक विंदुक टिप (10 μl pipettes के लिए क्रिस्टल सुझावों) का उपयोग करने पर चिपकने वाला संबंध सामग्री की एक छोटी राशि जमा। याद रखें कि चिप्स पर बाद में 8 चैम्बर स्लाइड धारक में फिट करने के लिए है और तदनुसार स्लाइड पर रखा जाना है।
  5. ध्यान से ठीक टिप चिमटी का उपयोग कर वेफर बोर्ड से एक समय में एक चिप को हटाने और कांच कवर पर चिपकने की बूंद पर चिप जमा। सुनिश्चित करें कि चिप की लेपित ऊपर की ओर का सामना करना पड़ता है।
  6. धीरे से एक कुंद पीई चिमटी के पीछे के साथ कवर कांच पर चिप धक्का। यह सुनिश्चित करें कि गोंद चिप के नीचे समान रूप से तिरस्कृत है, ध्यान से आगे और पीछे चिप स्लाइड। महत्वपूर्ण कदम: यह सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले चिप के नीचे फंस रहे हैं, के रूप में यह ऑप्टिकल इमेजिंग परेशान नहीं करेगापर बाद में चिप गुहाओं की। यह भी सुनिश्चित करना है कि कोई चिपकने वाला पदार्थ चिप सतह contaminates।
  7. एक कैबिनेट ड्रायर में 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए समाप्त कांच कवर सूखना।
    नोट: चिप्स अभी भी है कि हटाया जा करने की जरूरत है उनके निर्माण से एक सुरक्षात्मक परत के उद्भव के साथ लेपित हैं।
  8. सुरक्षात्मक परत को निकालने के लिए एक अनुक्रमिक विलायक धोने कदम प्रदर्शन करते हैं। चिप्स के इलाज के दौरान 54 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान पहले से गरम।
  9. नहाने के पानी में 3 गिलास बीकर, उनमें से दो isopropanol से भरा है और एक एसीटोन के साथ भरा रखें।
  10. एक स्लाइड धारक में चिप कांच कवर डालें और 10 मिनट के लिए पहले isopropanol भरा डिश में यह डूब। बाद में, एसीटोन भरा पकवान को हस्तांतरण दूसरी isopropanol डिश के लिए अंतिम चरण धोने के लिए यह स्थानांतरित करने से पहले 10 मिनट के लिए फिर से सेते हैं और एक और 10 मिनट सेते हैं।
  11. डिश से स्लाइड धारक निकालें और ध्यान से यह बड़े पैमाने पर धो ultrapur साथई पानी, नाइट्रोजन गैस का एक कोमल धारा के साथ चिप्स सुखाने के द्वारा पीछा किया।
  12. लो बंद 8 अच्छी तरह से चिपचिपा स्लाइड से फाड़ना चादर और बेंच पर पीछे की ओर रख दिया। ध्यान से कवर स्लाइड उठाओ और धीरे से कुओं का सामना करना पड़ चिप्स के साथ चिपचिपा स्लाइड पर दबाएँ। उपयोग करने से पहले कुछ मिनटों के लिए समाप्त चिप धारक आराम करने दो।

6. परख तैयारी

नोट: nanopore चिप्स एक गिलास को कवर करने के लिए चिपके और एक 8 अच्छी तरह से चिपचिपा स्लाइड के द्वारा अलग लाभ के अधिकारी, कि कई चिप्स एक एकल प्रायोगिक रन में संबोधित किया जा सकता है, के साथ चिप्स पूरी तरह से एक दूसरे से अलग किया जा रहा।

  1. चिप धारक तैयारी के बाद, शुद्ध इथेनॉल के साथ प्रत्येक चिप कुल्ला और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी झटका, धूल की तरह किसी भी संदूषण हटा दें।
  2. हवा, ऑक्सीजन या नाइट्रोजन प्लाज्मा के साथ चिप सतह को साफ करें। प्लाज्मा सफाई समय-अवधि के प्रकार के आधार पर भिन्न: 1 मिनट, हवा और एनआईटी के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार प्रदर्शन80% बिजली सेटिंग में 0.3 मिलीबार (आरएफ शक्ति मध्यम या उच्च) पर 5 मिनट के लिए रोजेन प्लाज्मा।
  3. प्लाज्मा सफाई के बाद 10-15 मिनट के लिए शुद्ध इथेनॉल में चिप्स सेते गुहा गीला सुनिश्चित करने के लिए।
  4. Tris बफर के 400 μl जोड़कर बफर के लिए चरणबद्ध विनिमय इथेनॉल (20 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, पीएच 8.0, बाँझ फ़िल्टर), हवा के बुलबुले और 400 μl के बाद हटाने शुरू करने के बिना समाधान के मिश्रण द्वारा पीछा किया। इस प्रक्रिया को दोहराएँ 12 बार, इथेनॉल हटाने सुनिश्चित करने के लिए।
    नोट: इथेनॉल liposomes और निलंबित लिपिड bilayers के लिए हानिकारक होगा।
  5. डोप Tris बफर (20 ​​मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, पीएच 8.0, बाँझ फ़िल्टर) के साथ 5 मिमी 2 CaCl और 1 माइक्रोन Oy647 डाई। पूरी तरह से चिप से धोने बफर हटाने और तुरंत चिप के लिए डाल दिया गया बफर जोड़ें। नोट: चिप्स, धो बफर हटाने के बाद एक पतली बफर फिल्म के साथ कवर किया जाएगा ताकि चिप हवा के साथ सीधे संपर्क में नहीं है, गुहाओं की एक निरंतर गीला और चिप सतह सुनिश्चित करने।
  6. 1 मिलीग्राम / एमएल LUVs या proteo-LUVs Tris बफर में जोड़ें (20 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, पीएच 8.0, बाँझ फ़िल्टर) प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से।
    नोट: प्रत्येक कुएं में अंतिम मात्रा 300 μl है। डाल दिया गया Tris बफर अलावा दौरान नियंत्रण डाई और रासायनिक आपरिवर्तक MTSET के बाद के जोड़ पर विचार करें।
  7. चिप सतह पर ताकना फैले लिपिड bilayer गठन के लिए liposome समाधान के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए चिप सेते हैं। बाद में सीए 2 + मुक्त Tris बफर के 4x 400 μl के साथ प्रत्येक चिप धो लें।
  8. 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के साथ एक अच्छी तरह से नियंत्रण डाई जोड़ें। चिप्स अब परख के लिए तैयार हैं।

7. परख सेटअप

  1. epifluorescence माइक्रोस्कोप (20X हवा उद्देश्य, लंबे समय तक काम दूरी) करने के लिए चिप धारक माउंट। nanopore चिप के रिम पर ध्यान दें और अधिक आसानी से सूक्ष्म cavities के फोकल हवाई जहाज़ खोजने के लिए। एक बार जब गुहाओं को ध्यान में हैं एक क्षेत्र वीं के लिए nanopore सरणी स्कैनप्रदर्शित करता है पर उच्चतम अनुपात सील।
    नोट: हर उल्टे epifluorescence माइक्रोस्कोप चिप assays प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उद्देश्य बढ़ाई पर निर्भर करता है (20X - 60X) यत्न गुहाओं की संख्या बढ़ाई 20X का उपयोग करते हुए देखने का एक ही क्षेत्र में 9,000 cavities के साथ, अलग अलग होंगे। एक लंबे समय तक काम दूरी के साथ एयर उद्देश्यों को बेहतर कर रहे हैं। उल्टे confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (CLSM) का उपयोग भी संभव है, लेकिन छवि अधिग्रहण ध्यान देने का सीमित गहराई के कारण सीमित कारक हो सकता है।
  2. चिप रोशनी का अनुकूलन।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि दोनों डाई चैनलों अधिकतम ग्रे स्केल मूल्य से अधिक नहीं है के रूप में परिवर्तन देखा नहीं जा सकता। निर्यात प्रयोगों के लिए अधिकतम संकेत क्षमता का 90% करने के लिए translocated डाई की रोशनी को समायोजित। स्पष्ट रूप से किसी भी टपकाया झिल्ली सील पता लगाने के लिए अधिकतम संकेत क्षमता का 80-90% के लिए खुला गुहाओं में नियंत्रण डाई समायोजित करें।
  3. एक बार सभी चैनलों समय श्रृंखला शुरू समायोजित कर रहे हैं। चित्र लेने के लिए हर 10-20 se90 मिनट के लिए सी।
    नोट: यह वैसे ही विशिष्ट और unspecific तपका घटनाओं का पालन करने के लिए पर्याप्त है।
  4. सिस्टीन-विशिष्ट के अलावा द्वारा फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के तपका प्रारम्भ करें, सकारात्मक 3 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए यौगिक MTSET का आरोप लगाया। पर बाद में एक स्थिर फ्लोरोसेंट संकेत आधारभूत उद्घाटन करने से पहले चैनल स्थापित करने में सक्षम होना करने के लिए MTSET अलावा पहले प्रयोग के क्रम में कम से कम 5 मिनट के लिए अनुमति दें। हमेशा उपयोग से पहले नए सिरे से सीधे MTSET समाधान तैयार है।

8. डेटा विश्लेषण

  1. ImageJ का एक मानक संस्करण (फ़ाइल / आयात / छवि अनुक्रम) के साथ समय श्रृंखला छवि ढेर खोलें।
  2. फ्लोरोसेंट चैनलों खड़ी कर रहे हैं, हर चैनल (छवि / ढेर / ढेर छवियों के लिए) के लिए अलग-अलग ढेर में चैनलों विभाजित।
  3. पहले translocation सब्सट्रेट चैनल की लागत पर लाभ के लिए (हित के क्षेत्रों) (छवि / डुप्लीकेट) छवि पहचान डुप्लिकेट।
  4. एक द्विआधारी छवि (छवि / समायोजन / सीमा) के लिए छवि परिवर्तित। सुनिश्चित करेंकि इस्तेमाल किया एल्गोरिथ्म pixilation ओवरलैपिंग के बिना सभी सील गुहाओं के लिए संकेतों को दर्शाया गया है।
  5. स्वचालित रूप से कण विश्लेषक उपकरण के साथ हित के क्षेत्रों को परिभाषित (विश्लेषण / विश्लेषण कण)। एक न्यूनतम कण आकार परिभाषित परिभाषित करें, कण शोर से बचने के लिए। विकल्पों की जाँच करें "किनारों पर बहिष्कृत" और "छेद में शामिल हैं"। सुनिश्चित करें कि जिसके परिणामस्वरूप ROIs microcavity सरणी पैटर्न को प्रतिबिंबित। मध्य का ROIs कलाकृतियों हैं, इसलिए उन्हें हटा दें। रॉय सूची सहेजें।
    नोट: माप पैरामीटर स्थापित किया जाना है कण विश्लेषण (विश्लेषण / सेट माप / क्षेत्र) से पहले "क्षेत्र" करने के लिए
  6. समय श्रृंखला विश्लेषक प्लग में (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), जो सभी ROIs एक ही आकार के लिए स्वचालित रूप से आकार बदलता खोलें। पुन: आकार चौड़ाई / 6x6 पिक्सल और अंडाकार आकृति (घड़ी श्रृंखला विश्लेषक / AutoROIProperties) की ऊंचाई तक सभी मौजूदा ROIs। विकल्प की जाँच करें "मौजूदा ROIS आकार बदलें"। जिसके परिणामस्वरूप का आकार बदला रॉय सूची सहेजें।
  7. रॉय प्रबंधक खोलें(विश्लेषण / उपकरण / रॉय प्रबंधक) और समय की श्रृंखला के प्रत्येक चैनल के लिए आकृति परिवर्तन रॉय सूची लोड (आरओआई चरनी / अधिक / ओपन)। ROIs superposed दिया जाएगा। प्रत्येक रॉय के लिए संकेत परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए बहु माप उपकरण (आरओआई प्रबंधक / अधिक / मल्टी उपाय) शुरू, का चयन बहु उपाय "सभी स्लाइस उपाय" और "टुकड़ा प्रति एक पंक्ति" और शुरू करते हैं।
    नोट: माप पैरामीटर इस कदम के लिए 'ग्रे मूल्य मतलब है "के लिए (विश्लेषण / सेट माप / ग्रे मूल्य मतलब है) स्थापित किया जाना है
  8. जिसके परिणामस्वरूप तालिका बचाओ, * .txt या * .xls प्रारूप में प्रत्येक रॉय के लिए मतलब ग्रे मूल्य दे रही है।
  9. NanoCalcFX में प्रत्येक इमेजिंग चैनल की लागत पर लाभ विश्लेषण आयात "आयात फाइल" विकल्प के माध्यम से। "श्रृंखला के नामकरण के लिए पहली पंक्ति का प्रयोग करें" सेट करें। समय श्रृंखला छवि अधिग्रहण अवधि के अनुसार छवियों के बीच कदम आकार सेट और इसी स्तंभ और दशमलव विभाजक चुनें।
  10. स्वचालित रूप से अलग-अलग Fluo के रेखांकन सहसंबंधी "कई पत्र" विकल्प का उपयोग करेंrescent चैनल।
    नोट: घटनाओं का विश्लेषण किया और अब 3-रंग वर्णक्रमीय जानकारी द्वारा दी गई जानकारी का उपयोग कर वर्गीकृत किया जा सकता है।
  11. निर्माण में फिट समारोह (फिट विकल्प) का उपयोग कर चुना घटता फिट बैठते हैं।
    नोट: कार्यान्वित तपका और बाढ़ समीकरण उपयुक्त है सभी monoexponential प्रसार संचालित घटनाओं और फिट सीमाएं निर्धारित किया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप दर स्थिरांक हिस्टोग्राम उपकरण का उपयोग कर साजिश रची या आगे डेटा शोधन के लिए निर्यात किया जा सकता है।

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Representative Results

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ताकना फैले झिल्ली आसानी से एक आत्म इकट्ठे ढंग से nanostructured चिप सतह पर बनाया जा सकता है। हालांकि अंतर्निहित प्रक्रिया अभी भी नाजुक और liposome आकार, liposome आबादी, lamellarity, lipid- और नमक एकाग्रता और रासायनिक सतह के गुणों की monodispersity जैसे कई मापदंडों से प्रभावित है। इन मानकों में से सबसे अधिक ध्यान विशेषता है और ऊपर प्रोटोकॉल में मानकीकृत किया गया है। अन्य मापदंडों हालांकि हर नई तैयारी के दौरान जाँच की जानी चाहिए, एक सफल प्रयोग सुनिश्चित करने के लिए। ये liposome आकार के वितरण और आबादी dispersity (छवि। 2 ए) कर रहे हैं। इष्टतम ताकना फैले झिल्ली गठन के लिए और अच्छी तरह से ऊपर ताकना व्यास गुहा अंतरिक्ष liposome आकार में liposome घुसपैठ से बचने के लिए एक जरूरत हैं। इसके अलावा, monodisperse liposome की तैयारी फैल रहा है और fusi झिल्ली में सबसे अच्छा परिणाम दिखाया गया हैपर। एक और महत्वपूर्ण कदम है कि हर तैयार करने के लिए जांच की जानी पुनर्गठन के बाद प्रोटीन गतिविधि है। MSCL जी 22 सी के साथ पुनर्गठन liposomes के लिए एक प्रतिदीप्ति dequenching परख का प्रयोग, चैनल खोलने प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से नजर रखी जा सकती है, सक्रिय MSCL जी 22 सी प्रोटीन (छवि। 2 बी) को शरण देने liposomes की एक अनुपात दे रही है।

एक बार जब चिप की सतह के लिए फैला है, MSCL जी 22 सी द्वारा एक फ्लोरोसेंट लक्ष्य की घुला हुआ पदार्थ translocation ligand सक्रियण पर पीछा किया जा सकता (छवि। 3 बी)। इंजीनियर MSCL जी 22 सी चैनलों उनके डिफ़ॉल्ट राज्य में बंद हो जाती हैं, गुहा अंतरिक्ष के अंदर छोटे फ्लोरोसेंट अणु entrapping। द्वारा रासायनिक न्यूनाधिक MTSET के अलावा सकारात्मक आरोप के कसना क्षेत्र के लिए पेश कर रहे हैंMSCL जी 22 सी ताकना, यह इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण के माध्यम से खुला धक्का। प्रायर फँस fluorophore प्रसार संतुलन हासिल करने के लिए गुहा अंतरिक्ष बचाव किया। गुहा अंतरिक्ष के अंदर प्रतिदीप्ति के बाद कमी नजर रखी जा सकती है। इस प्रक्रिया तपका घटनाओं की एक समरूप जनसंख्या (छवि। 3 सी) में जिसके परिणामस्वरूप, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। जिसके परिणामस्वरूप तपका घटता दो अलग आबादियों में क्लस्टर, एकल और मल्टीचैनल translocation घटनाओं (छवि। 3 डी) के बीच भेदभाव करने परख की क्षमता का प्रदर्शन है। इसके अलावा प्रणाली समानांतर में और वास्तविक समय में तीन प्रेतसंबंधी अच्छी तरह से अलग रंगों को पालन करने के लिए, यह संभव उच्च सामग्री स्क्रीनिंग रिकॉर्ड और सकारात्मक, झूठी सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों के बीच ठीक से और निष्पक्ष भेदभाव करने के लिए बनाने में सक्षम है। इस अध्ययन में 9.046 सील गुहाओं विश्लेषण किया गया है, जिनमें से 8% effl प्रदर्शित कियाUX व्यवहार। विभिन्न फ्लोरोसेंट पढ़ने के लिए बाहर चैनलों की तैनाती, घटनाओं monoexponential तपका घटनाओं, जटिल कैनेटीक्स, लिपिड घुसपैठ और झिल्ली ruptures (छवि। 3 ई) में भेदभाव किया जा सकता है। केवल घटनाओं है कि नियंत्रण घुला हुआ पदार्थ और झिल्ली डाई के लिए स्थिर संकेतों को प्रदर्शित अंतिम विश्लेषण के लिए माना जाता है। परिसर कैनेटीक्स अस्थिर नियंत्रण संकेतों के साथ तपका घटनाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं और इसलिए छोड़े गए हैं। लिपिड घुसपैठ और झिल्ली ruptures विरूपण साक्ष्य घटनाओं आंतरिक रूप से ध्यान में लीन होना फैले लिपिड bilayer सिस्टम का उपयोग होने वाली हैं। वे ऊपर के रूप में (छवि। 4) का उल्लेख नियंत्रण डाई संकेतों का उपयोग कर खारिज किया जा सकता है।

चित्र 2
चित्रा proteoliposomes और MSCL समारोह की 2. आकार वितरण। ए) Vesicles analyz थे नैनो कण ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा एड। LUV नमूने (काला ट्रेस) से पहले और MSCL जी 22 सी (लाल ट्रेस) के पुनर्गठन के बाद जांच की गई। LUV तैयारी के बाद, 214 ± 70 एनएम एक मतलब कण आकार हासिल की है। आकार आकार। बी) MSCL गतिविधि में 158 ± 60 एनएम के proteoliposomes, जिसके परिणामस्वरूप पुनर्गठन के दौरान कमी आई है एक तपका परख द्वारा पुनर्गठन के बाद मान्य किया गया था। 28 स्व-बुझती calcein MSCL चैनल के MTSET की मध्यस्थता खोलने के माध्यम से proteoliposomes से जारी है, fluorophore (लाल) और प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक तेजी से वृद्धि की dequenching के लिए अग्रणी। प्रोटीन के बिना Liposomes ऐसी कोई तपका, के बाद भी दोहराया MTSET अलावा (काला) दिखा। इसके बाद डिटर्जेंट पेश किया solubilization liposomes विज्ञप्ति के (TX-100) सभी पहले डाई समझाया। यह आंकड़ा 21 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था।एट = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3। एकल अणु के स्तर पर MSCL द्वारा ligand-gated घुला हुआ पदार्थ translocation। ए) इंजीनियर MSCL जी 22 सी चैनलों उनके डिफ़ॉल्ट राज्य में बंद हो जाती हैं। इस तरह के एक fluorophore के रूप में छोटे विलेय चैनल है और न ही लिपिड bilayer के माध्यम से न पारित करने में असमर्थ रहे हैं। MTSET, प्रत्येक MSCL जी 22 सी protomer के एक इंजीनियर एकल सिस्टीन के अलावा पर ​​संशोधित हो जाता है, pentameric चैनल परिसर के कसना पक्ष में कई सकारात्मक आरोप शुरू। MSCL जी 22 सी चैनल प्रभारी प्रतिकर्षण द्वारा खुले धकेल दिया है और फँस डाई गुहा के बाहर फैलाना कर सकते हैं, प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी करने के लिए अग्रणी। बी) तिवारीमेरे MSCL जी 22 सी MTSET के अलावा पर ​​उद्घाटन के निशान। कार्यात्मक पुनर्गठन MSCL जी 22 सी युक्त Proteoliposomes चिप सतह पर फैल गया था। Oy647 (लाल) translocation सब्सट्रेट के रूप में cavities के अंदर फँस गया था। OregonGreen dextran (70 केडीए, हरा) प्रयोग के दौरान परिवहन घटना की सब्सट्रेट विशिष्टता के साथ ही झिल्ली अखंडता की निगरानी करने के लिए चैनल अभेद्य नियंत्रण सब्सट्रेट के रूप में जोड़ा गया है। गुहाओं अंदर लिपिड संदूषण के लिए जाँच करने के लिए; LUVs डोप ATTO के साथ पूरक थे 390 (बैंगनी 0.1 मोल%)। पर टी = 0 सेकंड MTSET के अलावा (3 मिमी अंतिम), चैनल खोलता गुहाओं से Oy647 तपका। सी प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए बाहर के माध्यम से दर्ज की गई है) बेतरतीब ढंग से उठाया MSCL जी 22 सी तपका घटता ठेठ तपका घटनाओं का प्रदर्शन। डी) दर करने के लिए अग्रणी translocation घटनाओं के लिए स्थिरांक (एन = 242) दो गाऊसी आबादी में क्लस्टरएस, प्रदर्शन है कि एकल और मल्टी चैनल परिवहन घटनाओं भेदभाव किया जा सकता है। ई) उच्च सामग्री स्क्रीनिंग और ट्रिपल-रंग वास्तविक समय readout द्वारा 9046 सील चिप cavities के सांख्यिकीय विश्लेषण। सभी का विश्लेषण चिप गुहाओं के 8% घातीय तपका घटनाओं को दिखाने के। (:;: नियंत्रण घुला हुआ; वायलेट: हरी translocated घुला हुआ लाल लिपिड) वर्णक्रम डिकोडिंग के कारण, तपका घटनाओं, जटिल कैनेटीक्स, लिपिड घुसपैठ, और झिल्ली ruptures भेदभाव किया जा सकता है, इस प्रकार झूठी सकारात्मक को नष्ट करने। यह आंकड़ा 21 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4। इवेंट वर्ग तीन रंग का पता लगाने के द्वारा प्रतिष्ठित। Translocated घुला हुआ पदार्थ (लाल), विवादएल घुला हुआ पदार्थ (हरा) और एक लिपिड डाई (बैंगनी) प्रेतसंबंधी निष्पक्ष डेटा चयन के लिए अनुमति देने के लिए भेदभाव किया जा सकता। ए) मुहरबंद कोई झिल्ली प्रोटीन को शरण देने गुहाओं MSCL चैनल रिकॉर्डिंग के लिए वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत कोई प्रवाह घटनाओं को दिखाने (चित्र देखें। 3 ए) । फ्लोरोसेंट readout सभी चैनलों के लिए स्थिर है। बी) बीमार परिभाषित निलंबित लिपिड bilayers गुहा। असंतत लिपिड bilayer में सी) झिल्ली टूटना परिणाम nanopore दरारें फैले अतिक्रमण करने में सक्षम हैं। इस प्रकार, गुहा अंतरिक्ष अब बफर डिब्बे से अलग किया जाता है। फँस रंगों (लाल) एकाग्रता ढाल नीचे गुहा से बचने। नियंत्रण घुला हुआ पदार्थ (हरा), पहले झिल्ली भर में पारित करने में असमर्थ है, एक लिपिड घुसपैठ की घटना के लिए गुहा। डी) उदाहरण प्रवेश करती है। लिपिड डाई (बैंगनी) के लिए फ्लोरोसेंट संकेत झिल्ली गुहा अंतरिक्ष हमलावर के कारण बढ़ जाती है, वहीं translocation घुला हुआ है Pusheडी गुहा (लाल) से बाहर, फ्लोरोसेंट संकेत में कमी करने के लिए अग्रणी। Nanopore, लिपिड bilayer द्वारा अवरुद्ध है नियंत्रण सब्सट्रेट (हरा)। ई) के पारित होने को रोकने झिल्ली फटने के दौरान संलग्न परिवहन घुला हुआ पदार्थ तेजी से, गुहा (लाल) से बचाव किया जबकि नियंत्रण घुला हुआ पदार्थ में (हरा diffuses)। यह आंकड़ा 21 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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यहाँ प्रस्तुत तकनीक झिल्ली प्रोटीन परिवहन की एक अत्यधिक समानांतर विश्लेषण की अनुमति देता है। पुनर्गठन झिल्ली प्रोटीन सिस्टम सीधे सैद्धांतिक रूप से हर झिल्ली ट्रांसपोर्टर का रूपांतरण कर रही है या संभव चैनल biochip के लिए लागू किया जा सकता है। परिवहन विश्लेषण केवल या तो प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति परिवर्तन (fluorophores के translocation या fluorescently लेबल substrates) या अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति परिवर्तन (पीएच के प्रति संवेदनशील रंगों, माध्यमिक एंजाइमी प्रतिक्रियाओं) के माध्यम से, एक फ्लोरोसेंट पढ़ने के लिए बाहर प्रणाली की स्थापना के द्वारा सीमित है। उत्तरार्द्ध, हालांकि अभी तक स्थापित किया जाना है।

एकल प्रोटीन के स्तर पर झिल्ली चैनलों या ट्रांसपोर्टरों के कार्यात्मक विशेषताओं इस तकनीक का मुख्य लक्ष्य है। एक स्वचालित माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन में, प्रोटीन प्रभावोत्पादक के लिए स्क्रीनिंग आवेदनों की स्थापना भी संभव है। परख सेटअप प्रत्येक चिप पर कई परख अंक के साथ, ऊपर से 8 चिप्स के समानांतर रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। चिप्स का पूरा जुदाई के कारण, यह एक एकल प्रायोगिक समय में नियंत्रण सहित कई प्रयोगात्मक दोहराता है, एक बार की स्थिति स्थापित किया गया है के लिए अनुमति वास्तव में समानांतर है।

एक प्रयोग की स्थापना के दौरान महत्वपूर्ण कदम को सही मायने में unilamellar vesicles की तैयारी, पसंद के प्रोटीन के सक्रिय पुनर्गठन, चिप सतह और परख में इस्तेमाल किया substrates की ओर से निलंबित कर दिया लिपिड bilayer की अवधारण क्षमता पर proteoliposomes की दक्षता में फैल रहे हैं।

unilamellar vesicles की तैयारी इस परख निलंबित लिपिड bilayer गठन के दौरान चिप सतह पर multilamellar झिल्ली शीट की स्थापना से बचने के लिए बुनियादी महत्व की है, वहीं यह तैयारी के दौरान liposomes sonicating के माध्यम से पुटिकाओं के unilamellarity सुनिश्चित करने के बजाय आसान है।

proteoliposomes के प्रत्यक्ष आवेदन विधि presente की बड़ी प्रगति हैघ। पिछले दृष्टिकोण के विपरीत अधिक जटिल और चिकित्सकीय प्रासंगिक प्रोटीन अब निशाना बनाया जा सकता है, निश्चित रूप से LUVs में पसंद की कार्यात्मक प्रोटीन उपज एक पुनर्गठन प्रोटोकॉल की पूर्व स्थापना की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, झिल्ली बड़ी अतिरिक्त झिल्ली डोमेन रखने प्रोटीन उचित SSMS के गठन में कमी। यह 2 CaCl एकाग्रता अलग से प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना उदाहरण के लिए, है।

ब्याज की प्रोटीन के पुनर्गठन के अनुपात को ध्यान से चुना जाना है। एकल प्रोटीन की घटनाओं के विश्लेषण के वांछित और accomplishable यहाँ प्रस्तुत तकनीक का उपयोग किया जाता है। पुनर्गठन प्रोटीन की मात्रा इसलिए ताकना फैले झिल्ली पैच एक आदर्श पुनर्गठन संभालने प्रति और उस झिल्ली प्रोटीन प्रसंभात्य bilayer भर में वितरित किया जाता है 1-2 कार्यात्मक प्रोटीन यूनिट से अधिक नहीं होना चाहिए। इसके अतिरिक्त पुनर्गठन के बाद प्रोटीन की दिशात्मकता भी ध्यान में रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह n हैओटी दोनों directionalities के बीच बराबर हो।

अंत में एक बार इन सभी मुद्दों को ध्यान से जाँच की और अनुकूलित कर रहे हैं, इस्तेमाल किया substrates से कोई भी ध्यान में लीन होना फैले झिल्ली के किसी भी unspecific झिल्ली पारगम्यता प्रदर्शित कर सकता है। सकारात्मक आरोप लगाया fluorophores, लाल वर्णक्रम के शासन में सबसे rhodamine आधारित रंगों की तरह जल्दी से झिल्ली बाधा को दूर करने के लिए करते हैं। मजबूत हाइड्रोफोबिक बातचीत भी लिपिड bilayer के लिए एक unspecific लगाव पैदा कर सकते हैं। दोनों गुण वांछित नहीं हैं।

एक गुणात्मक तरीके से आयन चैनल के अध्ययन में यह भी कल्पना है। एक द्विआधारी का उपयोग कर हाँ चैनल प्रभावोत्पादक के लिए स्क्रीनिंग / नहीं readout आयन के प्रति संवेदनशील रंगों का उपयोग कर के बारे में सोचा जा सकता है। सबसे बड़ी बाधा यहां एक कम से कम आंशिक रूप से आयन को बनाए रखना लिपिड bilayer की स्थापना के लिए किया जाएगा। यह केवल nanopore चिप की सतह संशोधन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
[2-(Trimethylammonium)ethyl]
methanethiosulfonate
Toronto Research Chemicals Inc. T792900 MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer.
1 ml gas-tight syringe Hamilton #1001
10 ml round flask Schott Duran
2.7 mm glas beads Roth N032.1
2-Propanole Roth 9866.5
30 cm Luer-Lock Extension Tube Sarstedt 744304
Acetone Roth 5025.5
Bio-Beads SM-2 Adsorbent Bio-Rad 152-3920 need to be activated before first use
CaCl2 Dihydrat Roth HN04.3
Calcein Sigma C0875 store dark at -20 °C
Chloroform reagent grade VWR Chemicals 22711324
DOPEATTO390 ATTO-TEC AD 390-165 store dark at -20 °C
Ethanol absolute Sigma-Aldrich 32205
Injekt Single-use syringe Braun 460 60 51V
Injekt-F single-use syringe Braun 91 66 017V
Keck clips Schott KC29
L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) Avanti Polar Lipids 5416016 store under inert gas at -20 °C
NaCl 99.5% p.a. Roth 3957.2
Nanopore E100 wafer/chips Micromotive (Mainz/Germany) available on request
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm Whatman 800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) life Technologies D-7173 store dark at -20 °C
Oy647 Luminartis (Münster/Germany) OY-647-T-1mg store dark at -20 °C
Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm Roth P 818.1
Sephadex G-50 Sigma-Aldrich G5080 column material for size exclusion chromatography
Silastic MDX4-4210 Dow Corning curing agent for chip fixation onto cover glass support
sticky-Slide 8-well ibidi 80828 multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder)
Three-way stopcock blue Sarstedt 744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality Roth 5429.2
Triton-X 100 Roth 6683.1
Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter Roth NH69.1
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Büchi 461 water bath Büchi
Büchi Rotavapor RE 111 Büchi
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer  Varian
LiposoFast Mini Extruder Avestin
Membrane pump  Vaccubrand 15430
Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope Malvern / Nanosight LM 14C
NyONE microscope Synentec available on request
Pump control Vaccubrand CVC 2II
Sonicator bath Sonorex RK100H Brandelin electronic 31200001107477
Vaccum pump RC5 Vaccubrand 1805400204
Water bath W13 Haake 002-9910
Plasma Cleaner PDC-37G Harrick Plasma PDC-37G
Name Company Catalog Number Comments
Software
ImageJ Open Source http://imagej.nih.gov/ij/ scientific image processing software
NanoCalcFX Freeware http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets
NTA 2.3 Analytical Software Nanosight data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope
NTA 2.3 Temperature Comms Nanosight temperature controle software for nanoparticle tracking microscope

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References

  1. Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
  2. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  3. Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
  4. Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. (2015).
  5. Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
  6. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
  7. Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
  8. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
  9. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  10. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
  11. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
  12. Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
  13. Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
  14. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
  15. Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
  16. Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
  17. Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
  18. Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
  19. Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
  20. Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
  21. Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
  22. Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
  23. Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
  24. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
  25. Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
  26. Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
  27. Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
  28. Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
झिल्ली परिवहन एकल प्रोटीन संकल्प पर एक अत्यधिक समानांतर nanopore चिप सिस्टम द्वारा विश्लेषण प्रक्रियाओं
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Urban, M., Vor der Brüggen, M., Tampé, R. Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution. J. Vis. Exp. (114), e53373, doi:10.3791/53373 (2016).More

Urban, M., Vor der Brüggen, M., Tampé, R. Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution. J. Vis. Exp. (114), e53373, doi:10.3791/53373 (2016).

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