Abstract
Membrana de transporte de proteínas en el nivel de proteína única sigue evade análisis detallado, si el sustrato es translocado no electrógeno. considerables esfuerzos se han hecho en este campo, pero las técnicas que permiten el análisis automatizado de transporte de alto rendimiento en combinación con técnicas de bicapa de lípidos libres de disolvente necesarias para el análisis de los transportadores de membrana son raros. Esta clase de transportadores sin embargo, es crucial en la homeostasis celular y, por tanto, un objetivo clave en el desarrollo de fármacos y metodologías para obtener nuevos conocimientos necesita desesperadamente.
El manuscrito que aquí se presenta describe el establecimiento y manejo de un nuevo biochip para el análisis de proteínas mediada por procesos de transporte de membrana a una resolución de transportador sola. El biochip se compone de microcavidades encerradas por nanoporos que es altamente paralelo en su diseño y se pueden producir en grado industrial y cantidad. liposomas de proteínas que albergan directamente se pueden aplicar ala superficie del chip de formación de poros que abarca bicapas lipídicas auto-ensambladas utilizando técnicas SSM-(sólido apoyado membranas lipídicas). Pore-que abarca partes de la membrana son independientes, que proporciona la interfaz para la translocación de sustrato en o fuera del espacio de la cavidad, que puede ser seguido por la lectura fluorescente multiespectral en tiempo real. El establecimiento de procedimientos normalizados de trabajo (PNT) permite la creación directa de bicapas de lípidos proteínas albergar sobre la superficie del chip de prácticamente todas las proteínas de membrana que puede ser reconstituida funcionalmente. El único requisito previo es el establecimiento de un sistema de lectura de fluorescencia para sustratos de transporte no electrógenos.
aplicaciones de alto contenido de cribado son realizable por el uso de microscopios fluorescentes invertidas automatizados de grabación chips múltiples en paralelo. grandes conjuntos de datos pueden ser analizados utilizando el software de análisis de diseño personalizado de libre disposición. Tres colores fluorescentes múltiples espectralde lectura, además, permite la discriminación de datos imparcial en diferentes clases de eventos, la eliminación de resultados falsos positivos.
La tecnología de chip se basa actualmente en SiO2 superficies, pero funcionalización adicional el uso de superficies de chips recubiertas de oro también es posible.
Introduction
El análisis de las proteínas de la membrana ha sido de creciente interés para la investigación básica y farmacéutica en los últimos 20 años. El desarrollo de nuevos fármacos depende de la identificación y caracterización detallada de nuevas dianas, siendo en la actualidad uno de los factores limitantes. El hecho de que alrededor del 60% de todas las dianas farmacológicas son proteínas de membrana 1, hace que el desarrollo de técnicas para dilucidar su función más importante.
En el pasado, las técnicas para el estudio de los canales electrógenos y transportadores se han desarrollado multitud 2-4. Los substratos no electrógenos en contrario presentan una tarea más difícil. Sin embargo, son de especial interés como dianas de fármacos de primera, ya que controlan el flujo de solutos y nutrientes a través de la membrana celular y la función como receptores clave en las cascadas de señalización 5.
Un esfuerzo considerable se ha puesto en el desarrollo de techniques para estudiar la función de las proteínas de transporte de membrana 6, 7. Los sistemas que utilizan membranas soporte sólido han surgido como herramientas más prometedoras en este campo 8 - 10, incluyendo las bicapas lipídicas de soporte sólido, bicapas atados 11, 12, membranas lipídicas microblack 13, 14 y nativas matrices de vesículas 15, 16 para nombrar unos pocos. Algunos de ellos son incluso disponibles como configuraciones comerciales 17, 18. Algunos ejemplos se han publicado la combinación de la capacidad para estudiar las proteínas de membrana individuales de una manera altamente paralelo 14, 19, un requisito previo para aplicaciones de cribado. Sin embargo, estos métodos raramente puente desde la investigación básica hasta el entorno industrial. Las dificultades se encuentran a menudo en la capacidad del sistema para ser automatizable, la producción de alto coste y / o preparación laboriosa. Un enfoque overcoming todos los obstáculos mencionados anteriormente es el objetivo final.
La técnica que aquí se presenta se ha desarrollado para estudiar los canales de membrana y transportadores in vitro en un ambiente controlado en el nivel de proteína única 20 - 22. La reconstitución de proteínas de membrana purificadas en las LUV se estableció mucho más que los enfoques comparables para GUVs 23 - 26 o lípidos negro membranas 27. Ellos se pueden aplicar directamente a la superficie del chip, donde la formación de bicapa está llevando a cabo a través de un proceso de autoensamblaje. El diseño de fondo de vidrio del chip nanoporoso (Fig. 1) permite la microscopía de aire, que permite la automatización sencilla del sistema. En combinación con una etapa motorizada múltiples chips pueden ser medidas al mismo tiempo, con cada campo de visión que contiene miles de cavidades selladas para el análisis.
Figura 1. Diseño de biochips nanoporos multiplexados. A) A de silicio sobre aislante (SOI) de la oblea está estructurada por ataque de iones reactivos. Aproximadamente 1.150 fichas individuales se fabrican a partir de cada oblea con idénticas propiedades y calidad. B) Cada chip comprende 250.000 microcavidades individuales con aberturas nano. Barra de escala:. 200 micras C) Cada cavidad es direccionable a través de fluorescencia multiespectral de lectura. Un bloques de la capa superior carentes de las señales fluorescentes desde el depósito de regulación, haciendo que el biochip compatible con los microscopios de fluorescencia invertido. D) microscopía de fuerza atómica (AFM de imágenes) revela uniformemente dispuestas aberturas de los poros y rugosidad de la superficie de la capa de dióxido de silicio de 3,6 nm (n = 40) óptimo para la fusión de vesículas. Barra de escala:. 5 micras E) de micro electrónica de barridoimagen roscopy (SEM) muestra una sección transversal a través de la nanopore permitiendo el acceso a las cavidades femtoliter dentro del chip de silicio. Esta cifra se reutiliza con permiso de 21 años. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Todos los análisis de los datos se realiza utilizando software gratuito para garantizar el acceso sin restricciones para los usuarios finales. Las series temporales se analizaron utilizando el software de procesamiento de imágenes gratuito y un procesamiento por lotes que permite el software de análisis de la curva de generación personalizada y la correlación directa de grandes conjuntos de datos con múltiples canales fluorescentes y miles de curvas.
La proteína modelo utilizado en este protocolo es el canal mechanosensitive de proteínas de gran conductancia (MscL) canal derivado de E. coli. Funciona como una válvula para liberar choque osmótico en la naturaleza, pero se ha modificado de tal manera que racionalmente diseñada syntfuncionalidades hetic covalentemente se pueden unir a la banda de los canales de constricción. Via carga repulsión del activador unido covalentemente (MTSET) el canal se activa para abrir, la creación de una válvula de nano. Las pequeñas moléculas como iones, agua, proteínas pequeñas, pero también pequeños fluoróforos pueden permear a través del canal. Aquí, la proteína se usa como un modelo para demostrar la capacidad del sistema para detectar la translocación mediada por proteínas.
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Protocol
1. Preparación de vesículas unilamelares grandes (LUV)
- Limpiar un matraz de fondo redondo (10 ml de volumen) con gas nitrógeno para eliminar cualquier partícula de polvo. Lavar el matraz de fondo redondo con etanol.
Nota: etanol residual se puede tolerar y no perturbe las etapas subsiguientes. - Lavado A 1 ml de 4x de jeringa de vidrio con cloroformo, para eliminar cualquier contaminación. Añadir 4 SoyPC20 ml (25 mg / ml en cloroformo) al matraz de fondo redondo y dopar la solución de lípidos con un ATTO DOPE adicional 390 a una concentración final de 0,1% en moles.
Nota: En lugar de DOPE ATTO 390 otros lípidos marcados con fluoróforo o colorantes lipófilos también pueden ser utilizados, dependiendo de las fuentes de excitación disponibles. - Conectar el matraz de fondo redondo a un evaporador rotatorio. Se seca la película lipídica durante 40 minutos a 300 mbar, 30 ° temperatura del baño de agua C y la velocidad de rotación máxima, para formar una película de lípido homogénea sobre la pared de vidrio del matraz.
- transfer el matraz a una bomba de vacío de alta y seca la película lipídica durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente.
- Añadir 5 ml de tampón (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; filtrado estéril) y 8 perlas de vidrio (2,7 mm de diámetro, etanol lavado y secado) al matraz. Conectar el matraz al evaporador rotatorio y girar sin vacío a 50 ° C a la velocidad máxima.
Nota: Las cuentas de vidrio desplazan mecánicamente la película de lípidos de la pared de cristal, lo que lleva a (multilaminar) la formación de vesículas. Después de 45 minutos de rotación la solución lechosa y aparece ninguna película de lípidos residual debe ser visible en las paredes del matraz. En lugar de perlas de vidrio otros métodos como la sonicación el matraz en un baño de agua sonicador, vórtex el frasco o el método de rehidratación suave también son aplicables. - Transferir el matraz bajo gas inerte (argón) a un baño de ultrasonidos y sonicar durante 4 min a temperatura ambiente.
Nota: Las ondas de choque de ultrasonido interrumpen los liposomas, haciéndolos unilamelar. - Dividir la solución LUVen alícuotas de 1 ml.
- Realizar ciclos 5 de congelación / descongelación mediante la congelación de la solución LUV en nitrógeno líquido, seguido por descongelación a 40 ° C en un baño de agua.
Nota: Esto conduce a la ruptura y reordenación espontánea de liposomas individuales entre sí, dando lugar a aumento de tamaño. - En la última etapa de congelación tienda de todas las muestras a -80 ° C.
Nota: Las LUVs serán estables durante al menos 6 meses.
2. La reconstitución de proteínas
- Descongelar alícuota de 1 ml LUV en hielo. Directamente antes de la reconstitución, extruir liposomas 17x a través de una membrana de filtro de policarbonato de 400 nm utilizando una mini extrusora.
Nota: Los agregados de lípidos serán eliminados y se alcanza la distribución homogénea de tamaño final. - Desestabilizar LUVs mediante la adición de 4% de Triton X-100 (v / v) a una concentración final de 0,25% (v / v) y se incuba durante 5 min a 50 ° C.
Nota: La cantidad de liposomas utilizada en esta etapa depende de la masa de la purificado MscL G <sup> 22 C utilizado (véase el paso 2.3). Purificar MscL G 22 C (derivado de E. coli) como se describe en detalle en la 28. - Mezclar purificado MscL G 22 C y los liposomas detergentes saturado a 1:20 (w / w) Relación de e incubar durante 30 min adicionales a 50 ° C.
- Para la eliminación del detergente añadir bio-perlas en tampón Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; filtrado estéril) a la solución de proteína / liposoma, con 16 mg (peso húmedo) de bio-cuentas por l detergente utilizado para desestabilizar liposomas en paso 2.2.
- Efectuar la eliminación de detergente durante la noche (16 h) a 4 ° C en un plato giratorio.
Nota: La mezcla constante de la solución asegura la eliminación del detergente óptima. - Después de la eliminación del detergente proteoliposomas almacenar a 4 ° C y utilizar para los experimentos en el mismo día.
Ensayo 3. Actividad
- Durante la reconstitución de proteínas tomar una alícuota de 100 l de con detergentesolución proteoliposoma desestabilizado después de terminar el paso 2.3.
- Añadir 1 volumen de calceína (30 mM) a la solución de proteína-liposoma y se incuba adicional 5 min a 50 ° C.
- Eliminar el detergente de la solución como se describe en el paso 2.4 a 2.6.
- Después de la eliminación del detergente equilibrar una columna de exclusión por tamaño (20 ml de volumen de lecho o más) con tampón Tris (3 veces el volumen del lecho).
Nota: la separación Proteoliposoma puede llevarse a cabo a temperatura ambiente, manteniendo sin embargo la muestra constantemente a 4 ° C se recomienda para asegurar la mejor actividad de la proteína después del fraccionamiento. - proteoliposomas separados de la calceína libre mediante la aplicación de toda la alícuota (200 l) a la columna de exclusión de tamaño. Dejar que la mezcla penetre en la columna, seguido de elución de los proteoliposomas de la columna a través de la aplicación continua de amortiguación en la parte superior utilizando el flujo por gravedad. Observe la calceína contiene proteoliposomas como una banda de color naranja discreta en la parte delantera de elución. Recoger las fracciones de 500 & #181; l respectivamente.
Nota: colorante calceína libre se eluye después de la fracción proteoliposoma con separación completa. - Pipeta de 80 l de cada fracción en una placa de micro-bien para lámparas fluorescentes de lectura e identificar la fracción que contiene la mayor cantidad de proteoliposomas que contienen calceína a través de la emisión de fluorescencia. Detectar la fluorescencia a 520 nm con excitación a 490 nm. Utilice la fracción proteoliposoma con la más alta señal para el ensayo de actividad siguiente.
- Mezclar 20 l de la fracción que contiene proteoliposoma-con 980 l de tampón de Tris en una cubeta de fluorescencia de 1 ml.
- Medir la emisión de fluorescencia a 520 nm (excitación 490 nm) usando un espectrofluorímetro. Grabar durante 1 minuto y luego añadir 25 l de MTSET ([2- (trimetilamonio) etilo] methanethiosulfonate) a partir de una solución madre (160 mM) y mezclar bien. Seguir grabando durante la mezcla. Siempre preparar la solución madre fresca directamente antes de su uso.
Nota: Una vez solucionado en tampón hidrolizan MTSETs dentro de 30 min y serán no reactivo. MTSET se puede pesar y se mantuvo alícuota como polvo seco a -20 ° C hasta su uso.
Nota: Una vez activado el canal MscL G 22 C se abre y libera la calceína atrapada, lo que lleva a una disminución de la concentración local de la calceína cuando effluxing los proteoliposomas y posterior desatenuación del colorante, lo que resulta en un aumento de la emisión de fluorescencia. - Después de la emisión de fluorescencia ha alcanzado una meseta estable de nuevo, solubilizar los liposomas mediante la adición de 50 l de Triton X-100 (4% v / v).
Nota: Idealmente se puede observar ningún aumento de la fluorescencia más, lo que implica la proteína activa en cada liposoma.
4. Distribución del tamaño de Medición de la LUV uso del seguimiento de Nano-partículas
- Tenga en cuenta que sólo las muestras mínimas del liposoma o proteoliposoma solución son necesarios para el análisis de la distribución del tamaño usando el tracker de nanopartículas. Se diluye una solución de liposomas de 5 mg / ml concentración de lípidos 1: 5.000 (v / v) en tampón (Tris 20, NaCl 150 mM, pH 8,0; filtrado estéril) para el análisis a un volumen final de 1 ml. Filtrar todos los tampones utilizados para la dilución y preparación LUV antes y reconstitución utilizando una membrana de 0,2 micras para eliminar las partículas en suspensión como el polvo que perturbaría las mediciones de distribución de tamaño.
- Se lava la cámara de flujo con agua ultra pura.
- Utilice los marcadores de superficie para centrarse en el haz de luz. Inyectar aproximadamente 300 l de la muestra de liposoma diluida y cerrar inmediatamente la válvula de salida para detener el flujo en el interior de la cámara de flujo, sin la introducción de burbujas de aire.
- Ajustar los ajustes de enfoque y la cámara de obturación / ganancia para asegurar señal de dispersión adecuada de la muestra para la detección.
Nota: 20 - 80 señales deben ser claramente visible en el campo de visión. Evitar el hacinamiento (> 80 señales) como el software no será capaz de realizar un seguimiento de las señales individuales cuando se superponen. - Ir a la scr "captura"een. Ajuste el control de temperatura a 25 ° C y la duración de captura a 90 seg usando los controles de software. Pulse el botón "Grabar" para iniciar la grabación de una serie de tiempo.
Nota: Al concluir la serie de tiempo se abre una nueva ventana. - Guardar las series de tiempo en el formato determinado (* .avi). Por razones prácticas durante el análisis por lotes guardar todos los archivos en una sola carpeta.
- Abra la válvula de salida e inyectar otros 300 l en la cámara de flujo. Cierre la válvula y repita los pasos 4.3 a 4.6 veces.
- Después de completar todas las carreras muestra de lavado de la cámara de flujo con 5 ml de agua ultra-pura. Ir a la pantalla "Pre-Proceso". Ajuste la temperatura de los parámetros de calibración = 25 ° C y la viscosidad = 0,91 para el tampón Tris utilizado en este protocolo.
- Abra la ventana de proceso por lotes y cargar la serie de tiempo registrado (Avanzado / Proceso por lotes / conjunto de archivos 1-3). Pulse el botón "GO" para iniciar el análisis de la distribución del tamaño.
Nota: los automáti software de análisiscamente un seguimiento de las partículas individuales y calcula su diámetro en función de su comportamiento de movimiento utilizando los parámetros establecidos en el paso 4.8.
Nota: El análisis de la distribución del tamaño resultante se guarda automáticamente en la misma carpeta que los archivos de series de tiempo. - Además de crear un archivo de informe para resumir los resultados (Exportación / Crear informe en PDF).
5. Preparación de la viruta Holder
- Pesar 1,0 g de MDX4 base de elastómero de grado médico y 0,1 g de agente de curado MDX4 en un tubo de reacción de 50 ml. Mezclar bien ambos elementos con una barra de vidrio.
- Poner el tubo en un desecador durante 1 hora para desgasificar el adhesivo. Posteriormente usarla dentro de 30 minutos para el encolado de chips, ya que el adhesivo se endurecerá y será demasiado difícil trabajar con él.
- Durante la desgasificación de elastómero (paso 5.1) limpiar un portaobjetos de vidrio objetivo a fondo con cloroformo para eliminar cualquier contaminación antes de la unión de chips. Enjuague el portaobjetos con 5 ml de cloroformo usando una jeringa de vidrio. Se recoge elcloroformo en un vaso de precipitados por debajo de posicionado. Después del lavado dejar que la diapositiva seca.
Nota: Realice este paso bajo una campana de humos. Alternativa a cloroformo, otros disolventes orgánicos como la acetona también se pueden utilizar. - Depositar una pequeña cantidad del material de unión adhesivo sobre la cubierta de vidrio usando una punta de pipeta (puntas para pipetas de cristal 10 l). Recuerde que los chips tienen para encajar en el soporte de portaobjetos de 8 cámaras más adelante y tienen que ser colocado en la diapositiva en consecuencia.
- Retirar con cuidado una ficha a la vez desde el tablero de obleas utilizando unas pinzas de punta fina y depositar el chip de la gota de adhesivo en la cubierta de vidrio. Asegúrese de que el lado revestido del chip hacia arriba.
- Empuje suavemente el chip sobre la cubierta de vidrio con la parte posterior de un objeto contundente pinzas PE. Para asegurarse de que el pegamento se distribuye uniformemente por debajo del chip, deslice con cuidado el chip adelante y atrás. Paso crítico: Asegúrese de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo del chip, ya que podría interferir en las imágenes ópticasde las cavidades de chips más adelante. También asegúrese de que ningún material adhesivo contamina la superficie del chip.
- Desecar el vidrio de cubierta acabada durante 2 horas a 65 ° C en un armario secador.
Nota: Virutas todavía están recubiertos con una capa protectora procedentes de su fabricación que necesita ser eliminado. - Para eliminar la capa de protección, realizar una etapa de lavado con disolvente secuencial. Durante el curado de los chips, precalentar un baño de agua a 54 ° C.
- Coloque 3 vasos de vidrio en el baño de agua, dos de ellos lleno de isopropanol y uno lleno de acetona.
- Monte el vidrio cubierta de virutas en un soporte de diapositivas y sumergirlo en el primer plato lleno de isopropanol durante 10 minutos. Después transferirlo al plato lleno de acetona, se incuban de nuevo durante 10 min antes de transferirla a la etapa de lavado final a la segunda plato isopropanol y se incuba otros 10 minutos.
- Retire el soporte de diapositivas de la placa y lavar con cuidado extensamente con Ultrapure agua, seguido de secado de las patatas fritas con una suave corriente de gas nitrógeno.
- Despegue la lámina de laminación de la de 8 pocillos pegajosa-deslizante y lo puso al revés en el banco. Recoja cuidadosamente la tapa deslizante y presione suavemente sobre la pegajosa-deslizante con las fichas que enfrentan los pozos. Dejar que el titular de la viruta acabada reposo durante un par de minutos antes de su uso.
6. Preparación Ensayo
Nota: Las fichas Nanopore pegados a una cubierta de vidrio y separados por una de 8 pocillos pegajosa-deslizante poseer el beneficio, que múltiples chips pueden ser tratados en una sola corrida experimental, con chips de estar completamente separados unos de otros.
- Después de la preparación titular de la viruta, enjuague cada chip con etanol puro y secar con gas nitrógeno, para eliminar cualquier contaminación como el polvo.
- Limpiar la superficie del chip con aire, oxígeno o plasma de nitrógeno. Dependiendo del tipo de limpieza por plasma plazos varían: realizar el tratamiento con plasma de oxígeno durante 1 minuto, el aire y liendresrogen plasma durante 5 min a 0,3 mbar de ajuste de potencia del 80% (medio de potencia de RF o alta).
- Después de la limpieza de plasma se incuba fichas en etanol puro durante 10-15 minutos para asegurar la humectación de la cavidad.
- etanol cambio paso a paso para el tampón mediante la adición de 400 l de tampón Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; filtrado estéril), seguido de mezclado de la solución sin introducir burbujas de aire y la posterior eliminación de 400 l. Repita este procedimiento 12 veces, para asegurar la eliminación de etanol.
Nota: El etanol sería perjudicial para los liposomas y las bicapas de lípidos en suspensión. - Tampón Tris Dope (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; filtrado estéril) con 5 mM CaCl 2 y 1 M Oy647 colorante. Eliminar completamente el tampón de lavado del chip e inmediatamente añadir el tampón dopado al chip. Nota: Virutas serán cubiertos con una película delgada de tampón después de la eliminación de tampón de lavado, por lo que el chip no está en contacto directo con el aire, lo que garantiza una humectación constante de las cavidades y la superficie del chip.
- Añadir 1 mg / ml o LUVs proteo-LUVs en tampón Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; filtrado estéril) a cada pocillo.
Nota: El volumen final en cada pocillo es de 300 l. Considere la posibilidad de adiciones posteriores del colorante de control y el MTSET modificador químico durante dopado Además tampón Tris. - Para la formación de bicapa lipídica de poros que abarca en la superficie del chip incubar el chip durante 1 hora a temperatura ambiente con la disolución de liposomas. Posteriormente lavar cada chip con 4x 400 l de Ca 2 + exento de tampón Tris.
- Añadir el colorante de control a cada pocillo, con una concentración final de 5 mM. Los chips están ahora listos para el ensayo de translocación.
7. Configuración de Ensayo
- Montar el soporte de chip para el microscopio de epifluorescencia (20X objetivo de aire, larga distancia de trabajo). Enfoque en el borde del chip de nanoporos para encontrar más fácilmente el plano focal de las micro-cavidades. Una vez que las cavidades están en foco escanear la matriz nanoporos para una región THen pantallas de alta relación de sellado.
Nota: Cada microscopio de epifluorescencia invertido se puede utilizar para llevar a cabo ensayos de chip. Según la ampliación del objetivo (20X - 60X) el número de cavidades ensayadas variará, con un máximo de 9.000 cavidades en un único campo visual usando magnificación 20X. objetivos de aire con una distancia de trabajo larga son preferibles. El uso de invertidas microscopios de barrido láser confocal (CLSM) también es posible, pero la adquisición de imágenes puede ser el factor limitante debido a la limitada profundidad de foco. - Optimizar la iluminación chip.
Nota: Asegúrese de que los dos canales de tinte no superen el valor máximo de la escala gris, ya que los cambios no pueden ser observados. Para los experimentos de exportación ajustar la iluminación del colorante translocado a 90% de la capacidad máxima de la señal. Ajustar el tinte de control en cavidades abiertas al 80-90% de la capacidad máxima de la señal para detectar con claridad cualquier sellado de membrana permeable. - Una vez que todos los canales se ajustan iniciar la serie de tiempo. Tomar imágenes cada 10-20 SEc durante 90 minutos.
Nota: Esto es adecuado para seguir asimismo eventos específicos e inespecíficos de flujo de salida. - Inicializar flujo de salida del sustrato fluorescente por la adición de cisteína específica, cargado positivamente MTSET compuesto a una concentración final de 3 mM. Deje por lo menos 5 minutos de tiempo de ejecución experimento antes de la adición MTSET para poder establecer posteriormente una señal fluorescente estable línea de base antes de la apertura canalizar. Siempre preparar la solución MTSET fresco directamente antes de su uso.
Análisis de datos 8.
- Abra la pila de series de tiempo con una versión estándar de ImageJ (Archivo / Importar / Secuencia de imágenes).
- Si se apilan canales fluorescentes, dividir los canales en pilas individuales para cada canal (Imagen / Pilas / Pila de Imágenes).
- Duplicar la primera imagen del canal sustrato translocación de retorno de la inversión (regiones de interés) de identificación (Imagen / Duplicar).
- Convertir la imagen en una imagen binaria (Imagen / Ajustar / Umbral). Asegurarque el algoritmo utilizado representa señales para todas las cavidades selladas sin pixelación superpuestas.
- definir automáticamente las regiones de interés con la herramienta analizador de partículas (Analizar / Analizar de partículas). Definir un tamaño de partícula mínimo definido, para evitar el ruido de las partículas. Compruebe las opciones de "excluir en los bordes" y "incluir agujeros". Asegúrese de que los ROI resultantes reflejan la estructura de formación microcavity. ROI situado entre ellos son artefactos, por lo tanto, eliminarlos. Guardar la lista de retorno de la inversión.
Nota: El parámetro de medición tiene que estar en "zona" antes del análisis de partículas (Analizar / Set Mediciones / Área) - Abra el módulo adicional Time Series Analyzer (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), que cambia el tamaño de todas las regiones de interés de forma automática con el mismo tamaño. Cambiar el tamaño de todo el rendimiento de la inversión existente a un ancho / altura de 6x6 píxeles y forma ovalada (temporizador serie Analyzer / AutoROIProperties). Marque la opción "Cambiar el tamaño de ROIS existente". Guardar la lista de ROI cambiado el tamaño resultante.
- Abra el administrador de retorno de la inversión(Analizar / Herramientas / ROI Manager) y cargar la lista de ROI cambiar de tamaño para cada canal de la serie temporal (ROI Manger / Más / Open). ROIs se superpone. Para analizar el cambio de señal para cada ROI iniciar la herramienta Medición múltiple (ROI Gerente / Más / Multi Medida), seleccione "Medir todos los cortes" y "Una fila por rebanada" e iniciar la medida de múltiples.
Nota: El parámetro de medición tiene que ser ajustado a "valor medio gris" para este paso (Analizar / Medidas Set / La media de valor de gris) - Guarde la tabla resultante, que da el valor de gris medio para cada ROI en formato * .txt o * .xls.
- Importe el análisis del ROI de cada canal de imágenes en NanoCalcFX través de la opción "Importar archivo". Ajuste "Use primera línea para dar nombre a la serie". Ajuste el tamaño de paso entre las imágenes de acuerdo con los períodos de adquisición de imágenes de series de tiempo y elija la columna correspondiente y el separador decimal.
- Utilice la opción "hoja múltiple" para correlacionar automáticamente las gráficas de la persona fluofluores- canales.
Nota: Los eventos pueden ahora ser analizadas y clasificadas utilizando la información dada por la información espectral de 3 colores. - Ajustar curvas seleccionadas usando la función build-in ajuste (opción de ajuste).
Nota: La ecuación de flujo de salida y afluencia implementado es adecuado para todos los eventos de difusión impulsada por monoexponenciales y los límites de ajuste se pueden ajustar. Resultantes constantes de velocidad se pueden trazar con la función de histograma o exportados para el refinamiento de más datos.
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Representative Results
membranas de poros abarca se pueden crear fácilmente en la superficie del chip nanoestructurado de una manera auto-ensamblado. Sin embargo, el proceso subyacente sigue siendo delicada e influenciado por muchos parámetros como el tamaño de los liposomas, monodispersividad de la población de liposomas, lamelaridad, los lípidos y las propiedades de la sal y de la superficie de concentración química. La mayoría de estos parámetros han sido cuidadosamente caracterizados y estandarizados en el protocolo anterior. Otros parámetros no obstante, debería ser controladas durante cada nueva preparación, para asegurar un experimento exitoso. Estos son la distribución del tamaño del liposoma y dispersidad población (Fig. 2 A). Para la formación óptima de la membrana de poros que abarca y para evitar la intrusión de liposomas en los tamaños de cavidad espacio de liposomas muy por encima del diámetro de poro son una necesidad. Además, preparaciones de liposomas monodispersas han demostrado que el rendimiento mejores resultados en la membrana y la difusión de fusien. Otro paso crucial que debe ser controlado para cada preparación es la actividad de proteína después de la reconstitución. Utilizando un ensayo de fluorescencia de desatenuación para liposomas reconstituidos con MscL G 22 C, la apertura del canal se puede controlar a través de la espectroscopia de fluorescencia, dando una relación de liposomas que albergan activo MscL G 22 de la proteína C (Fig. 2 B).
Una vez extendido a la superficie del chip, soluto translocación de un blanco fluorescente mediante MscL G 22 C tras la activación ligando puede ser seguido (Fig. 3 B). Ingeniería MscL G 22 canales C están cerrados en su estado predeterminado, que atrapa pequeñas moléculas fluorescentes en el interior del espacio de la cavidad. Mediante la adición de la MTSET modulador químico cargas positivas se introducen en la región de la constricción dela MscL G 22 C poro, empujándolo abierta a través de la repulsión electrostática. El fluoróforo atrapado antes evade el espacio de la cavidad para alcanzar el equilibrio de difusión. La disminución subsiguiente de la fluorescencia en el interior del espacio de la cavidad se puede controlar. Este proceso es altamente reproducible, lo que resulta en una población homogénea de los acontecimientos de flujo de salida (Fig. 3 C). Las curvas de flujo de salida resultantes se agrupan en dos poblaciones distintas, lo que demuestra la capacidad del ensayo para distinguir entre eventos de translocación de una y de múltiples canales (Fig. 3 D). Además, el sistema es capaz de seguir hasta tres tintes espectralmente bien separados en paralelo y en tiempo real, por lo que es posible la grabación de detección de alto contenido y discrimina de forma precisa y objetiva entre los resultados positivos y negativos falsos positivos,. En este estudio se analizaron 9.046 cavidades selladas, de los cuales el 8% está representada eflUX comportamiento. La implementación de los canales de lectura de diferentes fluorescentes, los eventos pueden ser discriminados en eventos monoexponenciales de flujo de salida, cinética, intrusiones complejos de lípidos y romperse la membrana (Fig. 3 E). Sólo los eventos que muestran señales estables para el control de soluto y el colorante de membrana se consideran para el análisis final. cinética de complejos representan eventos de flujo de salida con señales de control inestables y por lo tanto se omiten. intrusiones de lípidos y rupturas de la membrana son eventos de artefactos que se producen intrínsecamente el uso de sistemas bicapa lipídica de poros de expansión. Pueden ser descartados mediante las señales de control de tinte como se mencionó anteriormente (Fig. 4).
Figura 2. Distribución de Tamaño de proteoliposomas y la función MscL. A) vesículas se analyz cado por el análisis de seguimiento de nano-partículas. LUV muestras fueron examinadas antes (trazo negro) y después de la reconstitución de MscL G 22 C (línea roja). Después de la preparación LUV, se consigue un tamaño de partícula medio de 214 ± 70 nm. El tamaño se reduce durante la reconstitución, lo que resulta en proteoliposomas de 158 ± 60 nm de la actividad tamaño. B) MscL fue validado después de la reconstitución mediante un ensayo de flujo de salida. 28 calceína Auto-templado es liberado de proteoliposomas través de la abertura mediada por MTSET del canal MscL, que conduce a desatenuación del fluoróforo (rojo) y un rápido aumento de la intensidad de fluorescencia. Los liposomas sin la proteína no muestran tal flujo de salida, adición MTSET incluso después de repetidas (negro). Tras la solubilización con detergente introducido (TX-100) de las liberaciones liposomas todo encapsulado previamente colorante. Esta cifra se reutiliza con permiso de 21.et = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Por ligando translocación de solutos por MscL a nivel de una sola molécula. A) Engineered MscL G 22 canales C están cerrados en su estado por defecto. Los pequeños solutos tales como un fluoróforo son incapaces de pasar a través del canal ni tampoco la bicapa lipídica. Tras la adición de MTSET, una cisteína única ingeniería de cada MscL G 22 C protómero es modificado, introduciendo múltiples cargas positivas en el lado de la constricción del complejo de canal pentamérica. El 22 de canal MscL G C se empuja abierta por repulsión de carga y el colorante atrapado puede difundir fuera de la cavidad, dando lugar a una disminución de la intensidad de fluorescencia. B) TiMe rastros de MscL G 22 C apertura tras la adición de MTSET. Proteoliposomas que contienen funcionalmente reconstituido MscL G 22 C se extendieron sobre la superficie del chip. Oy647 (rojo) fue atrapado en el interior de las cavidades como sustrato translocación. Se añadió OregonGreen dextrano (70 kDa, verde) como sustrato de canal de control impermeable para controlar la especificidad de sustrato de la eventos de transporte, así como la integridad de la membrana durante el experimento. Las LUV se complementaron con DOPE ATTO 390 (0,1 mol%; púrpura) para comprobar la contaminación de lípidos dentro de las cavidades. La adición de MTSET (3 mM final) en t = 0 seg abre el canal, lo que lleva a Oy647 flujo de salida de las cavidades, grabado a través de la fluorescencia de lectura. C) aleatoriamente recogieron MscL G 22 curvas C de eflujo demuestran eventos típicos de flujo de salida. D) Rate constantes para eventos de translocación (n = 242) se concentran en dos poblaciones de Gausss, lo que demuestra que los eventos de transporte de una o varias de canal pueden ser discriminados. E) La selección de alto contenido y el análisis estadístico de 9.046 cavidades de chips sellados por el triple de color en tiempo real de lectura. 8% de todas las cavidades de chips analizados muestran los eventos de flujo de salida exponenciales. Debido a la decodificación espectral (rojo: translocado soluto; verde: soluto control; violeta: lípidos), eventos de flujo de salida, la cinética de complejos, las intrusiones de lípidos, y romperse la membrana podría ser discriminado, eliminando así los falsos positivos. Esta cifra se reutiliza con permiso de 21 años. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 4. Clases de eventos distinguen por la detección de tres colores. soluto translocado (rojo), control soluto (verde) y un colorante de los lípidos (violeta) se pueden discriminar espectralmente lo que permite la selección de datos imparcial. A) cavidades selladas albergan no proteína de membrana no muestran eventos de flujo en las condiciones experimentales descritas para el canal de MscL la grabación (véase la Fig. 3A) . La lectura de fluorescencia es estable para todos los canales. B) Malos definen bicapas de lípidos en suspensión son capaces de invadir los resultados de la cavidad. C) rotura de las membranas de bicapa lipídica discontinua que abarcan las fisuras de nanoporos. De este modo, el espacio de la cavidad ya no separado del compartimento de amortiguamiento. colorantes atrapados (rojo) evaden la cavidad por el gradiente de concentración. El soluto control (verde), previamente incapaces de pasar a través de la membrana, entra en el D) Ejemplo cavidad. Para un evento de intrusión de lípidos. Mientras que la señal fluorescente para el colorante de los lípidos (violeta) aumenta debido a la membrana invadir el espacio de la cavidad, el soluto translocación es pushed fuera de la cavidad (rojo), que conduce a una disminución en la señal fluorescente. El nanopore es bloqueado por la bicapa lipídica, impidiendo el paso del sustrato control (verde). E) Durante ruptura de la membrana, el soluto de transporte cerrado evade rápidamente de la cavidad (rojo), mientras que el soluto se difunde en el control (verde). Esta cifra se reutiliza con permiso de 21 años. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La técnica que aquí se presenta permite un análisis altamente paralela de transporte de proteínas de membrana. sistemas de proteínas de membrana reconstituidas directamente se pueden aplicar a la biochip, por lo que la adaptación de teóricamente cada transportador de membrana o canalizar posible. el análisis del transporte sólo está limitado por el establecimiento de un sistema de lectura de fluorescencia, ya sea a través de los cambios directos de fluorescencia (translocación de fluoróforos o sustratos marcados con fluorescencia) o el cambio de fluorescencia indirecta (tintes sensibles al pH, reacciones enzimáticas secundarias). Este último, sin embargo aún no se han establecido.
Caracterización funcional de los canales de membrana o transportadores en el nivel de proteína sola es el foco principal de esta técnica. En combinación con un microscopio automatizado, el establecimiento de aplicaciones de cribado para efectores de la proteína también es posible. La configuración de ensayo permite la grabación en paralelo de hasta 8 chips, con múltiples puntos de ensayo en cada chip. Debido a la separación completa de los chips, es verdaderamente paralela, lo que permite múltiples repeticiones experimentales incluidos los controles en una única prueba experimental, una vez que se han establecido las condiciones.
Los pasos críticos durante la creación de un experimento son la preparación de vesículas unilamelares verdaderamente, la reconstitución activa de la proteína de elección, la difusión de la eficiencia de proteoliposomas en la superficie del chip y la capacidad de retención de la bicapa de lípido en suspensión hacia los sustratos utilizados en el ensayo.
Si bien la preparación de vesículas unilamelares es de importancia básica para este ensayo para evitar la creación de hojas de membrana multilamelares sobre la superficie del chip durante la formación de bicapa lipídica en suspensión, es bastante fácil para asegurar unilamellarity de las vesículas a través de sonicación de los liposomas durante la preparación.
La aplicación directa de proteoliposomas es el gran avance de la Presente métodore. En contraste con los enfoques anteriores proteínas más complejas y médicamente relevantes pueden ahora ser dirigidos, lo que requiere, por supuesto, el establecimiento previo de un protocolo de reconstitución rendimiento funcional de la proteína de elección en las LUV. Además, las proteínas de membrana que poseen grandes dominios extra-membrana disminuyen la formación de SSM adecuados. Esto tiene que ser optimizado para cada nueva proteína, por ejemplo, variando la concentración de CaCl 2.
La relación de la reconstitución de la proteína de interés tiene que ser elegido cuidadosamente. Se desea que el análisis de los eventos de proteínas individuales y accomplishable utilizando la técnica aquí presentada. La cantidad de proteína reconstituida, por tanto, no debe exceder de 1-2 unidades funcionales de proteínas por parche de membrana de poros abarca suponiendo una reconstitución ideal y que la proteína de membrana se distribuye estocásticamente través de la bicapa. Además, la direccionalidad de la proteína después de la reconstitución También debe tenerse en cuenta, ya que tiene not el ser igual entre ambos direccionalidades.
Finalmente una vez que todos estos temas son cuidadosamente revisados y optimizados, ninguno de los sustratos utilizados puede mostrar cualquier permeabilidad de la membrana no específico de la membrana de poros que atraviesan. fluoróforos cargados positivamente, al igual que la mayoría de los colorantes a base de rodamina en el régimen espectral roja tienden a superar rápidamente la barrera de la membrana. interacciones hidrofóbicas fuertes también pueden conducir a una unión no específica a la bicapa lipídica. Ambas propiedades no son deseados.
El estudio de los canales iónicos de una manera cualitativa también es imaginable. La detección de los efectores de canal utilizando un binario Sí / No de lectura podría ser considerado el uso de tintes sensibles a iones. El mayor obstáculo en este caso sería el establecimiento de una bicapa lipídica, al menos en parte, de iones de retención. Esto sólo puede ser alcanzable a través de modificación de la superficie del chip de nanoporos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
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